LAPORAN HASlL PENELlTlAN FUNDAMENTAL

TAHUN ANGGARAN 2006 h

A kiih

PERUBAHAN STRUKTUR SITOSKELETON BERBASIS MIKROTUBULUS DAN ULTRASTRUKTUR 00SIT

PASCA KRIOPRESERVASI DENGAN METODE VlTRlFlKASl

Oleh Dr. Ir. Sri Wahjuningsih, MSi.

Dr.lr. M.Sasmito Djati,MS

Dibiayai oleh birekorat Penelitin dan Pengabdian Kepada Nlwyarakat Di~ektorat Jenderal Pendidikan Tinggl

Departemen Pendidikan Nasional Dengan Sural Pe janjian Pelaksanaan Penelitian

Nomor :3231SPIPPIDP2M/Il/2006

FAKULTAS PETERNAKAN UNlVERSlTAS BRAWIJAYA

2006

Halaman Pengesahan Laporan Hasil Penelitian Fundamental

1. J~rdul Penelitian : Perubahan Struktur Sitoskeleton f3efbasis Mikrotubulus a n Ultrastruktur Oosit Pasca Kriopreservasi bngan Metode Vitrifikasi 2. Ketua Peneliti a.Nama : Dr. Ir. Sri Wahjuningsih,MSi bdenis kelamin : Perernpuan c.NIP : 131 759 598 d.PangkaVGolongan : Penata Tk illll-d e.Jabatan fungsional : Lektm f. Jurusan/Faku#as/Pusat Penelitjan : Produksi TemaWPetemakan g.Perguruan Tinggi : Universitas Bfawiijaya

3. Jurnlah Tim Peneliti 4. Lokasi Peneltitian

5. Kerjasarna dengan lnstitusi lain a. Narna lnstansi b, Alarnat 6. Masa Penelitian 7. Biaya yang diperlukan

: 2 orang : Labaratoriurn Kultur Jaringan

Jurusan Biologi FMlPA Unibraw

- -

: 8 bulan : Rp 30.000.000 (Tiga puluh juta

rupiah)

Malann. 31 OktoBer 2006

Dr. It. Sri Wahjuningsi NIP.131 759 598

PERUBAHAN STRUKTUR SITOSKELETON BERBASIS MIKROTUBULUS DAN ULTRASTRUKTUR OOSIT PASCA KRIOPRESERVASI DENGAN

METOM: VlTRlFlKASl

Sri Wahjuningsih dan M Sasmito Djati

RING KASAN

Tujuan Penelitian tahun pertarna adalah : mengkaji kualitas oosit pasca vitrifikasi tfwhadap mwfologi, viabilitas, serta struktur sitoskeleton oosit berbasis mikrotubulus dan mempelajari faktor yang menyebabkan tejadinya penurunan kualitas oosit Dasca vitaifkasi melalui evaluasi morfoloai, viabilitas serta analisa mikrotubulus &sit menggunakan metode irnunohistolri~~,

Materi penelitian adalah oosit kambing yang blah dilakukan maturasi in vitm selama 24 jam. Rancangan percobaan adalah : (1)rancangan acak lengkap pola faktorial 6 x 3, dengan perlakuan konsentrasi EG 0,10, 20, 30,40, dan 50 % dan lama paparan 1,3,5 menit untuk evalwasi morfologi dan viabititas dan (2) deskriptif wntuk analisa struktur sitoskeleton.

Hasil penelitian rnenunjukkan bahwa konsentrasi EG dan lama paparan berpengaruh terhadap morfologi dan viabilitas (pc0.01). Persentase oosit dengan morfologi normal dan omit Mdwp tertinggi serta vitrifikasi menggunakan 30 % EG dan lama paparan 3 rnenit, masing-masing sebesar 86.6% dan 78.7 %. Konsentrasi EG 30 % dan lama paparan 3 menit merupakan perlakuan terbaik untuk melindumgi oosit pada proses vitrifikasi. Hasil pengamatan terhadap sitoskeleiton berbasis mikrotubulus rnenggunakan metode imunohistokimia diperoleh gambar yang rnenunjukkan adanya perbedaan struktur sitoskeleton oosit kontrol dan oosit hasil vitrifikasi. Pada perlakuan kotrol struktulr sitoskeleton berbasis mikrotubul tampak seperti benang-benang berwarna kecoklatan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa setetah proses vitrifikasi strwktur sitoskeleton mengalami perubahan.

Kesimpulan dari penelitian ihi adalah vitrifikasi menggunakan 30 % EG dan lama paparan 3 rnenit dapat rnenghambat kerusakan morfologi omit dan penumnan viabilitas yang disebabkan oleh proses vitrifikasi Untuk menjaga fungsl oosit, struktur sitoskeleton berbasis mikratubulus hams dapat dipertahankan. EG sebesar 30 % terbukti dapat mencegah kerusakan lebih lanjut dari sitoskeleton. Struktur sitoskeleton pada perlakuan 30 % EG tampak seperti benang yang beratti rnasih bisa mengatami recovery, sedangkan pada konsentrasi EG yang lain, sitoskeleton oasit tampak mengalami kmsakan. Terdapat hubungan antara morfologi, viabilitas oosit dan struktur sitoskeleton berbasis mikrotubulus. Disarankan melakukan analisa ultrastruktur oosit rnenggunakan Transmiss~on Electron Micmscopy agar dapat menjawab mengapa terjadi penurunan kualitas oosid pasca vitrifikasi.

THE CHANGE OF CYTOSCELETON STRUCTURE BASED ON MICROTUBULUS AWD OOCYTE ULTRASTRUCTURE AFTER

CRYOPRESERVATION USING VITRlFICATION METHOD

SUMMARY

The aim of this m r c h far first year was to : study the quality of oocyte after Wriffcation to morphology, viability and also oocyte eytoskeleton s-re based on m i ~ b u l u s and study the W r that causing the happening of oocyte quality degradation afbr ' i M o n by morphology evaluation, viability and ako analyse oucyie micratubulwo s-e after vitrification using i m u n o h ~ e r n i ~ method.

The material of this research was used goat w e which have been maturated by in vitm during 24 hours. The research use (1) random complete design with factorial pattern 6 x 3, with treatment mmtrat ion of Ethylene Glywl (EG) were 0, 10, 20. 30.40 and 50 % with the time of exposure during 1 3 3 minutes for the morphology and viability evaluation and (2) descriptive for the sh&re of cytoskelebn.

The results of the research showed that concentration of EG and the time of expwure influenee morphology and viabitity (pcO.01). Percentage of aocyte with normal mc~pholagy and highest life oocyte and also uitrif~cation use 30% EG and the tkne of exposure during 3 minutes, eaGh cff 86.6% and 78.7%. ConcenWon of EG 30% and the time of exposure during 3 minutes were the best treatment to protect oocyte in process of vitrification. The result of obsewtion to cytmceleton based on microtubulus use imunohiiochemisQ method was obtained picture that showing the dirence existence of cytoscekton struwre of oocyte contml and cryop~e~ewed cmyte. In the control treatment, the structure of cyuDscaleton based on micxbtubulus looked like bmwn yam. The result of this research showed that after the process of vitrification, structure of cytoskeieton has a change.

The rx3Rolusian of this research was that vitrification use 30% EG and the @me of exposure during 3 minutes can pursue darna@e of oocyke morphology and viability which is caused by the process of vitrification. To safe the function of oocyte, cyt08~~letan stnrGtu~e based on microtubutus have to eam lo be defended. EG equal to 30% g r o w can prevent further damage of q&osceleton. cytosceletan structure in the treatment of 30% EG looked like yam means that it still can recovery, white in the other c o n a m o n of EG, visible oocyte cyihceleton experience af damage. There am relation between morpkolugy, mcyte viability and cytmceleton sbucture based on microtubulus.

PRAKATA

Puji dan syukur kehadirat Allah SVVT karena berkat rahrnat dan

karuniaNYA, pelaksanaan penelitian dan pernbuatan laparan penelitian

Fundamental tahun pertama ini dapat diselesaikan.

Penelitian ini dibiayai dengaR dana dari DireMorat Jenderal Pendidikan

Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, Kontrak Nornor:

323lSP/PP/DP2MA3/2006 Tanggal 21 Pebruari 2006.

Pada kesempatan ini karni menyampaikan terirna kasih kepada yang

morrnat:

1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional.

2. Rektor Universitas Brawijaya

3. Ketua Lembaga Penelitian Unibraw

4. Dekan Fakultas Peternakan Unibraw

5. Ketua dan Staf Lab. Fisiologi, Kultur Jaringan dan Mikroteknik FMIPA-

Unibraw

6. Semua pihak yang telah memberikan rekomendasi, menyetujui dan membantu

pelaksanaan serta penyusunan laporan peneliian ini.

Sernoga ha i l penelitian yang dituangkan dalam laporan ini bermanfaat

bagi pihak-pihak yang mernerlwkan.

Malang, 31 Oktober 2006

Tim Peneliti

DAFTAR IS1

Halaman

MALAMAN PENGESAHAN RINGKASAN DAN SUMMRY PRAKATA DAFTAR IS1 DAFTAR GAMBAR BAB I. PENDAHULUAN BAB It. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Morfologi dan karakteristik Oosit 2.2. Kriopreservasi Oosit Menggunakan Metode

Vitrifikasi 2.3. Kualitas Oosit Pasca Vitrifikasi 2.4. Struktuf Sitoskeleton Oosit

BAB Ill. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITPAN BAB IV. METODE PENELITIAN BAB V. HASlL DAN PEMBAHASAN

5.1. Evaluasi Morfologi Oosit Mt-11 Setelah Vitrifikasi dalam Berbagai Konsentrasi Etilen Glikol dam Lama Paparan.

5.2. Tingkat Viabliis Oosit Mt-ll setelah Vitrifikasi dalam berbagai Konsentrasi Etilen Glikol dan Lama Paparan

5.3. Analisa Strukrur sitoskeleton loerbasis Mikrotubulus rnenggunakan Metode Imunohistokimia

BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan 6.2. Saran

DAFTAR PUSTAKA

Garnbar

DAFTAR GAMEAR

Malaman

1 Skerna Analisis Struktwr Sitosketeton Oosit 14 krbasis mikrotubulus

2 Morfologli oosit Normal dart Abnormal Hasil Vitrifikasi 17 Menggunakan EG

3 Persenlase Oosit Normal Hasil Vitrifikasi dengan 17 Variasi Konsentrasi EG dan Lama Paperan

4 Persentase Oosit Hidup Hesit Vifikasi dengan 21 Variasi Konsentrasi EG dan Lama Paparan

5 Strukfur Sitaskeleton Berbasis Mikrotubulus W i t 25 Pasca Virifikasi

I. PENDAHULUAN

Salah satu kernajuan iEmu pengetahuan dan teknologi di bidang

biologi repmdlrksi adalah teknologi transfsr embrio. Salah satu

hambatan dalam pelaksanaan program transfer embrio (TE) pada temak

di Indonesia adalah faktor ketersedtaan ernbrio yang berkualitas unggul.

Upaya (hi dapat diperoleh dari beberapa surnber (7 ) kolekgi embrio dari

temak betina donor yang disuperovutasi (2) produksi ernbrio mefalui

proses fet'titilisasi in @ro (FIV). Produksi embrio secara in vivo

memeriukan biaya yang relatif tinggi dan jurnlahnya sangat tqbatas,

khususnya jika rnemproduksl embrio yang diioleksi dari saluran

reproduksi betha donor yang disuperovutasi. Produksi embrio in vitro

rnerupakan alternatif yang bisa dimanfaatkan untuk rnendapatkan embrio.

Secara wmum ptoduksi ernbrio secara h vitro yang meliputi mwrasi

oosit, fertilisasi dan kultur in vitro telah dilaprkan pada hewan ternak

kambing dan sapi (Djati, 1999; Wahjuningsih dkk, 2001)

Teknologi FlV saat ini di lndonesia dilakukan dengan

mmanfaatkan oosit segar yang diperoleh langsung dan Rurnah Rotang

Hewan (RPH). Namun dernikian, kendala yang dihadapi adalah oosit

mamalia memiliki daya tahan hidup yang sangat terbatas sehingga Wak

dapat disirnpan &lam waktu yang lama pada suhu kamar. Keterbatasan

waktu simpan ini dapat diatasi dengan teknik penpimpanan b k u atau

krioprese~aai oosit untuk mernpertahankan kelangsungan hidup sel

sehingga viabiliis oosit dapat dipertahankan ,

Teknolqi rekayasa reproduksi khususnya ktioprwwasi telah

diiembangkan untuk spermatozoa dan embrio, namltn sejauh ini

keberhasilan kriopmewasi w i t yang telah dllaporkan masih sangat

terbatas dhn variatif. Penggunaan pmedur kriopreservasi oasit secara

komersial masih sangat tefbatas (Vajta, 2000). Bada awal studi tantang

krbpreservasi, dilakukan kriopresenrasi menggunakan metode

kwwensional, namun saat ini metode viwlikasi lebih sering dia~fikasikan~

Metode tersebut sederhana, murah dan tidaln memdiukan alat khusus

untuk menurunkan suhu secara bertahap dan dapat meminimalkan

pembentukan kristal es sehingga mudah diaplikasikan di tempat yang

memiliki kontainer nitrogen cair. (Shaw st a/., 2000).

Selama proses kriopreservesi diperlukan suatu kriopratektan.

Kriopmtektan selain &pat melindungi sel juga temyata diduga dapat

rnenimbulkan kerusakan pada sel akibat pengaauh toksisitasnya. Derajat

proteksi dari bahan kriopratektan terhadap proses kristaiisasi pada masa

pembekuan tergantung dari jenis dan konsentmsi ktiopratektan yang

dipakai serrta lama paparan (Leoni et a/., 2002). Dari beberapa

penelitian tentang kriopreservasi oosit, diketahui ada bemacam-macam

krioprotektan yang dapat dipergunakan untuk vitrifikasi oosit, narnun

demikian telah diketahui bahwa etilen gtikol (EG) mernpunyai efek toksik

yang lebih rendah dibapdingkan ktiopmtektan yang lain (Gordon, 1994;;

Mochi eta/., 1995).

Beberapa penelitian kriopreservasi oosit telah dihkukan dengan

hasil yang bervariasi dalam persentase morfologi normal, viatilitas dan

tingkat +%tilitas (Acker et a/., 2003 Wahjuningsih dkk.., 2002). Evaluasi

pengeruh sitologis setelah perlakuan menunjukkan kerusakan yang

permanen ymg tidak tmpak setelah paparan k-tutektan (Han et

a/. ,2004).

Dalarn peneliiian tahun pertama struktur sitogkeleton berbasis

mikrotubulus menggunakan teknik imunohistokimia akan dikaji untuk

menjelaskan m a p a terjadi perubahan kualitas oosit pasca

kriopresenrasi. Dengan rnengetahui perubahan stnrkfur sitoskeleton

berbasis mikrotubulus akanl mernbuka peluang un'tuk meningkatkan

keberhasilan kriopresewasi -it secara komersial dan ha1 hi akan

menjadi topik yang sangat menarik unfuk peneliian berikutnya.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Morfologi dan Karakteristik oosit

Oosit mamalia merupakan sel tunggal dan dibandingbn dengan sel tubuh

lainnya, ukuran oosit relatif sangat besar serta rnemiliki karakteristik rnoflologik

dan fungsional yang unik. Keadaan ukuran, struktur dan morfologi sangat berkait

erat dengan fungsi biologis (Vajta, 2000).

Sebelum dilakukan FIV, oosit immature hasil aspilrasi dari ovarilnm harus

mengalami IVM (In Wtro Maturasi) dalam medium kultur.. Untuk rnendapatkan

medium maturasi yang menghasilkan inti mencapai tahap rnetafase II, peneliti

utarna (Wahjuningsih, 2003, Wahjuningsih,2004) rnendapatkan hasil bahwa

swplementasi kornbinasi PMSG dan HCG dalam medium dasar TCM 199 dan

FCS kornbinaainya dapat menstimulus ekspansi kumulus. Oosit yang telah

matang, kumulus oophorusnya akan mengernbang dan ikatan sesama kumulus

oophorus akan melonggar. Persentase yang tinggi dari sel kurnulus terekspansi

sempurna pada perlakuan yang rnendapat suplementasi PMSG dan HCG

rnenunjukkan bahwa kedua horrnon ini rnemberikan pengaruh positip secara

sinergis dan rnemberikan persentase oosit mencapai Metafase II.

2.2. Kriopreservasi oosit menggunakan metode vitrifikasi

Secara garis besar ada dua metoale kriopreservasi yaitu konvensional

(slow freezing) dan metode vitvifikasi. Perbedaan yang rnendasar diantara

kedua metode tersebut adalah pada metode konvensio~~al terjadi pernadatan

cairan melalui pembentukan kristal es, sedangkan pada vitrifikasi pernadatan

cairan tanpa melalui psmbentukan kristal es intraseluler (Men et a/, 2003).

Kriopresefvasi dengan metoda konvensional memerlukan peratatan freezing

machine (cry~cetl) yang harganya sangat mahat untuk menurunkan suhu secara

bertahap, proses kriopresewasi memerlukan waktu yang relatif lama serta

tehentuk kristall es intraseluler sehingga merusak organel oosit. Dibandingkan

sistim konvensiional, keuntungan kriopresewasi secara vitrifikasi adatah tidak

memerlukan f-ng machine (Cryocell) dan proses kriopresevasi cepat,

namun kelemahannya adalah seringkali terjadi tokisitas karena tingginya

osmolaritas larutan vitrifikasi (Acker et a/., 2003; Han et el., 2004)

Tidak seperti pada krioprese~asi embrio, penggunaan pmsedur

kriopresewasi oosit S a r a komersial masih sangat terbatas. Sifat yang

berbeda pada oosit dan ernbrio seperti ukuran, bentuk, perrneahilitas, kualitas

dan sensitivitas, tergantung pada spesies, tahap perkembangan akan

menentukan kondisi yang paling tepai untuk keberhasilan kriopreservasi

(Vajta,2OOO; Quello et a/., 2004)

Pada proses vitrifikasi dibutuhkan kriopmtektan. Ada dua sisi yang

berlawanan dari penggunaan krioprotektan, yaitu selain dapat melindungi sel,

kriopmtektan dapat menimbulkan kerusakan pads sel akibat pengaruh

toks~sitasnya. Konsentras~ krioprotektan yang rendah dnlam medium

krioprotektan akan menyebabkan kerusakan oosit akibat terbentuknya kristal-

kristal es intraeluler, akan tetapi konsentrasi krioprotektan yang tinggi dapat

bersifat toksik dan menyebabkan kerusakan osmotik pada oasit. Diantara

krioprotektan intraseluler, etilen glikol merupakan yang paling hanyak

digunakan dalam proses pembekuan (Saha et a!., 1995). Dibandingkan

dengan gliserol dan propilen glikol, etilen glikol merniliki toksisitas yang lebih

rendah karena etilen glikol paling mwdah menyerap air dalam oosit dibandingkan

krioprotektan lainnya (Hotamisligil et al., 1996, Wahjuningsih, 2002).

Penggunaan M e n glikol sebagai krioprotektan intraseluler juga diungkqpken

oleh Gordon (I 994).

2.3. Kuabitas oosit pasca kriopfiesewasi

Hasil penelitian Kuwayama et a/., (1999) pada oosit manusia bahwa

metode vitrifikasi dengan eampuran 30 % EG dan 0.5 M Sukrosa dapat menjaga

viabilitas oosit setetah dibekukan sebesar 90%. Kasai (1996) membuktikan

bahwa penambahan 30% EG pada larutan PBS meningkatkan tingkat

kelangsungan hidup atau survival rate in vifm oosit tikus sampai dengan 98%.

Namun demikian penelitin ini berbeda dibandingkan dengan hasil penelitian

Otoi et al. (1998) yang menunjukkan bahwa penggunaan krioprotektan EG 40

% dalarn larutan vitrifikasi lebih baik pengaruhnya terhadap viabilitas

dibandlngkan EG 30 %. Perbedaan ini disebabkan lama paparan yang berbeda.

2.4. Struktur Sitoskeleton Omit

Sitoskeleton merupakan suatu sistem dalam sel berfungsi sebagal

kerangka Clan alat gerak yang memiliki struktur sebagai anyaman benang-

benang halus. Sebagian besar sel hewan mernpunyai empat struktur

sitoskeleton dengan protein penyusun yang berbeda yaitu filamen aktin,

mikrotubul, filarnen mtermdiat dan protein aksesori (Yarp, 1984; Subowo, 1995).

Mikrotubul berperan penting dafarn organisasi struktur intraseluler,

transport intraseluler dan pembentukan sentriol. Mikrotubul merupakan sistern

penopang yang kuat dalam sel untuk mempertahankan bentuk sel, bagian

perluasan membmn sel seperti flagela dan silia serta membantu pergerakan

kromosom selama pembelahan sel. Jenis sel yang befbeda akan mempunyai

struktur sibskeleton yang berbeda (Kimball, 1994; Childs, 1996).

Pretein yang membentuk rnikrotubul disebut tubulin. Ada dua macarn

yaitu a-tubulin dan ptubulin. Kedvranya mempunyai ukuran yang hampir sarna,

masing-masing dengan berat rnolekul sekitar 55.000 dalton, bergabung secara

nonkovalen untuk rnembentuk dimer. Dirner ini adalah bbk bangunan untuk

rnendirikan mikrotubul. Menurut Childs (1996) a- dan P-tubulin jafang dalam

bentuk terpisah pada kondisi normal. Ditarnbahkan oleh Maciver (2001) bahwa

protein tubulin dalarn bentuk dimer bersifat stabil karena stuktur ikatannya sangat

kuat. Lane (1999) dan Picton (2000) menyatakan bahwa mikrotubvl yang

menyusun spindel aosit sangat sensitif terhadap ketusakan akibat proses

pendinginan. Aman dan Parks (1994) menyatakan bahwa pendinginan oosit

sapi 4% atau 2 5 ' ~ menyebabkan sehagian atau seluruh spindel mengalami

kerusakan dan bebrapa kromoson rnenyebar atau teturai

Mikrotubul rnerupakan polimer non-kovalen dari protein tubulin yang

ditemukan pada semua sel eukariota yang sedang rnernbelah dan pada

sebagian bear seCsel yang telah mengalami diferensiasi. Selarna pemklahan

sel, stwktur mikmtubul beTfungsi memisahkan kromosom dan menyusunnya

pada Mdang pembelahan. %da sel yang tidak sectang membelah mkrotubul

temrgamisir pada sitoplasma, mengatur posisi nukleus dan organel-organel serta

bertindak ssbagai struktur daaar elemen flagela dan sila (Desai, 1997).

Sitoskelebn sangat dinamis, dapat mengalami depolimetisasi, polimerisasi dan

bergerak dalam sitoplasma (Karp. 1984; Kimball, 1994)

3.1. Tujuan Penelitian

Mengkaji kualltas oosit pasca vitrifikasi menggunakan berbagai

konsentrasi EG dan lama paparan tel"hadap morfologi, viabilitas, serta

struktur sitoskeleton oosit berbasis rnikratubulus.

Mengetahui apakah terdapat hubungan antara morfologi, vibilitas dan

struktur sibskeleton oosit .

32. Manfaat Penelitian

Mmperoleh informasi konsentrasi EG dan lama paparan yang sesuai

untuk vitrifikasil omit yang dipelajari dari fenomena morfologi, viabilitas,

struktur sitoskeletan oosit berksis mikmtubulws

Dapat menjelaskan hubungan antara morfologi, vlbilibs dan struktur

siloskeleton oosit.

IV. METQDE PENELlTlAN

Lokasi dan Waktu Pe~elitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Kultur jaringan

FMlPA Unibraw mulai bulan April sampai September 2006.

Kobksi omit:

Ovarium dikumpulkan dari RPH Sukun dalam keadaan segar dan

dimasukkan dalam medium berisi NaCl 0,9% + Penisitin 100 1U + Streptomisin

100 IU pada suhu 35°C. Koleksi oosit dengan cara aspirasi. dari folikel

menggunakan jarum dengan ukuran spuit 18 G. Medium aspirasi yang

digunakan TCM 199 powder (CIBCO, Cat no 212000760) dimbahkan Hepes

dan NaHC03, media ini dififtrasi dengan menggunakan membran filter berukuran

diameter 0.22 urn. Medium aspirasi disiapkan dan diinkubasikan minimal dua jam

sebelum dipergunakan. Evaluasi kualitas oosit immature dilakukan berdasarkan

kriteria Hozumi (2001).

A = Sitoplasma kompak secara sempurna dengan sel-sel kumulus

beraturan rnenempel di keselunrhan bagian oosit

B = Sitoplasrna kompak secara sempurna dengan sel-sel kurnulus

beraturan menempel di sebagian oosit.

C = Sitoplasma kompak sempurna tanpa ada sel-sel kwmulus menernpell

pada oosit.

D = sitoplasma tidak kompak atau rusak

Hanya oosit berkualitas A yang digunakan untuk penelitian selanjutnya.

Matuwi omit in vStro

Setelah dilakukan klasifikasi kualitas oosit, rnaka oosit yang berkualitas A

dimaturasi secara in v i h dengen medium TCM199 + FCS 10% + PMSG 10 IU +

HCG 10 IU selama 24 jam datam inkubator pada suhu 3g°C dan 5% COz,

kelernbaban 95%.

Kriopreservasi oosit menggunakan metode vitrifibsi

Oosit hasil IVM dipaparkan ke dalam larutan vitrifikasi yang berbeda

(etiien glikol 10, 20, 30, 40, dan 50 %) ditambah 0.5 M Sukrosa dengan lama

waklu paparan yang berbeda (1,3,5 menit). Oosit dirnasukkan ke dalam

ministraw transparant 0.25 cc (French straw) yang telah mengalami OPS (open

pulled straw) masing-ming berisi 10 oosit. Setelah pemaparan di dalam uap

nitrogen selama 10 detik, ministraw yang berisi oosit dimasukkan dalarn

kontainer nitrogen cair dan disimpan selama 2 rninggu untuk analisa lebih lanjut.

Thawing oosit

Setelah oosit dalam ministraw disimpan dalam kontainer selama 2

rninggu, ooslt yang telah mengalami vitrifikasi dilakukan thawing dengan cara

penghangatan (warming) dl uclara selama 10 detik kernudian dirnasukkan dalam

penangas air suhu 35% selama 1 rnenit lsi ministraw dituangkan ke dalam

cawan petri dan oosit dibilas dua kali dengan sukrosa 0.5 M untuk

menghilangkan krioprotektan seperti prosedur yang dilakukan oleh Sun et

a1.(1995).

Evaluasi morfologi oosit

Setelah vitrifikasi dsngan metode OPS dan fhawing, oosit dievaluasi

terhadap morfologi dengan menggunakan mikroskop inverted dengan

pembesaran 400 X. Morfologi oosit diklasifikasikan normal jika menunjukkan

bentuk bulat dengan membran plasma utuh dan sitoplasma bulat dengan

granulasj kompak homogen. Sedangkan morfologi abnormal jika menunjukkan

bemtuk yang tidak bulat, zona pelusida fraktur, sitoplasma tidak bulat dan terjadi

degenerasi (desintegrasi membran plasma dan sitoplasma tidak homogen).

Evaluasi viabititas Oosit dengan Pewarnaan Haescht 33342

Setelah diamati morfologinya, oosit hasii vitrifikasi dari berbagai

konsentrasi EG dan tama paparan yang berbeda diamati viabilitasnya.

Pewarnaan bizbenzimidazole (Hoechst 33342,Sigma.USA) dilakukan untuk

mengetahui viabilitas oosit. Oosit dicuci dengan PBS dan dimasukkan dalam

larutan PBS yang mengandung bizbenzimidamle dengan konsentrasi 10 uglml

dan selanjutnya dilakukan pemeriksaan di bawah mikroskop ffuom~ent (Nikon,

Japan). Oosit dengan kromosom yang berpendar menunjukkan oosit hidup.

Tingkat vlabilitas omit dihitung dari jumlah oosit yang hidup per jumlah oosit

yang diwamal

Analisa Sltoskeletan Ooslt berbasis mikrotubulus dengan lmunohistokimia

Analisis mikrdubulus dilakukan dengan menggunakan metode

imunohistokimia berdasarkar: Ito et a/., (1994) dengan modifikasi. Sel kumulus

pada oosit kontrol dan oosit yang mengalami vitrifikasi dan thawing dihilangkan

sel kumulus dengan cara dipipet berulang-ulang dengan pipet pasteur. Oosit

yang sudah dihilangkan sel kumulusnya difiksasi selama 30 menit dalam drop

yang berisi larutan fiksatif pada cawan ptri. Setelah itu oosit dicuci tiga kali

dalam drop berisi PBS masing-masing 5 menit. Selanjutnya oosit dimasukkan

dalam drop hidrogen peroksida 1 % selama 5 menit dan dlanjutkan dengan

pencucian menggunakan PBS tiga kali masing-masing selama 5 menit. Oosit

dimasukkan dalam 0.3 % Triton X-100 dan 2 % brmaldehid dalam PBS selama

1 jam. Selanjutnya oosit diletakkan dalam 7.5 % FBS =lama 10 menit dalam

suhu ruang an selanjutnya dimasukkan dalam drop antibodi primer (1:200)

seiama 8 jam {overnight). Setelah itu dilakukan pencucian dengan PBS

sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya dirnasukkan

antibodi antibodi sekunder (1:200) setama 30 menit. Selanjutnya oosit dkuci

da4am PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit dan dimasukkan SA-HRP

selama 20 menit. Oosit dicuci PBS 3 kali, masing-masing 5 menit kernudian

dimasukkan dalam drop DAB selarna 5 menit. Langkah berikutnya oosit dicuci

dengan akuades 2 kali masing-msing 5 menit dan dilanjutkan dengan mounting

Oosit diletakkan datarn d'rop entelan pada gelas obyek dan ditutup dengan cover

glass. Selanjutnya dilakukan pengamatan terhadap mikrotubulus aosit dengan

menggvnakan mikroskop cahaya. Skema analisis sitoskeleton adalah sebagai

berikut :

oosl metafase II

[ stabiriasi I 1 +---- dic~r~i PBS 3% I@ 5 menit

1 1% Hz02 seiama 5 mf?nit

I d c u c i PBS 3s @ s menit

dimasukkan medium permeabilisasE 0,3% Wton X-100 dan 2% formaldetrid dalam PBS 1 jam

I . f 7.5 % FBS pada suhu ruang]

I

r ditambah anti p tubulin (1:200) > djam l-mei PBS 3s @ 5 mcoit

I Ab Sekunder (1:200) selama 30 +nit 1 V i PBS 3x @ 5 menit

[ SA HRP selama 20 m$it 1 d e u c i PlfS 3x @ 5 menit

-

1 kromogen DAB 1 . r Mounting dengan e

1

Gambarl. Skema Analisis Struktur Sibskeleton oosit Barbasis Mikrotwbulus

Analfsis Data

Rancangan penelitian yang digumkan adalah rancangan acak lengkap

pola faktorial 6x3 rnenggunakan 6 kali ulangan. Faktor pertana adalah

konsentrasi krioprotektan Etilen Glikol, yaitu kontml 10 %; 20 %,30 %,40 % dan

50%. Faktor kedua adaiah lama paparan, yaitu 1. 3 dan 5 menit. Analisis ragarn

digunakan untuk rnenguji penga~h konsentrasi EG dan lama paparan terhadap

morfologi dan viabilitas. Analisa data rnenggunakan program SPSS. Untuk

rnenganalisa gambar stwktulr struktursitoskeleton berbasis mikrofubulus

dilakukan secara deskriptif

V. HASlL DAN P E M W S A N

5.1. Evaluasi Morforogi Oosit Mt-ll Setelah Vdrifikasi dalam Berbagai Kmentrasi Etilen Glikol dan Lama Paparan.

Penelitian vitrifikasi ini menggunakan krioprotektan intraseluler etilen

glikal dalam behgai konsentrasi (10,20,30,40 dan 50 %) dan sukrosa

0.5 M sebagai krioprotektan ekstraseluler dengan lama papamn 1,s dan 5

menit. Hasil vitrifikasi wsit menggunakan berbagai konsentrasi EG dan

lama paparan yang berbeda menghasilkan morfologi oosit yang berkeda

Morfologi oosit dikelarnpokkan menjadi 2 yaitu morfologi normai dan

abnormal (Gambar 2). Morfologi oosit diklasifikasikan normal apabila

menunjukkan bentuk bulat dengan rnembran plasma utuh dan sibplasma

bulat dengan granulasi kompak homogen. Sedangkan morfologi

abnormal jika menunjukkan bentuk yang tidak bulat, zona pelusida

fraktur,sitoplasma tidak butat dan terjadi degenerasi.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi EG berpenga~h

nyata telfiadap rnorfologi oosit normal (p<O,OI), sedangkan lama paparan

tidak berpengaruh nyata (pz0,Ol). Terdapat interaksi antara konsentrasi

EG dan lama paparan (pc0,Ol). Konsentrasi 30 % dengan lama paparan

menit 3 menit menghasilkan morfologi normal cusit sebesar 86.6 %

apabila dibandingkan dengan kontrol (oosit yang tldak mengalami

vitrifikasi) yang mempunyai morfologi normal sebesar 88.3 %, keduanya

menunjukkan tidak ada perbedaan yang bermakna (p>O,Ol).

Gambar 2. MorfoEogi omit normal dan abnormal haail vimkasi mengaunakan EG

Ketecanaan : a : oosit normal b , ~ : oosit abnmal

Garnbar 3. Peisentase oosit n o m l hasif vitriikasi dengan variasi konsentrasi EG dan lama paparan

Persentase morfalogi oosit normal berbeUa pada konsentrasi den

lama paparan yang berbeda, Lama papamn 3 menit dan konsentmi EG

30 % memberikan morfologi normal terbaik. Perlakuan EG 10% dengan

lama paparan 1 (menit dan EG 50% dengan lama paparan 5 menit

rnenunjukkan nllai morfologi oosit normal yang terendah, masing-rnasing

18.3 % dan 21.7 %.

ApaMla dibandingkan dengan konsentrasi krioprobkbn yang lailn,

yaitu EG 10 %, EG 20 %, EG 4Q %,EG 50 %, rnaka EG 30 %

menghasilkan nilai morfnlogt normal yang tertinggi. Hal ini membuktiian

bahwa konsen2tasi EG 30 % rnempakan komntrasi optimum untuk

vitrifikasi oosit karnbing. Medium vitrifikasi 30 % EG sebagai

kriaprotektan intraseluler dan 0.5 M sukrosa sebagai krioprotektan

ekstraseluler dapat rnengharnbat kerusakan oosit yang disebabkan deh

proses vitrifikasi. Kriopmtektan dangan konmtrasi 30 % dapat

rnencegah terbentuknya kris3al es intraseluler sehingga mencegah

kerusakan sel. Molekul-molekul air di dalam sel blah keluar dari sel dan

krioprotektan intraseluler masuk ke dalam sel hingga tidak terjadi

pernbentukan kristal 6s intraseluler (Dinnyes et al.. 2000).

Hasil penelian ini menunjukkan bahwa pada konsentwi EG 110 %

dan 20 %EG, w i t banyak mengalami kerusakan. Path konsentrasi

rendah kriopmtektan fidak mampu metindungi omit selama proses

vitrifikasi berlangsung sehingga oosit rusak saat terkena paparan suhu

dingin. Pada konseltrasi EG 10% dan EG 20%, lingkungan hidrofobik

yang hilang Bdak sepenuhnya terganti aieh eZilen glikol. Vajta (20QO)

manwmukakan bahwa pada konsentrasi y n g terlalu rendah

krioprotektan tidak dapat menoegah terjadinya pembentukan kristal es

intraseluler akibat penunrmn suhu yang sangat cepat dan mengakibatkan

kerusakan sel. Pada konsentrasi krioprotektan EG 40% dan SO%, oosit

banyak mengalami kerusgkan temarna pada konsentrasi 50% EG. Hal ini

disebabkan konsentrasi krioprotektan yang terlalu tinggi dapat beMat

toksik den merusak sitoplasma sel (MI, 1996; Kwwayama, 1999: Shaw

e t d 2000).

Fakbr pembentukan kristal es dan bksisitas merupakan faktor

utama dalam kriopreservasj dengan metode vitrifikasi. Keseimkngan

antara pencapaian keeepatan pendinginan (cooling rate) maksimum untuk

menoegah pembentukan kristal e$ dan penggunaan sekecil mungkin

konsentrasi krioprotektan yang bersifat taksik tefhadap sel merupakan

dm ha1 penting yang haw diperhaiikan.

Kewsakan yang terjadi pada ooplasma disebabkan karena

terbentuknya kristal es intmseluher sehingaa organel yang terdapat di

dalm sel pecah akibal ekspansi es. Faktqr lain yang dapat

menyebabkan terjadinya kerusakan pada ooplasma adalah karena

terjadinya dehidrasi baik dari suspensi media intra dan ekstmseluler

sehingga oosit mengalami pengkenttan rnaupun pembengkakan

(sweiliflg). Strategi yang diunakan untuk menghindaa bksisitas

larutan vitrifikasi adalah memperpendek wktu pernaparan clengan

larutan. Namun jika waktu pemaparan terlalu pendek, maka penyerapan

knopmtektan tidak cukup, sehingga es intraseluler mgsih &pat terbentuk.

Oleh karena iltu waktu pamaparan optimal untuk kebrhasilan vitrifikasi

diprlukan sebagai petTimbangan untuk mempertahankan dari toksisitas

dan menjaga agar tidak tefbentuk es ekstraseluler (Triwulanningsih,

1997).

Kasai (1996) dan Wetzels (1996) mengemukakan bahwa kerusakan

sel dapat terjadi akibat dari peningkatan osmolaritas m@i krioprewasi

sehingga krioprotektam rnenjadi bersht racun, kerusakan fisik kamna

terbentuknya kristal es ekstraseluler, atau terjadinya osmotic suvelliing

L.2. Tingkat Viabilitas Omit Mt-ll Setelah VWfikasi dalam berbagai

konsentrasi Etilen Glikol dan Lama paparan.

Viabilitas oosit dinyatakan dalarn persentase jumlah oosit hidup per

seluruh jumlah dosilt yang diamati. Pengamatan viabilitas dilakukan

dengan pewaman menggunakan Hoechst 33342 dan diamati dibawah

mikroskop ff uorescent

Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlaltuan konsentrasi

EG betpengaruh sangat nyata (p<0,01) terhadap oosit yang hidup,

sedangkan lama paparan tidak mempunyai pengaruh (p>0,01) terhadap

oosit yang hidup.

Hasil penetitian ini sesuai dangan hasil yang dipemleh Kuwayama

ef af., (1999) pada oosit manusla bahwa metode vitrifikasi dengan

campuram 30 % EG dan 0.5 M. Sukrosa dapat men- viabilitas msit

setelah dibekuken sebesar 90%. Kasai (1996) mbuktikan h twa

pnambahan 30% EG pada llarwtan PBS meningkatkan tinskat

kelangsungan hidup atau s-val rate in vitro uosit tiltus sampai dengan

98%. Marnun demikian penelitian ini berbeda dibandingkan dengan hasil

penelitien Otoi ef al. (1998) yang rnenuFjuWCgn bahwa penggunaan

krioprotekpan EG 40 % dalam larutan viZriSrkasi lebh &k pengatuhnya

tefiadap viabilltae dibandingkan EG 3D %. Perbedam ini disebabkan

lama paparan yang berbeda.

Paparan krioproteklan pada msit sapii seperti penelian CRoi eel a/.

(1998) menunjukkan hasil bahwa waW pernapran 1 menit, 5 menitdan

10 men~l trdak menampakkan petbedaan yang signifikan. Penelitian

Dhali el al. (ZUOU) menunjukkan bahwa waktu paparan 3 menit cukup

baik digunakan wntuk viPifikasi wit kerbau, sedangkan Rayos et a/.

(1 994) melaporkan bahwa waktu paparan 10 rnenEt menunjukkan hasil

yang baik terhadap rnorfolagi oosit tikus dibandingkan dengan waktu

paparan 5 menit.

Perlakuan vitrifikasi pada media vitrifikasi 40% EG dan 50% EG

ooeit banyak mengalami kematian tenrtama pada konsentrasi 50% EG

Hal ini dikarenakan krioprokktan dengan Ronsentrasi pekat dapat bersifat

toksik bagi Wsit 6an dapa* menyebabkan kematian sel (Kasai, 1396).

Hasil penelitian Arav et a/., (1993) mnunjukkan bahwa sel yang

mengalami ktTopwemsi dapat menimbulkan stres osmatik ataupun

keracunan kirniawi yang Bisebabkan tinggimya komsentrasi krioprotektan

yang digunakan sehingga organel sel akan w a k dan mengganmu

proses metabolisme.

Shaw et a/.,( 2000) dan Kasai (2002) mengemwkakan bahwkl secara

garis beSar dapat dlkmukakan tiga faktor yang dapat menyebabkan sel

berdegenerasi atau mati karma proses pemaparan dalam Mopreservasi,

yaitu: a. keruwkan mekanis dengan tirnbulnya pembsntukan kristal es

intraseluler yang dapat mmpengmhi s%ruktur sel; b. dehidrasi dlari

swpansi media intfa maupun ekstrasebler sehingga konsentrasi menjadi

toksik dan ktal. Dehidrasi juga dapat menimbulkan presfpiW, koagulasi,

kenaikan prmeabilitas dan viskositas ~6rta gangguan keseimbangan ion.

c.perubahan fisika-kimiawi diarrtaranya kehilapgan sifat-sifat a M f atau

sifplt-sffat pengikatan air setta interaksi dad ketiga fplktor tersebut.

5.3.. Analisa Struktur Sitoskeleton Oosit EkFtMsis Mikrohrbulus

mengg~unakan Metode lmunohi6tokirnia

Pengamatan sitoskeleton baik oosit segar maupun msit hasil

vitrifikasi menggunakan metode imunahistokimia. Hasil pengamatan

rnenunjukkan adanya perbedaan struktur mikmtubul oosit kmtrol dan

oosit hasil vihifikasi. MikPatubul m p a k a n struktur sel penymm spindel

mebtik yang berpem penting dalam pembelahan sel. Pada onsit kontrol

mikrotubul tampek sepefti benang-benang m a m a k d l a t a n (Qambar

5). Pada konsentrasi EG 1046, 20%. 40%, dan 50% stfuktur rnikm'tubulus

tidak tampak seperti pada kontrol, tetapi menunjukkan adanya

deplimerisasi. Untuk rnenjaga fungsi oosit, struktur sitoskeleton berbasis

mikrotubulus haws dapat dipertahankan, untuk in1 EG sehesar 30 %

brbukti &pat rnencegah ke~usakan lebih lanjut dari sitoskeletcm. Seperti

tampak pada Gamhr 6, oosit dengan pertakuan EG 30 %, struk.tur

sitoskeleton tampak sepvti benang yang berati mash b i a mengalami

recovefy, sedangkan pada konsentrasi EG yang lain, &ibkeleton oosit

UKnpaK mengabmi kewkan.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ada hubwrgan antara

morfologi dengan viabilitas aosit, bahwa pada konsentlgsi EG 30 % oosit

menunjukkan persentase morfologi normal yang tertinggi (86.6%) dan

persentase oosit hidup tartrnggi ( 78.7 %) dibandingkan konsentrasi EG

yang laih. Vlabilitas oosR temyata juga ada hubungan dengan smktur

sitmkelelon berbasis mikrotubulus. Struktur sitoskeleton oosit pada

vitrifkasi dengan 30 % EG menunjukkan tingkat kerusakan yang paling

rendah dibandingkan pada konsentrasi EG yang lain

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi EG 10 %

dan 20 %EG, msit banyak mengalami kerusakan. Pada konsentrasi

rendah krioprotektan tidak rnarnpu melindungi oosit selama proses

vitrifikasi berlangsung sehingga oosit rusak saat terkena paparan suhu

dingin. Pada konsantrasi EG 10% dan EG 20%, lingkungan hjdrofobik

yang hilang tidak sepenuhnya terganti oleh etilen glikol. Vajta (2000)

mengernukakan bahwa pada konsentrasi yang terlalu rendah

krioprotektan tidak dapat mencegah tejadinya pernbentukan kristal es

intraseluler akibat penurunan suhu yang sangat -at dan mengakibatkan

kerusakan sel. Pada konsentrasi krioprotektan EG 40% den 50%, mslt

banyak mengalami kerusakan terutarna pada konsentrasi 50% EG Hal ini

disebabkan konsentrasi krioprotektan yang telllalu tingar dapal bersifat

toksik dan merusak sitoplasma sel (Kasai, 1996; Kuwayama, 1999; Shaw

et el, 2000).

Ditambahkan oleh Kasai (1996) bahwa karena toksisiias lawtan,

pengenceran cepat pada larutan vitrifikasi setelah pewairan adakah

penting. Ketika oosit dipemneasi oleh krioprotektan, oosit terancarn

ke~sakan dari pembengkakan osrnotik karena air melakukan penneasi

jauh lebih cepat dibandingkan dengan kriopmtektan rnelalukan difosi

keluar.

Penelitian Shaw ef a/. (2000) dan Ermlu et a/., (1998)

menunjukkan bahw proses pend~nginan merupakan rnasalah dalam

kriopreservasi oosif rnarnalia. Semua oosit tahap M-ll rentan terhadap

kerusaitan pendinginan karena spindel yang menarik kromosorn pada

bidang rnetafase dan rnengalami depolirnerisasi ketika suhu diunmkan.

Lane (1999) dan Picton (2000) rnenyatakan bahwa rnikrotubul yang

rnenyusun spindel oosit sangat sensitif terhadap kewsakan akibat proses

pendinginan. Arnan dan Paks (1994) rnenyatakan bahwa pendinginan

m S i t sapi 4 ' ~ atau 2 5 ' ~ rnenyebabkan sebagian atau seluruh spindel

rnengalami kerusakan dan beberapa krmoson rnenyebar atau terupai.

Mekanisme kerusakan rnikrotubul oosit akibgt proses vitrifikasi

disebabkan oleh banyak faktor. Beberapa penelitian rnenyatakan bahva

kerusakan tersebut terjadi karena depolirnerisasi tubuiin yang rnenyusun

~mikrotubul. Menurut Karp (1984) rnikrotubul dalarn set rnerniiiki stablitas

yang berbeda rneskipun secara rnorfologi kdihatan =ma. Mikrotubul

spindel rneiotik dan sitoskeleton sangat labil sehingga sensitif tethadap

kerusakan, sedangkan rnikrotubul pada silia dan flagela relatif lebih stabil

strukturnya. Sifat labil rnikrotubul spindel rneiotik dan sbkeleton

rnenunjukkan bahwa mikrotubul merupakan suatu polirner yang terbentuk

rnehlui ikatan nonkovalen pada subunit rnonornemya. Perlakuan yang

rnenyebabkan hilangnya struktur tersebut biasanya disebabkan

depolimerisasi rnikrotubul. Hal ini dirnungkinan karena depolinetisasi

dapat menyebabkan kondisi rnikrotubul oosit yang mendapat pedakuan

vitrifikasi terurai rnenjadi bentuk monamer.

kwsakan rnikrotubul oosit hasil vitriflkasi juga dapat diibabkan

oleh paparan kriopmtektan yang digunakan. Menurut Agca et a!. (2000)

krioprotektan mernpunyai efek merwgikan pada organisasi sistem

mikrotubul oosit tikus. Paparan -it tikus menggunakan 1,5 M OMSO

tanpa pendinginan menyebabkan terjadinya aneuploidi pada embrio. Lim,

et a/.. (1999) menyatakan bahwa oosit sapi yang telah rnencapai tahap

metafase II sangat sensitif terhadap kriopmtekkn dan didapatkan spindel

rnetafase II abnormal setelah papamn kriaprotektan selarna satu menit.

Saunders dan Parks (1999) berpendapet bahwa kornbinasi papamn oosit

sapi dengan knopmtekn EG yang disertai pendinginan dapat

mengacaukan organisasi mikrotubul dibandingkan hanya melalui

pendinginan. Selain itu EG dilaporkan dapat rneningkatkan terbenbknya

spindel yang abnomml dan merusak konfigurasi kromosom.

Faktor lain yang rnempengaruhi tejadinya kerusakan mikrotubul

adalah kemampuan memperbaiki kerusakan. Penelitian ini menggunakan

oosit yang telah mengalami maturasi yang &@an besar pada tahap

pembelahan metafase II, dimana pada tahap ini oosit mengalami maturasi

inti dan matumsi sitoplasmik, polar bodi keluar dan kromoson mengalami

kondensasi serta tersusun pada spindel metafase. Mikmtubul spindel

meiotik tldak terlindung oleh membran inti seperti pada M a p GV

sehingga lebih mudah mengalami kerusakan akibat proses pendinginan

dan pernapawn larutan kriprotektan. Menurut Arav et al.,(1993) osit

yang sudah rnencapai tahap metafase II mempunyai struktur spesifik

seperti spindel meiosis yang sangat sensitive terhadap paparan

kripmtektm, suhu sangat rendah yang rnengakibatkan terjadinya

depolirnerisasj tubulin. Picton et a/., (2000) menyatakan bahwa

pendinginan msit pada suhu 2 0 ' ~ dapat menyebabkan kewsakan

permanen pada spindel meiotik, sedangkan pada suhu d i w a h o°C

tejadi depolimaerisasi spindel dengan cepat. Kerusakan yang tejadi

akibat pendlnginan oosit metafase meiosis I1 rneliputi reduksi spindel,

disorganisasi mikrotubul (Pickering eta/., 1990), hilangnya kromosom dan

splndel meiotik (Wood et al., 1997) den hilangnya kestabilan ikatan

kromomn (Fabri et al., 2001).

Kerusakan rnikrotubul oosit pada perlakuan vitrifikasi dapat

menyebabkan abnormalitas pada kromosom. Hal itu bemubungan denganl

peranan miklntubul dalam pembelahan sel. organisasi mikrotubul sangat

penting untuk penyatuan yang tepat dan pemisahan kromosom ketika

pembentukan spindel kembali pada saat suhu kembali normal (Wcton et

a1.,2000). Selanjutnya Shaw et a/., (2000) dan Newton (2001).

menyatakan bahwa meskipwn mikrotubul dapat mengalami perakin

kembali setelah suhu normal kembali, pendinginan dapat meningkatkan

terjadinya aneuploidi karena kromosom tidak tersusun dengan bener pada

spindel yang baru terbentuk.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan

1. Vitrifikasi rnenggunakail 30 9/0 EG dan lama papawn 3 rnenit dapat

mengharnbat kerusakan rnorfolrrgi oosit dan viabilitas yang disebabkan

oleh proses vitrifikasi,

2 Wntuk rnenjaga fungsi oosit, struktur sitoskeleton berbasis rnikrotubulus

hams dapat dipertahankan. EG sebesar 30 YO terbukti dapt mencegah

kerusakan lebih lanjut dgri sitoskelefon. Struktur sitoskelelon pada

perlakuan 30 % EG tampak seperti benang yang berarti masih bisa

mengalami recovery, sedangkan pada konsentrasi EG yang lain.

sitoskeleton oosit tampak mengalami kerusakan.

3. Terdapat hubungan antara morfologi, viabilitas oosit a n struktur

sitoskeleton berbasis rnikrotubulus.

6,2. Saran

1. Untuk melakukan ktiopfesenrasi oosit secara vitrifikasi disarankan

menggunakan Etilen Glikol30 % dengan lama paparan 3 rnenit.

2. Disarankan melakukan analisa ultrastruktur oosit menggunakan

Transmission Electron Microscopy agar dapat menjawab mengapa

terjadi penurunan kwlitas oosit pasca vitrifikasi.

Acker,J.P. and LQcksley, E.M. 2003. Protect'~ve effect of intradtular ice during freezing ?. Cryobiology 46 : 797-202

Agca. Y. 2000. Clyopressnratian sf oocyte and ovarian tissue. http:/www4.nas.edufclsfijhme.nsf/OpenD0~ument.

Aman: R.R. and Parks, J.E. 1994. Effect of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chmmosorne of in vitm matutured bovine oocytes. Biol. Reprod. 1994; 50 : 103-1 10.

Arav, A., Zemn Y., and Ocheretny, A., 2000. A new device and method for vitrification incmase the cooling rate and allows successful cryopresewation of bovine oocytes. Theriogenology 53:248.

Arav, A., D. Shebu, and Wttioli, M. 1993. Osmotic and cytotoxic study of vitrification of immature bovine oocytes. J. Reprod and Fert. 99~353-358

Childs, G.V. 1996. Structure and Function of Microtubules. p.

Desai, A. dan T.J. Mitchison. 1997. Micmtubule Polimerization Dinamics. -arg

Dhali, A., Manik R.S. Das, S.K. Singla and Palta. P. 2000. Effect of ethylene glycol concentration and exposure time on post vitrification survival and in vitm maturation rate of buffalo oocytes. Theriogencvlogy 53:253.

Djati, M.S., 1999. Pengaruh suplementasi PMSG dan hCG pada proses fertilisasi in vitm dan kultur klon embrio sqpi dengan IGF-I. DlseWi 'hat 25. Pmgram Pascasa jana lnstitut Pertanian Bogor, Bogor

Eroglu, A , Toth, T.L and TOner,M. 1998. Alterations of the cytoskeleton and polyptoidy induced by cryopmervation of metaphase II mouse c&yte.- Fert and ~Gril. 65.:944- 957

Fabri, R., Porcu, E., Marsella. T, Rwhetta, G. Venturoli and Flamcgni, C.. 2001. Human oocyte cryopresenration: New perspectives regarding oocyte survival. http://www.3ou~,m.uWesh,relpress- reIease/free~df.l16041 1 pdf.

Fukui, E.J., Xia, L. and Downey, B.R., 1995. UltrastWral changes in bovine oocyte cryoprese~ed by vitrification. Cyobiology 32(2):139156.

Gordon, 1. 11994, Laboratory production of cattle embryos. Cab. International. Cambridge. 55-65

Han, B and Bischof,J.C. 2004. Direct dl injury associated with eutectic crystallization during freezing. Cryobiology 48 : 8-21

Hochi, S., Kimra, K., lto, K, Wirabayashi, Mi 1996. Effect of nuclear stages during in vitro maturation on the survival of bovine w e s following vitdfication. Theriogenology 46345.

Hochi, S., Fujimoto,T., and Oguri, N. 1995. Viability of immature horse oocytes cryopreselved by vitrification. Theriogenology 42:236

Hotarnisligil, S., Toner, M. and Power, R.D. 1996. Changes in membrane integrity, cytoskeletal structure, and develqpmental potential of murine oocytes after vitrification in ethylene glycol. Binlogy Reproduction. 55:161-168.

Hozumi, J. 2001. Reproductive Biology and Biotechnobgy. Japan International Cooperation Agency. lndonesia.22-27

Hyttel, P., Vajta, G. and Callasen, H. 2000. Vitrification of bovine oocytes with the opt?n pulled straw method : Ultra-structural consequences. Md. Reprod and Dev 56:80-88

Ito ,K., Masuda, M., Fujiwara. K and Sato, H. 1994. Do astral microtubules play rode in metaphase chromosome pasitioning?. J.Bology Wluler. 82:95-102

Karp, G. 1984. Cell Biology. Mc Graw-Hill Book Company. New York.

Kasai, M. 2002. Advances in the cryopreselvation of mammalian oocytes and embFyos: Development of ultrarapid vitrification. Reproductive Medicine and Biology. Rev 1:l-9. http:llrwvw.Mackwell-synergy .corn/ links/doi/lO.I 046/j.l445781.2002.00004.

Kasai, M. 1996. Simple and efficient methads for vitrification of mamaltan embryos. Anim. Reprod. Sci 42:67-75.

Kimball, J.W. 1994. Biologi. 1994. Erlangga. Jakarta

Kutwta, C., Yang, X., Dinnyes, A,. Todomki, J, Yamakuchi, H, tvli~shita, K, I n h e , S, Tabara, J. 1998. In vitro and In vivo survival of frozen-thawed bovine o w e s after IVF, nuclear transfer and parthenogenetic activation. Mol Reprod. And Dev 51:281-286.

Kuwayama, M. and Kato, 0. 1999. All-round vitrification methods for human oocytes and embryos. Kato Ladies Clinic. Tokyo 160- 0023, Japan.

Lane, M.B., Bavister,B.D., Lyons and Forest. KT. 1999. Containerless vitrification of mammalians oocytes and embryos. hftp:llwww.biotech.nature.com.

Le Gal, F. 1996. In Wtro maturation and ferfilizatbn of goat ooqks at the germinal vesicle stage. Theriogenology 45:2177-1185.

Leoni, G., Bol;rlioli,L., beWnguer, F.. Rosati, I., Pintus, P.P.. ledda. S., ~aitana. S. 2002. -befined media for vitrification, warming and rehydration : effects on post-thaw protein synthesis and viability of in v h derived ovine &bryos. ~Gobioi& :2W212.

Lim, J.M, Fukui, Y. and Ono, H. 1992. Developmental competence of bovine oocytes frozen at various maturation stages followed by in vitro rnatu&ion and fertilization. ~heriogfmolag~ 37:351-362

Lim, J.M.,. KO. J.J., Hwang..W.S., Chung,H.M. and Nawa, K. 1999. Development of In Vitro Matured Bovine Oowtes After

Macimr, S.K. 2001. Cytoskektal Dynamiw. h~Jotherrlsmaciver/CS2.pdf

Men, H., Monson, R.L., Parrih, J.J., and Rutledge, J.J. 2003. degeneration of c!yopreseNed bovine ocqtes via apoptosis during subsequent cufture. Cryobiology 47 : 73-81.

Newton. H. 2001. The cryoprese~ation of ovarian tissue as a strategy for preserving the fertility of cancer patients. httD:/lwww.3.ou~,co.uWhuup/hdbNol~me04/I~~~e03I040237.sgm. abs.html.

Otol. T., Yamamoto, K., Koyama,N., Tachikawa, S. and Suzuki, T. 1998. Cryopreservation of mature bovine by vitrification in straws. Cryobiology 37 : 77 - 85

Patk J,E. Ruffing, N.A. 1992. Factors affecting low temperature survival of mammalia oacytes. Theriogenology 37: 5973.

Pickering, S.J., Braude, P.R., Johnson, Cant, A and Cunie, J. 1990. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of The meiotic spindle in the human oocyte. http:/~.ncbi.nlm.nih.aov/entrez/a~ery.f~i~~~eve&db=p ubmed&

Pictan, H. M., Gosden, R.G. and L&h, S.P. 2000. Cryoprese~ation of ocytes and ovarian tissue.hitp://www.who,inl/reprodud~vehealth/

inkrtilill7.pdf

Richardson, R.R. and Parks, J.E. 1992. Eftects of chilling on the meiotic spindle-of bovine ova. Theriogenology 37: 284-287.

Saha, S., Otoi, T and Suzuki, T. 1996. The efficiency of ethylene gly&,trehalose and polyvinilpyrrolidone for su~essful 'vitsificafioll of IVF bovine embryos. J. of Reprod. And Dev. 42:163-169.

Saunders, K.M and Parks, J.E. 1999. Effects of in vltro-matured bovine ~es.http: /~ .bi~rod.o1+1/~i I~~ntent / ful I /61111178.

Shaw, J.M., Omnratnachai, A. and Trounson, A.O. 2000. Fundamental oryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue. Theriogenology 53-.59-72.

Subowo.ZP95. Biologi Sel. Angkasa. Bandung

Stoddart. N.R and Fleming, S.D. 2000. Viability of oacytes after ICSI. human reprodudm l5(7):1580-1585.

Sun,Q.Y., Yang, Q.Z.,Liu, G.Y., Feng, H.L. and Qin, P.C. 1905. Cryoprese~ations of bovine oocytes matured in vitro Theriogenology 42:329.

Triwulanningsih, E. 1997. Pembekuan embrio dengan berbagai krioprotektan dan metode pembekuan. Prosiding Seminar Nasional Peteman dan Veteriner. Balai Penelitian Temak. Bogor

Vajta, G. 2000. Vitrification of bavine ooqtes and embryo. Embryo Technology Center, Danish lhstitute of Agricultural Sciences. Denmark.

Wahjuningsih, S dan Dja3, M.S. 2003. Krioprese~asi oasit -pi Madura untuk pebtarian plasma nu&h Indonesia, Makalah seminar Indonesia Toray Science Foundation, Jakarta 4 Pebruafi 2003.

Wahjuningsih, S. 2002. In vitro maturation of bovine oocytes derived from clyopteservation of dimetyl .%Ifoxide (DMSO). Glyml, and ethylen glycol (EG). Journal of Reprotech, vol. I. No. 2:93-96

Wdhjlmingsih, S. Nurul, I., Ciptadi,G., Suyadi, DjM, MS. 2001. Kuaiitas -it sap yang dibekukan dengan kriopmtektan etilen glikol m l e h pmses maturasi in vitm. Jumai llmu Hayati. Vd 13 No. 2 : 9-15.

Wahjuningsih, 2004. finalisis isngamh Wtr#ikasi terhadap viabilkas dan Struktur Oosit Sapi. Disertasi. Pascasa jana. Universitas Airlangga Surabaya.

Wetzels, AM.M. 1996. Cryopresewation theory. In : M. Bras (editor). IVF Labratory aspects of in vPtro fertilization. N.V. Organon\ Netherlands.

Wood, C.E., Shaw, J.M dan Tmunm, A.O. 1997. Potential reproductive inSUranCe far women at risk of early ovarian failure. Medical Journal of Australia. http:hYvuw.mja.corn.au