KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS - BIOAUTOGRAFI

Bioautografi

Bioautografi merupakan suatu metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, dan anti viral. Bioautografi juga merupakan suatu metode yang cepat untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui yang mana metode kimia atau fisika yang terbatas untuk substansi yang murni. Sementara deteksi kimia reaksi warna hanya spesifik digunakan sebagai pembanding hasil bioautografi sehingga kedua meode tersebut saling melengkapi (Stahl, 1965). Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Stahl, Egon, I TB Bandung, 1985

Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi sebelum melakukan uji bioautografi antara lain :

1.Sterilisasi alat dan proses pengerjaannya

2.Ada media yang cocok untuk menumbuhkan mikroba uji

3.Ada mikroba uji yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri senyawa uji

4.Senyawa yang akan dianalisis diduga memiliki aktivitas membunuh atau menghambat bakteri (Wagmon & Wenstein, 1983).

Ada 3 metode bioautografi :

• Bioautografi langsung / direct : mikroorganisme tumbuh secara langsung di atas lempeng KLT

• Bioautografi kontak / contact : senyawa dipindahkan dari lempeng KLT ke medium• Bioautografi pencelupan / overlay : medium agar yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme dituang di atas lempeng KLT (Mulyaningsih, 2004)

Metode uji pada bercak hasil KLT disebut dengan bioautografi (Ahmad et al., 2006). Bioautografi dalam uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan berbagai metode, yaitu bioautografi kontak, bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung (Choma, 2005).

a)      Bioautografi kontak

Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan lempengan kromatogram hasil elusi dari senyawa uji di atas media padat yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Adanya aktivitas antibakteri dari senyawa uji ditandai dengan adanya zona bening.

b)      Bioautografi agar overlay

Bioautografi agar overlay dilakukan dengan melapisi lempeng kromatogram hasil elusi senyawa uji dengan media agar cair yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Setelah agar mengeras, lempengan kromatogram diinkubasi dan diwarnai dengan tetrazolium dye. Penghambatan dapat dideteksi dengan terbentuknya pita (band).

c)       Bioautografi langsung

Bioautografi langsung dilakukan dengan menyemprot lempeng kromatogram hasil elusi senyawa uji dengan mikroba uji dan diinkubasi. Zona hambat yang terbentuk divisualisasikan dengan menyemprot lempeng kromatogram dengan tetrazolium dye.

            Ketiga metode tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Menurut Kusumaningtyas et al. (2008) bioautografi agar overlay memiliki sensitivitas lebih baik dari pada metode yang lain. Akan tetapi, bioautografi kontak lebih mudah dilakukan dan hasilnya telah jelas terlihat. Sedangkan bioautografi langsung merupakan bioautografi yang jarang digunakan karena dilaporkan tidak dapat digunakan untuk sampel tertentu. Oleh karena itu, kombinasi bioautografi kontak dengan langsung menghasilkan bioautografi agar overlay (Kusumaningtyas et al., 2008).

Metode bioautografi dalam mendeteksi komponen yang aktif sebagai antibakteri memiliki beberapa keuntungan dan kerugian :

Keuntungan :

- Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antibiotik, dan antiviral.

- Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui mekanismenya.

- Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan.- Cepat dalam pengerjaannya.

Kerugian:

- Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai aktivitas membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.

- Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari luar atau karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung khasiat bakteri antibakteri.

- Mempunyai faktor kesalahan yang besar  (Rudi,L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Universitas Haluoleo. Kendari)

Kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas (KKt) adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana yang akan disajikan. Karena di sebagian besar laboratorium KKt telah diganti dengan KLT. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparative. Kedua, dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter, Roy J., 1991,Pengantar Kromatografi, Penerbit ITB, Bandung,. Hal.186 – 280. Johnson, E. L.,)