KULTUR DAN FUSI PROTOPLAS

1. Kultur Jaringan

Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam dengan induknya.

Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Penggunaan kultur jaringan untuk pembiakan klonal didasarkan pada anggapan bahwa jaringan secara genetik tetap stabil jika dipisahkan dari tumbuhan induk dan ditempatkan dalam kultur. Pendapat ini sebahagian besar berlaku jika tumbuhan dibiakkan dengan kuncup ketiak atau tunas liar yang secara langsung dipisahkan dari tanaman. Walaupun demikian, apabila tunas terbentuk dari jaringan kalus, sering terjadi penyimpangan.

Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni: kultur biji (seed culture),

kultur organ (organ culture), kultur kalus (callus culture), kultur suspense sel (suspension culture), kultur protoplasma dan kultur haploid. Sel tanaman pada umumnya dilindungi oleh dinding sel dari selulosa yang keras untuk menopang struktur tanaman. Sel tanaman yang telah kehilangan dinding selnya disebut dengan istilah protoplas. Protoplas dapat diisolasi dari berbagai macam jaringan ataupun organ tanaman seperti daun, tunas,akar, dan buah. Pada kultur protoplasma, eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).

2. Kultur Protoplas

Kultur protoplasma dapat digunakan untuk berbagai macam tujuan seperti perbanyakan dan untuk memperolehvarietas baru. Teknik yang digunakan untuk memperoleh hibrida ini antara lain perlakuan protoplasma dengan mutagen dan manipulasi genetik ditingkat sel melalui fusi (penggabungan) dua protoplasma dari varietas atau spesies yang berbeda serta penggunaan protoplasma dalam rekayasa genetika ditingkat molekuler dengan teknik elektroporasi, mikro injeksi atau partikel bombardment.

3. Mekanisme Kultur Protoplas

Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma dapat dilakukan dengan menambahkan senaywa mutagen ke dalam media tanam atau dengan memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut. Silangan somatik dilakukan dengan cara penggabungan dua buah protoplama segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur protoplasma secaraa umum adalah sebagai berikut:

1)   Persipan eksplan.

Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam, umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan. Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenchyma (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder.

2. Sterilsasi eksplan.

Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 – 2 % selama 10 – 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril (3 – 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan.

3. Isolasi Protoplasma.

Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat mengahancurkan dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya. Berikut dikemukanan perbandingan antara dinding sel primer dan sekunder pada sel tumbuhan

Protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti: daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora. Diantara organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena: Bentuk selnya relatif seragam, tidak perlu membunuh tanamannya, dinding sel

mudah terkelupas oleh enzim. Enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan umumnya ada 3 yaitu: Cellulase untuk menghancurkan sellulose, Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose, Pectinase untuk menghancurkan pektin.

4. Fusi Protoplasma

Fusi protoplasma adalah usaha yang dilakukan manusia untuk menggabung protoplasma (isi sel) dari dua macam sel yang berbeda berasal dari tumbuhan tingkat tinggi secara alami maupun sengaja. Pada fusi protoplas ini biasanya digunakan sel tubuh (sel somatis). Tujuan fusi protoplas adalah untuk mendapatkan suatu hibrida somatik atau mengatasi kelemahan dari hibrida seksual. Terdapat kelemahan dari hibrida seksusal, yaitu:

a) Sukar untuk mendapatkan suatu hibrida antar-spesies dan antar genera. Hibridisasi somatik dapat mengatasi hal tersebut.

b) Sitoplasma pada perkawinan seksual hanya berasal dari induk betina saja. Dalam proses pembuahan, gamet jantan hanya membawa inti saja dengan sedikit sitoplasma sebaliknya pada tetua betina selain inti juga sitoplasma. Untuk mendapat sitoplasma dari kedua tetua diadakan fusi antara sitoplasma.

Fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu family (inter-genus). Penggunaan fusi protoplas memungkinkan diperolehnya hibrida-hibrida dengan tingkat heterosigositas yang tinggi walaupun tingkat keberhasilannya sangat ditentukan oleh genotipenya. Teknologi fusi protoplas juga dapat dilakukan untuk mendapatkan sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap hama dan penyakit serta cekaman abiotik. Dengan demikian, tanaman hasil fusi dapat berupa tanaman dengan sifat-sifat gabungan dari kedua tetuanya termasuk sifat-sifat yang tidak diharapkan terutama berasal dari spesies liar.

5. Mekanisme Fusi Protoplas

Mekanisme Fusi protoplasma (bioteknologi modern) untuk menghasilkan produk-produk yang berkualitas tinggi. Dinding sel tanaman merupakan struktur ‘lapis banyak’ yang tersusun dari polisakarida dan protein. Dinding sel berperan penting dalam (1) memberikan kekuatan regang dan plastisitas sehingga sel dapat mengalami/menghadapi tekanan turgor yang tinggi tanpa mengalami kerusakan, dan (2) memberikan pembatas fisik yang melindungi interior sel tanaman dari serangan mikroorganisme. Ukuran pori dinding sel cukup kecil bahkan untuk dilalui virus sekalipun. Sifat-sifat dinding sel tersebut membatasi penggunaan sel tanaman untuk berbagai teknik kultur sel dan jaringan, termasuk memasukkan molekul berukuranbesar ke dalam sel, hibridisasi somatic dan manipulasi genetik. Oleh karena itu, teknik-teknik tersebut hanya dapat dilakukan setelah dinding sel dihilangkan. Penghilangan dinding sel menghasilkan protoplas yang terdiri dari kandungan sel yang dibatasi oleh membran plasma. Dibawah kondisi kultur yang sesuai

protoplas dapat meregenerasi dinding sel dan selanjutnya mengalami pembelahan sel untuk membentuk kalus dan menghasilkan tanaman baru.Penghilangan dinding sel untuk isolasi protoplas dapat dilakukan secara mekanik atau penggunaan enzim ‘pencerna’ dinding sel. Protoplas yang telah diisolasi dari spesies yang sama atau berbeda dapat difusikan dengan perlakuan yang sesuai sehingga terjadi penggabungan inti dan sitoplasma dari keduanya.

Fusi protoplas dapat dilakukan dengan metode kimia dengan menggunakan polyethylene glycol (PEG) atau elektrik dengan memaparkan protoplas pada aliran listrik lemah. Setelah metode fusi dilakukan akan diperoleh campuran hasil fusi yang terdiri dari protoplas tetua yang tidak mengalami fusi, hasil fusi dari tetua yang sama, atau berbeda dimana diinginkan diperoleh heterokarion (sel dengan lebih dari satu inti). Selanjutnya perlu dilakukan konfirmasi terhadap tanaman heterokarion dengan cara analisis morfologi yang menunjukkan karakter tetua, analsis sitologi yang menunjukkan apakah terjadi penghilangan kromosom selama hibridisasi serta analisis biokimia yang melibatkan pembandingan pola pita protein/enzim antara tanaman tetua dan hibrid atau analisis genom.

Pada awalnya hibridisasi sel dipandang sebagai cara ‘membawa’ dua genotype ‘berbeda’ secara bersama-sama dimana hal ini tidak dapat terjadi melalui hibridisasi konvensional (proses penyerbukan). Dengan metode ini persilangan antar species dengan hubungan kekerabatan yang cukup jauh menjadi mungkin terjadi. Salah satu contoh fusi protoplas yang berhasil adalah fusi antara kentang domestik Solanum tuberosum dengan kentang liar S. brevidens yang bertujuan untuk mengintroduksi karakter tahan virus yang dimiliki species ketang liar ke species kentang domestic.

Beberapa permasalahan pada fusi protoplas adalah tidak dimungkinkannya mendapatkan heterokarion yang stabil dari species-species tanaman dengan hubungan kekerabatan yang jauh, adanya materi genetic yang tidak diinginkan pada tanaman heterokarion yang yang harus dihilangkan dengan metode tradisional yaitu pengulangan backcross dan seleksi. Untuk mengatasi hal ini, transfer spesifik gen dengan materi genetic yang sudah terseleksi telah banyak dilakukan. Dalam hal ini protoplas tanaman menunjang kesiapan pengambilan materi genetik yang akan disisipkan ke dalam protoplas/sel lain.