LAPORAN PRAKTIKUM III

ANALISIS MAKANAN

“Identifikasi dan Penetapan Kadar Senyawa Nitrat dan Nitrit dalam Makanan

Sosis”

Disusun oleh:

Regina Sheilla Andinia (118114058)

Fransisca Andriani (118114059)

Hilarius Adi Evaldo (118114060)

I Putu Abhiseka Pranajaya (118114064)

LABORATORIUM ANALISIS INSTRUMENTAL

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2013

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Seiring berkembangnya jaman, banyak berbagai macam makanan

yang berkembang n beredar di masyarakat. Banyak produk yang ditawarkan

oleh produsen terkait dengan pemenuhan gizi, makanan cepat saji, dll. Salah

satu makanan yang berkembang pesat saat ini adalah sosis. Sosis merupakan

salah satu produk olahan daging yang sangat populer serta digemari oleh

berbagai kalangan, hal ini disebabkan karena sosis memiliki rasa yang enak,

harga yang relatif murah dan dapat diproduksi dalam berbagai bentuk yang

menarik serta memiliki daya simpan yang baik. Karena memiiki daya simpan

yang baik, sosis sering dipertanyakan apakah menggunakan bahan kimia

sebagai pengawet dalam proses pembuatannya. Faktor yang mendorong

untuk digunakannya bahan tambahan pangan, antara lain supaya

meningkatkan kualitas daya simpan, mempermudah dalam preparasinya,

dan mempertahankan nilai gizi. Pengawet yang paling umum digunakan pada

produk-produk daging olahan yaitu senyawa nitrat dan senyawa

nitrit(Cahyadi, 2008).

Nitrat nitrit telah lama digunakan dalam produk-produk daging dan

dimanfaatkan sebagai komponen senyawa curing, pengawet, antimikroba

dan sebagai bahan pembentuk faktor-faktor sendiri, misalnya warna, rasa

dan aroma. Kombinasi dari penggunaan senyawa nitrat dan senyawa nitrit

sebagai pengawet dalam makanan dapat meningkatkan daya tahan makanan

karena peningkatan efek antimikrobanya, nitrat nitrit dalam bentuk garam

banyak digunakan untuk memperoleh warna merah yang seragam pada

produk daging yang diawetkan. Menurut Badan Pengawas Obat dan

Makanan (BPOM), penggunaan nitrat nitrit di Indonesia diatur dalam

Permenkes RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/88 tentang bahan tambahan

makanan yang mengizinkan penggunaan nitrat nitrit dalam produk olahan

dengan batas maksimum nitrat 500 mg/kg per kg bahan, nitrit batas

maksimum 125 mg/ kg bahan.

Dalam proses pengawetan, nitrit akan membentuk nitrit oksida yang

akan bereaksi dengan pigmen mioglobin membentuk nitromioglobin yang

berwarna merah muda. Secara umum, nitrit lebih beracun daripada nitrat.

Nitrit dapat bereaksi dengan amina dan amida membentuk senyawa N-

nitroso yang kebanyakan bersifat karsinogenik (dapat menyebabkan kanker).

Tidak seperti nitrit, nitrat tidak bereaksi dengan cara yang sama, namun

nitrat yang terkandung dalam pangan dapat direduksi menjadi nitrit dengan

bantuan bakteri Penitrifikasi. Melihat pemaparan di atas, maka diperlukan

pengawasan dan analisis kuantitatif terhadap pengawet nitrat nitrit secara

rutin. Apabila pemakaian bahan pasangan dan dosisnya tidak diatur dan

diawasi, kemungkinan besar akan menimbulkan kerugian bagi pemakainya,

baik yang bersifat langsung,misalnya keracunan, maupun yang bersifat tidak

angsung atau kumulatif, misanya karsinogenik. Di Indonesia, regulasi hukum

yang mengatur mengenai penggunaan senyawa nitrat dan nitrit sebagai

pengawet diatur dalam Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor

722/Menkes/Per/IX/1988.

Dalam beberapa literatur, penetapan kadar nitrat nitrit dapat

dilakukan antara lain dengan metodeGriess dan metode Xylenol

(Cahyadi,2008). Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah Metode

Griess. Metode ini dipilih karena kadar nitrit dan nitrat yang digunakan dalam

jumlah yang kecil (dalam satuan ppm). Metode yang digunakan untuk

anlaisis kadar nitrit harus mempunyai sensitifitas yang tinggi untuk dapat

menetapkan kadar secara akurat. Maka metode kolorimetri yang banyak

digunakan menggunakan alat spektrofotometer visible karena intensitas

warna hasil reaksi dapat ditangkap pada daerah tampak yaitu pada panjang

gelombang antara 400nm – 800nm.Pemilihan metode ini dipertimbangkan

juga daari ketersediaan bahan-bahan di laboratorium. Parameter validasi

yang akan dilakukan dalam praktikum ini adalah akurasi, presisi, batas

deteksi, batas kuantifikasi.

B. RumusanMasalah

a. Berapa kadar senyawa nitrat maupun nitrit yang terkandung dalam

Sosis merk. Y?

b. Apakah kandungan senyawa nitrat maupun nitrit yang terkandung

dalam Sosis merk. Y telah memenuhi persyaratan yang berlaku?

C. Tujuan

a. Mengetahui kadar nitrat serta nitrit yang terkandung dalam Sosis

merk. Y.

b. Mengetahui apakah kadar nitrat serta nitrit dalam Sosis merk Y telah

memenuhi persyaratan yang berlaku.

D. Manfaat

Manfaat teoritis : Manfaat teoritis praktikum ini adalah memahami

langkah-langkah serta mampu menganalisis senyawa nitrat-nitrit dalam sediaan

makanan sosis merk Y serta mengetahui kadar yang terdapat dalam makanan

tersebut.

Manfaat praktis : manfaat praktis pada praktikum ini adalah sebagai

informasi untuk food safety tentang kadar nitrit-nitrat sebagai pengawet dalam

produk sosis yang beredar di masyarakat masih berada dlaam batas aman untuk

dikonsumsi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Sosis

Sosis merupakan produk makanan yang diperoleh dari campuran daging

halus (mengandung daging tidak kurang dari 75%) dengan tepung atau pati dengan

atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan tambahan makanan lain yang

diizinkan dan dimasukkan ke dalam selubung sosis. Sosis memiliki berbagai macam

kandungan di dalamnya, antaralain air, protein, abu, lemak, karbohidrat. Masing –

masing kandungannya memiliki ketentuan dalam jumlah penggunaanya.

Ketentuannya adalah sebagai berikut :

Tabel 1. Syarat mutu sosis berdasarkan SNI 01-3020-1995

Nutrisi Jumlah (%)

Air Maks 67,0

Protein Min 13,0

Abu Maks 3,0

Lemak Maks 25

Karbohidrat Maks 8

(Dewan Standar Nasional, 1995).

B. Proses Pembuatan Sosis

Tahapan yang pertamadilakukanpada pembuatan sosis yaitu berawal

dengna pemilihan daging, kemudian dihaluskan secara hati-hati. Bahan

tambahan yang khusus digunakan adalah sodium nitrit atau sodium nitra,

tujuannya adalah untuk mempertahankan warna daging. Selain itu,

ditambahkan pula glukosa, sukrosa, merica, bawangputih, ketumbar. Setelah

dicampur rata maka dimasukkan ke dalam selubung sosis diasap diruang

asap selama 12-16 jam (Purnomo, 2009).

Adonan sosis dimasukkan ke dalam selubung (casing) dengan

menggunakan alat khusus dengan tujuan membentuk dan mempertahankan

kestabilan (Karmlich, 1971) dan mengurangi terbentuknya kantong-kantong

udara (Henrickson, 1978). Pemanasan bertujuan untuk menyatukan

komponen utama adonan sosis, inaktivasi mikroorganisme dan

meningkatkan atau menurunkan keempukan tergantung tempertur serta

jenis daging (Lawrie, 1991).

C. Clostridium botulinum

Clostridium botulinum termasuk mikroorganisme/ bakteri gram positif

berbentuk panjang, besar, dan membentuk spora serta tidak dapat tumbuh

apabila terdapat oksigen.Mikroorganisme ini bersifat pathogen. Spora

Clostridium botulinum kebal dalam proses kontrol makanan. Mikroorganisme

ini tetap dapat berkembang dalam makanan, dan dapat tumbuh hanya

beberapa millimeter saja di bawah permukaan makanan di mana kondisi

anaerobic terpenuhi, sekalipun makanan tersebut berhubungan langsung

dengan udara. Clostridium botulinum dapat memproduksi Botulinal

neurotoxins (BoNT).

Penyakit yang disebabkan oleh Clostridium botulinum sangat

berbahaya. Gejala keracunan muncul diantara 12 – 36 jam setelah

pengkonsumsian makanan yang terkontaminasi. Gejalanya adalah mual,

muntah, diare, gangguan pada mata, mulut, tenggorokan dan otot (World

Health Organization, 2010).

D. Sifat fisika dan kimia bahan yang digunakan

a. Asam sulfanilat

Bentuk : padat

Berat molekul : 97.10 g/mol

pH : 1.18 (250C)

Titikleleh : 205 0C

Kelarutan : 6,5 bagian di air 00C, 2 bagian di air 800C.Mudah larut

dalam larutan amoniak

(Merck &Co,1989)

b. α-naftalamin

Bentuk : serbuk kristal

Bau : menyerupai amonia

Berat molekul : 143.18 g/mol

pH : 7.1

Titik didih : 301 0C

Titik leleh : 48-50 0C

Kelarutan : Larut dalam 590 bagian air, sangat larut dalam eter

alcohol

Efek toksik : 65 mg/L

(Merck &Co,1989)

c. Air

Bentuk : cairan

Bau : tidak berbau

Warna : tidak berwarna

Berat molekul : 18.02 g/mol

pH : 7

Titik didih : 100 0C

(Merck &Co,1989)

d. HgCl2

Bentuk : padat, kristal

Bau : tidak berbau

Warna : putih

Berat molekul : 271,5 g / mol

Titik didih : 302 ° C (575,6 ° F)

Titik leleh : 276 ° C (528,8 ° F)

Kelarutan : Mudah larut dalam air dingin, air panas. Larut dalam

metanol, dietil eter.

(Merck &Co,1989)

e. NaCl

Bentuk : padatan, bubuk kristal

Warna : putih

Berat molekul : 58.44 g / mol

pH : 7

Titik didih : 1413 ° C (2575,4 ° F)

Titik leleh : 801 ° C (1473,8 ° F)

Kelarutan : Mudah larut dalam air dingin, air panas. Larut dalam

gliserol, dan amonia. Sangat sedikit larut dalam

alkohol. larut dalam asamklorida

(Merck &Co,1989)

f. Asamasetat

Bentuk : cair

Warna : tidak berwarna

Berat molekul : 60.05 g / mol

pH : 2

Titikdidih : 118,1 ° C (244,6 ° F)

Titik leleh : 16,6 ° C (61,9 ° F)

Kelarutan : Mudah larut dalam air dingin, air panas. Larut

dalamdietil eter, aseton. Larut dengan Gliserol,

alkohol, benzena, Karbon Tetraklorida. Praktis tidak

larut dalam karbon disulfida.

(Merck &Co,1989)

g. HgNO3

Bentuk : padat ,kristal

Warna : putih

Bau : tidak berbau

Berat molekul : 169,87 g / mol

pH : 6-7

Titik didih : 440 ° C (824 ° F)

Titik leleh : 212 ° C (413,6 ° F)

Kelarutan : Mudah larut dalam air dingin, air panas. Larut dalam

dietil eter. Sangat sedikit larut dalam aseton. Kelarutan

dalam air: 122 g/100ml air

(Merck &Co,1989)

h. Sodium Nitrat

Bentuk : serbuk

Warna : tidak berwarna, jernih

Bau : tidak berbau

Rumus Kimia : NaNO3

Kelarutan : Mudah larut dalam air, sedikit larut dalam etanol

Titik lebur : 308oC

Bobot Molekul : 84,99 g/mol

Berat Jenis : 2,26

Inkompaktibilitas : Sangat reaktif dengan bahan yang mudah terbakar,

bahan organik. Reaktif dengan agen pereduksi dan

asam

(Merck &Co,1989)

i. Sodium Nitrit

Bentuk : serbuk

Warna : putih atau kekuningan

Bau : tidak berbau

Rumus kimia : NaNO2

Kelarutan : Sangat larut dalam air, larut dalam etanol, sedikit

larut dalam dietil eter.

Titik didih : 320oC

Titik lebur : 271oC

Bobot Molekul : 69 g/mol

Berat Jenis : 2,2

Inkompaktibilitas : Sangat reaktif dengan bahan yang mudah terbaka

bahan organik. Reaktif dengan agen pereduksi

logam,dan asam. Sedikit reaktif dengan keadaan

lembab.

(Merck &Co,1989)

Nitrit dapat bersifat sebagai substansi pereduksi maupun oksidasi.

Ion nitrit memiliki sifat sangat reaktif terhadap zat organik dan labil

terhadap panas. Nitrit dapat dioksidasi menjadi nitrat, sebaliknya nitrit

dapat mengoksidasi iodida menjadi iodium (Furia, 1983). Dalam suasana

asam, ion nitrit ada dalam kesetimbangan dengan molekul asam nitrit

sesuai dengan:

Gambar 1. Reaksi keseimbangan antara ion nitrit dengan molekul asam

nitrit

Banyaknya asam nitrit tergantung pada pH larutan, semakin

rendah pHnya maka semakin besar asam nitritnya karena pKa nya 3,4

maka dalam daging biasanya mempunyai pH ± 5,5 – 6,0 hanya sedikit dari

nitrit yang ditambahkan ada dalam bentuk asam nitrit (Furia, 1983).

Warna merah pada kebanyakan produk daging disebabkan akibat

reaksi ion-ion nitrit mengoksidasi zat warna mioglobin yang

menghasilkan senyawa metmioglobin yang bewarna coklat abu-abu.

Dengan adanya zat pereduksi didaging maka nitrit direduksi menjadi

nitrogen monoksida menghasilkan senyawa nitroso metmioglobin yang

bewarna coklat, nitroso metmioglobin selanjutnya direduksi oleh zat-zat

pereduksi dalam daging menjadi nitrosomioglobin (mudah terjadi pada

pH rendah), yang setelah perubahan oleh panas dan garam membentuk

nitroso hemochromogen yang mempunyai warna merah muda relatif

stabil.

Gambar 1. Reaksi pembentukan warna merah pada daging

Menurut Food Additives and Contaminant Committee perlu dilakukan

penurunan total maksimum nitrit dan nitrat pada daging dan keju. Hal ini

dikarenakan pemakaian nitrit dengan dosis tinggi menyebabkan kanker pada

sistem hewan percobaan (tikus). Pada kondisi tertentu akan terjadi reaksi antar

nitrit dan beberapa amin secara alami kepadatan dalam bahan pangan sehingga

membentuk senyawa nitrosamine yang dikenal sebagai senyawa karsinogenik.

Nitrosamine menimbulkan tumor pada bermacam-macam organ.Reaksi

pembentukan nitrosamine dalam pengolahan atau dalam perut yang bersuasana

asam:

R2NH + N2O3 R2N.NO + HNO2

(amin sekunder)

R3N + N2O3 R2N.NO + RNO2

Nitrosoamina (karsinogenik)

Gambar 2. Reaksi pembentukan nitrosamine

E. Metode Gries

Metode Griess merupakan salah satu metode colorimetry yang digunakan untuk

menetapkan kadar nitrit dengan reaksi diazotasi yang menghasilkan senyawa azo

atau senyawa yang berwarna, sering juga disebut metode pengkoplingan. Dalam

medium asam, nitrit bereaksi dengan amin aromatis menjadi bentuk garam

diazonium. Garam diazonium ini akan dikopling dengan cinicin aromatis lain yang

mengandung gugus –NH2atau–OH, untuk membentuk zat warna azo sebagai basis

darei metode spektrofotometri

Reaksi nitrit, asam sulfanilat, dan 1-naftilamin dalam metode Griess :

Asam sulfanilat asam nitrit ion diazonium

Ion diazonium 1-naftilamin senyawa azo (ungu)

Gambar 3. Reaksi pembentukan garam diazonium dan senyawa azo

(Marczenko, 2000)

Senyawa azo yang terbentuk memiliki λ max= 520 nm dengan absorpsivitas

spesifik 4,0.10-4 Panjang gelombang 520 masuk dalam range panjang gelombang

500-560 yang akan memberikan warna hijau dengan warna komplementer ungu

kebiruan. LOD metode Griess secara teoretis untuk nitrit harus pada level

koncentrasi 10-6 M - 10-7M (Trojanowicz, 2008). Jadi, warna ungu yang dihasilkan

senyawa azo dari reaksi diazotasi nitrit dengan pereaksi Griess dapat terukur

dengan spektrofotometer-Vis dengan λ max= 520 nm.

Pengukuran nitrat dan nitrit dengan metode ini digolongkan menjadi dua

klasifikasi analisis yaitu:

1. Range besar (0-4.5 mg NO3- N/L)

2. Range kecil (0-0.4 mg NO3- N/L)

(Zhang, 2007).

Metode Griess memiliki sensitivitas yang tinggi dan cukup spesifik hanya dengan

presisi yang baik. Namun metode ini memiliki kekurangan yaitu nitrat dengan reaksi

ini terlebih dahulu membutuhkan reduksi kimia atau enzimatik untuk mengubah

nitrat menjadi nitrit sebelum reaksi diazotasi.

F. Kolom Cadmium

Granul cadmium diperlukan dalam metode analisis ini untuk mereduksi nitrat

menjadi nitrit. Granul cadmium yang digunakan harus dalam ukuran 0,5-2mm.

Kolom cadmium berupa kolom gelas dengan lapisan-lapisan tembaga yang

berdiameter 3-5mm dan panjang 10-20cm, dapat dipanaskan dan dibengkokkan

menjadi bentuk U. Lapisan tembaga yang digunakan untuk melapisi granul adalah

CuSO4 [Tembaga(II) Sulfat]. Kolom cadmium harus dibilas menggunakan asam,

misalnya HCl atau H2SO4 untung menghilangkan senyawa yang mungkin dapat

mengoksidasi dan selanjutnya dicuci dengan aquabidest. Kolom admium harus

diperiksa dan dicek dengan pH meter untuk melihat pembilasan telah berjalan

sempurna dan bersifat netral (Elsevier, 2001).

Mekanisme reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit oleh cadmium dengan

etilediamin-tetraacetic acid adalah :

(Zhang, 2007)

Mekanisme reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit oleh cadmium dengan sulfanilat

adalah :

(Zhang, 2007)

G. Spektofotmeter UV-VIS

Prinsip spektroskopi didasarkan adanya interaksi dari energi radiasi

elektromagnetik dengan zat kimia. Dalam analisis kimia peristiwa absorbs

merupakan dasar dari cara spektroskopi karena proses absorbs bersifat unik/spesifik

untuk setiap zat kimia. Disamping itu banyaknya absorbs berbanding lurus dengan

banyaknya zat kimia (Sudarmaji, dkk, 1989).

Spektrum tampak terentang dri sekitar 400 nm (ungu) sampai 750 nm (merah),

sedangkan spectrum ultraviolet (UV) terentang dari 100 sampai 400 nm. Baik radiasi

UV maupun radiasi cahaya tampak berenergi l lebih tinggi dari pada radiasi

inframerah. Absorbsi cahaya UV atau cahaya tampak mengakibatkan transisi

elektronik, yaittu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar berenergi

rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi (Fessenden dan

Fessenden, 1975).

Panjang geombang cahaya UV ataua cahaya tampak bergantung pada

mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak

energi untuk promosi electron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih

pendek. Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada

panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam

daerah tampak mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan daripada

senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang lebih pendek (Fessenden

dan Fessenden, 1975).

Interaksi radiasi elektromagnetik dengan bahan yaitu bila cahaya jatuh pada

senyawa maka sebagian dari cahaya di serap oleh molekul-molekul sesuai dengan

struktur dari molekul. Setiap senyawa mempunyai tingkatan tenaga yang spesifik

(Sudarmaji, dkk, 1989).

H. Regulasi yang berlaku di Indonesia

Pengujian toksisitas jangka pendek terhadap suatu bahan biasanya dilakukan

dengan tiga macam percobaan pada hewan. Pertama, penentuan LD50 yaitu dosis

suatu bahan saat 50% hewan percobaan mati, dan hal ini memberikan indikasi

toksisitas relatif senyawa yang diuji. Kedua, penentuan dosis maksimum yang dapat

ditolerir, yaitu dosis harian maksimum saat hewan percobaan dapat bertahan hidup

untuk periode 21 hari, di mana tujuan pengujian ini adalah untuk menunjukkan

bahan organ yang diperiksa memperlihatkan adanya efek keracunan. Ketiga,

pengujian pemberian pakan selama 90 hari, di mana setelah 90 hari percobaan

maka dapat diketahui gejala tidak normal pada hewan percobaan sehubungan

dengan pakan yang diberikan. Hasil ketiga, pengujian tersebut dapat menunjukkan

atau menetapkan dosis “tidak ada efek” dan dari data percobaan pada hewan dapat

di tentukan ADI (Acceptable Daily Intake) (Cahyadi,2008).

Tujuan utama dari pengujian jangka panjang terhadap bahan tambahan

makanan adalah untuk menentukan potensi karsinogenik suatu bahan atau

senyawa, tetapi harus didukung pula dengan pengujian jangka pendek

(Cahyadi,2008).

Bahan Pengawet Fungsi dalam Bahan

Pangan (mg/kg Berat

Badan)

ADI

Natrium nitrit Antimikroba, pelindung

warna

0-0,2

Sulfur dioksida Antimikroba 0-0,5

Sumber : FAO/WHO, 1974

Tabel 3. Beberapa Bahan Pengawet yang Diizinkan Pemakaiannya dari Nilai ADI

Menurut Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/1988 tentang

bahan tambahan pangan. Bahan tambahan pangan yang diproduksi, diimpor, atau

diedarkan harus memenuhi persyaratan yang tercantum pada Kodeks Pangan Indonesia

tentang bahan tambahan pangan atau persyaratan lain yang ditetapkan menteri kesehatan.

No. Nama BTP JenisBahanPangan Batas MaksimumPenggunaan

1. Kalium nitrat Daging olahan;

daging awetan

500 mg/kg, tunggal/ campuran

dengan Na-nitrat dihitung sebagai

Na-nitrat

Keju 50 mg/kg tunggal/ campuran

dengan Na-nitrat

2. Kalium nitrit Daging olahan;

daging awetan

125 mg/kg, tunggal/campuran

dengan Na-nitrit

Korned kalengan 50 mg/kg, tunggal/campuran

dengan Na-nitirit, dihitung

sebagai Na-nitrit

3. Natrium nitrat Daging olahan ;

daging awetan

500 mg/kg, tunggal/ campuran

dengan K-nitrat

Keju 50 mg/kg tunggal/ campuran

dengan K-nitrat

4. Natrium nitrit Daging olahan;

daging awetan

125 mg/kg, tunggal/campuran

dengan K-nitrit

Korned kalengan 50 mg/kg, tunggal/campuran

dengan K-nitirit

Tabel 4. Daftar Bahan Pengawet Anorganik yang Diizinkan Pemakaiannya dan

Dosis Maksimum yang Diperkenankan Oleh Dirjen POM (Lampiran Peraturan

Menteri Kesehatan RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/1988)

Kerangka Konsep

Daging olahan seperti sosis menggunakan pengawet nitrit serta nitrat dalam

proses pengolahannya. Pada praktikum ini dilakukan pemeriksaan laboratorium

untuk mengetahui kadar nitrit nitrat disesuaikan dengan Permenkes Nomor

722/Menkes/Per/IX/1988.

Gambar 4. Kerangka Konsep Praktikum

I. Validasi Metode

Sosis

Pengawet Nitrit

Pengawet Nitrat

Kadar Nitrit

Kadar Nitrat

Memenuhi/ Tidak Memenuhi syarat Permenkes RI No. 722/Menkes/Per/X/1988

Parameter validasi terdiri dari kecermatan (akurasi), keseksamaan (presisi),

selektivitas (spesifisitas), linearitas dan rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi,

ketangguhan metode (ruggedness) dan ketahanan (robustness) (Rohman, 2007).

Akurasi dari suatu metode analisis adalah kedekatan nilai hasil uji yang

diperoleh dengan prosedur tersebut dari harga yang sebenarnya. Akurasi

merupakan ukuran ketepatan prosedur analisis (Rohman, 2007).

Presisi dari suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian di antara masing-

masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah

cuplikan yang diambil dari satu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi

standar atau deviasi standar relatif (koefisien variasi) (Rohman, 2007).

Kespeksifikan dari suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk

mengukur kadar analit secara khusus dengan akurat, di samping komponen lain

yang terdapat dalam matriks sampel. Kespesifikan sering kali dinyatakan sebagai

derajat bias dari hasil analisis sampel yang mengandung pencemar, hasil degradasi,

senyawa sejenis yang ditambahkan atau komponen matriks, dibandingkan dengan

hasil uji sampel analit tanpa zat tambahan (Rohman, 2007).

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang

secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah

pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat

ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima

(Rohman, 2007).

Limit deteksi dari suatu metode analisis adalah nilai parameter uji batas, yaitu

konsentrasi analit terrendah yang dapat dideteksi, tetapi tidak dikuantitasi pada

kondisi percobaan yang dilakukan. Limit deteksi dinyatakan dalam konsentrasi analit

(persen, bagian per milyar) dalam sampel. Limit kuntitasi adalah konsentrasi analit

terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang

dapat diterima pada kondisi eksperimen yang ditentukan (Rohman, 2007).

Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari

analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium,

analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan lain-lain.

Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan

operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji (Rohman, 2007).

Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh

adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan

melakukan variasi parameter-parameter metode seperti : presentase pelarut

organik, pH, kekuatan ionik, suhu, dan sebagainya (Rohman, 2007).

BAB III

METODE ANALISIS

A. Prinsip Metode

Analisis Kuantitatif Nitrat dan Nitrit pada makanan berupa sosis dapat

dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer Visibel. Pada tahapan

preparasinya, untuk dapat dibaca absorbansi nya oleh spektrofotometer Visibel

dilakukan penambahan pereaksi Griess sehingga terjadi reaksi pengkoplingan.

Nitrit dan Nitrat merupakan suatu senyawa yang dapat larut air sehingga, dalam

ektraksinya pelarut yang digunakan adalah air, namun air yang digunakan

merupakan air yang bebas nitrit supaya tidak mempengaruhi hasil. Sedangkan Nitrit

dan Nitrat dapat dilakukanan dengan menggunakan kolom Cadmium.

B. Alat dan Bahan :

1. Alat :

Alat yang digunakan adalah Neraca Analitik, Spektrofotometer UV-Vis Mini

1240 Shimadzu,Mortir, stamper, Penangas air, alat destilasi, hot plate, kertas

saring dan alat-alat gelas (Pyrex), antara lain : labu ukur, Erlenmeyer, pengaduk,

Pipet tetets, pipet volum, gelas beker, gelas ukur, corong kaca.

2. Bahan :

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro analysis

kecuali dinyatakan lain yakni baku NaNO2, aquadest, NaHCO3, HgSO4 HCl, NH4Cl,

asam sulfanilat , asam asetat 15%v/v , α-naptilamin

C. Prosedur Kerja

1. Sample

Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah sosis yang beredar di

pasaran. Pengambilan dilakukan berdasarkan metode simple random sampling,

yaitu metode pengambilan sampel yang setiap unit dari populasi memiliki

kesempatan yang sama untuk dipilih seabgai sampel. Pengambilan sampel

dilakukan dengan cara acak sederhana ke populasi sosis. Dari setiap penjual

diperlukan 1 sampel, sehingga total sampel adalah 2buah sosis. Hal ini dilakukan

untuk mengetahui apakah pada setiap sosis terkandung kadar nitrit dan nitrat

dan apakah dalam kadar yang berbeda-beda tiap kemasan.

a. Identifikasi sampel

Sampel sosis merk Y dibeli di pasar. Dilakukan identifikasi terlebih

dahulu diawali dengan mengidentifikasi semua yang tercantum dari di

kemasan sosis merk Y tersebut (merk nya, kode produksi, tanggal expired

date, bahan-bahan lain yang terkandung pada sosis, peringatan yang

tercantum pada kemasan, barcode, kemasan tertutup rapat atau tidak, berat

bahan yang diuji, pabrik yang memproduksi).

b. Keseragaman Bobot

Uji keseragaman bobot dilakukan dengan menimbang sosis pada tiap

kemasan plastik dan mencocokannya dengan berat bersih yang tercantum

pada kemasan.

c. Pemerikasaan Organoleptis

Sampel dibuka dari wadahnya dan dilakukan analisis organoleptis

yang meliputi bentuk, warna, bau, kemasan, tanggal kadaluarsa, keberadaan

kontaminasi.

d. Cara pengambilan sample

Sampel ditimbang lebih kurang 5 gram, dihaluskan dalam mortir,

ditambahkan air pada suhu 80oC selama 2 jam, didinginkan dan disaring

menggunkan kertas saring. Larutan hasil penyaringan ditambah dengan

reagen pereaksi Griess dan didiamkan selama Operating time (OT). Dibaca

serapan panjang gelombang 480-580. Jika serapan panjang gelombang

maksimum berada di daerah serapan nitrit diperkirakan sampel mengandung

nitrit.

e. Uji Pendahuluan

Sebanyak 5-10 g dari masing – masing sampel diambil dan dilakukan

pemeriksaan kadar nitrit dengan metode Griess (pengukuran menggunakan

spektrofotometri untuk analisis kuantitatif), sedangkan untuk pemeriksaan

analisis kualitatif dilakukan dengan melihat perubahan warna yang terjadi

serta spektra yang terjadi.

f. Preparasi Sampel

Haluskan sosis yang diambil secara acak dengan mortir atau blender.

Timbang 5 g sampel dalam gelas beker 100 ml, tambahkan ±40 ml aquadest

bebas nitrit yang telah dipanaskan sampai 80˚C aduk dengan pengaduk

kaca, ,masukkan ke labu ukur 250 ml. Tambahkan air panas ke dalam labu

ukur hingga 200 ml, panaskan di atas penangas air selama 2 jam sambil

sesekali digoyang kemudian disaring.Penyaringan dilakukan dengan

menyaring 2 kali dengan Erlenmeyer terpisah. Corong yang telah diberi kertas

saring dijenuhkan dengan air bebas nitrit terlebih dahulu. Pada Erlenmeyer

pertama saring sebagian larutan dalam labu ukur 250 ml. Pindahkan corong

pada Erlenmeyer kedua, saring sisa larutan dalam labu ukur 250 ml. Filtrat

yang digunakan adalah filtrat dari Erlenmeyer kedua, karena dikhawatirkan

adanya pengenceran dari penjenuhan kerts saring menggunakan air bebas

nitrit.

Pipet5,0 ml hasil penyaringan, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml,

tambahkan 2 ml pereaksi Griess dan encerkan sampai tanda batas

menggunakan air bebas nitrit. Bandingkan dengan spektrum absorbansi yang

dihasilkan dari penambahan 5,0 ml NaNO2 5 µg/ml yang diencerkan sampai

250 ml lalu diambil 5,0 ml filtrat ke dalam labu ukur 50 ml. Tambahkan 2,5 ml

reagen Griess. Diamkan selama OT. Lalu tambahkan aquadest bebas nitrit

sampai bataas volume 25 ml.Ukur larutan dengan spektrofotometer dan

tetapkan serapannya pada panjang gelombang maksimal.

2. Pembuatan Pereaksi

a. Pereaksi Griess

0,05 g asam sulfanilat dilarutkan dalam 15 ml asam asetat 15%v/v.

Didihkan 0,01 g α-naptilamin dalam 2 ml air sampai larut dan dituangkan ke

dalam 15 ml asam asetat encer (dalam keadaan panas). Kedua larutan

tersebut dicampurkan dan disimpan dalam botol kaca berwarna coklat.

Digunakan botol kaca berwarna coklat bertujuan untuk mencegah terjadinya

degradasi senyawa karena cahaya.

b. Pembuatan Larutan Baku Nitrit

LarutanstokNaN O 2 1 m g/ml

Lebih kurang 100 mg NaNO2 ditimbang sekasama, dilarutkan dengan

aquadest dalam labu ukur 100 ml sampai tanda.

Larutan kerja NaN O 20, 1 m g/ml

Larutan stok diambil 10,0 ml dengan pipet dan diencerkan dengan aquadest

dalam labu ukur 100 ml sampai tanda.

Larutan kerja NaN O 20, 05 m g/ml

Larutan stok diambil 5,0 ml dengan pipet dan diencerkan dengan aquadest

dalam labu ukur 100 ml sampai tanda.

c. Pembuatan Larutan Blanko

2,5 ml reagen Griess dicampurkan dandilarutkan dengan aquadest

bebas nitrit dalam labu ukur 25 ml hingga tanda.

d. Pembuatan Larutan Amonium Klorida

175 gram NH4Cl ditimbang seksama, dan dilarutkan dengan aquadest

dalam labu ukur 500 ml sampai tanda batas (Larutan I). Ambil Larutan I

sebanyak 12,5 ml diencerkan sampai 500 ml dengan aquadest (Larutan II).

e. Pengecekan Kertas Saring

Kertas saring yang digunakan sebagai penyaring ditetesi dengan

pereaksi Griess. Adanya kandungan nitrit ditunjukkan dengan terbentuknya

warna merah muda sampai ungu.

f. Pengecekan Air Bebas Nitrit

Air yang digunakan sebagai pelarut disaring dengan kertas saring.

Kertas saring yang telah jenuh dengan air ditetesi dengan pereaksi Griess.

Adanya kandungan nitrit ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah

muda sampai ungu.

3. Rencana Optimasi

a. Penetapan operating time

Natrium Nitrit konsentrasi 1 µg/ml dibuat sebanyak 6 buah larutan.

Pembuatan natrium nitrit konsentrasi 1µg/ml dilakukan dengan cara

mengambil 5,0 ml larutan kerja NaNO2 5µg/ml masukkan ke labu ukur 25 ml,

kemudian tambahkan 2,5ml Griess,diamkan selama waktu yang ingin diteliti

serapannya(10 menit; 20 menit ; 30 menit; 40 menit; 50 menit; 60 menit).

Tambahkan air bebas nitrit sampai batas volume 25 ml sehingga didapat

konsentrasi kadar larutan natrium nitrit 1µg/ml. Intensitas warna diukur pada

panjang gelombang maksimum teoritis 520 nm. Operating time ditandai

dengan selang waktu dimana absorbansi stabil (perbedaan serapan tidak

terlalu jauh dari masing-masing selang waktu).

b. Penetapan panjang gelombang

Penetapan panjang gelombang maksimum larutan natrium nitrit padaseri

konsentrasi 1 µg/ml. Pembuatan natrium nitrit konsentrasi 1 µg/ml dilakukan

dengan cara mengambil 5,0 ml larutan kerja NaNO2 5µg/ml masukkanke labu

ukur 25 ml, kemudian tambahkan 2,5ml reagen Griess diamkan selama OT

yang diperoleh. Lalu tambahkan aquadest bebas nitrit sampai batas 25 ml.

Intensitas warna diukur pada panjang gelombang antara 480 nm- 580 nm.

Setelah itu tentukan panjang gelombang larutan tersebut menghasilkan

absorbansi maksimum. Panjang gelombang ini kemudian digunakan sebagai λ

maks.

c. Penetapan kurva baku

Larutan seri kadar dibuat dengan cara pengambilan 1,0;2,0;3,0;4,0;5,0

larutan kerja NaNO20,05 mg/ml ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian

tambahkan 2,5 ml reagen Griess diamkan selama OT diperoleh. Lalu

tambahkan air bebas nitrit sampai batas volume 25 ml sehinggadidapat

konsentrasi seri larutan dengan kadar larutan natrium nitrit 2;4;6;8;10; dan

12 µg/ml. Intensitas warna diukur pada panjang gelombang maksimum

teoretis 520 nm, hasil penetapan dan buat persamaan kurva bakunya dengan

mengeplotkan ke dalam kurva dimana absorbansi sebagai sumbu Y dengan

konsentrasi sebagai sumbu X.

4. Penetapan Kadar

a. Penetapan Kadar Nitrit dalam Sampel

Haluskan sosis yang diambil secara acak dengan mortir atau blender.

Timbang seksama 5 gram sosis. Buat 5 sampel masing-masing 5 gram, dan

dimasukkan masing-masing dalam gelas beker 100 ml. Masing-masing sampel

ditambahkan 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ml NaNO2 0,1 mg/ml, tambahkan ±40

ml aquadest bebas nitrit yang telah dipanaskan sampai 80˚C aduk dengan

pengaduk kaca,masukkan ke labu ukur 250 ml. Tambahkan air panas ke

dalam labu ukur hingga 200 ml, panaskan di atas penangas air selama 2 jam

sambil sesekali digoyang kemudian disaring.Penyaringan dilakukan dengan

menyaring 2 kali dengan Erlenmeyer terpisah. Corong yang telah diberi kertas

saring dijenuhkan dengan air bebas nitrit terlebih dahulu. Pada Erlenmeyer

pertama saring sebagian larutan dalam labu ukur 250 ml. Pindahkan corong

pada Erlenmeyer kedua, saring sisa larutan dalam labu ukur 250 ml. Filtrat

yang digunakan adalah filtrat dari Erlenmeyer kedua, karena dikhawatirkan

adanya pengenceran dari penjenuhan kerts saring menggunakan air bebas

nitrit.

Pipet 5,0 ml hasil penyaringan, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml

tambahkan 2,5 ml pereaksi Griess dan encerkan sampai tanda batas

menggunakan air bebas nitrit. Diamkan sesuai OT yang didapat supaya

terbentuk warna.Ukur larutan dengan spektrofotometer dan tetapkan

serapannya pada panjang gelombang maksimal.

b. Penetapan Kadar Nitrat dalam Sampel

- Proses Pembuatan dan Penggunaan Kolom Cadmium

Granul cadmium yang tersedia dicuci menggunakan HCl2 N dalam

tabung Erlenmeyer dan dibilas dengan aquabidest. Cek pH dengan pH

meter, pH yang diharapkan netral. Lapisi granul menggunakan tembaga

dengan menambahkan 5% w/wCuSO4, aduk dengan kuat sampai warna

birunya menghilang. Ulangi langkah tersebut hingga larutan CuSO4 tidak

lagi kehilangan warna ketika ditambahkan ke Cd. Jaga granul cadmium

tidak kontak dengan udara. Sambil terus diaduk dengan pengaduk, bilas

granul dengan aquabidest, dan ulangi hingga air terbebas dari partikel kecil

atau warna hitam sehingga granul tampak bersinar. Kondisikan kolom dan

granul cadmium terendam aquabidest, masukkan granul dalam kolom

gelas, dan isi bagian ujung gelas dengan benang wool. Simpan kolom

dengan ujung mulutnya terendam aquabidest. Penggunaan kolom terlebih

dulu diaktifkan dengan melewatkan Larutan II (NH4Cl) sebanyak 200 ml.

Ditambahkan 1µg/ml nitrat sebanyak 110 ml untuk mengoreksi efisiensi

kolom reduksi. Setelah dilewatkan dalam kolom, 25 ml pertama dibuang

dan 50 ml selanjutnya diambil dan diukur absorbansinya pada panjang

gelombang maksimal. Setelah didapatkan absorbansi kemudian ditentukan

faktor F :

Keterangan :

A : absorbansi larutan nitrat pada panjang gelombang maksimal

Jika nilai F yang didapatkan diatas 0,33, berarti efisiensi kolom baik.

- Penetapan Kadar Nitrat

Siapkan 6 sampel dan ambil masing-masing 90,0 ml sampel.

Ditambah dengan NH4Cl sebanyak 2 ml, kemudian di ad sampai batas

dalam labu ukur sampai 100 ml. Lewatkan atau alirkan larutan ke dalam

kolom cadmium. Buang 25 ml larutan yang keluar pertama, dan tampung

50 ml larutan selanjutnya dengan erlenmeyer. Larutan hasil penyaringan

dari kolom ini dipipet 5,0 ml, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml,

tambahkan 2,5 ml pereaksi Griess dan encerkan sampai tanda batas

menggunakan air bebas nitrit. Diamkan sesuai OT yang didapat supaya

terbentuk warna. Ukur larutan dengan spektrofotometer dan tetapkan

serapannya pada panjang gelombang maksimal.

Setelah didapatkan konsentrasi nitrit yang tidak dilewatkan kolom (A)

dan konsentrasi nitrit + nitrat yang telah dilewatkan kolom cadmium (B)

sehingga kadar nitrat dapat diperoleh dari B-A.

5. Rencana Validasi Metode

a. Penetapan Akurasi :

Ditimbang 5 gram sampel sebanyak 6 kali. Diadisi masing-masing dengan

lima seri konsentrasi larutan baku Nitrit yang ditentukan setelah mengetahui

absorbansi sampel dan satu sampel tanpa adisi (larutan adisi adalah larutan

standar NaNO2 0,05mg/mL). Dilakukan preparasi sampel. 5,0 mL larutan

filtrat sampel yang telah dipreparasi di pipet ke dalam 5 buah labu takar

25mL. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum.

Didapatkan absorbansi dan hitung kadarnya.

Penetapan akurasi ditetapkan sebagai nilai perolehan kembali

(recovery), yang dihitung dengan rumus :

Recovery = x 100 %

Suatu metode dinyatakan valid, jika memiliki rentang recovery antara

98 % – 120 %.

b. Penetapan Presisi :

Pengukuran Nitrit

Dilakukan preparasi sampel.Ambil 5,0 mL dari filtrat sampel ke dalam

labu takar 25 mL. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum

menggunakan spektrofotometri visible (x). Diukur absorbansi sampel yang

telah direplikasi 3 kali dengan spektrofotometer visibel pada panjang

gelombang maksimum . Dihitung nilai RSD= dari masing-masing

kadar yang diperoleh

Pengukuran Nitrit Total

Dilakukan preparasi sampel . Ambil 5,0 mL dari filtrat (filtrat

sama dengan filtrat diperhitungan nitrit diatas) sampel ke dalam labu

takar 25 mL. Diukur absorbansi sampel yang telah direplikasi 3 kali

dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum (x

)

Parameter presisi dinyatakan sebagai nilai coefisien variation

(CV) atau relative standar deviation (RSD), dilakukan dengan cara

mengukur baku sebanyak 6 kali, kemudian dari data yang tersebut

diperoleh SD dan rata-rata. Kemudian dihitung dengan rumus :

RSD = x 100 %

Suatu metode dinyatakan valid, jika nilai RSD < 2,5 %.

c. Linearitas

Linieritas dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri

baku nitrit. Suatu metode dapat dikatakan memiliki linieritas yang baik jika

r > 0,99atau r2 ≥ 0,997. Kemudian ukur absorbansi keenam larutan seri

konsentrasi baku dengan spektrofotometer visible pada panjang

gelombang maksimum. Dibuat kurva kalibrasi dengan menghitung

hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi menggunakan regresi

linear. Apabila nilai R yang didapatkan R> 0,99 atauR2 ≥ 0,997

menunjukkan kelinearan yang baik.

d. Penetapan Batas Deteksi (LoD)

Penentuan batas deteksi dinyatakan bahwa batas deteksi merupakan

kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko (Yblanko)

ditambah 3 kali simpangan baku (s). Sehingga dapat dinyatakan dengan

rumus persamaan di bawah ini :

Y =

Dengan :

Y : LoD

Sb : simpangan baku respon analitik dari blanko

S : arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon

terhadap konsentrasi = slope

e. Penetapan LoQ (Batas Kuantifikasi) :

Penentuan batas deteksi dinyatakan bahwa batas kuantifikasi

merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko

(Yblanko) ditambah 10 kali simpangan baku (s). Sehingga dapat dinyatakan

dengan rumus persamaan di bawah ini :

Y =

Dengan :

Y : LoQ

Sb : simpangan baku respon analitik dari blanko

S : arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon

terhadap konsentrasi = slope

BAN IV

DATA PENGAMATAN

Data Penimbangan

Penimbangan Baku

NaNo2 Baku 100 mg

Berat kertas 423,3 g

Berat kertas + zat 523,8 g

Berat kertas + sisa 423,8 g

Berat zat 100 g

Penimbangan Pereaksi Griess

As. Sulfa

(0,05 g)

a-nap

(0,01g)

As. Sulfa

(0,05 g)

a-nap

(0,01g)

As. Sulfa

(0,05 g)

a-nap

(0,01g)

Berat kertas 0,2456 g 0,4122 g 0,2456 g 0,2380 g 0,2419 g 0,2326 g

Berat kertas + zat 0,2958 g 0,4223 g 0,2957 g 0,2480 g 0,2919 g 0,2427 g

Berat kertas + sisa 0,2456 g 0,4124 g 0,2457 g 0,2385 g 0,2419 g 0,2328 g

Berat zat 0,0502 g 0,0090 g 0,0500 g 0,0095 g 0,0500 g 0,0099 g

Penimbangan Sample

Akurasi

I II III IV V VI

Berat kertas 0,2420 g 0,2359 g 0,2258 g 0,2419 g 0,2281 g 0,2262 g

Berat kertas + zat 5,2420 g 5,2361 g 5,2256 g 5,2424 g 5,2351 g 5,2264 g

Berat kertas + sisa 0,2524 g 0,2361 g 0,2268 g 0,2420 g 0,2339 g 0,2265 g

Berat zat 4,9896 g 5,000 g 4,9988 g 5,0004 g 5,0012 g 4,999 g

Pengukuran Absorbansi

Optimasi Time (1ug/ml)

Waktu 10 menit 20 menit 30 menit 40 menit 50 menit 60 menit

Absorbansi 1,103 1,539 0,914 0,943 0,785 0,536

Optimasi Panjang Gelombang

Panjang Gelombang yang didapatkan 515,5 nm dengan hasil absorbansi 1,033 (data

terlampir).

Pengukuran Kurva Baku

Konsentrasi (ug/ml) Absorbansi

2 0,705

4 1,041

6 0,965

8 0,485

10 0,550

Pengukuran Sample

Akurasi

Jumlah Adisi (ml) 0 1 2 3 4 5

Absorbansi 0,118 0,154 0,176 0,196 0,146 0,180

BAB IV

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum ini adalah melakukan identifikasi dan penetapan kadar

senyawa nitrat dan nitrit dalam makanan sosis yang beredar di pasaran. Tahap pertama

yang dilakukan adalah melakukan identifikasi semua informasi yang berada pada kemasan,

sedangkan penetapan kadar senyawa nitrat dan nitrit dilakukan dengan spektrofotometer.

Merk sosis yang digunakan adalah Vida, kode produksi 071113 – 94F, tanggal kedaluarsanya

7 Februari 2014, bahan yang terkandung di dalamnya adalah daging sapi, air, tepung

tapioka, minyak nabati, protein kedelai garam, gula, bumbu, penguat rasa MSG, sekuestran

natrium tripolisulfat, pengawet kalium sorbet dan natrium nitrit, pewarna kuning FCF,

Ponceau 4R. Peringatannya yang tercantum di kemasan adalah harus disimpan pada suhu

00C sampai -100C, kemasan tertutup rapat, parbrik yang memproduksinya adalah PT. San

Miguel Pure Food, Indonesia, nomor registrasi BPOM adalah 214810213343.

Proses yang selanjutnya adalah menguji keseragaman bobot. Setiap kemasan sosis

berisi 6 buah sosis, masing – masing sosis ditimbang satu per satu untuk mengetahui

bobotnya. Setelah didapatkan semua bobot sosis, lalu dihitung rata – ratanya. Bobot sosis

pertama sampai keenam secara urut adalah 33.2676 ; 30.6768 ; 30.8245 ; 33.0429 ;

30.8044 ; 30.5676 sehingga rata – rata yang diperoleh adalah 31.5306 gram. Pemeriksaan

organoleptis yang diperoleh adalah bentuk berupa padatan, warna merah, dan bau khas

daging.

Penetapan kadar dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer-Vis. Prinsip

spektroskopi didasarkan adanya interaksi dari energi radiasi elektromagnetik dengan zat

kimia dan banyaknya absorbs berbanding lurus dengan banyaknya zat kimia. Untuk dapat

terbaca dalam alat tersebut terlebih dahulu, maka dilakukan penyiapan terlebih dahulu

dengan metode Griess. Metode Griess merupakan salah satu metode colorimetry yang

digunakan untuk menetapkan kadar nitrit dengan reaksi diazotasi yang menghasilkan

senyawa azo atau senyawa yang berwarna, sering juga disebut metode pengkoplingan.

Dalam medium asam, nitrit bereaksi dengan amin aromatis menjadi bentuk garam

diazonium. Garam diazonium ini akan dikopling dengan cinicin aromatis lain yang

mengandung gugus –NH2atau–OH, untuk membentuk zat warna azo sebagai basis dari

metode spektrofotometri. Reaksi nitrit, asam sulfanilat, dan 1-naftilamin dalam metode

Griess :

Asam sulfanilat asam nitrit ion diazonium

Ion diazonium 1-naftilamin senyawa azo (ungu)

Pereaksi Griess ini dibuat dengan cara melarutkan 0,05 g asam sulfanilat dalam 15 ml

asam asetat 15%v/v, kemudian ditambahkan 0,01 g α-naptilamin dalam 2 ml air panas dan

tuangkan dalam keadaan panas ke dalam 15 ml asam asetat encer. Campurkan kedua

larutan tersebut dan simpan dalam botol kaca berwarna coklat. Menggunakan botol kaca

berwarna coklat supaya mencegah terjadinya degradasi senyawa karena cahaya, hal ini di

sebabkan karena pereaksi ini mudah terdegradasi oleh cahaya (sensitif).

Sebelum menetapkan kadar sample yang akan di amati, harus dilakukan optimasi

terlebih dahulu untuk dapat diketahui waktu yang optimal untuk nitrit bereaksi dengan

pereaksii Griess dan panjang gelombang yang optimal dalam membaca absorbansi. Optimasi

yang pertama yang dilakukan adalah Panjang gelombang, dilakukan scaning lamda dengan

menggunakan spektro vis. Larutan baku nitrit yang digunakan untuk scaning lamda ini

adalah 1 ug/L. Dari pengukuran tersebut di dapatkan bahwa panjang gelombang yang

optimal adalah 515,5 nm, dengan absorbansi 1,033. sehingga untuk tahap selanjutnya

digunakan panjang gelombang 515,5 nm. Kemudian dilakukan optimasi waktu reaksi reagen

dengan nitrit. Optimasi ini dilakukan dengan cara membuat larutan baku dengan

konsentrasi 1ug/L kemudian di tambahkan reagen dan diukur waktunya dimulai dari saat

reagen ditambahkan, yaitu pada menit ke 10,20,30,40,50,60 dan diukur pada panjang

gelombang 515,5 yang merupakan panjang gelombang optimal, dan kemudian diukur

absorbansinya dengan menggunakan spektro-vis. Sehingga di dapatkan absorbansi dari

menit ke 10,20,30,40,50,60 secara berturut-turut adalah 1,103; 1,539; 0,914; 0,943; 0,785;

0,538. Menurut data tersebut di dapatkan bahwa waktu optimal nya adalah 20 menit,

sehingga untuk tahap selanjutnya digunakan OT (operating time) / waktu optimal selama 20

menit.

Kemudian dilakukan juga penetapan Kurva Baku. Kurva baku atau Kurva standart di

buat pertama-tama dengan cara membuat larutan stock yang akan digunakan untuk

membuat seri baku, larutan stock dibuat dengan cara melarutkan dengan tepat 100 mg

serbuk baku Nitrit dengan 100 ml aquadest dalam labu ukur (1 mg/ml b/v), setelah itu

diambil kembali 10 ml larutan tersebut dan ditambah kembali dengan 100 ml aquadest

dalam labu ukur sehingga didapat konsentrasi dari Nitrit adalah 0,1 mg/ml b/v. Diambil

kembali 5,0 ml larutan Nitrit dengan konsentrasi 0,1 mg/ml tadi, dan dimasukkan kedalam

labu ukur 100 ml dan di tambahkan aquadest sampai tanda batas, dan didapatlah larutan

stock dengan konsentrasi 0,05 mg/ml. Larutan stock disini berfungsi sebagai larutan awal

yang telah diketahui nilai konsestrasinya dengan tepat yang akan diambil sebagai larutan

baku.

Setelah larutan stock selesai dibuat, kemudian dilakukan proses pembuatan seri

baku dengan cara mengambil 1,0;2,0;3,0;4,0;5,0 larutan kerja NaNO2 0,05 mg/ml ke dalam

labu ukur 25 ml, kemudian menambahkan 2,5 ml reagen Griess dan didiamkan selama OT

yang diperoleh. OT yang diperoleh adalah 20 menit, disini OT atau operating time

merupakan waktu yang paling optimum dimana larutan Nitrit bereaksi paling optimal

dengan pereaksi Griess. Lalu tambahkan air bebas nitrit sampai batas volume 25 ml

sehingga didapat konsentrasi seri larutan dengan kadar larutan natrium nitrit 2;4;6;8;10;

dan 12 µg/ml. Larutan seri baku tersebut kemudian diukur absorbansinya dengan

menggunakan spektrofotometer UV dengan lamda maks sebesar 515.5, lamda maks ini

menunjukkan bahwa pada panjang gelombang tersebut didapat nilai absorbansi maksimal.

Kurva baku digunakan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi dengan

absorbansi sehingga jika diketahui absorbansi dari sampel maka akan diketahui juga

konsentrasi Nitrit dalam sampel tersebut. Dari hasil pengukuran kurva baku, didapat regresi

linear dengan r sebesar 0,3084. Nilai r ini digunakkan sebagai acuan apakah kurva baku yang

dibuat telah linear sehingga dapat digunakan sebagai acuan untuk mengubah absorbansi

yang didapat dari sampel menjadi bentuk konsentrasi. Hasil dari kurva baku yang didapat

sangat kurang memuaskan dimana dengan konsentrasi yang meningkat seharusnya

mendapatkan absorbansi yang meningkat juga, namun hasil yang didapat malah sebaliknya

yaitu dengan konsentrasi tinggi, absorbansi yang didapat kecil. Kesalahan dalam pembuatan

kurva baku ini menyebabkan tidak validnya hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi

yang didapat, sehingga tidak dapat dignakan untuk mengubah nilai absorbansi suatu sampel

menjadi nilai konsentrasi. Nilai r yang baik dalam suatu linearitas adalah 0,999. Kurva baku

yang didapat sangat tidak bagus tersebut dapat dikarenakan oleh preparasi dari pereaksi

yang kurang baik, sehingga mungkin reaksi antara pereaksi Griess dengan Nitrit yang

digunakan menjadi kurang sehingga warna yang dihasilkan berubah-ubah, hal ini dapat

terjadi karena kesalahan penimbangan pada saat pembuatan pereaksi selain itu adalah

penyimpanan pereaksi yang kurang baik sehingga telah terdegradasi oleh cahaya. Adapun

hal lai yang memicu kurang baiknya suatu kurva baku yang dihasilkan adalah operating time

yang sedikit berbeda pada setiap serinya sehingga terjadi reaksi yang berbeda juga pada tiap

seri yang menyebabkan terjadinya perbedaan pada absorbansinya juga. Selain itu

pengenceran dari seri baku juga menjadi hal utama dalam sebuah kurva baku yang baik,

hasil kurva baku yang jelek dapat mengindikasikan bahwa pengenceran yang dibuat tidak

benar.

Pada tahapan preparasi sampel, sampel sosis dihomogenkan dalam mortir.

Penambahan aquadest bebas nitrit panas pada sampel bertujuan untuk meningkatkan

kelarutan sampel dalam air. Untuk mempercepat proses percampuran air dan sosis, dapat

dilakukan pengadukan dengan batang pengaduk. Setelah itu, sampel + air dimasukkan ke

dalam labu takar dan di add sampai 250 ml dan dilakukan penyaringan 2 kali. Sebelum

disaring, kertas saring terlebih dahulu dijenuhkan dengan air bebas nitrit supaya tidak ada

larutan nitrit yang masuk ke dalam penyaringan. Penyaringan dilakukan berulang agar

didapatkan filtrat jernih, dan juga supaya tidak ada sisa pengenceran dari penjenuhan kertas

saring mnggunakan kertas bebas nitrit. Hasil penyaringan tersebut kemudian dimasukkan ke

dalam labu ukur dan ditambahkan dengan pereaksi Gries dan kemudian di add sampai batas

labu ukur. Penambahan pereaksi Gries ini bertujuan supaya terjadi reaksi pengkoplingan

dimana akan terbentuk ion diazonium yang merupakan hasil reaksi antara senyawa nitrit

yang terkandung dalam sampel dengan asam sulfanilat dalam pereaksi Gries. Setelah

menjadi ion diazonium, kemudian akan bereaksi dengan naftilamin dalam pereaksi Gries

membentuk senyawa azo (senyawa berwarna ungu) yang dapat dideteksi dengan

spekstrofotometer-Vis.

Tahapan penetapan akurasi pada dasarnya tidak dapat dilakukan, hal ini disebabkan

karena r yang diperoleh dari kurva baku sangat buruk yaitu 0,308 yang menandakan

buruknya linieritas sehingga perhitungan kadar tidak dapat dilakukan. Hanya saja dilakukan

preparasi untuk penetapan akurasi yaitu dengan menambahkan NaNO2 0,05ug/mL.

Absorbansi yang diperoleh dari adisi sebanyak 0, 1, 2, 3,4,5 ml berturut turut adalah 0.118 ;

0.154 ; 0.176 ; 80.196 ; 0.146 ; 0.180.

DAFTAR PUSTAKA

Cahyadi , W., 2008. Analisis dan Aspek Kesehatan Bahan Tambahan Pangan edisi II.. Bumi

Aksara. Jakarta. hal 7-36

Dewan Standarisasi Nasional. 1995. Sosis Daging. Jakarta.

Elsevier, 2001, Global Seagrass Research Methods, Elvisier Science B.V, Netherlands, pp.

397-399.

FAO Food And Nutrition Paper. 1980. Additives Contaminates Tehniques. Food and

Agriculture Organization of The United nations, Rome.

Furia, E. Thomas. 1983. Handbook of Food Additives. 2 nd edition, Vol. 1 & Vol. 2, CRC

Press, Boca Raton, Florida, USA.

Henrickson, R.L. 1978. Meat, poultry and Seafoood Products.The AVI Publishing Company

Inc. Westport, Connecticut.

Kramlich, W. E. 1971. Sausage product. In: J.F Price and B. S. Schweigert (Eds.). The

Science of Meat and Meat Product.2 nd Edit W.H Freeman and Company, San

Fransisco.

Lawrie, R.A. 1995. IlmuDaging. Terjemahan: A. Praktisi. Universitas Indonesia Press.

Jakarta.

Merck & Co. 1989.The Merck Index.Edisi 11.Merck & Co. Inc. USA.pp. 6318.8893.

Purnomo, H. 2009. IlmuPangan. Universitas Indonesia Press. Jakarta.

Rohman, A.. 2007.KimiaFarmasiAnalisis,.PustakaPelajar.Yogyakarta. hal. 464-471.

Sudarmaji, S. Haryono, B.Suhardi, 1989, Analisa Untuk Bahan Makanan dan Pertanian,

Penerbit Liberty, Yogyakarta, pp.14-19.

Trojanowicz, 2008, Advances in Flow Analysisis, Wiley, Germany, pp. 578-580

World Health Organization, 2010, International Programme on Chemical Safety,

http://www.foodsafety.govt.nz/elibrary/industry/Clostridium_Botulinum-

Neurotoxins_Produced.pdf, diunduh padatanggal 12 November 2013.

Zhang, Chunlong, 2007, Fundamentals of Environmental Sampling and Analysis, Wiley, USA, pp.

362-363.