Oleh:dr. Widya Astriyani

UNIT DONOR DARAH PEMBINA PMI PROPINSI LAMPUNG

IMUNOHEMATOLOGI DASAR

2

IMUNOHEMATOLOGI

Cabang Ilmu Patologi Klinik yg mempelajari penggunaan teknik imunologik untuk mendeteksi kelainan-kelainan hematologik, al:

1. Reaksi transfusi hemolitik 2. Reaksi hemolitik pd bayi yang baru lahir (HDN=Hemolytic Disease of the Newborn) 3. Reaksi hemolitik pd AIHA (Auto Immuno Hemolytic Anemia)

Pemeriksaan laboratorium yg sering

dilakukan untuk kepentingan klinis adalah :

1. Deteksi Antigen (Ag) gol darah

ABO & Rhesus (Rh)

2. Tes pretransfusi : Cross matching test

reaksi silang Mayor & Minor

3. Deteksi antibodi (Ab) Coomb’s test

(Test Anti Globulin)

Reaksi transfusi hemolitik

HDN AIHA

Gol drh ABO

Gol drh Rh Reaksi silang

Coomb’s test

Pendahuluan

Normal:

Abnormal: hemolisis

mengalami hemolisis

• Jutaan eritrosit diproduksi tiap menit, umur 120 hari• Eritrosit tua, ‘mati’: dibersihkan dan dihancurkan oleh SRE (limpa)

• Penyebab hemolisis: sebagian besar krn adanya antibodi• Tipe hemolisis : destruksi/kerusakan imun• Tjd pd reaksi transfusi, hemolytic disease of the newborn (HDN), autoimmune hemolytic disease (AIHA)

Pendahuluan

>> reaksi transfusi hemolitik disebabkan krn kerja antibodi (dlm serum pasien) spesifik berinteraksi dg antigen donor

Dasar-dasar imunologi

Dasar imunologi

Eritrosit mengekspresikan antigen (Ag) (glikoprotein) di permukaan sel eritrosit, Ag tsb disebut Aglutinogen

Aglutinogen bersifat imunogenik Antigen A : golongan darah A Antigen B : golongan darah B Tidak mengekspresikan Ag A & B : gol O

Normal seseorang membentuk aglutinin thd Antigen yg “tidak dimiliki “ oleh eritrosit didlm tubuhnya sendiri

Antibodi (Ab) dlm serum (Aglutinin): anti A, Anti B

Pendahuluan

ANTIGEN Antigen adalah unsur yang dapat dikenal oleh

imunoglobulin/antibody atau reseptor sel T

Imunogen adalah unsur asing yang dapat merangsang respon imun, sehingga dapat menghasilkn zat-zat imun yang dapt dideteksi.

Antigenesitas adalah kemampuan unsur asing tersebut untuk bereaksi dengan zat imun

Imunogenisitas adalah kemampuan unsur asing untuk menimbulkan respon imun.

Antigen Sel Darah Merah

Terdapat 29 sistem golongan darah dengan lebih dari 250 antigen sel darah merah yang telah ditemukan.

Glycoprotein dan glycolipids yang menonjol keluar dari membrn SDM yang memungkinkan terjadi ikatan dengan antibodi(aglutinasi) hemaglutinasi

A

A

Anti B

B

Anti A

B

H

H

Y

Y

Y

Y

Y

YAntigen/aglutinogen A

Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A

Anti/aglutinin B

Y

Golongan A Golongan B

Anti B

YAntigen/aglutinogen A

Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A

Anti/aglutinin B

Golongan AB Golongan O

ABB H

A

-

-

O-

-

-

H

Anti A

Y

Y

Y

Y

Human Leukosit Antigen (HLA) Platelet Antigen

1. Ab natural dan Ab imun

Ab natural : merupakan IgM, timbul sbg akibat rangsangan bahan alami yg

menyerupai Ag A/B (berasal dr bakteri/makanan atau produk bakteri) yg masuk tubuh, terbentuk ssdh umur 6 bln.

Ab imun (Allo Ab) :

merupakan IgG thd Ag pada individu dgn genetik berbeda ttp spesies sama, o.k masuknya Ag A dan/atau B kedlm tubuh melalui sirkulasi darah (transfusi, placenta) atau pemaparan thd produk darah

Antibodi (Ab)

2. Complete Ab dan incomplete Ab

Complete Antibody :

Antibodi yg mampu menyebabkan aglutinasi langsung ( direk ) eritrosit-eritrosit yg tersuspensi di dalam salin (Ig M)

Incomplete Antibody :

Antibodi yg tidak mempunyai kemampuan untuk menyebabkan aglutinasi secara langsung dari eritrosit-eritrosit tsb tanpa penambahan fase antiglobulin (Ig G)

3. Ab tipe hangat ( Warm ) & Ab tipe dingin ( Cold )

Ab tipe warm : bereaksi lebih cepat pd 370 C

(IgG)

Ab tipe cold : bereaksi lebih cepat pd 200C

(IgM)

Reaksi Antigen-Antibody IN VIVO

• Transfusi, kehamilan, respon imun– Selama tranfusi darah, pasien akan terpapar

banyak sekali antigen pada sel-sel darah dengan derajat imunogenisitas tertentu.

– Antibodi yang dhasilkan akibat transfusi termasuk dalam alloantibodi

– Pemeriksaan skrining antibodi dapat dilakukan sebelum dilakukan transfusi untuk mendeteksi adanya alloantibody.

Reaksi Antigen-Antibody IN VITRO

• Merupakan reaksi Ag-Ab yang terjadi diluar tubuh manusia(pemeriksaan laboratorium)

• Aglutinasi atau hemolisis• Hemaglutinasi terjadi dalam 2 tahap yaitu:

– Tahap sensitisasi– Lattice formation

FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI REAKSI Ag-Ab IN VITRO

Sensitization Stage(Antibody Binding to Red Blood Cells)

• Temperatur Reaksi• Masa Inkubasi• pH• Ionic Strenght

Pada fase ini memerlukan pengenalan antigen terhadap antibodi. Selama masa ini determinan antigenik pada sel darah

merah akan berikatan dengan antigen-binding site pada molekul antibodi aglutinasi tidak dapat dilihat pada fase ini.

Serum-to-cell ratio

• Temperatur– Sebagian antibodi (Ig G) bereaksi pada suhu 370C– Inkubasi– Ig M lebih reaktif pada suhu yang lebih rendah

220C

• Masa Inkubasi– Memberikan waktu yang cukup untuk reaksi Ag-

Ab– Bervariasi tergantung prosedur atau reagen.

• Ionic Strenght– Pada lingkungan yang isotonic, misalnya dengan

saline fisiologic, Na+ dan Cl-

• pH pH optimal 7,00

Lattice formation Stage(Cells-Cells Interaction)

• Jarak antara sel darah merah satu dengan yang lain– (zeta potensial) gaya tolak menolak antara SDM

satu dengan yang lain akan mempengaruhi reaksi aglutinasi.

– SDM memiliki muatan negatif pada permukaan sel, muatan positif yang berasal dari larutan salin akan mengikat muatan negatif pada permukaan SDM sehingga membentuk muatan positif yang menyebabkan gaya tolak-menolak.

– Karena bentuknya IgM mampu mengikat SDM-SDM yang berdekatan sehingga dapat terjadi aglutinasi

– Sementara IgG, karena bentuknya , tidak mampu mengikat SDM-SDM yang berdekatan sehingga aglutinasi terjadi namun tidak dapat terlihat.

• Konsentrasi optimal Ag-Ab– Aglutinasi maksimal akan terjadi bila konsentrasi

Ag-Ab berada dalam zona ekuivalen. – SDM diencerkan menjadi suspensi 2%-5%,– Bila suspensi melebihi 5% dapat menyebabkan

reaksi negatif.

Grading Reaksi Aglutinasi

Hemolysis sebagai Reaksi Ag-Ab

• Hemolisis juga merupakan indikator terjadinya reaksi Ag-Ab

• Hemolisis terjad bila jalur komplemen teraktivasi yang akan merusak permukaan membran SDM sehingga cairan intersellular keluar hemoglobin menyebabkan warna kemerahan pada supernatan dalam tabung.

• Grading +H

TERIMA KASIH

Alur uji laboratorium pre-transfusi

b. Eritrosit

Buat suspensi eritosit1. 5% dlm salin2. 10% dlm salin3. 40% dlm salin a/ serum

Pasien

Donor

a. Serum

Reaksi silangABORh

a. Serum

Buat suspensi eritosit1. 5% dlm salin2. 10% dlm salin3. 40% dlm salin a/ serum

c. Pem gol ABO, Rh – metode slide, jika hasil OK:

d. Reaksi silang

b. Eritrosit

MAYORFase IFase IIFase III

MINORFase IFase IIFase III

e. CCC

Minor + : sebab?- Ab donor ?- Ab melapisi eritr pasien ?

Cek dg tes Coombs Direk

Merup tes Coombs indirek

Golongan darah

Tipe gol drh ditentukan oleh ekspresi antigen di permukaan eritrosit (Antigen A, B, H)

Ditemukan I x oleh Landsteiner th 1900

(Golongan A, B, O) Golongan AB ditemukan oleh

Von Decastello & Sturli (1902) Identifikasi gol drh ditentukan dg melihat reaksi

aglutinasi antara Ag & Ab

Karakteristik Umum ABO Antigen

Antigen didistribusikan secara luas pada sel darah merah, limfosit, platelet, sel epitel dan endotel organ seperti ginjal.

Terdapat bentuk terlarut dalam cairan tubuh kec. pada CSF

Dapat dideteksi pada umur 5-6 minggu dalam uterus.

Gen yang berperan: ABO, H, Se.

Distribusi Frequensi Golonan Darah ABO Phenotypes (US Population)

ABO phenotypes

White(%) Black(%) Asian(%)

A 40 27 28B 11 20 27

AB 4 4 5O 45 49 40

Substansi H

Constantoulakis menemukan substansi H pd sel fetus dari semua golongan ABO (ada sejak lahir)

Substansi H berguna untuk pembentukan antigen A, B dan H pd eritrosit

Pembentukan Ag A, B dan H tsb ditentukan oleh interaksi gen ABO dan Hh

Substansi H merup struktur dasar Ag A & B Bila tdp gen H pd prekursor substance mk akan

diubah mjd substansi H

bila ada gen A / B mk akan mjd Ag A atau B

Substansi H

Shg seseorang dg gol A akan memp Ag A & H Gol B : memp Ag B & H Gen O, tak ada produk yg dpt dideteksi pd sel

Gol O, tak ada substansi H yg diubah, hanya ditemukan substansi H saja Substansi H pada gol A & B < gol O Pd subgrup A, tak banyak substansi H yg diubah

mjd Ag A bila reaksi thd Ag A menurun pd subgrup

A yg lemah mk reaksi dg H mjd meningkat

Formasi antigen ABH Gen ABH tdk langsung nyata mengkode produksi antigen

ABH, tp memproduksi ensim spesifik glycosyltransferase yg bertugas menambahkan gula-gula ke substansi prekursor (PS) dasar pd eritrosit

Ag ABH dibentuk dr material prekursor dasar yg sama yang memp gycolipid backbone

Tdp satu struktur molekul karbohidrat (KH) yang melekat pd backbone tsb paragloboside/rantai oligosakarida/substansi prekursor

Formasi Ag ABH tergantung pd gula-gula yg ditambahkan

Monosakarida terakhir (nukleotida) / gula-gula yg menempel pada rantai KH menentukan spesifisitas molekul

Gene Glycosyltransferase(enzyme)

Immunodominant Sugar

Antigen

H -2-L-fucosyltransferase L-fucose H

A-3-N-acetylgalactosaminyltransferase

N-acetyl-D-galactosamin A

B-3-D-galactocylltransferase D-galactose B

Ensim & gula-gula yang berperan dlm penyusunan antigen ABH

Red blood cell precursor structure(which represents a paragloboside)

Material dasar:• Galactose (GAL)• N-Acetylglucosamine (GLNAC)• Galactose (GAL)• Glucose (GL)

Menyusun :Paragloboside a/

Oligosaccharide chain a/Precursor substance

menent spesifisitas

Gen H mengkode produkasiensim L-fucocyltransferase

Ensim tsb menempelkanGula FUCOSE ke GAL

Menyusun Antigen H

Diekspresikan di permukaan eritrosit

Gol O

Formasi antigen A

Gen A mengkode produksiensim N-Acetylgalactosaminyl

transferase

Ensim tsb menempelkanGula N-acetyl-D-galactosamine

(GALNAC) ke struktur H

Menyusun Antigen A

Diekspresikan di permukaan eritrosit

Gol A

Formasi antigen B

Gen B mengkode produksiensim D-galactocyl

transferase

Ensim tsb menempelkanGula D-galactose (GAL)

ke struktur H

Menyusun Antigen B

Diekspresikan di permukaan eritrosit

Gol B

A

A

Anti B

B

Anti A

B

H

H

Y

Y

Y

Y

Y

YAntigen/aglutinogen A

Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A

Anti/aglutinin B

Y

Golongan A Golongan B

Anti B

YAntigen/aglutinogen A

Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A

Anti/aglutinin B

Golongan AB Golongan O

ABB H

A

-

-

O-

-

-

H

Anti A

Y

Y

Y

Y

Golongan darah

Genotipe Gen Imunologi

A AA atau AO

Homozygot

Heterozygot

Memp Ag A & HMemp Anti B

B BBAtauBO

Homozygot

Heterozygot

Memp Ag B & HMemp Anti A

AB AB Heterozygot Memp Ag A, Ag B, Ag HTidak punya anti

O OO Homozygot Memp Ag HTdk punya Ag A & BMemp Anti AMemp Anti B

Bombay hh Homozygot Tdk memp Ag H, A & BMemp anti A, anti B, & anti H

Phenotype A dpt dibagi menjadi sub group :

Sub grup dlm sistem ABO : A1 & A2

± 80 % group A : ph A1

± 20 % group A : ph A2

A2 : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol O

A2B : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol B

Antigen (Ag) yg termasuk sistem gol AB terdapat dlm :

- eritrosit, endotel & epitel

- cairan tubuh (mis : saliva) : glikoprotein

Kualitatif dan

Kuantitatif berbeda

A A Anak

B AB AB SemuaGol AB100%

B AB AB

Istri

Suami

Suami istri homozygot

OOAOO

Bisa A, B, O, AB

Prob ms

25%

BOABB

AnakOA

Istri

Suami

Suami istri heterozygot

BOABB

Bisa B a/ AB

Prob.

50:50

BOABB

AnakOA

Istri

Suami

Suami heterozygot AIstri homozygot B

AOAOO

Bisa A a/ AB

Prob.

50:50

ABABB

AnakAA

Istri

Suami

Suami homozygot AIstri heterozygot B

OOOOO

100%

O

OOOOO

AnakOO

Istri

Suami

Suami homozygot OIstri homozygot O

BOAOO

50% A

50% B

BOAOO

AnakBA

Istri

Suami

Suami heterozygot ABIstri homozygot O

OOAOO

A 75%

O 25%

AOAAA

AnakOA

Istri

Suami

Suami heterozygot AIstri heterozygot A

BOBOO

100%

B

BOBOO

AnakBB

Istri

Suami

Suami homozygot BIstri homozygot O

Golongan darah Bombay

Darah Bombay adalah homozygot hh Jarang >> 99,9% individu : HH atau Hh Pertama kali ditemukan oleh Bhende di Bombay

(1952) Dicurigai adanya darah yg tidak diaglutinasi oleh

anti-A, anti-B, anti-AB dan anti-H Dituliskan sebagai golongan darah Oh untuk

menunjukkan tidak adanya substansi H Gen h tidak memproduksi L-fucocyltransferase Memp Anti-A, anti-B, & anti-H

Seorang yang tidak mengekspresikan gen H

(disbt juga genotype-nya hh)

memp phenotype

Bombay (Oh)

tidak memproduksi substrat H

gen A & B juga tdk bisa diekspresikan shg juga tidak mampu memproduksi Ag A dan Ag B

Perbedaan gol drh Oh dan O biasa

Gol Anti A

Anti B

Anti AB

Anti H

Sel A1

Sel A2

Sel B Sel O

Oh/Bombay - - - - + + + +

O - - - + + + + -

Golongan BOMBAY

BOMBAY

h

Anti/aglutinin H

Y

Y

Anti B

Anti A

Y

Y

Aglutinasi eritrosit oleh adanya reaksi

antigen-antibodi ada 2 tahap :

1. Tahap Sensitisasi

2. Tahap Hemaglutinasi

Lisis eritrosit terjadi bila seluruh rangkaian sistem komplemen teraktifkan menyertai interaksi Ag-Ab

Aglutinasi terjadi bila Ab yg terikat menghubungkan eritrosit-eritrosit yg berdekatan membentuk gumpalan

Reaksi aglutinasi

B

B

BB

Anti A

B

Hemaglutinasi= reaksi positif

B

B

Anti-B

+

Anti-B

Anti-B

Anti-B

B

B

Golongan B

Y

Y

Y

Y

Reaksi aglutinasi

O

Tdk tjd hemaglutinasi= reaksi negatif

O

O

Anti-A

+

Anti-B

Golongan O

O -

Anti AAnti A

Anti A

-

-

Anti B Anti B

Anti BH

Anti-B Anti-AB

Anti-A Y

Y

Y

Reaksi penggolongan darah

Eritrositpasien

Reaksi dg anti-A

Reaksi dg anti-B

Reaksi dg anti-AB

Interpretasi

1 Negatif Negatif Negatif O

2 + Negatif + A

3 Negatif + + B

4 + + + AB

Sistim Rhesus

Sampai saat ini dikenal 6 Ag: C & c, D & d, E & e Kombinasi: CDe, cDE, cDe, CDE, cdE, CdE, cde,

Cde (terbanyak CDE, cDE, cde) Hasil: Rhesus + & Rhesus – Yang menentukan + a/ - adalah: ada tidaknya

antigen D Berguna dalam klinik Rhesus - : >> orang kulit putih Indonesia: <<

Golongan Darah Rhesus ( Rh )

D + : gol darah Rh +, mempunyai Ag D D - : gol darah Rh - , genotipe cde/cde, tdk mempunyai

Ag D, mampu membentuk Anti D bila terjadi

pemaparan dg eritrosit Rh + Du : Rh + lemah, bereaksi lambat, sering keliru

dengan D-