I. JUDUL : IDENTIFIKASI MIKROBA

II. TUJUAN

1. Membuat pewarnaan bakteri dan dapat menerangkan reaksi kimia yang

terlibat dalam proses pewarnaan gram.

2. Mengamati morfologi dan fisiologi mikroba.

III. TINJAUAN PUSTAKA

3.1 Pengertian Mikroba

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil

(biasanya kurang dari 1 mm) sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan.

Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniselular) meskipun beberapa  protista 

bersel tunggal masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel

tidak terlihat mata telanjang. Mikroorganisme biasanya mencakup semua prokariota,

protista  dan  alga renik. Fungi, terutama yang berukuran kecil dan tidak

membentuk hifa, dapat pula dianggap sebagai bagiannya meskipun banyak yang

tidak menyepakatinya. Kebanyakan orang beranggapan bahwa yang dapat dianggap

mikroorganisme adalah semua organisme sangat kecil yang dapat dibiakkan dalam

cawan petri atau inkubator di dalam laboratorium dan mampu memperbanyak diri

secara mitosis (Adelia, dkk., 2010).

Mikroba yang ada di alam ini mempunyai morfologi, yang khas. Namun

demikian, penggunaan alat bantu tersebut hanya untuk mengamati morfologisnya.

Masih diperlukan metode lain untuk mampu mengidentifikasinya (Kusmayani, dkk.,

2010).

3.2 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan

gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Bakteri Gram

negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode

pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu

gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji

pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil

ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau

merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini

berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Kusmayani, dkk., 2010).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian

warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).

Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-

ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat

warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa.

Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut

pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat

warna tersebut disebut pewarna asam/negatif (Pramuditya, dkk., 2011).

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

a. Zat warna utama (violet kristal)

b. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan

warna utama.

c. Pencuci/peluntur zat warna (alkohol/aseton) yaitu solven organik yang digunakan

uantuk melunturkan zat warna utama.

d. Zat warna kedua/cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-

sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.

(Lestari, 2013).

Pada dasarnya dinding sel bakteri golongan gram negatif umumnya lebih tipis

dari dinding sel bakteri golongan gram positif. Bakteri gram negatif mengandung

presentasi lipid (lemak) yang lebih banyak daripada yang dimiliki dinding sel bakteri

golongan gram positif. Selama perlakuan dengan alkohol ternyata lemak ini tertarik

ke luar sehingga memperbanyak porositas/menaikkan permeabilitas dinding sel,

akibatnya kristal violet iodin keluar dan bakteri tidak berwarna. Pada bakteri

golongan gram positif yang dinding selnya sedikit mengandung lemak akan

mengalami dehidrasi karena perlakuan dengan alkohol sehingga ukuran pori-pori dan

permeabilitas dinding sel berkurang. Beberapa marga bakteri melepaskan zat

pewarna dengan mudah apabila dicuci, pada bakteri lain, zat pewarna tetap bertahan

walau dicuci dengan alkohol 95%. Organisme yang tidak dapat menahan zat pewarna

setelah dicuci dengan alkohol 95% disebut organisme gram negatif, sedangkan yang

dapat menahan zat pewarna disebut gram positif (Rezqi P, dkk., 2010).

3.3 Aplikasi Identifikasi Mikroba

“Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi

Bali sebagai Kandidat Biopreservatif”

Preservasi merupakan cara untuk mengawetkan produk pangan seperti daging

dan produknya sehingga terhindar dari pembusukan akibat cemaran oleh mikroba.

Metode preservasi yang banyak dipergunakan untuk memperpanjang masa simpan

(helf life) daging/produknya adalah pendinginan pada suhu -2°C sampai 5°C. Selain

itu, pertumbuhan mikroba perusak dapat dicegah dengan pemberian bahan preservasi

kimiawi seperti nitrit, boraks, rhadomin ataupun formalin.

Nisin sebagai bakteriosin merupakan senyawa biopreservatif pertama yang

diisolasi dari bakteri asam laktat Lactococcus lacis spp. Senyawa ini sekarang telah

digunakan di 57 negara sebagai bahan pengawet makanan yang aman dan dapat

mencegah pertumbuhan bakteri perusak atau bahkan bakteri patogen.

Penggunaan bakteriosin sebagai biopreservaif memiliki beberapa keuntungan,

yaitu (1) tidak toksik dan mudah mengalami biodegradasi karena merupakan

senyawa protein, (2) tidak membahayakan mikroflora usus karena mudah dicerna

oleh enzim-enzim dalam saluran pencernaan, (3) aman bagi lingkungan dan dapat

mengurangi penggunaan bahan kimia sebagai bahan pengawet, dan (4) dapat

digunakan dalam kultur bakteri unggul yang mampu menghasilkan senyawa

antimikroba terhadap bakteri patogen atau dapat digunakan dalam bentuk senyawa

antimikrobial yang telah dimurnikan (Suardana, dkk., 2007).

Gambar 3.1 Flowchart Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan

Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif

(Suardana, dkk., 2007)

Bakteri ditumbuhkan dalam media MRS agar

(deMann, Rogosa, Sharpe)

Setelah padat, media MRS agar diinkubasi dalam keadaan anaerob

Koloni yang tumbuh diisolasi dan diseleksi

Selesai

Mulai

Diseleksi bakteri asam laktat penghasil substansi antimikroba

Bakteri asam laktat selanjutnya diisolasi dan diidentifikasi berdasarkan sifat koloni

Isolat dikelompokkan berdasarkan genusnya

100 gram sampel cairan rumen diencerkan

dengan 100 ml larutan NaCl

Dilakukan uji fisiologis dan biokimia

IV. METODOLOGI PERCOBAAN

IV.1 Bahan dan Fungsi

1. Kristal violet

Fungsi: sebagai bahan untuk pewarnaan gram pada bakteri.

2. Larutan iodin

Fungsi: sebagi bahan untuk pewarnaan gram pada bakteri.

3. Aseton alkohol

Fungsi: sebagai bahan untuk pewarnaan gram pada bakteri.

4. Safranin

Fungsi: sebagai bahan untuk pewarnaan gram pada bakteri.

5. Air parit Rumah Sakit USU

Fungsi: sebagai mikroba yang akan diamati dan diberi pewarnaan.

6. Air parit Fakultas Keperawatan USU

Fungsi: sebagai mikroba yang akan diamati dan diberi pewarnaan.

IV.2 Peralatan dan fungsi

1. Kawat inokulasi

Fungsi: sebagai alat untuk mengambil sampel dan penggerus pada kaca

objek.

2. Pipet tetes

Fungsi: untuk mengambil larutan pewarna.

3. Kaca benda

Fungsi: sebagai tempat untuk meletakkan objek yang akan diamati.

4. Mikroskop

Fungsi: sebagai alat untuk mengamati bentuk mikroba.

5. Lilin

Fungsi: sebagai sumber api untuk mensterilkan kawat inokulasi dan

fiksasi sampel.

6. Tisu

Fungsi: sebagai alat untuk menyerap air yang berlebih pada kaca objek.

7. Penjepit tabung

Fungsi: sebagai alat untuk menjepit kaca objek saat fiksasi.

4.3 Prosedur Pewarnaan Gram

1. Air parit Rumah Sakit USU diambil dengan menggunakan kawat inokulasi

yang telah disterilkan terlebih dahulu dengan lilin.

2. Bakteri diambil sebanyak 4 atau 5 loop lalu digoreskan ke atas kaca objek

lalu dibiarkan kering di udara terbuka kemudian difiksasi di atas api lilin.

3. Diamati di bawah mikroskop.

4. Digambar hasil yang didapat.

5. Preparat dibasahi dengan kristal violet lalu dimiringkan untuk membuang

cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan air.

6. Kemudian preparat dibasahi iodin lalu dimiringkan untuk membuang

cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan air.

7. Kemudian preparat dibasahi alkohol aseton lalu dimiringkan untuk

membuang cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan

air.

8. Kemudian preparat dicuci dengan safranin lalu dimiringkan untuk

membuang cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan

air.

9. Preparat dikeringkan dengan tisu lalu diamati dengan mikroskop dan

hasilnya digambarkan.

10. Percobaan diulangi untuk sampel air parit Fakultas Keperawatan USU.

4.4 Flowchart Percobaan Pewarnaan Gram

Mulai

Diambil bakteri 4 atau 5 loop dan digoreskan ke atas kaca objek lalu dibiarkan kering kemudian

difiksasi di atas api lilin

Diambil preparat dengan kawat inokulasi steril

Diamati preparat dibawah mikroskop

Digambar hasil yang didapat

Preparat dibasahi dengan kristal ungu

Preparat dibasahi dengan larutan iodin

Preparat dibasahi dengan larutan aseton-alkohol

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

A

Gambar 4.1 Flowchart Percobaan Pewarnaan Gram

TidakYa

Selesai

Apakah mikroba berwarna ungu?

Preparat dibasahi dengan safranin

Diamati sampel di bawah mikroskop

Digambar hasil yang didapat

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Gram Positif Gram Negatif

A

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

V.1 Hasil

Tabel 5.1 Hasil Pewarnaan Gram

Sampel

Gambar BakteriMorfologi

BakteriKeteranganSebelum

Pewarnaan

Setelah

Pewarnaan

Air Parit

Rumah Sakit

USU

Coccus Gram Negatif

Air Parit

Fakultas

Keperawatan

USU

Bacillus Gram Positif

5.2 Pembahasan

5.2.1 Air Parit Rumah Sakit USU

Hasil yang diperoleh pada pengamatan mikroba lingkungan akuatik dan

pewarnaan gram dengan sampel air parit Rumah Sakit USU didapat bahwa mikroba

yang ada pada sampel adalah genus Coccus. Bentuk-bentuk bakteri Coccus, yaitu :

a. Monokokus yaitu berupa sel bakteri kokus tunggal.

b. Diplokokus yaitu dua sel bakteri kokus berdempetan.

c. Tetrakokus yaitu empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi empat.

d. Sarkina yaitu delapan sel bakteri kokus berdempetan membentuk kubus.

e. Streptokokus yaitu lebih dari empat selbakteri kokus berdempetan

membentuk rantai.

f. Stapilokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan seperti

buah anggur.

(Winati, 2014).

Gambar 5.1 Bentuk-Bentuk Bakteri Coccus

(Winati, 2014)

Pada dasarnya dinding sel bakteri golongan gram negatif umumnya lebih tipis

dari dinding sel bakteri golongan gram positif. Yang pertama mengandung presentasi

lipid (lemak) yang lebih banyak daripada yang dimiliki dinding sel bakteri golongan

gram positif. Selama perlakuan dengan alkohol ternyata lemak ini tertarik ke luar

sehingga memperbanyak porositas/menaikkan permeabilitas dinding sel, akibatnya

kristal violet iodin keluar dan bakteri tidak berwarna (Rezqi P, dkk., 2010).

Menurut teori, bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan

terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada

saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah (Lestari, 2013).

Berdasarkan percobaan, bakteri Coccus pada air parit Rumah Sakit USU

merupakan bakteri gram negatif, karena setelah diwarnai dengan safranin, bakteri

berwarna merah.

5.2.2 Air Parit Fakultas Keperawatan USU

Hasil yang diperoleh pada pengamatan mikroba lingkungan akuatik dan

pewarnaan gram dengan sampel air parit Fakultas Keperawatan USU didapat bahwa

mikroba yang ada pada sampel adalah genus Bacillus.

Bentuk-bentuk bakteri Bacillus, yaitu :

a. Basil tunggal, berupa batang tunggal, contohnya Escherchia coli dan Salmonella

typi.

b. Diplobasil, berbentuk batang bergandengan dua-dua.

c. Streptobasil, berupa batang bergandengan seperti rantai, contohnya

Streptobacillus moniliformis dan Azotobacter sp.

(Pramuditya, dkk., 2011).

Gambar 5.2 Bentuk-Bentuk Bakteri Bacillus

(Pramuditya, dkk., 2011)

Bakteri yang menghasilkan endospora tahan panas diklasifikasikan dalam

famili Bacillaceae, kecuali bakteri anaerobik penghasil endospora, genus Bacillus

adalah famili yang terbesar, termasuk juga Sporosarcina dan Sporolactobacillus.

Analisa dari rRNA oleh sebagian oligonukleotida menunjukkan bahwa ada hubungan

dekat antara genus Bacillus, Planococcus, Sporosarcina, Staphylococcus, dan

Thermoactinomyces dan dinyatakan bahwa Bacillus sebagai takson yang cukup

bagus. Selanjutnya, studi homologi DNA menunjukkan bahwa spesies Bacillus

seperti B. circulans, B. megaterium, B. sphaericus dan B. stearothermophilus dikenal

beraneka ragam dan perlu dilakukan revisi taksonomi (Priest, et al., 1988).

Bakteri Bacillus gram positif, yaitu:

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis merupakan salah satu yang paling banyak digunakan untuk

produksi enzymes dan bahan kimia khusus. Aplikasi industri termasuk produksi

amylase, protease, inosine, ribosides, dan asam amino.

Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis  sudah dikenal luas sebagai bakteri pathogen terhadap

serangga. 

Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis sangat bermanfaat sebagai probiotik dan biasa

dimanfaatkan untuk meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan ikan.

Bacillus brevis

Bacillus brevis sangat bermafaat bagi kehidupan manusia yaitu menghasilkan

terotrisin. Tirotrisin merupakan antibiotik pertama yang dipakai untuk mengobati

penyakit-penyakit manusia.

(Dika, 2015).

Menurut teori, bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu

gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak

(Kusmayani, dkk., 2010).

Berdasarkan percobaan, bakteri Bacillus pada air parit Fakultas Keperawatan

USU merupakan bakteri gram positif, karena setelah diwarnai dengan safranin,

bakteri mempertahankan warna ungu.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Adapun kesimpulan yang diperoleh adalah:

1. Mikroba yang terdapat pada air parit Rumah Sakit USU adalah bakteri

dengan morfologi Coccus.

2. Mikroba yang terdapat pada air parit Fakultas Keperawatan USU adalah

bakteri dengan morfologi Bacillus.

3. Bakteri Coccus yang terdapat pada air parit Rumah Sakit USU merupakan

bakteri gram negatif.

4. Bateri Bacillus yang terdapat pada air parit Fakultas Keperawatan USU

merupakan bakteri gram positif.

6.2 Saran

Adapun saran yang dapat diberikan adalah:

1. Sebaiknya percobaan dilakukan dengan beberapa variasi sampel, misalnya

air rendaman sayur-sayuran.

2. Disarankan untuk mengunakan pewarna lain seperti eritrosin sebagai

pembanding dengan pewarna safranin.

3. Percobaan sebaiknya dilakukan dua kali untuk memperoleh pengamatan

bakteri secara akurat.

DAFTAR PUSTAKA

Adelia., Dadan Khusnudzan., Novita Silvi A., dan Dimas Rendra G. 2010. Makalah

Identifikasi Mikroba Berdasarkan Sifat Kimiawi. Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan. Bandung : Universitas Padjadjaran.

Dika, Djumbawan. 2015. Makalah Bakteri Positif. www.academia.edu. Diakses pada

tanggal 3 Maret 2015.

Kusmayani, Indriati Sari., Wida Hanayasashi S., dan MA. Faisal Datu Sefa. 2010.

Identifikasi Mikroba Berdasarkan Sifat Kimiawi. Program Studi Ilmu Kelautan.

Fakultas Perikanan dan Imu Kelautan. Bandung : Universitas Padjadjaran.

Lestari, Rina. 2013. Pewarnaan Sederhana, Negatif, Kapsul, dan Gram. Program

Studi D3 Kebidanan. Yogyakarta : Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan

Yogyakarta.

Pramuditya, Alfian., Daris., dan Diah Oktiva Furi. 2011. Pewarnaan Gram dan

Pengamatan Morfologi Bakteri. Program Studi Gizi S1. Fakultas Ilmu

Kesehatan. Surakarta : Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Priest, Fergus G., Michael Goodfellow., and Carole Todd. 1988. A Numerical

Classification of the Genus Bacillus. Journal of General Microbiology. United

Kingdom.

Rezqi P, Erfitra., Evi Ayu Chandra., Jihan Mawaddah., dan Rina Dwi A. 2010.

Pewarnaan Gram. Jurusan Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Malang : Universitas Negeri Malang.

Suardana, Wayan I., I Nyoman Suarsana., I Nengah Sujaya., dan Komang Gede

Wiryawan. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan

Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif. Jurnal Veteriner. Denpasar :

Universitas Udayana.

Winati, Ni Kadek Lina. 2014. Pengertian Mikrobiologi & Bentuk, Struktur, dan

Morfologi Bakteri. Jurusan Analis Kesehatan. Denpasar : Politeknik

Kesehatan Denpasar.

LAMPIRAN A

FOTO SAMPEL

LA.1 Air Parit Rumah Sakit USU

Gambar A.1 Air Parit Rumah Sakit USU

LA.2 Air Parit Fakultas Keperawatan USU

Gambar A.2 Air Parit Fakultas Keperawatan USU

LA.3 Foto Pengambilan Sampel Air Parit Rumah Sakit USU

Gambar A.3 Foto Pengambilan Sampel Air Parit Rumah Sakit USU

LA.4 Foto Pengambilan Sampel Air Parit Fakultas Keperawatan USU

Gambar A.4 Foto Pengambilan Sampel Air Parit Fakultas Keperawatan USU