PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN (SB-091324)

PEMBUATAN MEDIA INDUKSI KALUS

Achmad Chusnun Ni’amNRP. 1508 100 049

Asisten : Noer Laily Desriatin S.Si

LABORATORIUM BOTANIJURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA

2011

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangKultur jaringan merupakan metode perbanyakan tanaman

secara vegetatif dalam lingkungan in vitro dengan mengisolasi bagian tanaman kemudian menumbuhkannya di media dalam kondisi steril. Hartman et al. (1990), menjelaskan bahwa jaringan tanaman yang sering digunakan dalam teknik kultur jaringan adalah kalus, sel, dan protoplasma, dan organ tanaman meliputi, pucuk, bunga, daun, batang, dan akar.

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Banyak media kultur yang digunakan pada kultur jaringan. Jenis media dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Media yang digunakan secara luas adalah media Murashige and Skoog (MS) yang dikembangkan pada tahun 1962.

1.2 PermasalahanPermasalahan yang dihadapi adalah bagaimana

memahami bahan-bahan dasar yang terdapat dalam media MS

1.3 TujuanTujuan dari praktikum pembuatan media kalus adalah

peralatan adalah memahami bahan-bahan dasar yang terdapat dalam media MS

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kultur JaringanKultur jaringan merupakan suatu metode untuk

mengisolasi bagian dari tanarnan seperti protoplas sel, sekelompok sel, jaringan dan organ serta menumbuhkannya dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali (Winata, 1988). Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman dalam media buatan yang dilakukan di tempat steril. Salah satu alternatif untuk mendapatkan tanaman bernilai ekonomis dalarn jumlah banyak dan dalam waktu singkat adalah dengan melakukan perbanyakan melalui teknik kultur jaringan.

Teknik kultur jaringan sangat sederhana, suatu sel atau jaringan tanaman yang disbeut eksplan secara aseptic dipeilhara dalam medium dalam keadaan steril. Sel tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Kalus yang terbentuk dipindahkan ke dalam medium diferensiasi, maka akan terbentuk tanaman kecil lengkap yang disebut planlet (Daisy, 1994).

Pelaksanaan teknik kultur jaringan berdasarkan teori sel yang dikemukakan oleh Scleiden dan Schwan, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, dari mana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan pada lingkungan yang sesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna (Daisy, 1994). Kultur jaringan akan lebih besar persentase keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dindingnya tipis, belum mempunyai penebalan dari zat pektin, plasmanya penuh, dan

vakuolanya kecil-kecil (Suryowinoto, 1991). Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:1) Pembuatan media2) Inisiasi3) Sterilisasi4) Multiplikasi5) Pengakaran6) Aklimatisasi

Teknik kultur jaringan dapat berhasil dengan baik jika syarat yang diperlukan terpenuhi, meliputi pemilihan eksplan untuk pembentukan kalus, penggunaan medium yang cocok, dan kondisi yang aseptik.Perbanyakan tanaman secara kultur jaringan mempunyai beberapa kelebihan sebagai berikut:

a. Perbanyakan tanaman secara kultur jaringan menawarkan peluang besar untuk menghasilkan jumlah bibit tanaman yang banyak dalam waktu relatif singkat sehingga lebih ekonomis.

b. Tidak memerlukan tempat yang luasc. Dapat dilakukan sepanjang tahun tanpa bergantung pada

musim. d. Bibit yang dihasilkan lebih sehat. e. Memungkinkan dilakukannya manipulasi genetik.f. Menghasilkan bibit tanaman dalam jumlah banyak dan

seragam dalam waktu relatif singkat

2.3 Media Kultur JaringanMedia kultur merupakan salah satu faktor penentu

keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Beberapa macam media yang digunakan adalah Murashige and Skoog, Knudson dan Vacin and Went (Wardiyanti, 1998). Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan (Yusnita, 2003).

Adapun jenis media dalam kultur jaringan dapat dibedakan menjadi beberapa macam, antara lain:a. Media Murashige and Skoog (1962) dapat digunakan untuk

hampir semua jenis kultur, terutama pada herbaceousb. Medium Knop digunakan untuk menumbuhkan kalus wortelc. Media Vacin and Went biasa digunakan untuk tanaman

anggrekd. Media Knudson untuk kelapa kopyor dan anggreke. Media White (1934) dikembangkan oleh Hildebrant untuk

keperluan kultur jaringan tumor Helianthus, sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat

f. Media Nitsch menggunakan NO3- da K+ dengan kadar yang

cukup tinggi untuk mengkultur jaringan tanaman artichoke Jerussalem.

g. Media Gamborg B5 untuk kultur sel kedelaih. Media Schenk and Hildebrant (1972) cocok untuk kuljar

tanaman monokotili. Media Woody Plant Medium j. Medium N6 untuk serelia terutama padi

(Hendaryono, 1994).

Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula, misalnya medium MS sangat baik untuk tanaman krisan, tanaman semusim sering menggunakan media MS. Medium Knudson hanya cocok utuk menanam eksplan kelapa kopyor (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Medium yang digunakan untuk kultur in vitro tanaman dapat berupa medium padat atau cair. Medium padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi membentuk tanaman yang lengkap (plantlet), sedangkan medium cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Medium yang digunakan mengandung lima komponen utama yaitu senyawa anorganik,

sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh dan suplemen organik (Yuwono, 2008).

Media yang digunakan secara luas adalah media MS yang dikembangkan pada tahun 1962. Dari berbagai komposisi dasar ini kadang-kadang dibuat modifikasi, misalnya hanya menggunakan ½ dari konsentrasi dari garam-garam makro yang digunakan (½ MS) atau menggunakan komposisi garam makro berdasarkan MS tetapi mikro dan vitamin berdasarkan komposisi Heller. Zat pengatur tumbuh yang akan digunakan disesuaikan dengan tujuan inisiasi kultur (Gunawan, 1995). Kisaran pH anatara 5-6,5 cocok untuk pertumbuhan dengan pH optimum 5,8 karena pH kurang dari 4,5 atau lebih dari 7 umumnya menghentikan petumbuhan tanaman. Jika pH tidak optimum maka akan berpengaruh zat pengatur tumbuhan terhadap eksplan (Wadiyanti, 1998).

Beberapa kelompok senyawa yang diperlukan dalam media kultur in vitro, yaitu senyawa organik dan anorganik, sumber karbon, agar, zat pengatur tumbuh (ZPT), air, keasaman, vitamin, myo-inositol. Jaringan yang ditumbuhkan memerlukan beberapa bahan anorganik secara terus menerus baik unsur makro maupun mikro. Unsur hara makro yang diperlukan dalam jumlah banyak, yaitu C, H, O, N, P, K, Ca dan Mg sedangkan unsur hara mikro, yaitu Cu, Fe, Mn, Bo dan Mo. Tambahan senyawa organik diperlukan plantlet, yaitu senyawa komplek, asam amino, protein. Senyawa komplek yang sering digunakan adalah air kelapa, ekstrak ragi, jus pisang, kentang atau buah-buahan (Wardiyanti, 1998).

2.4 Medium Murashige and SkoogSampai saat ini dikenal beberapa jenis medium dengan

komposisi kimia yang berbeda dan dapat digunakan untuk kultur in vitro dari tanaman tertentu. Medium yang sering digunakan untuk sebagian besar spesies tanaman yang termasuk dikotil maupun monokotil adalah medium Murashige dan Skoog (MS) (Dixon, 1985). Suryowinoto (1996) menyebutkan bahwa medium

MS memiliki unsur-unsur dan persenyawaan yang lebih lengkap dibandingkan dengan medium yang lain. Menurut Street (1972), kadar mineral dalam medium MS relatif lebih tinggi dibandingkan medium lain. Staba (1982) menambahkan bahwa umumnya mineral-mineral ini dapat mendukung pertumbuhan sel-sel tanaman dalam kultur in vitro. Sebab pada medium MS, nitrogen tersedia dalam bentuk cairan nitrat dan ammonia sehingga kebutuhan nitrogen akan selalu terpenuhi. Menurut George dan Sherrington (1984), sumber nitrogen lain adalah asam amino yang dapat dimanfaatkan secara langsung oleh jaringan tanaman daripada nitrogen yang terdapat dalam bentuk nitrogen anorganik. Asam amino berperan sebagai bahan pembangun protein

2.5 Komposisi Media Kultur JaringanKomposisi media kultur sangat berpengaruh terhadap

proses pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditanam secara in vitro. Medium yang digunakan sebagai sumber makanan adalah senyawa organik dan anorganik yang diperlukan untuk pertumbuhan eksplan. Media kultur yang memenuhi syarat adalah media yang mengandung nutrien makro dan nutrien mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, sumber tenaga, air, asam amino, vitamin, zat pengatur tunbuh. Kadang-kadang diperlukan penambahan zat lain seperti yeast, ekstra tanaman sebagai sumber zat perangsang pertumbuhan. Selain itu perlu ditambah agar terjadi kontak antara jaringan tanaman media dengan udara (Wetherell, 1982). Adapun kompisisi medium kultur jaringan tanaman adalah sebagai berikut:

2.5.1 AirAir merupakan komponen yang penting di dalam

pengkulturan eksplan karena 95% dari medium mengandung air. Untuk tujuan penelitian, digunakan air destilasi, dan untuk penelitian dengan materi eksplan dari protoplas, meristem dan sel sebaiknya digunakan aquabides (Welsh 1991). Dimana air

destilasi (air suling) tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang dapat merusak proses perkembangan eksplan (Katuuk, 1989). Air yang digunaka alam media harus disterilisasi dan daoat juga digunakan demineralisasi. Penyimpanan air yang telah disuling diusahakan tidak disimpan dalam bahan plastik terlalu lama (Wardiyanti, 1998).

2.5.2. Bahan PemadatMedia tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk

tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran komponen kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media cair tersebut ditambah zat pemadat agar (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Penggunaan agar biasanya adalah 8 - 10 g/l. Sedangkan menurut Yusnita (2003), konsentrasi agar dalam media yang lazim digunakan berkisar 6 - 10g/l. Staba (1982), menambahkan bahwa agar dengan kadar 0,6 - 0,8% cukup untuk berbagai macam tujuan pengkulturan sel, jaringan, atau organ karena konsentrasi agar yang tinggi dapat menghambat pertumbuhan eksplan tanaman yang dikulturkan secara in vitro.

2.5.3 Larutan Garam Anorganik Tiap tanaman memerlukan setidaknya 6 elemen

makronutrien, yaitu unsur yang diperlukan dalam jumlah besar meliputi N, K, Mg, Ca, S, P dan 7 elemen mikronutrien, yaitu unsur yang diperlukan dalam jumlah kecil meliputi Fe, Mn, B, Mo, Cl (Wetherell, 1976). Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3, CaCl2

.2H2O, MgSO4.7H2O dan KH2PO4, sedangkan unsur mikro biasanya diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, Na2MoO4.2H2O5, CuSO4.5H2O dan CoCl2.6H2O (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

2.5.4 Zat OrganikSenyawa kimia organik yang biasa dipakai sebagai

sumber energi dalam kultur in vitro adalah karbohidrat. Karbohidrat tersusun atas unsur-unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama. Bahan-bahan organik yang termasuk karbohidrat meliputi gula, pati dan selulosa. Karbohidrat mempunyai dua fungsi utama yaitu sebagai sumber energi untuk jaringan dan untuk keseimbangan tekanan osmotik dalam medium. Karbohidrat yang sering digunakan adalah sukrosa meskipun kadang-kadang diganti dengan glukosa (Wetherell, 1982).

Vitamin adalah bahan yang perlu ditambahkan dalam medium kultur in vitro, sebab sel bagian tanaman yang dikulturkan secara in vitro belum mampu membuat vitamin sendiri untuk kehidupannya (Katuuk, 1989). Vitamin yang sering ditambahkan ke dalam medium adalah tiamin (vitamin B1), asam nikotinat (niasin), piridoksin (vitamin B6), riboflavin (vitamin B2), biotin, asam askorbat ( vitamin C), Vitamin E dan myo-inositol sebagaz zat suplemen karena bermamnfaat mendorong pertumbuhan dan morfogenesis. Vitamin berfungsi sebagai katalisator, stimulator pertumbuhan dan meminimalkan stress eksplan dalam kultur (Wetherell, 1982). Vitamin dibutuhkan sel tanaman karena berperan dalam proses metabolism (George and Sherington, 1984).

Vitamin yang sering ditamabhkan dalam media kultur jaringan adalah Niasin, Glisin, Piridoksin HCl, tiamin HCl, Myo-inositol, Asam folat, Sianokobalamin, Riboflavin, Biotin, Kolin klorifa, Kalsium pantotenat, Piridoksin fosfat, Nikotinamida (Hendaryono dam Wijayani, 1994). Penambahan myo-inositol kedalam media bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertu buhan sejumlah jaringan. Penambahan myo-inositol bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Asam amino merupakan sumber nitrogen organik yang diperlukan untuk pertumbuhan eksplan. Asam amino yang sering digunakan adalah L-glutamin, asam aspartat, L-arginin, dan glisin (Yusnita, 2003). Setiap jenis asam amino memberikan pengaruh yang berbeda untuk setiap jenis kultur. Beberapa asam amino memang membuktikan mempunyai pengaruh positif terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan (George dan Sherrington, 1984).

2.6 Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa

organik bukan hara, dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tanaman. Beberapa golongan ZPT adalah auksin, giberelin, sitokinin, asam absisat dan etilen (Abidin, 1985). Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi sel eksplan. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan sangat terhambat, bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Setiap eksplan yang berasal dari organ dan spesies yang berbeda akan membutuhkan zat pengatur tumbuh yang berbeda pula (Narayanaswamy, 1994). Selain itu dijelaskan pula oleh Gunawan (1987) bahwa zat pengatur tumbuh mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan atau organ secara in vitro. Arah perkembangan kultur ditentukan oleh interaksi dan perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diproduksi oleh sel tanaman secara endogen. Walaupun pada eksplan terdapat zat pengatur tumbuh endogen tetapi sering kali pada medium ditambahkan zat pengatur tumbuh eksogen untuk pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditanam secara in vitro.

2.6.1 AuksinAuksin berfungsi merangsang perpanjangan sel-sel

pucuk. Auksin meningkatkan pemanjangan dan pembelahan sel serta pembentukan akar adventif (Pierik, 1997). Auksin

berpengaruh pula untuk menghambat pembentuka tunas aksilar dan tunas adventif, namun kehadirannya dalam media kultur dibutuhkan untuk meningkatkan embryogenesis somatic pada kuktur suspense sel. Kontraksi auksin yang rendah akan meningkatkan pembentukan akar adventif dan jika Kontraksi auksin tinggi akan merangsang pembentukan kalus dan menekan morfogenesis (Smith, 1992). Golongan auksin yang sering digunakan adalah 2,4-Dichloro fenoksiasetat, Indol Asam Asetat, Naftalen Asam Asetat, Indol Buterik Asetat.

2.6.2 GiberelinGiberelin berfungsi mendorong perkembangan biji,

perkembangan kucup, pemanjangan batang, petumbuhan daun, mendorong pembungaan, perkembangan buah, mempengaruhi pertumbuhan dan diferensiasi akar. Potensi giberelin untuk meningkatkan pertumbuhan pada tanaman lebih kuat dibandingkan dengan pengaruh yang ditimbulkan auksin apabila diberikan secara tunggal. Auksin dalam jumlah sedikit tetap dibutuhkan agar giberelin terlibat dalam proses regulasi perkembangan tumbuhan, memacu pembungaan dan mematahkan dormansi tunas dan biji (Dewi, 2008). Terdapat 37 macam senyawa yang tergolong giberelin dan yang paling popular adalah GA3 (Dwijoseputro, 1978).

2.6.3 SitokininPemberian sitokinin kedalam media kuljar penting untuk

menginduksi perkembangan dan pertumbuhan eksplan. Sitokinin dapat meningkatkan pembelahan sel, proliferasi dan morfogenesis pucuk (Smith, 1992). Golongan sitokinin yang sering digunakan adalah kinetin, zeatin, benzyladenin dan benzilaminopurin. Adenin digunakan untuk merangsang pembentukan tunas pada kultur meristem dan kultur pucuk

2.6.4 Etilen Etilem diproduksi oleh tanaman sebagai respons tehadap

kelebihan air dimana merupakan kondisi analog pada kultur in vitro. Kultur tanaman didalam wadah tertutup dapat meningkatkan akumulasi produksi etilen yang menghambat pertumbuhan akibag terjadinya vitrifikasi dan penuaan pada pucuk-pucuk muda (George and Sherington, 1984).

2.6.5 Asam absisatAsam absisat jarang digunakan dalam kultur jaringan,

namun memiliki aplikasi yang spesifik seperti merangsang perkembangan embrioid dan kalus (George and Sherington, 1984).

BAB III

METODOLOGI

3.1 AlatPeralatan yang digunakan antara lain erlenmeyer, kompor

listrik, neraca analit, spatula, pH meter, gelas ukur, dan gelas beker

3.2 BahanBahan yang digunakan antara lain makronutrien,

mikronutrien, zat besi, vitamin, sukrosa 30 g, dan agar 0,8%

3.3 Cara Kerja

Perlakuan praktikum pembuatan media kalus dilakukan dengan membuat larutan stock dan media padat berupa agar. Larutan stock dibuat dari 100 ml/l makronutrien, 10 ml/l mikronutrien, 10 ml/l zat besi, dan 10 ml vitamin yang dilarutkan dalam 1 liter aquades dalam gelas beker. Media padat terdiri dari 80 gram agar dan 8 gram sukrosa yang dilarutkan dalam 1 liter aquades kemudian dipanaskan hingga mendidih. Setelah itu dimasukkan larutan stock dan diaduk hingga homogen. Kemudian dituang kedalam beberapa botol kultur dengan volume sama setiap botolnya.

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Pembahasan

Pembuatan media MS diawali dengan membuat larutan stock yang membutuhkan komposisi makronutrient, mikronutrien, vitamin, iron, Myo-inositol, sukrosa, agar dan zat pengatur tumbuhan (ZPT). Larutan stock dibuat dengan memperbesar konsentrasi menjadi 10 kali lipat atau sesuai dengan kebutuhan. Larutan stock digunakan untuk membuat media yang dibutuhkan oleh eksplan. Pembuatan larutan stock dibutuhkan 100 ml/l makronutrien, 10 ml/l mikronutrien, 10 ml/l zat besi, dan 10 ml/l vitamin yang telah tersedia dalam erlenmeyer. Mulut erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan disimpan dalam lemari es agar komposisi dari larutan stock yang telah dibuat tidak rusak dan tidak terkontaminasi. Larutan stock yang terdiri dari makronutrient, mikronutrien, vitamin, dan besi dilarutkan jadi satu sesuai dengan kebutuhan satu liter media Aquades digunakan untuk melarutkan komposisi larutan stock.

Pembuatan agar dilkakukan dengan Agar ditimbang sebanyak 7 gram dan sukrosa sebanyak 30 gram kemudian dilarutkan dengan 1liter aquades dalam gelas bekker kemudian dipanaskan hingga homogen dan mendidih. Setelah itu diukur pH, tetapi ketika praktikum tidak dikur berapa besar pH pada medium. pH yang diharapkan yaitu 5.7 dengan menggunakan pH indikator. Jika pH terlalu tinggi diatas 5.7 ditambahkan HCl dan jika pH terlalu rendah dibawah 5.7 ditambahkan NaOH. Jika pH telah 5.7 maka medium dapat dituangkan kedala tabung atau botol kultur yang telah disterilisasi kemudian ditutup rapat. Setelah itu tabung atau botol kultur yang telah berisi medium dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 1210C dalam tekanan 2 atm selama 15 menit untuk disterilisasi.

Salah satu faktor paling penting yang berkaitan dengan pertumbuhan dan morfogenesis dari jaringan tanaman dalam adalah komposisi dari media kultur. Sumber hara yang dibutuhkan oleh sel-sel tanaman yang dikulturkan adalah sama dengan yang dibutuhan tanaman itu sendiri. Media dalam kultur jaringan tanaman umumnya terdiri dari komponen-komponen sebagai berikut: hara makro, hara mikro, vitamin, asam amino atau suplemen nitrogen lainnya, gula, bahan organik komplek, bahan pemadat (agar), dan zat pengatur tumbuh. Beberapa formulasi media sudah umum digunakan dalam banyak pekerjaan kultur jaringan dan sudah dikomersilkan.

Pembuatan media dapat dipermudah dan dipercepat dengan tersedianya unsur hara yang dibutuhkan tanaman dalam bentuk stock karena unsur hara telah dalam bentuk terlarut sesuai dengan kebutuhan. Larutan stock yang dibuat disimpan didalam lemari pendingin dengan suhu konstan. Hal ini bertujuan agar larutan tidak terkontaminasi. Larutan stok merupakan komposisi untuk membuat medium. Medium berfungsi sebagai tempat tumbuh eksplan dan memberi nutrisi eksplan selama pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Pembuatan larutan stock harus dalam kondisi steril. Peralatan dan bahan serta teknisi harus dalam kondisi steril. Larutan stok terdiri dari makronutrien, mikronutrien, vitamin, iron, myo-inositol, zat pengatur tumbuh, agar dan sukrosa dengan volume tertentu tiap senyawa.

Pembuatan media MS0 bertujuan sebagai media dasar untuk melihat keberhasilan pembuatan media, apakah media berhasil padat atau tidak dan melihat apakah terkena kontaminasi atau tidak. Selain itu ketika praktikum tidak ditambahkan ZPT sehingga disebut media MS0. Media Murashige & Skoog (MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat

pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Media Vacin ad Whitebiasanya digunakan untuk tanaman anggrek. Medium MS kandungan yang terkandung lebih lengkap daripada media yang lainnya sehingga media MS mum digunakan untuk hampir semua jenis kultur termasuk anggrek.

Chang (1998) dalam regenerasi tanaman dari kultur kalus Cymbidium ensifolium var. misericors mumbuhkannya pada medium dasar Murashie and Skoog dengan ½ macronutrients dan mikronutrient dengan suplemen (mg/l) myo-inositol (100), niacin (0.5), pyridoxine HCl (0.5), thiamine HCl (0.1), glycine (2.0), peptone (1000), NaH2PO4 (170), sucrose (20,000); and Gelrite (2200). Sedangkan Ferreira (2006) pada penelitiannya tentang Thidiazuron yang mempengaruhi totingkatan encdogen sitokini dan IAA selama pembungaan pada isolasi akar Dendrobium menggunakna media tumbuh Vacin and Went yang dimodifikasi dengna penambahan Fe2(C4H4O6)3 untuk FeEDTA dan disuplementasi dengan mikronutrien dari media MS, 0.22 mM TDZ, 2% sucrose, 0.4 mg/L thiamine, 100 mg/L myo-inositol and 0.2% Phytagel (maintenance medium).

Tabel 1. Komposisi Medium Vacin And Went

Tabel 2. Komposisi Medium Murashige

and Skoog

No. Komposisi

Macronutrients and Micronutrients

1. Ammonium nitrate (NH4NO3)

2. Boric acid (H3BO3)

3. Calcium chloride (CaCl2 · 2H2O)

4. Cobalt chloride (CoCl2 · 6H2O)

5. Magnesium sulfate (MgSO4 · 7H2O)

6. Cupric sulfate (CuSO4 · 5H2O)

7. Potassium phosphate (KH2PO4)

8. Ferrous sulfate (FeSO4 · 7H2O)

No. KOMPOSISI

1. Tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2)

2. Potassium nitrate (KNO3)

3. Monopotassium acid phosphate

4. Magnesium sulphate (MgSO4.7H2O)

5. Ammonium sulphate

6. Ferric tartrate (Fe)

7. Maganese sulphate (MnSO4.H2O)

8. Sucrose (C12H22O11)

9. Agar

10. Water

9. Potassium nitrate (KNO3)

10. Manganese sulfate (MnSO4 · 4H2O)

11. Potassium iodide (KI)

12. Sodium molybdate (Na2MoO4 · 2H2O)

13. Zinc sulfate (ZnSO4·7H2O)

14. Na2EDTA · 2H2O

Common organic additives

1. i-Inositol

2. Niacin

3. Pyridoxine · HCl

4. Thiamine · HCl

5. IAA

6. Kinetin

7. Glycine (recrystallized)

8. Edamine

9. Sucrose

10. Agar

4.1.1 MakronutrienMakronutrien merupakan senyawa-senyawa sumber

unsur makronutrien diperlukan dalam jumlah yang cukup besar.

Oleh karena itu sebaiknya dibuat dalam larutan stok tunggal. Selain itu anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama, kemungkinan hal tersebut akan mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan stok campuran. Biasanya larutan stok hara dibuat beberapa macam dengan konsentrasi 10 atau 20 kali lipat konsentrasi media dan diberi nama sebagai berikut: a) Larutan stok A untuk persenyawaan NH4NO3

b) Larutan stok B untuk persenyawaan KNO3

c) Larutan stok C untuk persenyawaan CaCl2.2H2Od) Larutan stok D untuk persenyawaan MgSO4.7H2Oe) Larutan stok E untuk persenyawaan KH2PO4

Makronutrien terdiri dari enam unsur utama yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel dan jaringan tanaman, yaitu: nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg) dan sulfur (S). MgSO4 menyediakan magnesium dan sulfur; NH4H2PO4, KH2PO4, atau NaH2PO4 menyediakan fosfor; CaCl2.2H2O atau Ca(NO3)2.4H2O menyediakan kalsium; dan KCl, KNO3, atau KH2PO4 menyediakan potasium. Klor disediakan oleh KCl dan/atau CaCl2.2H2O.

Konsentrasi optimum yang dibutuhkan untuk mencapai pertumbuhan maksimum bervariasi diantara jenis tanaman. Media kultur harus mengandung sedikitnya 25-60 mM nitrogen anorganik untuk pertumbuhan sel tanaman. Sel-sel tanaman mungkin dapat tumbuh pada sumber N dari nitrat saja, tetapi diketahui bahwa pertumbuhan yang lebih baik apabila mengandung nitrat dan amonium. Nitrat yang disediakan umumnya berkisar 25-40 mM, konsentrasi amonium berkisar antara 2-20 mM. Akan tetapi untuk beberapa spesies tanaman konsentrasi amonium > 8 mM akan menghambat pertumbuhan sel. Sel-sel dapat tumbuh dalam media kultur yang hanya mengandung amonium sebagai sumber nitrogen jika satu atau lebih terdapat asam-asam yang terlibat dalam siklus TCA (seperti sitrat, suksinat, atau malat) juga terdapat dalam media pada konsentrasi sekitar 10 mM. Apabila nitrat dan amonium sebagai sumber nitrogen digunakan bersama dalam media maka ion-ion

amonium akan digunakan lebih cepat dibandingkan dengan ion-ion nitrat.

Nitrogen termasuk unsur pokok yang dibutuhkan dalam jumlah yang sangat besar. Nitrogen penting dalam pembentukan asam amino dan protein sehingga besar perananya dalam pertumbuhan dan perkembangan kultur. Jika kekurangan nitrogen tanaman menjadi kerdil dan daun menjadi kuning dimulai dari ujung daun dan menyebar sepanjang tulang daun hingga akhitnya mati. Ini menunujukkan bahwa unsur N mempunyai mobilitas tinggi, dimana proretein nitrogen daun bagian bawah dikonversi ke bentuk yang larut untuk dikirimkan ke bagian meristematis dan digunakan lagi dalam sintesa protoplasma yang baru. Tambahan kalsium pada media sering meningkatkan penyerapan ammonium oleh sel-sel. Fosfor bagi tanaman berperan sebagai penyimpan dan pemindahan tenaga. Tenaga yang diperoleh dari fotosintesis dan metabolisme karbohidrat disimpan dalam senyawa fosfor untuk kemudian digunakan dalam proses pertumbuhan dan reproduksi. Persediaan fosfor yang cukup akan meningkatkan pertumbuhan akar. Peningkatan konsentrasi fosfor pada media dasar MS terkaang meningkatkan pertumbuhan dan terbentuknya tunas. Unsur kalium berperan penting dalam mengatur tekanan osmotic yang berhubungan dengan pross metabolisme dan fotosintesis. Konsentrai kalium tertinggi terdapat dalam daun yang termuda dan tunas. Kekurangan kalium menyebabkan akumulasi poliamin (Bonga, 1992).

4.1.2 MikronutrienMikronutrien sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan

media. Biasanya larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 100 atau 200 kali konsentrasi media dan bahan yang diperlukan masih cukup kecil jumlahnya. Oleh karena itu larutan stok unsur hara mikro dapat dibuat sebagai stok campuran. Stok campuran ini disebut stok F yang terdiri dari:a) MnS04.4H2Ob) ZnSO4.7H2O

c) H3BO3

d) KIe) Na2MoO4.2H2Of) CoCl2.6H2Og) CuSO4.5H2O

Mikronutrien yang paling dibutuhkan untuk petumbuhan sel dan jaringan tanaman mencakup besi (Fe), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B), terusi (Cu) dan molibdenum (Mo). Besi adalah yang paling kritis diantara semua hara mikro. Besi sitrat dan tartrat dapat digunakan untuk media kultur, tetapi senyawa ini sulit untuk larut dan biasanya akan terpresipitasi setelah media dibuat. Oleh karena itu dapat digantikan dengan menggunakan asam etilen diamintetraasetik (EDTA). Kobal (Co) dan iodin (I) juga dapat ditambahkan dalam media tetapi kebutuhan yang jelas untuk pertumbuhan sel belum diketahui. Natrium (Na) dan klorida (Cl) juga digunakan pada beberapa media tetapi tidak begitu penting untuk pertumbuhan sel.

4.1.3 Vitamin dan Myo-inositolVitamin dan zat pengatur tumbuh merupakan bahan-

bahan kimia organik yang umumnya peka terhadap suhu dan cahaya tinggi. Selain itu zat organik dalam bentuk larutan mudah mengalami perubahan, sehingga tidak awet disimpan. Oleh karena itu larutan stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, harus disimpan dalam lemari es dan sebaiknya dalam membuatnya tidak perlu berlebihan agar cepat habis terpakai. Komponen larutan stok vitamin terdiri dari:a) Thiamine-HClb) Nicotinic acidc) Pyridoxine-HCld) Glycine

Vitamin disintesis pada tanaman untuk kebutuhan pertumbuhan dan perkembangannya. Vitamin dibutuhkan oleh tanaman sebagai katalis dari berbagai macam proses metabolik. Pada saat sel dan jaringan ditumbuhkan secara in vitro, beberapa

vitamin mungkin menjadi faktor pembatas untuk pertumbuhan sel. Vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan adalah thiamin (B1), asam nikotinat, piridoksin (B6), dan mio-inositol. Umumnya hampir semua sel tanaman memerlukan thiamin untuk pertumbuhannya. Konsentrasi thiamin yang digunakan dalam media biasanya berkisar antara 0.1-10 mg/L. Asam nikotinat dan piridoksin termasuk vitamin yang sering digunakan dalam media kultur tetapi untuk beberapa spesies tanaman bukan merupakan komponen yang esensial untuk pertumbuhan selnya. Asam nikotinat umumnya digunakan pada konsentrasi 0.1-5 mg/, sedangkan piridoksin antara 0.1-10 mg/L.

Pada beberapa media kultur juga sering ditambahkan vitamin-vitamin seperti biotin, asam folat, asam askorbat, asam panthotenat, vitamin E (tokoperol), riboflavin, dan asam p-aminobenzoik. Meskipun vitamin-vitamin tersebut bukan merupakan faktor pembatas pertumbuhan, tetapi sering memberikan keberhasilan dalam kultur sel dan jaringan tanaman. Biasanya penambahan vitamin-vitamin tersebut ke dalam media dilakukan apabila konsentrasi thiamin dianggap dibawah taraf yang diinginkan atau apabila jumlah populasi sel-sel yang tumbuh masih rendah. Myo-inositol termasuk dalam karbohidrat, Meskipun tidak terlalu esensial, mio-inositol berfungsi untuk menstimulir pertumbuhan sel pada banyak spesies tanaman. Myo-inositol akan terurai menjadi asam askorbat dan pektin yang kemudian akan menjadi fosfoinositida dan fosfatidilinositol, yang berperan dalan pembelahan sel. Mio-inositol umumnya digunakan dalam media kultur jaringan pada konsentrasi 50-5000 mg/L

4.1.4 Zat Pengatur TumbuhZat pengatur tumbuh umumnya dibutuhkan dalam jumlah

yang sedikit. Zat pengatur tumbuh dilarutkan dengan HCl atau NaOH berdasarkan dengan sifat yang dimiliknya. Ketika praktikum tidak ditambahkan ZPT, oleh karena itu disebut media MS0. ZPT merupakan senyawa organik dalam jumlah sedikit yang dapat mendukung atau menghambat proses fisiologis tanaman.

ZPT dalam tanaman terdiri dari lima kelompok, yaitu auksin, giberelin, sitokinin, etilen dan inhibitor (Hendaryono, 1994).

Pemberian auksin dengan kadar relative tinggi, difrensiasi kalus cenderung kea rah pembentukan primordial akar. Sedangkan pemberian sitoknin dengan kadar yang relative tinggi, diferensiasi kalus akan cenderung kea rah pmbentukan primordial batang atau tunas (Hendaryono, 1994).

4.1.5. Bahan Pemadat Bahan pemadat pada media kultur menggunakan agar

yang mengandung karbohidrat yang berfungsi sebagai nutrisi bagi eksplan. Menurut Hendaryono (2000), pemberian agar yang ideal adalah 8 g/liter. Ketika praktikum menggunakan agar sebsesar 8 g/liter, Keuntungan dari agar, yaitu:a. saat dicampur dengan air, agar akan terbentuk bila dilelehkan

pada suhu 60o-100oC dan memadat pada suhu 45oC; b. gel agar bersifat stabil pada suhu inkubasi; c. agar gel tidak bereaksi dengan komponen dalam media dan

tidak dicerna oleh enzim tanaman.Kualitas fisik agar dalam media kultur tergantung pada

konsentrasi dan merek agar yang diguinakan serta pH media. Konsentrasi agar yang digunakan dalam media kultur berkisar antara 0.5-1%, dengan catatan pH media 5.7. Kemurnian agar yang digunakan dalam media kultur juga merupakan faktor yang penting. Agar yang mengandung garam-garam Ca, Mg, K dan Na dapat mempengaruhi ketersediaan unsur hara dalam media. Oleh karena itu penggunaan agar yang murni sangat diperlukan terutama untuk tujuan percobaan. Untuk memurnikan agar dapat dilakukan dengan cara mencuci dengan air destilasi bening yang cocok untuk mendeteksi ada tidaknya kontaminan. Media yang digunakan dalam kultur anggrek adalah media padat maka diperlukan agar sebagai bahan pemadat. Menghindari supaya tidak terjadi perubahan pH yang cukup besar, agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar dan memanaskan beberapa menit media dalam autoklaf. Sel-sel tanaman membutuhkan pH

yamg sedikit asam. Oleh karena itu, derajat keasaman diatur sekitar 5.7 sehingga tidak mempengaruhi fungsi membran sel dan pH sitoplasma tanaman. Pengaturan pH dilakukan menggunakan NaOH jika terlalu asam karena NaOH bersifat basa kuat dan jika terlalu basa maka menggunakan HCl karena HCl bersifat asam kuat.

4.2.2.7 SukrosaSukrosa merupakan bentuk karbohidrat yang menjadi

sumber nutrisi utama dalam proses fisiologis tanaman. Karbohidrat yang merupakan sumber karbon berupa gula dalam bentuk sukrosa sangatlah perlu digunakan. Selain sukrosa sumber karbon yang lain adalah glukosa. Konsentrasi sukrosa yang digunakan tergantung pada tipe dan usia eksplan. Sukrosa yamg digunakan sebesar 30 g/liter.

DAFTAR PUSTAKA

Chang, C. Chang · W. C. 1998. Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var. misericors. Springer-Verlag

Dewi, Ratna I.A. 2008. Peranan dan Fungsi Fitohormon bagi Pertumbuhan Tanaman. Universitas Padjajaran Press. Bandung

Dixon, R.A. 1985. Plant cell Culture: A PracticL Approach. IRL Press Limited. England.

Ferreira, Wagner de Melo,. et al. 2006. Thidiazuron influences the endogenous levels of cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium. Universidade Federal do Tocantins, Nu`cleo de Estudos Ambientais (NEAMB), Caixa Postal 111, 77500-000 Porto. Nacional, Tocantins, Brazil

George, E.F and P.D Sherington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture hand Book and Directory of Comercial Laboratorius. Exegenetics Ltd. England.

Gunawan, L.W. 2000. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman. PAU Bioteknologi IPB. Bogor

Hendaryono, S.P.D dan Wijaya Ari. 1994. Teknik Kultur Jaringan, Kanisius. Yogyakarta

Pierik, R.L.M. 1971. Plant Tissue Culture as Motivation for The Symposium dalam J.v. Bragt et al (eds.). Effect if Sterilisation on Components in Nutrient Media. Wageningen: Vennam and Zonen

Smith, E.F, 1992. Plant tissue Culture: Techniques and experiment. Academic Press Inc. New York.

Soeryowinoto, 1991. Budidaya Jaringan Terobosan Bermanfaat dalam Bioteknologi. Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Waluyo, Lud. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. UPT Penerbitan Universitas Muhammadiyah Malang.

Winata, I988 , Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan. PAU Bioteknologi IPB.

Wetherell DF. 1982. Pengantar Propagasi Tanaman Secara in Vitro. Penerjemah: Koensumardiyah. New Jersey: Avery Plublishing Group Inc

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan: Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Agro Media Pustaka. Jakarta.

Zulkarnain. 2009. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara. Jakarta.

LAMPIRAN

1. Penimbangan sukrosa sebanyak 8 gran untuk membuat media

dengan agar sebanyak 30 gram dalam 1 liter

2. Pembuatan larutan stock

3. Larutan stock dan pemadat dicampu dalam 1 liter aquades

4. Penuangan media MS dalam botol kultur

Tabel 3. Komposisi Medium Murashige and Skoog

Medim Murashige and SkoogNo Bahan Kimia Untuk 1

Liter Medium

Stock Volume Stock

Untuk 1 Liter

MediumI MACRO

NUTRIENTAmbil 100 ml stock

NH4NO3 1650 16500KNO3 1900 19000MgSO4.7H2O 370 3700KH2PO4 170 1700CaCl2.2H2O 440 4400

II MICRO NUTRIENT

Ambil 10 ml stock

MnSO4.4H2O 22.3 2230ZnSO4.7H2O 8.6 860H3BO3 6.2 620KI 0.83 83Na2MoO4.2H2O 0.25 25

CuSO4.5H2O 0.025 2.5CoCl2.6H2O 0.025 2.5

III IRON Ambil 10 ml stockNa2-EDTA 74.5 1492

FeSO4.7H2O 55.7 1114IV VITAMIN Ambil 10

ml stockGlycine 2 100Nicotinic Acid 0.5 25Pyridoxin-HCl 0.5 25Thiamine-Cl 0.1 5

V Agar 8 g/lVI Sukrosa 30 g/l