KOMPLEMEN SISTEM IMUN

PENDAHULUAN

Begitu antibodi tersangkut pada permukaan mikroorganisme yang menyerang,

serangkaian protein plasma yang disebut komplemen akan teraktivasi. Protein komplemen ini

mampu menghancurkan penyerang tersebut. Proses ini dimulai oleh perubahan konformasional

pada daerah Fc suatu antibodi pada saat berikatan dengan antigen.

Jika antigen tersebut melayang bebas dalam sirkulasi sebagai molekul tunggal, kompleks

imun yang terbentuk dapat berikatan pula dengan komplemen. Komplemen dalam kompleks

tersebut kemudian dapat membantu menarik sel-sel fagosit, yang akan menelan dan membuang

antigen yang diinaktivasi dari sirkulasi.

Jika antigen merupakan bagian dari dinding sel bakteri, komplemen dapat melekat pada

antibodi yang terikat, pada akhirnya akan melemahkan dan membunuh bakteri tersebut. Proses

yang sama dapat terjadi pada sel darah yang ditransfusikan jika terdapat ketidaksesuaian dengan

resipiennya, dan oleh karenanya menyebabkan hemolisis.

Melalui aktivasi komplemen yang disebut jalur klasik, komplemen pertama C1q melekat

pada daerah Fc pada dua molekul IgG yang berdekatan yang menjadi saling berdekatan karena

berikatan pada suatu permukaan asing. Selain itu, satu molekul IgM dapat menarik C1q karena

IgM mempunyai lima daerah Fc. Selanjutnya, subunit C1r dan C1s terikat pada C1q. Subunit-

subunit ini mempunyai aktivitas enzimatik yang memecah dua komponen lain (C4 menjadi C4a

dan C4b, dan C2 menjadi C2a dan C2b). C4 berikatan langsung dengan permukaan dekat tempat

aktivasinya, dan C2a berikatan dengan C4b. Kompleks C4b-C2a kemudian memecah C3

menjadi C3a dan C3b, yang pada akhirnya melekat dipermukaan yang berdekatan. Interaksi

antara C2a dan C3b akan memecah C5 yang kemudian akan mengikat C6 dan C7 dan juga

melekat pada permukaan. C8 dan C9 tertarik untuk membentuk tambahan akhir pada kompleks

ini. Pada titik ini, permukaan sel bakteri akan mengalami kerusakan yang serius, yang pada

akhirnya akan menyebabkan lisis. Rangkaian aktivasi komplemen ini sama tidak tergantungpada

antigen spesifik yang terlibat dalam kompleks imun. Antibodi spesifik yang mengarahkan dan

memulai keseluruhan proses ini.

Jalur alternatif merupakan cara lain aktivasi komplemen. Jalur ini tidak tergantung pada

antibodi. Ini terjadi bila C3 bergabung dengan faktor B dan mengikat suatu substansi seperti

dinding sel bakteri. Kompleks ini selanjutnya mengaktivasi C3 lebih banyak lagi, yang kemudian

berlanjut dengan aktivasi dan perlekatan C5 sampai C9.

Aktivasi komplemen dihambat oleh suatu protein plasma yang secara selektif

menghambat C1, C4b atau C3b. Defisiensi kongenital pada protein semacam itu, C1 esterase

inhibitor, berakibat pada suatu sindrom klinis yang disebut angioedema herediter. Pada gangguan

ini, edema terjadi pada saluran cerna dan pernafasan jika komplemen teraktivasi oleh suatu

trauma atau sering kali karena alasan yang tidak diketahui.

Defisiensi kongenital pada komponen komplemen tertentu dapat bermanifestasi sebagai

peningkatan kerentanan terhadap infeksi oleh bakteri piogen (defisiensi C1, C4, C2 atau C3) atau

Neisseria (C3, C5, C6, C7, C8 atau C9). Selain itu, frekuensi untuk penyakit rematik lebih besar

(terutama lupus eritematosus sistemik) pada defisiensi C1, C2 atau C4, mungkin akibat

pembersihan kompleks imun yang terganggu.

KOMPLEMEN SERUM

Integritas dari seluruh sistem komplemen dan komponen-komponennya disaring dengan

baik sekali dengan pemeriksaan hemolitik yang ditunjukkan CH50. Pada pemeriksaan ini,

pengenceran serum manusia yang akan diuji aktivitas komplemennya dicampur dengan larutan

terstandarisasi eritrosit domba yang disensitisasi dengan adsorpsi antibodi spesifik. Komplemen

yang ada dalam serum uji akan menyebabkan hemolisis, yang dihitung secara spektrofotometrik

sebagai jumlah hemoglobin yang dilepaskan dari eritrosit domba yang lisis. CH50 ini sebaiknya

dipakai untuk pemeriksaan penyaring untuk fungsi komplemen pada keadaan yang dicurigai

adanya defisiensi kongenital salah satu komponen. Pada masa lalu, CH50 telah dipakai untuk

menunjukkan aktivitas komplemen kuantitatif sebagai bagian dari proses penyakit. Namun

pemeriksaan imunologis modern terhadap masing-masing komponen telah menggantikan

sebagian besar peran CH50 dalam pemantauan penyakit. Salah satu alasan laboratorium

imunokimia yang sangat baik sekalipun dapat menunjukkan variasi kadar CH50 yang bermakna,

yaitu bahwa sel-sel domba menunjukkan adanya fluktuasi stabilitas musiman. Oleh karena itu,

pemeriksaan CH50 fungsional sebaiknya dibedakan pada hampir semua keadaan untuk

pemeriksaan komponen yang lebih spesifik, yang telah terstandarisasi dengan baik untuk jangka

waktu lama. CH50 mempunyai rentang normal sekitar 50-200 unit. Kadar dibawah rentang

normal menunjukkan adanya peningkatan konsumsi atau penurunan sintesis. Pemeriksaan

hemolitik mempunyai sensitivitas tertentu untuk kadar komponen C2, C4 dan C5. suatu nilai nol

dari aktivitas hemolitik menunjukkan adanya defisiensi satu atau lebih komponen dan sebaiknya

dilanjutkan dengan investigasi yang rinci untuk menggambarkan abnormalitasnya. Peningkatan

kadar CH50 tidak bermakna kecuali sebagai reaktan fase akut.

Komponen komplemen yang paling sering diperiksa dalam serum adalah C3 (75-175 mg/dL) dan

C4 (15-45 mg/dL). Keduanya pada keadaan normal merupakan faktor komplemen yang

terbanyak dalam serum dana paling mudah diukur dengan metode imunologis (biasanya

nefelometri atau imunodifusi). Penurunan kadarnya dapat saling dihubungkan secara serial dari

waktu ke waktu untuk pemantauan suatu penyakit autoimun. Kadar yang rendah menunjukkan

kekurangan akibat aktivasi skunder terhadap progresi penyakit. Kadar normal atau tinggi

menunjukkan kebalikannya, regresi penyakit atau respons terhadap terapi. Pemeriksaan

komponen lain yang lebih canggih diperoleh dari laboratorium rujukan khusus. Termasuk

diantaranya penentuan C1q, C2, C4, C4d, C5, C6, Faktor B (properdin) dan inhibitor esterase

C1. Pemeriksaan-pemeriksaan ini dapat dipakai untuk membedakan gangguan imunologis dari

keadaan peradangan lain dan juga untuk mendiagnosis suatu defisiensi spesifik.

PEMERIKSAAN KOMPLEMEN

Perubahan dalam kadar komplemen menunjukkan adanya proses penyakit. Kadarnya

yang meningkat sering ditemukan pada inflamasi akut dan infeksi dan berhubungan dengan

peningkatan AFP.

Defisiensi komplemen dapat dibagi menjadi defisiensi primer yang ditentukan faktor

genetik dan defisiensi sekunder yang diakibatkan oleh pemakaian komplemen dalam interaksi

antigen-antibodi yang lebih memberikan hubungan dengan patogenesis penyakit.

Komplemen dapat dibagi dalam 3 golongan sebagai berikut :

a. Komplemen dini pada jalur klasik (C1, C4 dan C2)

b. Komplemen dini pada jalur alternatif (faktor B, D dan P)

c. Komplemen lambat pada kedua jalur (C3 dan C9)

Bila kadar C4 dan C3 rendah tetapi faktor B normal, maka itu berarti aktivasi komplemen

hanya terjadi melalui jalur klasik. Bila kadar C4, C3 dan faktor B semuanya rendah,

kemungkinan besar juga terjadi aktivasi melalui jalur alternatif. Tetapi bila kadar C4 normal

dengan kadar C3 dan faktor B rendah, berarti ada aktivasi melalui jalur alternatif saja.

Pengukuran C3 dan C4 akan membantu dalam pemantauan pengobatan penderita

glomerulonefritis dan vaskulitis. Kadar yang rendah biasanya menjadi normal pada remisi.

Telah diketahui bahwa pada suatu interaksi antigen-antibodi, komplemen yang ada dalam serum

dapat diikat atau dikonsumsi oleh kompleks antigen-antibodi tersebut, dan bahwa komplemen

dapat diaktivasi oleh kompleks erithrosit-hemolisin, sehingga mengakibatkan eritrosit tersebut

melisis.

Complement Fixation Test (CFT) atau uji Fiksasi komplemen merupakan cara untuk

menentukan antigen atau antibodi yang hanya bereaksi bila ada komplemen. Antibodi dicampur

dengan antigen dan komplemen. Komplemen akan diikat kompleks antigen-antibodi. Bila tidak

terjadi ikatan komplemen, maka komplemen akan ditemukan bebas dalam larutan. Adanya

komplemen bebas tersebut dapat diperlihatkan dengan menambahkan sel darah merah dan

hemolisin. Lisis sel darah merah akan terjadi atas pengaruh komplemen yang bebas tadi.

Kenyataan ini dipakai untuk menggunakan komplemen sebagai salah satu bahan untuk

penetapan antigen maupun antibodi. Pengujian ini didasarkan atas reaksi yang terdiri atas 2

tahap, yaitu tahap pertama dimana sejumlah tertentu komplemen oleh suatu kompleks antigen-

antibodi, dan tahap kedua dimana komplemen yang tersisa (bila ada) menghancurkan eritrosit

yang telah dilapisi hemolisin. Banyaknya komplemen yang tidak dikonsumsi pada reaksi tahap

pertama, dan yang mengakibatkan hemolisis pada reaksi tahap kedua, secara tidak langsung

merupakan parameter untuk antibodi atau antigen yang diperiksa.

Untuk mendapatkan hasil yang bisa dipercaya, semua reaktan yang diperlukan untuk uji

ini harus disesuaikan satu dengan yang lain dan berada dalam jumlah atau titer yang optimal.

Oleh karena itu sebelum melaksanakan pemeriksaan pada sampel penderita, terlebih dahulu

dilakukan uji pendahuluan untuk menstandarisasi titer hemolisin dan titer komplemen yang

dipakai pada sistem uji ini.

Titer hemolisin ditentukan oleh pengenceran tertinggi hemolisin yang masih dapat

melisiskan eritrosit berkonsentrasi 2% secara lengkap, bila ada komplemen. Titer hemolisin ini

disebut 1 unit dan untuk pemeriksaan sampel penderita dipakai 2 unit.

Oleh karena uji fiksasi komplemen melibatkan suatu sistem yang terdiri atas berbagai reaktan,

disamping titrasi hemolisin dan komplemen diatas, setiap reaktan harus diuji terhadap ada

tidaknya faktor penghambat atau faktor yang meningkatkan aktivasi komplemen

(antikomplemen atau prokomplemen). Untuk keperluan ini, pada titrasi komplemen

diikutsertakan antigen dan antigen kontrol, serta pada pemeriksaan sampel selalu harus

diikutsertakan kontrol serum positif maupun negatif. Suatu hasil pemeriksaan, baru bisa

dipercaya apabila semua reaktan pada sistem ini terkontrol dengan baik.

Uji fiksasi komplemen dipakai pertama kali oleh Wassermann, Neisser dan Bruck untuk

menentukan diagnosis Sifilis (Test Wassermann), akan tetapi kemudian prinsip pengujian yang

sama dipakai juga dalam diagnosis serologik berbagai penyakit lain, diantaranya penyakit-

penyakit yang disebabkan oleh parasit, seperti Trypanosoma, Schistosoma, serta penyakit-

penyakit yang disebabkan oleh virus, seperti virus Hepatitis B, Herpes, Rotavirus, Rubella dan

lain-lain.

SISTEM KOMPLEMEN

Pendahuluan

Komplemen merupakan sekumpulan molekul protein dan interaksinya yang terjadi secara

berantai, mengakibatkan efek bilogis pada membran, pada sifat sel dan interaksi protein lain.

Sedikitnya ada 11 jenis protein komplemen yang ada dalam plasma normal, masing-masing ada

dalam keadaan inaktif tetapi bila komplemen diaktivasi, setiap jenis komplemen mempunyai

fungsi spesifik. Akivasi dapat dimulai dengan reaksi antigen dengan IgG atau IgM atau bila ada

kontak dengan IgA yang menggumpal, selain itu aktivasi dapat pula dimulai oleh kontak dengan

polisakarida atau lipopolisakarida, oleh produk yang terjadi akibat aktivasi sistem pembekuan

atau kalikrein.

Aktivitas Biologis komplemen dinyatakan dengan nomor dan huruf. Proses aktivasi tidak

berlangsung berurutan sesuai dengan urutan nomor komplemen. Disepakati bahwa urutan

interaksi komplemen adalah : C1q, C1r, C1s, C4, C2, C3, kemudian C5 sampai C9. Aktivasi

komplemen dapat merupakan proses pemecahan molekul-molekul secara enzimatik yang

menghasilkan zat yang aktif atau proses penyesuaian tanpa pemecahan. Pada beberapa tahap dari

proses ini diperlukan ion kalsium dan magnesium.

Aktivasi lengkap dari C1 sampai C9 mengakibatkan pecahnya membran dan kerusakan

sel yang tidak dapat diperbaiki lagi. Aktivasi lengkap terjadi dengan tahapan-tahapan sebagai

berikut : C2 melepaskan suatu peptida dengan berat molekul kecil dan aktivitas kinin, hasil

aktivasi C3 dan C5 merangsang mastosit, otot halus dan leukosit sehingga terjadi efek

anafilaktik, unsur lain dari C3 dan C5 berikatan dengan membran sel dan menyebabkan sel lebih

mudah di fagositosis, proses ini disebut opsonisasi, fragmen C3 dan C4 menyebabkan proses

perlekatan yaitu partikel yang dilapisi komplemen melekat pada permukaan sel yang memiliki

reseptor untuk komplemen, C3 dan C4 aktif dapat pula menetralisir virus, dan akhirnya fragmen

C3 da C4 merangsang aktivitas kemotaktik neutrofil sehingga neutrofil bergerak menghampiri

fragmen protein yang bersangkutan. Kompleks C5-C9 mempunyai aktivitas prokoagulan

trombosit dan sebaliknya aktivitas prokoagulan faktor XII dapat mencetuskan aktivasi C1.

Plasmin dan trombin bersifat proteolitikdan dapat memecah C3 hingga terbentuk C3 aktif.

Jalur aktivasi pada jalur klasik, aktivasi komplemen diawali dengan aktivasi C1q, C1r

dan C1s oleh kompleks antigen-antibodi. Karena C1q tidak tahan panas, maka pemanasan serum

dapat melumpuhkan seluruh aktivitas komplemen. Untuk penggabungan C1qrs diperlukan Ca++

sedangkan Mg++ diperlukan oleh C4 untuk mengaktivasi C2. Bila digunakan antikoagulan yang

mengikat ion, naka plasma kehilangan kation sehingga komplemen yang ada didalamnya tidak

dapat diaktivasi. Setelah C1qrs aktif mengaktivasi C4 dan kemudian C4 akut mengaktivasi C2,

maka kontak dengan C2 aktif menyebabkan C3 pecah menjadi 2 bagian yaitu : bagian yang kecil

dan tetap berada dalam cairan dan C3b yang lebih besar dan melekat pada membran sel. C3b

diperlukan untuk mengaktivasi C5, tetapi setalah itu sisa kompleks C5-C9 terbentuk dengan

sendirinya tanpa aktivasi oleh enzim.

Jalur alternatif tidak melibatkan aktivasi C1, C4 dan C2 tetapi dimulai dengan pemecahan

C3. Setelah C3b terbentuk, aktivasi C5 sampai C9 berlangsung dengan sendirinya. Kunci dari

jalur alternatif adalah aktivasi properdin, yaitu suatu protein serum yang tidak mempunyai efek

biologis bila ia berada dalam keadaan tidak aktif. Kontak dengan IgA yang menggumpal,

endotoksin atau kompleks melekul seperti dekstran, agar dan zymosan dapat merubah properdin

kemudian mencetuskan proses yang menghasilkan C3b.

Tes Fiksasi Komplemen berbagai prosedur untuk menentukan adanya interaksi antigen-

antibodi dengan cara mengukur penurunan kadar komplemen dalam serum, setelah dipaparkan

pada bahan yang akan diperiksa. Test fiksasi komplemen hanya dapat dipakai bila reaksi antigen

antibodi benar-benar mengikat komplemen. Cara dipengaruhi oleh berbagai faktor kesulitan

teknik maupun imunologik dan hanya dipakai bila tidak ada cara lain yang lebih baik.

Komplemen

Teknik radioimunoassay dan imunodifusi memungkinkan untuk menentukan kadar setiap

komponen komplemen termasuk komponen dalam jalur alternatif. Sebagian besar pemeriksaan

ini terutama dipakai dalam penelitian. Untuk keperluan klinik, penetapan aktivitas komplemen

secara umum biasanya sudah memadai. Cara yang paling mudah adalah menentukan hemolisis

lengkap dari eritrosit domba dalam suatu reaksi yang memerlukan komplemen. Dalam hal ini

eritrosit domba dilapisi dengan antibodi yang hanya dapat bereaksi dengan antigen bila ada

komplemen, sehingga derajat hemolisis eritrosit dapat dipakai sebagai ukuran untuk aktivitas

komplemen. Hasil tes dinyatakan dengan unit CH50, yang menyatakan pengenceran serum

tertinggi yang dapat menghancurkan separuh dari jumlah eritrosit yang dipakai pada test. Setiap

laboratorium harus menentukan nilai rujukan sendiri karena hasilnya akan berbeda pada kondisi

yang berlainan misalnya perbedaan dalam kadar antibodi dan eritrosit yang dipakai, cara

penyimpanan, elektrolit dan suhu.

Kadar C3 dan C4 masing-masing dapat ditentukan dengan cara imunodifusi radial. Cara

ini memerlukan waktu 24-36 jam, disamping itu hasilnya menunjukkan variasi akibat aktivitas

komplemen in vivo dan cara penanganan spesimen yang berbeda-beda.

Aktivitas komplemen meningkat pada berbagai penyakit tetapi jarang dirasakan perlu untuk

mencari kelainan pada komplemen. Komplemen merupakan protein fase akut, kadarnya

meningkat pada inflamasi, analog dengan peningkatan LED dan CRP pada keadaan yang sama.

Penetapan komplemen lebih sering diperlukan untuk mengetahui ada tidaknya penurunan

aktivitas komplemen.

Penurunan aktivitas komplemen komplemen dikonsumsi pada reaksi antigen-antibodi,

khususnya reaksi yang membentuk kompleks imun. Penurunan CH50 biasanya terdapat pada

penyakit imunologis sistemik terutama SLE dan glomerulonefritis akibat kelainan imunologis.

Pada SLE penurunan kadar komplemen dan peningkatan titer anti-DNA menunjukkan adanya

glomerulonefritis akut dan pada saat penyakit tenang kadar komplemen biasanya kembali

normal. Pada penyakit kolagen-vaskuler yang lain seperti skleroderma dan artritis reumatoid.

Kadar komplemen biasanya menurun waktu penyakit kambuh. Banyak jenis vaskulitis dan

artritis diakibatkan oleh pembentukan kompleks imun, penurunan titer CH50 sering memastikan

adanya kompleks imun khususnya yang menyertai beberapa jenis infeksi seperti hepatitis B,

Streptokokus, Mononukleosis infeksiosa dan penyakit parasit.

Pada hipotensi akut yang tidak diketahui sebabnya, kadar komplemen dalam serum biasanya

rendah, hal ini menunjukkan adanya aktivitas sistem imun secara menyeluruh atau adanya

aktivitas melalui jalur alternatif. Keadaan tersebut mungkin disebabkan oleh beberapa hal

misalnya aktivasi granulosit dalam sirkulasi sistemik atau sirkulasi paru-paru, interaksi heparin

dan protamin dan aktivasi sistem bradikinin. Penderita artritis reumatoid sering menunjukkan

penurunan aktivitas komplemen dalam cairan sendi, walaupun kadar komplemen dalam serum

normal.

Ada kemungkinan terjadi defisiensi komplemen secara spesifik tetapi hal ini jarang dijumpai.

Penyakit autoimun sering dijumpai pada penderita dengan defisiensi salah satu komponen

komplemen, sedangkan defisiensi C3 merupakan predisposisi umum untuk penyakit infeksi.

Infeksi Neisseria yang menyeluruh dapat terjadi bila ada defisiensi C6, C7 atau C8. Pada

defisiensi setiap komponen komplemen, penetapan CH50 menunjukkan nilai nol.

UJI FIKSASI KOMPLEMEN

Telah diketahui bahwa pada suatu interaksi antigen-antibodi, komplemen yang ada dalam

serum dapat diikat atau dikonsumsi oleh kompleks antigen-antibodi tersebut, dan bahwa

komplemen dapat diaktivasi oleh kompleks erithrosit-hemolisin, sehingga mengakibatkan

eritrosit tersebut melisis.

Kenyataan ini dipakai untuk menggunakan komplemen sebagai salah satu bahan untuk

penetapan antigen maupun antibodi. Pengujian ini didasarkan atas reaksi yang terdiri atas 2

tahap, yaitu tahap pertama dimana sejumlah tertentu komplemen oleh suatu kompleks antigen-

antibodi, dan tahap kedua dimana komplemen yang tersisa (bila ada) menghancurkan eritrosit

yang telah dilapisi hemolisin. Banyaknya komplemen yang tidak dikonsumsi pada reaksi tahap

pertama, dan yang mengakibatkan hemolisis pada reaksi tahap kedua, secara tidak langsung

merupakan parameter untuk antibodi atau antigen yang diperiksa.

Untuk mendapatkan hasil yang bisa dipercaya, semua reaktan yang diperlukan untuk uji ini harus

disesuaikan satu dengan yang lain dan berada dalam jumlah atau titer yang optimal. Oleh karena

itu sebelum melaksanakan pemeriksaan pada sampel penderita, terlebih dahulu dilakukan uji

pendahuluan untuk menstandarisasi titer hemolisin dan titer komplemen yang dipakai pada

sistem uji ini.

Titer hemolisin ditentukan oleh pengenceran tertinggi hemolisin yang masih dapat

melisiskan eritrosit berkonsentrasi 2% secara lengkap, bila ada komplemen. Titer hemolisin ini

disebut 1 unit dan untuk pemeriksaan sampel penderita dipakai 2 unit.

Oleh karena uji fiksasi komplemen melibatkan suatu sistem yang terdiri atas berbagai reaktan,

disamping titrasi hemolisin dan komplemen diatas, setiap reaktan harus diuji terhadap ada

tidaknya faktor penghambat atau faktor yang meningkatkan aktivasi komplemen

(antikomplemen atau prokomplemen). Untuk keperluan ini, pada titrasi komplemen

diikutsertakan antigen dan antigen kontrol, serta pada pemeriksaan sampel selalu harus

diikutsertakan kontrol serum positif maupun negatif. Suatu hasil pemeriksaan, baru bisa

dipercaya apabila semua reaktan pada sistem ini terkontrol dengan baik.

Uji fiksasi komplemen dipakai pertama kali oleh Wassermann, Neisser dan Bruck untuk

menentukan diagnosis Sifilis (Test Wassermann), akan tetapi kemudian prinsip pengujian yang

sama dipakai juga dalam diagnosis serologik berbagai penyakit lain, diantaranya penyakit-

penyakit yang disebabkan oleh parasit, seperti Trypanosoma, Schistosoma, serta penyakit-

penyakit yang disebabkan oleh virus, seperti virus Hepatitis B, Herpes, Rotavirus, Rubella dan

lain-lain.

Uji Fiksasi Komplemen untuk penetapan antibodi terhadap virus

Peralatan dan bahan yang diperlukan (cara mikro)

1. Peralatan yang dipakai sama seperti untuk teknik mikrohemaglutinasi

2. Kit reagens (Behring) terdiri atas antigen virus, komplemen, eritrosit domba, hemolisin dan

larutan penyangga.

Cara kerja :

I. Uji Pendahuluan

1. Titrasi hemolisin

a. Sediakan 9 tabung reaksi. Masukkan kedalam tabung pertama dan seterusnya larutan

penyangga dengan volume seperti pada gambar.

b. Masukkan 1,0 ml hemolisin yang telah diencerkan 1:100 kedalam tabung pertama, lalu campur

kemudian pindahkan 1 ml kedalam tabung berikutnya, demikian seterusnya hingga tabung

terakhir.

c. Sediakan 12 tabung, kemudian kedalam 9 tabung pertama dimasukkan masing-masing 0,2 ml

larutan hemolisin dari tabung-tabung permulaan. Tabung 10-12 dipakai untuk kontrol erithrosit.

d. Kedalam tabung 1-9 dimasukkan 0,1 ml komplemen yang sudah diencerkan 1:30, 0,2 ml

suspensi eritrosit 2% dan 0,5 ml larutan penyangga.

e. Kedalam tabung 10-12 masukkan 0,2 ml suspensi eritrosit 2% dan 0,8 ml larutan penyangga.

f. Campur lalu inkubasikan tabung-tabung tersebut pada suhu 37OC selama 30 menit.

g. Perhatikan adanya hemolisis dan tentukan tabung dengan pengenceran hemolisis tertinggi yang

menyebabkan hemolisis lengkap. Pengenceran ini disebut 1 unit dan untuk pemeriksaan sampel

penderita dipakai 2 unit.

h. Pembuatan sistem hemolitik

Campur eritrosit 2% sama banyak dengan hemolisin yang titernya 2 unit. Biarkan dalam suhu

kamar selama minimal 10 menit sebelum dipakai.

2. Titrasi Komplemen

a. Sediakan 3 baris tabung yang jumlahnya masing-masing 8 buah. Kedalam tabung-tabung baris

I masukkan larutan penyangga, komplemen dan larutan antigen, lalu campur

b. Lakukan hal yang sama pada tabung baris ke II dan ke III, hanya sebagai pengganti antigen,

kedalam tabung baris II dimasukkan antigen kontrol dan kedalam tabung baris ke III dimasukkan

larutan penyangga.

c. Inkubasikan semua tabung dalam penangas air dengan suhu 37OC selama 30 menit.

d. Masukkan sistem hemolitik (1h) kedalam semua tabung sebanyak 0,2 ml. Campur dan

inkubasikan lagi pada suhu 37OC selama 30 menit.

e. Perhatikan hemolisis yang terjadi dan tentukan pengenceran komplemen tertinggi yang

menyebabkan hemolisis lengkap. Apabila hemolisis lengkap pada ketiga baris tabung terjadi pada

pengenceran komplemen yang sama, berarti semua reaktan pada sistem ini baik.

f. Pengenceran tertinggi komplemen yang dapat menyebabkan hemolisis lengkap disebut 1 unit

dan dipakai 2 unit untuk pengujian.

II. Pemeriksaan sampel

Pada setiap pemeriksaan selalu harus diikutsertakan kontrol antigen, kontrol sistem hemolitik,

kontrol eritrosit dan kontrol komplemen.

Serum penderita terlebih dahulu diinaktifkan dalam penangas air dengan suhu 56OC untuk

menghilangkan komplemen yang ada dalam serum, sehingga satu-satunya sumber komplemen

hanya yang dibubuhkan pada pengujian dan diketahui titernya.

1. Sampel

Pakai satu baris sumur untuk sampel pertama (sampel akut) dan satu baris lain untuk sampel

kedua (konvalesen).

a. Masukkan ke dalam sumur 1 dan sumur 4-12 larutan penyangga sebanyak 25 ul.

b. Masukkan ke dalam sumur 1-4 sampel yang terlebih dahulu telah diencerkan 1:5 sebanyak 25

ul.

c. Buat pengenceran serum mulai sumur 4 sampai 12 dengan mikrodiluter.

d. Masukkan kedalam sumur 2, sebanyak 25 ul antigen kontrol dan ke dalam sumur 3-12

sebanyak 25 ul antigen virus (2 unit).

e. Campur, kemudian masukkan kedalam sumur 1-2 komplemen 2 unit sebanyak 25 ul, lalu

campur lagi.

2. Kontrol antigen

Pakailah satu baris sumur.

a. Masukkan ke dalam sumur 1 dan 4-12 larutan penyangga sebanyak 25 ul.

b. Masukkan kedalam sumur 1-4 serum kontrol positif yang telah diencerkan 1:5 sebanyak 25 ul,

dan ke dalam sumur 11-12 serum kontrol negatif yang telah diencerkan 1:5 sebanyak 25 ul.

c. Buat pengenceran serum mulai sumur 10 dengan mikrodiluter.

d. Ke dalam sumur 2-12 dimasukkan 25 ul antigen virus (2 unit) kemudian campur.

e. Masukkan ke dalam sumur 1-12 komplemen (2 unit) sebanyak 25 ul, kemudian campur (kocok

dengan alat pengocok).

3. Kontrol sistem hemolitik

Pakailah baris terakhir untuk kontrol sistem hemolitik, eritrosit dan komplemen dengan prosedur

seperti yang diuraikan dibawah ini :

Masukkan ke dalam sumur 1 dan 2 larutan penyangga sebanyak 50 ul dan komplemen sebanyak

25 ul.

4. Kontrol eritrosit

Masukkan ke dalam sumur 3 dan 4 larutan penyangga sebanyak 75 ul dan sistem hemolitik

sebanyak 50 ul.

5. Kontrol komplemen

a. Masukkan ke dalam sumur 5-12 larutan penyangga sebanyak 25 ul, ke dalam sumur 5-8

antigen virus sebanyak 25 ul dan kedalam sumur 9-12 antigen kontrol sebanyak 25 ul.

b. Buat pengenceran komplemen dalam tabung terpisah sehingga memperoleh larutan

komplemen 2 unit, 1,5 unit, 1,0 unit dan 0,5 unit.

c. Masukkan ke dalam sumur 5 dan 9 komplemen 2 unit sebanyak 25 ul, ke dalam sumur 6 dan

10 komplemen 1,5 unit sebanyak 25 ul, ke dalam sumur 7 dan 11 komplemen 1,0 unit sebanyak

25 ul dan ke dalam sumur 8 dan 12 komplemen 0,5 unit sebanyak 25 ul.

d. Campurlah reaktan dalam setiap sumur.

6. Plate ditutup dengan plate lain kemudian diinkubasikan pada suhu 4-6OC selama 18 jam dalam

kotak yang lembab (diberi kain basah).

7. Keesokkan harinya, biarkan plate dalam suhu kamar selama 15 menit, kemudian masukkan

ssitem hemolitik ke dalam semua sumur.

8. Kocok, lalu inkubasikan pada suhu 37OC selama 15-30 menit.

9. Reaksi dianggap selesai bila telah timbul hemolisis lengkap dalam sumur yang berisi

komplemen 2 dan 1,5 unit, hemolisis tak lengkap dalam sumur berisi komplemen 1 unit dan tidak

ada hemolisis dalam sumur berisi komplemen 0,5 unit.

10. Perhatikan hemolisis yang terjadi pada sumur-sumur berisi sampel dan nyatakan pengenceran

tertinggi sampel yang tidak menyebabkan hemolisis.

Penafsiran

1. Adanya reaksi positif (tidak ada hemolisis) berarti dalam serum terdapat antibodi terhadap

virus bersangkutan.

2. Titer antibodi dalam serum tunggal belum memastikan apakah ada infeksi atau pernah

divaksinasi.

3. Untuk mengetahui adanya infeksi diperlukan pemeriksaan serum ganda, yaitu 2 sampel yang

diperoleh pada masa akut dan masa konvalesen dengan jarak waktu 2 minggu. Suatu kenaikan

titer sebanyak 4 kali merupakan indikasi adanya infeksi.

4. Reaksi positif pada kontrol antigen berarti dalam serum antibodi terhadap zat-zat nonspesifik

yang menyertai antigen. Untuk memastikan, titrasi terhadap serum diulang dengan menggunakan

kedua jenis antigen secara paralel. Adanya antibodi spesifik dapat dipastikan bila titernya

terhadap antigen virus 4 kali titer terhadap antigen kontrol.

5. Serum kontrol yang diperoleh dari binatang, kadang-kadang mengandung antibodi terhadap

antigen kontrol hingga dapat menimbulkan hemolisis.

http://ripanimusyaffalab.blogspot.com/2010/02/komplemen-sistem-imun.html