karakterisasi morfologi dan barkoding...
TRANSCRIPT
KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN BARKODING DNA
Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn. (ZINGIBERACEAE)
AKSESI KALIMANTAN
NURKHOLIDAH
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 M / 1441 H
KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN BARKODING DNA
Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn. (ZINGIBERACEAE)
AKSESI KALIMANTAN
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
NURKHOLIDAH
11150950000059
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 M / 1441 H
v
KATA PENGANTAR
Bismillahirarahmanirrahim
Assalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh
Segala puji bagi Allah Subhanahu wa Ta’ala atas rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Karakterisasi
Morfologi dan Barkoding DNA Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn.
(Zingiberaceae) Aksesi Kalimantan” dalam rangka Tugas Akhir sebagai syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi di Fakultas
Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih karena adanya dukungan dari
banyak pihak yang terkait, untuk itu penulis berterimakasih kepada :
1. Prof. Dr. Lily Surayya Eka Putri, M.Env.Stud. selaku Dekan Fakultas Sains
dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Dr. Priyanti, M.Si. selaku Ketua Program Studi Biologi Fakultas Sains dan
Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan selaku Dosen pembimbing II.
3. Dr. Marlina Ardiyani, M.Sc. selaku Dosen pembimbing I dan Kepala
Laboratorium Sistematika Molekuler Tumbuhan, Pusat Penelitian Botani-LIPI
Cibinong.
4. Dr. Megga Ratnasari Pikoli, M.Si. dan Agustina Senjayani, M.Si, M.Si. selaku
Dosen penguji seminar proposal dan seminar hasil penelitian.
5. Kepala Pusat Penelitian Biologi-LIPI dan Kepala Herbarium Bogoriense,
Bidang Botani-LIPI beserta para staff.
6. Semua pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan
Skripsi yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari tulisan ini jauh dari sempurna, oleh karena itu Penulis
mengharapkan kritik dan saran yang konstruktif untuk perbaikan tulisan ini.
Wassalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh
Jakarta, November 2019
Penulis
vi
ABSTRAK
Nurkholidah. Karakterisasi Morfologi dan Barkoding DNA Globba
atrosanguinea Teijsm. & Binn. (Zingiberaceae) Aksesi Kalimantan. Skripsi.
Program Studi Biologi. Fakultas Sains dan Teknologi. 2019. Dibimbing oleh
Marlina Ardiyani dan Priyanti.
Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn. merupakan tumbuhan suku Zingiberaceae
yang dikenal sebagai etnomedisin suku Dayak dan memiliki potensi ornamen yang
tinggi karena perbungaannya yang indah. Habitat alami G. atrosanguinea di
Kalimantan menjadi terancam disebabkan oleh degradasi Daerah Aliran Sungai
(DAS). Karakterisasi morfologi G. atrosanguinea dari Kalimantan penting
dilakukan karena menunjukkan adanya variasi. Karakterisasi molekuler dengan
barkoding DNA menggunakan region Internal Transcribed Spacer (ITS) dari
genom inti juga dilakukan untuk melihat kekerabatan antar aksesi. Sebanyak 33
spesimen herbarium G. atrosanguinea aksesi Kalimantan yang tersimpan di
Herbarium Bogoriense (BO) diobservasi untuk dilakukan karakterisasi morfologi.
Namun, hanya dipilih 4 sampel untuk pengerjaan barkoding DNA dikarenakan
keterbatasan sampel material DNA. Sebanyak 18 sekuens ITS G. atrosanguinea
dan spesies lain yang berkerabat dekat ditambahkan dari NCBI GenBank untuk
analisis filogenetik. Analisis filogenetik menggunakan metode Neighbor-Joining
dengan model p-distance diimplementasikan dengan pairwise distance calculation
dalam MEGA 7.026. Hasil karakterisasi morfologi menghasilkan 3 kelompok yang
memiliki perbedaan bentuk helaian daun. Hasil karakterisasi molekuler
menggunakan barkoding DNA region ITS dapat mengungkapkan hubungan
filogenetik G. atrosanguinea dengan spesies lainnya, tetapi tidak dapat
membedakan antar aksesi karena variasi nukleotida yang sangat rendah. Hasil
persebaran G. atrosanguinea aksesi Kalimantan berdasarkan data spesimen di BO
terdistribusi di setiap provinsi di Pulau Kalimantan.
Kata kunci: Barkoding DNA, Internal Transcribed Spacer (ITS), Globba
atrosanguinea, Pohon Filogenetik
vii
ABSTRACT
Nurkholidah. Morphological Characterization and DNA Barcoding Globba
atrosanguinea Teijsm. & Binn. (Zingiberaceae) Accessions Kalimantan.
Undergraduate Thesis. Department of Biology. Faculty of Science and
Technology. Syarif Hidayatullah State Islamic University Jakarta. 2019.
Advised by Marlina Ardiyani dan Priyanti.
Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn. is a species in the family Zingiberaceae,
which is known as an etnomedicine of Dayak ethnic and has a high ornamental
potential due to its beautiful inflorescence. The natural habitat of G. atrosanguinea
in Kalimantan becomed threatened because of watershed degradation.
Morphological studies of G. atrosanguinea from Kalimantan are important because
they show variations. Molecular characterization using DNA barcoding Internal
Transcribed Spacer (ITS) region from nuclear DNA is done to understand the
relationship among the accessions of G. atrosanguinea. A total of 33 specimens
Herbarium Bogoriense (BO) of G. atrosanguinea were examined for the
morphological characterization. However only 4 samples of G. atrosanguinea from
Kalimantan were available for the DNA barcoding because of limited DNA
material. An addition of 18 ITS sequences of G. atrosanguinea and other closely
related species from NCBI were analyzed. Phylogenetic analysis used Neighbor-
Joining method with p-distance, implemented to pairwise distance calculation in
MEGA 7.026. Morphological observations can be grouped into 3 clusters according
to leaf shape variations. Molecular characterization using DNA barcoding can be
used to reveal the phylogenetic relationship of G. atrosanguinea but was not able
to distinguish between accessions due to very low variations of the nucleotides. The
distribution of G. atrosanguinea accessions to Kalimantan based on specimen data
(BO) in the are distributed in each province of Kalimantan.
Keywords: DNA Barcoding, Internal Transcribed Spacer (ITS), Globba
atrosanguinea, Phylogenetic tree
viii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR.....................................................................................................v
ABSTRAK ................................................................................................................... vi
ABSTRACT ................................................................................................................ vii
DAFTAR ISI .............................................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................x
DAFTAR TABEL ......................................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................ xii
BAB I PENDAHULUAN .............................................................................................1
1.1. Latar Belakang ..........................................................................................1
1.2. Rumusan Masalah .....................................................................................3
1.3. Tujuan Penelitian ......................................................................................3
1.4. Manfaat Penelitian ....................................................................................3
1.5. Kerangka Berfikir .....................................................................................4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................5
2.1. Botani Globba atrosanguinea ...................................................................5
2.1. Ayat Al Qur’an mengenai Tumbuhan Obat-obatan ....................................6
2.2. Barkoding DNA ........................................................................................8
2.3. Internal Transcribed Spacer (ITS) ............................................................9
2.4. Filogenetika Molekuler ........................................................................... 10
BAB III METODE PENELITIAN ............................................................................ 12
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian.................................................................. 12
3.2. Alat dan Bahan ....................................................................................... 12
3.3. Prosedur Penelitian ................................................................................. 13
3.3.1. Koleksi Sampel ....................................................................................... 13
3.3.2. Sterilisasi Alat dan Bahan ....................................................................... 13
3.3.3. Persiapan Buffer CTAB 2x ..................................................................... 13
3.3.4. Ekstraksi DNA ........................................................................................ 14
3.3.5. Amplifikasi DNA dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) ..... 15
3.3.6. Analisis Kualitatif Hasil Ekstraksi DNA Genom Total dan Amplifikasi
DNA Region ITS .................................................................................... 15
3.3.7. Sekuensing DNA .................................................................................... 16
3.3.8. Pengamatan Morfologi ............................................................................ 17
3.3.9. Pemetaan Distribusi Globba atrosanguinea berdasarkan data Herbarium
Bogoriense (BO) ..................................................................................... 17
3.4. Analisis In silico ..................................................................................... 17
ix
3.4.1. Analisis Sekuens DNA ............................................................................ 17
3.4.2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik .............................................................. 19
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 20
4.1. Karakterisasi Morfologi Globba atrosanguinea ....................................... 20
4.1.1. Kelompok Pertama G. atrosanguinea aksesi Kalimantan ......................... 23
4.1.2. Kelompok Kedua G. atrosanguinea aksesi Kalimantan ........................... 25
4.1.3. Kelompok Ketiga G. atrosanguinea aksesi Kalimantan ........................... 26
4.1.4. Distribusi Globba atrosanguinea............................................................. 26
4.2. Hasil Karakterisasi Molekuler Globba atrosanguinea .............................. 29
4.2.1. Analisis Filogenetik berdasarkan Region ITS .......................................... 29
4.2.2. Jarak Genetik Sekuens DNA Globba atrosanguinea ................................ 32
BAB V PENUTUP ....................................................................................................... 36
5.1. Kesimpulan ............................................................................................. 36
5.2. Saran ...................................................................................................... 36
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 37
LAMPIRAN ................................................................................................................. 42
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Alur Kerangka Berfikir ............................................................................. 4
Gambar 2. Morfologi Globba atrosanguinea: A. Habitus B. Spesimen untuk
Herbarium C. Perbungaan terminal D. Kapsul buah verukosa E. Bunga dengan
4 embelan (Dokumentasi: Marlina Ardiyani, unpublished) ......................................... 6
Gambar 3. Ilustrasi DNA Barkode (https://earthsky.org/)............................................ 9
Gambar 4. Posisi relatif region ITS (Takano & Okada, 2002) ..................................... 10
Gambar 5. Spesimen Globba atrosanguinea aksesi Kalimantan (BO-1518989)
Koleksi Herbarium Bogoriense (BO) (Dokumentasi Pribadi, 2019) ............................ 22
Gambar 6. Bentuk helaian daun Globba atrosanguinea aksesi Kalimantan Koleksi
Herbarium Bogoriense (BO) A. Bulat telur menjorong B. Bulat panjang melanset
C. Panjang melanset ((Dokumentasi Pribadi, 2019) .................................................... 23
Gambar 7. Peta Persebaran Globba atrosanguinea aksesi Kalimantan berdasarkan
data Spesimen di Herbarium Bogoriense (BO) ........................................................... 27
Gambar 8. Pohon filogenetik marga Globba dengan metode Neighbor-Joining (NJ)
berdasarkan region ITS .............................................................................................. 29
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Pengelompokan Globba atrosanguinea berdasarkan hasil pengamatan
karakterisasi morfologi ............................................................................................. 20
Tabel 2. Matriks Jarak genetik sekuens DNA Globba atrosanguinea dengan spesies lain
dari NCBI GenBank ................................................................................................. 34
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian Karakterisasi Molekuler .................................. 42
Lampiran 2. Tahap Ekstraksi DNA (Doyle & Doyle 1990) yang dimodifikasi .......... 43
Lampiran 3. Penyatuan sekuens forward dan reverse Globba atrosanguinea
menggunakan program ChromasPro ver 1.7.4 .......................................................... 44
Lampiran 4. Alur Kerja Proses Barkoding DNA ....................................................... 45
Lampiran 5. Hasil BLAST Sekuens DNA Globba atrosanguinea region ITS dari
NCBI GenBank ........................................................................................................ 46
Lampiran 6. Matriks posisi nukleotida sekuens DNA Region ITS yang
menunjukkan variasi ................................................................................................. 47
Lampiran 7. Lanjutan Matriks posisi sekuens DNA Region ITS yang menunjukkan
variasi ....................................................................................................................... 48
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki kekayaan alam berupa
plasma nutfah tumbuhan obat. Sekitar 30.000 spesies tumbuhan, 9.600 spesies
berpotensi sebagai tumbuhan obat (Salimi & Bialangi, 2014). Suku yang banyak
dimanfaatkan sebagai tumbuhan obat adalah Zingiberaceae (Washikah, 2016).
Marga Globba dapat dimanfaatkan untuk pengobatan tradisional (Sam & Ibrahim,
2016). Kandungan fitokimia daun Globba memiliki flavonoid pinostrobin chalcone
sebanyak 75,63% (Andila & Tirta, 2019) dan aktivitas farmakologis antihistamin,
antipiretik, antispasmodik dan hipotensi (Lemmens & Bunyapraphatsara, 2003).
Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn. adalah spesies yang dimanfaatkan oleh
suku Dayak di Kalimantan. Daun G. atrosanguinea berpotensi untuk mengobati
sakit panas, luka oleh serangga dan penstimulasi (Heyne, 1987). Selain itu, G.
atrosanguinea juga memiliki bunga dengan potensi ornamental. Spesies ini
memiliki daun gagang merah yang mencolok dan bunga jingga pucat, membuatnya
mudah dibedakan dari spesies lain (Takano & Okada, 2001).
Selain di Kalimantan G. atrosanguinea banyak ditemukan di wilayah
Sumatra (Lamb, Gobilik, Ardiyani, & Poulsen, 2013). Hasil penelitian yang
dilakukan terkait identitas dan status taksonomi G. atrosanguinea (Gambar 1)
mencakup penelitian analisis morfologi untuk mempertelakan varietas baru yaitu
G. atrosanguinea var. sumatrana. Adanya variasi pembeda morfologi G.
atrosanguinea var. atrosanguinea yaitu adanya lobus pada bibir yang menyebar
dan ukuran signifikan perhiasan bunga seperti benang sari rudimenter samping dan
tabung mahkota (Takano & Okada, 2001, 2003). Penelitian lain adalah analisis
filogenetika molekuler menggunakan sekuens DNA dari region ITS (Williams,
Kress, & Manos, 2004) dan trnK-matK untuk studi formasi triploid (Takano &
Okada, 2002). Hasil penelitian tersebut dapat mengungkap identitas dan status
taksonomi G. atrosanguinea aksesi Sumatra, namun penelitian untuk aksesi
Kalimantan khususnya karakterisasi morfologi dan molekuler sejauh ini belum
dilakukan.
2
Globba atrosanguinea dapat tumbuh di hutan dataran rendah hingga
ketinggian 1000 mdpl (Lemmens & Bunyapraphatsara, 2003). Persebaran G.
atrosanguinea berdasarkan data spesimen di Herbarium Bogoriense (BO) penting
untuk diketahui di tiap-tiap provinsi di Kalimantan. Berdasarkan informasi di label
herbarium, beberapa lokasi tumbuhnya G. atrosanguinea di Kalimantan berada di
hutan primer Dipterokarpa yang dekat dengan Daerah Aliran Sungai (DAS). Di
Indonesia terdapat 60 DAS kritis 3 diantaranya terdapat di Kalimantan (Status
Lingkungan Hidup Ekoregion Kalimantan, 2011). Berdasarkan Badan Pengelolaan
Daerah Aliran Sungai (BPDAS) Mahakam Berau (2009) kegiatan seperti
pembukaan wilayah yang tidak terarah, eksploitasi hutan dan kebakaran hutan dapat
menjadi permasalahan pokok DAS di Kalimantan. Kerusakan habitat G.
atrosanguinea di alam dapat menyebabkan penurunan populasi.
Kajian karakterisasi morfologi sangat penting dilakukan untuk mengenal dan
mengonfirmasikan identitas suatu spesies, tetapi tidak mudah untuk memecahkan
spesies kompleks (Zein & Prawiradilaga, 2013). Selain diatur oleh genetik, karakter
morfologi juga dipengaruhi oleh lingkungan sehingga karakternya kurang spesifik
(Hikmah, Retnoningsih, & Habibah, 2016). Di samping itu, dilakukan juga kajian
karakterisasi molekuler menggunakan teknik barkoding DNA. Barkoding DNA
merupakan teknik yang menggunakan satu atau beberapa buah region DNA berupa
sekuens pendek untuk mengidentifikasi suatu spesies (Hebert, Cywinska, Ball, &
DeWaard, 2003; Hebert, Stoeckle, Zemlak, & Francis, 2004). Barkoding DNA
tidak hanya bermanfaat untuk mengidentifikasi spesies, namun juga dapat
digunakan untuk merekonstruksi pohon filogenetik (Utami & Ardiyani, 2015).
Region barkode yang sering digunakan pada tumbuhan dan berprospek untuk
barkoding adalah Internal Transcribed Spacer (ITS) (Techen, Parveen, Pan, &
Khan, 2014) Region ITS dipilih karena memiliki tingkat keberhasilan tinggi dalam
amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR), sekuensing dua arah dan
kemampuan diskriminatif sempurna (Zhang, Duan, & Zhou, 2013). Selain itu,
region ITS juga memiliki tingkat variasi yang tinggi bahkan di antara spesies yang
berkaitan erat (Letchuman, 2018). Dengan dilakukannya barkoding DNA
menggunakan region ITS ini diharapkan dapat memberikan kejelasan informasi
karakter molekuler G. atrosanguinea.
3
1.2. Rumusan Masalah
Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :
1. Apakah terdapat variasi morfologi G. atrosanguinea aksesi Kalimantan yang
diduga berkorelasi dengan karakter molekuler?
2. Apakah pohon filogenetik yang direkonstruksi menggunakan region ITS
dapat membedakan aksesi G. atrosanguinea di Kalimantan?
3. Bagaimanakah persebaran G. atrosanguinea aksesi Kalimantan berdasarkan
data spesimen di Herbarium Bogoriense (BO)?
1.3. Tujuan Penelitian
Tujuan dalam penelitian ini adalah :
1. Mengetahui variasi morfologi G. atrosanguinea aksesi Kalimantan dan
korelasinya dengan karakter molekuler.
2. Mengetahui hubungan filogenetik G. atrosanguinea aksesi Kalimantan
berdasarkan region ITS.
3. Mengetahui persebaran G. atrosanguinea aksesi Kalimantan berdasarkan
data spesimen di Herbarium Bogoriense (BO).
1.4. Manfaat Penelitian
Manfaat dalam penelitian ini adalah :
1. Informasi karakterisasi morfologi G. atrosanguinea dapat menjadi acuan
untuk studi marga Globba spp.
2. Membantu dalam menghasilkan data region barkode ITS yang potensial
untuk identifikasi tumbuhan terutama suku Zingiberaceae.
3. Informasi hubungan filogenetik G. atrosanguinea dapat berguna untuk
proyek filogenetika (tree of life) sehingga dapat dimanfaatkan untuk studi
selanjutnya.
4
1.5. Kerangka Berfikir
Kerangka berfikir dalam penelitian ini adalah :
Gambar 1. Alur Kerangka Berfikir
Indonesia memiliki kekayaan
alam berupa tumbuhan obat
dan ornamental
Globba atrosanguinea
Penelitian terkait
Aksesi Sumatra Aksesi Kalimantan
Habitat terancam akibat
degradasi DAS
Belum adanya kajian
karakterisasi
Sudah adanya kajian
Status taksonomi
Kajian Morfologi
(Takano & Okada
2001;2003)
Kajian Morfologi Molekuler dengan
Barkoding DNA
Kajian filogenetika
molekuler dan studi
formasi triploid (Takano
& Okada, 2002)
Rekonstruksi filogenetik Globba
atrosanguinea (Zingiberaceae)
Region ITS (Internal
Transcribed Spacer) dari
Genom inti
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Botani Globba atrosanguinea
Secara etimologi Globba atrosanguinea; Globba berasal dari kata Galoba
(tanaman asli Indonesia berupa bumbu dari Ambon) dan atrosanguinea berasal dari
kata ater (hitam atau sangat gelap) dan sanguinea (merah darah) (Clay & James,
1987). Globba atrosanguinea secara taksonomi termasuk anggota Kingdom
Plantae, Divisi Magnoliophyta, Kelas Liliopsida, Bangsa Zingiberales, Suku
Zingiberaceae, Marga Globba, Spesies Globba atrosanguinea Teijsm. & Binn
(1864) (Boldsystems, 2019). G. atrosanguinea memiliki nama lokal Indonesia yaitu
Susu perada (Palembang, Sumatra), Tubo bala (Kenyah Dayak, Kalimantan), Tubu
bayung atau Baku bayung (Lundayeh, Kalimantan) (Heyne, 1987; Lamb et al.,
2013; Lemmens & Bunyapraphatsara, 2003).
Spesies ini termasuk tumbuhan herba yang dapat mencapai tinggi 65 cm
(Gambar 2), memiliki bentuk helaian daun Bulat telur menjorong, ujung daun
bertaring melancip dan pangkal daun runcing menirus (Takano & Okada, 2003).
Teruk berdaun hingga 10-12 daun, menghasilkan tunas kuncup, biasanya berwarna
kemerahan di bagian bawah, perbungaan hampir tegak, agak kompak, dengan
adanya banyak ikalan pendek, daun gagang luas dan merah terang, bunga kuning
ke jingga, tak bertangkai, benang sari rudimenter lebih pendek daripada tabung
mahkota lateral, memiliki kelopak merah dengan bibir kuning-jingga dan kepala
sari dengan 4 embelan 2 di setiap sisi dan kapsul buah bersifat verukosa (Lamb et
al., 2013; Lemmens & Bunyapraphatsara, 2003). Saat ini, dilaporkan terdapat 2
varietas yaitu: Globba atrosanguinea var. atrosanguinea dan Globba
atrosanguinea var. sumatrana yang dibedakan karena adanya perbedaan karakter
morfologi: lobus pada bibir yang menyebar dan adanya perbedaan ukuran
signifikan perhiasan bunga seperti benang sari rudimenter samping dan tabung
mahkota (Takano & Okada, 2001).
Marga Globba terdiri dari sekitar 100 spesies yang tersebar di Asia Tenggara.
6
Wilayah yang memiliki banyak spesies endemik lokal tersebar di Himalaya timur
dari Myanmar ke Indo-Cina dan Thailand (Lemmens & Bunyapraphatsara, 2003).
Marga ini umumnya terdistribusi di wilayah hutan Asia tropis monsoon. Di hutan
hujan, spesies ini ditemukan dari Semenanjung Malaya dan hingga ke New Guinea.
Tigabelas taksa telah tercatat di Borneo sejauh ini. G. atrosanguinea dilaporkan
banyak ditemukan di Sumatra dan Kalimantan. Spesies ini umumnya dapat
ditemukan di hutan dataran rendah hingga ketinggian 1000 mdpl dan sering berada
dekat lokasi basah (Lamb et al., 2013).
Gambar 2. Morfologi Globba atrosanguinea: A. Habitus B. Spesimen untuk
Herbarium C. Perbungaan terminal D. Kapsul buah verukosa E. Bunga dengan 4
embelan (Dokumentasi: Marlina Ardiyani, 2017)
2.1. Ayat Al Qur’an mengenai Tumbuhan Obat-obatan
Al-Qur'an adalah kitab suci yang menggambarkan pentingnya tumbuhan
yang digunakan untuk berbagai macam manfaat. Nabi Muhammad Shalallaahu
'Alayhi Wasallam menggunakan dan merekomendasikan tanaman obat untuk
berbagai penyakit dan makanan sejalan dengan kutipan seorang dokter Yunani
7
kuno Hippocrates berkata “Biarkan makanan menjadi obat dan obatmu menjadi
makananmu”.
Manfaat tumbuhan sebagai bahan makanan dan obat-obatan sesungguhnya
telah dijelaskan Allah SWT dalam Firman-Nya:
“Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, berapakah banyaknya Kami
tumbuhkan di bumi itu pelbagai macam tumbuh-tumbuhan yang baik?
Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar terdapat suatu tanda kekuasaan
Allah. Dan kebanyakan mereka tidak beriman” (Asy – Syu’ara (26) : 7-8).
Secara umum tumbuhan suku Zingiberaceae telah tertulis didalam Al-
Qur’an pada Surah Al-Insan (Manusia) ayat 17. Ayat ini lebih mengacu kepada
tumbuhan Zingiber officinale ( َزْنَجبِيل).
“Di dalam syurga itu mereka diberi minum segelas (minuman) yang campurannya
adalah jahe” (Al – Insan (76) : 17).
Zingiber officinale yang umumnya dikenal sebagai jahe, anggota suku
Zingiberaceae adalah rempah-rempah yang dikenal dengan beberapa potensi
sebagai obat. Z. officinale memiliki sejarah panjang dapat mengobati penyakit
seperti mual, gangguan pernapasan, kesehatan jantung dan gangguan rematik. Sama
halnya dengan G. atrosanguinea yang termasuk famili Zingiberaceae secara umum
memiliki kemampuan sebagai obat-obatan dan memiliki potensi sebagai
ornamental atau tanaman hias karena perbungaannya yang indah. Berdasarkan
pengetahuan masyarakat setempat spesies ini memiliki kekuatan magis dapat
menenangkan hewan liar, berteman dan menarik pasangan (Lamb et al., 2013).
Spesies ini dilaporkan terdapat di Muaradua (Palembang) di daerah tersebut
dibudidayakan dan dimanfaatkan bagian tumbuhan berupa rimpang dan daun.
8
Rebusan daun tersebut memiliki khasiat digunakan untuk mengobati sakit panas,
dan memiliki efek mendinginkan dan menyegarkan (Heyne, 1987). Kegunaan
tumbuhan ini berbeda dari setiap daerah, Di Sumatra rebusan daun digunakan untuk
mengobati demam karena dianggap sebagai pendingin dan penstimulasi. Di Borneo
rimpang di bungkus daun atau dipanggang dengan bara lalu diaplikasikan sebagai
tapal untuk luka yang disebabkan oleh serangga (Lemmens & Bunyapraphatsara,
2003).
2.2. Barkoding DNA
Barkoding DNA diusulkan pertama kali oleh Hebert et al. (2003) dari
Universitas Guelph, Kanada yang yang berhasil mengidentifikasi dan
mendiferensiasi spesies hanya menggunakan sekuens dari gen tertentu yang cukup
pendek. Gen yang posisinya di dalam genom telah terstandarisasi atau disepakati
bersama disebut sebagai DNA Barcode. Pengembangan teknik barkoding DNA
bermula dari suatu ide untuk melakukan proses identifikasi spesies secara cepat,
dapat dipercaya, biaya efektif dan dapat diakses oleh masyarakat banyak (Rahayu
& Nugroho, 2015).
Berdasarkan Zein & Prawiradilaga (2013) teknik DNA barkoding terbukti
dapat digunakan dengan cepat dalam mengidentifikasi spesies yang sulit, teknik ini
dapat dilakukan secara mudah dan relatif murah dalam mengidentifikasi spesies.
Pada tanggal 9-12 Maret 2003 diadakannya workshop dengan tema “Taxonomy and
DNA” di Cold Spring Harbor Laboratory di New York oleh Aflred P. Sloan
Foundation yang juga mendirikan Consortium for the Barcode of Life (CBOL)
dengan misi utama memajukan eksplorasi dan pengembangan barkoding DNA
sebagai standar global untuk identifikasi spesies dan saat itu disepakatinya Gen
Cytochrome Oxydase I (COI) sebagai gen representatif dalam barkoding DNA.
Teknik barkoding DNA yang menggunakan sekuens pendek dari genom ini
diibaratkan seperti mesin scanner genggam yang biasa digunakan di supermarket
untuk mengetahui identitas dari suatu barang dengan proses cepat dan tepat
(Gambar 3).
Proses barkoding DNA pada tumbuhan dilakukan dengan mengekstraksi dan
mengamplifikasi DNA dari gen-gen genom kloroplas maupun genom inti
menggunakan satu region maupun gabungan dari beberapa region barkode. Region
9
yang sering digunakan pada tumbuhan dan berprospek untuk barkoding adalah ITS,
rbcL, matK, trnH-psbA, rpl16 dan trnL-F (Chen et al., 2010; De Groot et al., 2011;
Techen et al., 2014; Zhang et al., 2013).
Gambar 3. Ilustrasi DNA Barkode (https://earthsky.org/)
Barkoding DNA tidak hanya bermanfaat untuk mengidentifikasi dan
mengklasifikasi spesies, namun juga dapat dipergunakan untuk merekonstruksi
hubungan kekerabatan antar spesies (filogenetik) salah satunya berguna untuk
memecahkan masalah yang berkaitan dengan proses evolusi, diantaranya asal-usul
(Utami & Ardiyani, 2015). Selain itu, dapat membedakan antara spesies yang
memiliki kemiripan morfologi, mempercepat penamaan spesies dan memberikan
informasi genetik secara detail (Zein & Prawiradilaga, 2013). Berdasarkan Kress
(2017) barkoding DNA dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan dasar dalam
bidang sistematika, ekologi, biologi dan konservasi evolusioner, termasuk
perakitan komunitas, jaringan interaksi spesies, penemuan taksonomi, menilai area
prioritas untuk perlindungan lingkungan dan sebagai botani forensik dalam
pengaturan lalu lintas pada spesies yang terancam punah serta untuk pemantauan
produk komersial, seperti makanan dan suplemen herbal.
2.3. Internal Transcribed Spacer (ITS)
Region barkode yang sering digunakan pada tumbuhan dan berprospek untuk
barkoding salah satunya adalah Internal Transcribed Spacer (ITS) (Techen et al.,
2014). Menurut Ekasari et al. (2012) Region ITS sering digunakan dalam
menganalisis filogenetika molekuler karena region ITS memiliki karakteristik
unggul dengan memiliki panjang kurang lebih 700 bp dan memiliki salinan yang
banyak di dalam genom inti. Region ITS dipilih karena memiliki tingkat
keberhasilan yang tinggi dalam amplifikasi PCR, sekuensing dua arah (forward dan
reverse) dan tingkat variasi yang tinggi bahkan di antara spesies yang berkaitan erat
10
(Letchuman, 2018; Zhang et al., 2013). Region ITS juga biasanya mengalami
perubahan atau mutasi sehingga dapat bervariasi di antara spesies (Mulyatni,
Priyatmojo, & Purwantara, 2011). Region ITS1 terletak diantara 18S dan 5.8S
rRNA, sementara ITS2 berada diantara 5.8S dan 25S rRNA (Takano & Okada,
2002) (Gambar 4).
Gambar 4. Posisi relatif region ITS (Takano & Okada, 2002)
Aplikasi barkoding DNA pada tumbuhan telah banyak dilakukan oleh para
peneliti diantaranya pada tumbuhan berbunga menggunakan beberapa region
barkode (Kress, Wurdack, Zimmer, Weigt, & Janzen, 2005). Penerapan
menggunakan region ITS telah digunakan pada identifikasi spesies Amomum
(Zingiberaceae) (Segersäll, 2011), megidentifikasi spesies Taxus L. (Taxaceae)
(Gao et al., 2010), benih di petak hutan tropis Amazon (Gonzalez et al., 2009),
spesies berry dalam makanan (Jaakola, Suokas, & Häggman, 2010), spesies invasif
Cardamine di danau Constance (Bleeker, Klausmeyer, Peintinger, & Dienst, 2008)
dan identifikasi tanaman obat Cina (Fabaceae) (Gao et al., 2010), mengetahui
status taksonomi Roscoea cautleoides var. pubescens (Zingiberaceae) (Zhang et al.,
2013).
2.4. Filogenetika Molekuler
Filogenetika molekuler merupakan studi yang mempelajari hubungan
evolusioner antar organisme dengan menggunakan data molekuler berupa urutan
nukleotida atau asam amino (Graur & Li, 2000). Perkembangan teknik-teknik
molekuler di dalam biologi molekuler berkembang pesat, seperti PCR (Polymerase
Chain Reaction) dan sekuensing DNA, penggunaan sekuens DNA dalam penelitian
filogenetik telah dilakukan pada semua tingkatan taksonomi, misalnya suku, marga
dan spesies evolusi (Aprilyanto & Sembiring, 2015). Filogenetik molekuler
mengkombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk merekonstruksi
11
hubungan filogenetik. Analisis filogenetik adalah suatu pendekatan logis untuk
menunjukkan hubungan evolusi antara organisme (Schmidt, 2003). Studi
filogenetika bertujuan untuk rekonstruksi hubungan kekerabatan antara organisme
(hubungan genealogikal), estimasi waktu divergensi, dan pemetaan urutan kejadian
dalam proses evolusi (Aprilyanto & Sembiring, 2015).
Penggunaan sekuens DNA dalam merekonstruksi filogenetik dengan
menggunakan analisis bioinformatika telah meningkat secara pesat. Bioinformatika
sebagai ilmu yang mengkaji biologi pada tatanan makromolekul dan kemudian
menerapkan teknologi informasi untuk memahami dan menata informasi yang
terkait dengannya dalam skala besar (Luscombe, Greenbaum, & Gerstein, 2001).
Dasar penggunaan sekuens DNA dalam studi filogenetik adalah terjadi perubahan
basa nukleotida menurut waktu sehingga kecepatan evolusi akan dapat diperkirakan
(Aprilyanto & Sembiring, 2015). Berbagai teknik berdasarkan materi genetik DNA
telah banyak dikembangkan dan berpotensi menjadi penanda gen. Dengan
pengetahuan ini, rekonstruksi pohon evolusi antara organisme dapat dilakukan
(Karmana, 2009). Analisis filogenetik dari sekuens nukleotida dilakukan antara lain
untuk menentukan hubungan kekerabatan diturunkan selama proses evolusi
(Aprilyanto & Sembiring, 2015). Analisis sekuens yang memiliki kedekatan dan
kekerabatan dapat diidentifikasi dengan menempati cabang yang bertetangga pada
pohon filogenetik (Dharmayanti, 2011).
12
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan bulan Oktober
2019 di Laboratorium Sistematika Molekuler Tumbuhan, Herbarium Bogoriense,
Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi LIPI-Cibinong.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: autoklaf (labo Sanyo),
dry sterilier/oven (Sanyo), electrophoresis printgraph (gel doc), ice maker (Sanyo),
inkubator (Sanyo), lemari asam (fumehood), microwave (Bompani), mikropipet
(Gilson), refrigerator centrifuge (Kubota 6800), submarine electrophoresis system
(Mufid-exu), PCR thermal cycler (Wealtec SEDI G), thermomagnestir (Sibata
mgh-320), timbangan analitik (Adam nimbus nbl), vortex genie 2tm (Scientific
industries, inc), waterbath shaker (Taitec personal 11), spindown (Wealtec e-
centrifuge), water purification apparatus (Suac-21oe), lemari es (Toshiba, Sanyo),
tip putih, tip kuning, tip biru, rak tabung, mikrotube 1,5 ml dan 0,2 ml, mortar dan
alu, spatula, botol reagen schott, erlenmeyer, gelas beaker, komponen
elektroforesis, label indikator, alumunium foil dan mikroskop lengan (Amscope 7x-
45x trinocular stereo).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sampel jaringan daun,
dH2O (deionized water), alkohol 70%, akuades (distilled water), TBE 1x (tris HCl,
asam borat dan EDTA), kloroform-isoamilalkohol, 2-mercaptoethanol, gel silika,
kantong teh, isopropanol, polyvinylpyrrolidone (PVP) 1%, pasir kuarsa, CTAB,
NaCl, gel agarosa (Vivantis), gel-red (visafe red gel strain) (Vivantis), DNA ladder
(1Kb Geneaid dan 100bp Promega), nuclease free water (Promega), go-taq
polymerase (Promega), loading dye (KAPA2G), MgCl2 (Promega), dNTPs
(Promega), primer ITS5P sebagai forward (5'-
GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3') dan primer ITS8P sebagai reverse (5'
CACGCTTCTCCA GACTACA- 3') dari Möller & Cronk (1997).
13
3.3. Prosedur Penelitian
Karakterisasi molekuler dilakukan dengan teknik barkoding DNA region ITS
(Lampiran 4) dilakukan dengan tahap: persiapan koleksi sampel, ekstraksi DNA,
PCR, elektroforesis, sekuensing dan analisis filogenetik (Lampiran 1).
Karakterisasi morfologi G. atrosanguinea dilakukan dengan mengamati karakter
morfologi yang terlihat pada setiap lembar Herbarium.
3.3.1. Koleksi Sampel
Sampel G. atrosanguinea yang digunakan dalam penelitian ini
menggunakan voucher spesimen yang tersimpan di Cibinong Science Center,
Herbarium Bogoriense (BO). Percobaan awal terbaik dalam riset barkoding DNA
adalah menggunakan spesimen terpercaya (spesimen voucher) (Schander &
Willassen, 2005). Spesimen yang digunakan untuk studi morfologi adalah semua
spesimen G. atrosanguinea aksesi Kalimantan yang berasal dari hasil eksplorasi
dan survei dari Kalimantan sebanyak 33 spesimen. Sampel yang dipilih untuk
pengambilan material DNA G. atrosanguinea yaitu sampel yang tersimpan dalam
silika gel di Laboratorium Sistematika Molekuler Tumbuhan. Sampel yang
digunakan sebanyak 4 sampel dengan No. Koleksi MA 621, MA 639, MA 643 dan
WEKBOE 40 yang dikoleksi oleh Marlina Ardiyani pada tahun 2011 dan 2017.
3.3.2. Sterilisasi Alat dan Bahan
Semua alat dan bahan yang akan digunakan disterilisasi dengan autoklaf
pada suhu 121°C dan tekanan sebesar 1 bar selama 15 menit. Alat seperti mortar
dan alu dibungkus plastik tahan panas dan diikat dengan karet. Selain itu, spatula
dibungkus dengan alumunium foil hingga tertutup seluruh bagiannya dan alat-alat
gelas ditutup dengan menggunakan alumunium foil. Untuk bahan seperti akuades
dan akuabides langsung dimasukkan kedalam wadah. Tips ditata di dalam dan
diberi label indikator sebagai informasi atau keterangan sudah dilakukan sterilisasi.
3.3.3. Persiapan Buffer CTAB 2x
Larutan CTAB 2x dengan volume total sebanyak 500 ml disiapkan. Proses
pertama adalah menyiiapkan larutan CTAB 2x yang terdiri dari 2% CTAB, 1,4 M
NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,20 mM EDTA dan akuabides sebanyak 500 ml.
Kemudian masing-masing zat ditimbang (10 g CTAB, 40,908 g NaCl, 6,055 g NaCl
14
dan 3,0722 g EDTA). Seluruh zat dicampurkan ke dalam gelas beaker dan
ditambahkan dH2O sebanyak 300 ml. Setelah itu, dihomogenisasi dengan kecepatan
sedang. Larutan ditambahkan kembali dengan akuabides sebanyak 200 ml untuk
mencapai total larutan 500 ml. Larutan yang telah siap dimasukkan ke dalam botol
reagen Schott kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf. Setelah itu
larutan dapat disimpan pada suhu ruang dan siap untuk digunakan.
3.3.4. Ekstraksi DNA
Jaringan daun yang disimpan dalam silika gel kemudian digunakan untuk
ekstraksi DNA total menggunakan metode yang berbasis CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide) mengacu pada metode ekstraksi oleh Doyle & Doyle (1990)
yang dimodifikasi (Lampiran 2). Tahap pertama ekstraksi diawali dengan
memanaskan 600 μL larutan CTAB pada suhu 60oC selama 1 jam. Sampel daun
seberat 0,02 g ditimbang menggunakan neraca analitik, kemudian dimasukkan ke
dalam mortar dan ditambahkan 1 sendok spatula 1% PVP dan pasir kuarsa. Sampel
yang sudah digerus halus dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 ml dan ditambahkan
CTAB hangat sebanyak 600 µl. Sampel ditambahkan 2-mercaptoethanol 2% yaitu
sebanyak 12 µl. Penambahan 2-mercaptoethanol dilakukan di dalam fumehood
karena 2-mercaptoethanol bersifat toksik. Sampel kemudian dipanaskan di dalam
penangas air 60oC selama 1 jam. Setelah itu, sampel diangkat dari penangas air dan
dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya sampel tersebut
dihomogenisasi dengan kecepatan 13.000 rpm, pada suhu 20 oC selama 15 menit.
Lalu supernatan dipindahkan ke dalam mikrotube 1,5 ml sebanyak 500 µl.
Selanjutnya ditambahkan kloroform-isoamilalkohol sebanyak 1x volume yaitu 500
µl dan dihomogenisasi selama 10-15 menit menggunakan shaker.
Sampel tersebut dihomogenisasi lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu
20oC selama 15 menit. Lalu supernatan dipindahkan ke dalam mikrotube 1,5 ml
sebanyak 500 µl. Kemudian ditambahkan kloroform-isoamilalkohol lagi sebanyak
1x volume yaitu 500 µl dan dihomogenisasi selama 10-15 menit. Selanjutnya
ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 2/3 volume yaitu 200 µl dan didiamkan
satu malam di dalam freezer -20oC. Larutan kemudian dihomogenisasi dengan
kecepatan 13.000 rpm pada suhu 20oC selama 10 menit. Kemudian supernatan
dibuang dan ditambahkan alkohol 70% sebanyak 500 µl. Larutan kembali
15
dihomogenisasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 20oC selama 5 menit. Lalu
supernatan dibuang dan pelet dikeringkan di dalam inkubator selama 30 menit.
Selanjutnya, pelet ditambahkan nuclease free water sebanyak 30-50 µl dan
dilakukan spindown. Hasil ekstraksi DNA genom total ini siap untuk digunakan
pada analisis selanjutnya. DNA genom total dapat disimpan untuk jangka waktu
cukup lama di dalam lemari pendingin atau freezer pada suhu -20oC.
3.3.5. Amplifikasi DNA dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi bertujuan untuk memperbanyak DNA region ITS. Seluruh
region ITS1-5.8S-ITS2 diamplifikasi melalui Polymerase Chain Reaction (PCR)
menggunakan primer ITS5P (5'-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3 ') dan
ITS8P (5' CACGCTTCTCCA GACTACA- 3') dari dari Möller & Cronk (1997).
Sampel DNA sebelum dilakukan PCR harus dilakukan spindown terlebih dahulu.
Campuran PCR atau disebut PCR mix atau PCR cocktail disiapkan sesuai dengan
jumlah sampel yang akan diamplifikasi. Komposisi campuran PCR per-sampel
adalah: 7,93 µl dH2O, 1,25 µl 5x Buffer, 1,5 µl MgCl2 25 µM, 0,25 µl dNTPs 10
µM, 0,25 µl Primer ITS5P 10 µM, 0,25 µl Primer ITS8P 10 µM dan 0,07 µl Gotaq
Polymerase 5u/µl. Parameter PCR untuk amplifikasi region ITS adalah sebagai
berikut: predenaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit dilanjutkan dengan 30 siklus
dengan kondisi tiap-tiap siklus yaitu: 1 menit tahap pemisahan rantai DNA
(denaturasi) pada suhu 94oC, 1 menit tahap penempelan primer (annealing) pada
suhu 54oC, 90 detik tahap pemanjangan (elongasi) pada suhu 72oC, 5 menit tahap
final elongasi (pemanjangan berikutnya) pada suhu 72oC dan tahap penyimpanan
pada suhu 4oC.
3.3.6. Analisis Kualitatif Hasil Ekstraksi DNA Genom Total dan Amplifikasi
DNA Region ITS
Analisis kualitatif bertujuan untuk melihat kualitas dari hasil ekstraksi DNA
genom total maupun hasil dari amplifikasi DNA. Analisis dilakukan dengan
menggunakan elektroforesis gel agarosa. Tahap pertama pembuatan gel agarosa 1%
adalah dengan menimbang 0,2 g serbuk gel agarosa. Gel agarosa dilarutkan dalam
40 ml TBE 1x di dalam erlenmeyer 50 ml. Kemudian dipanaskan dan
dihomogenisasi menggunakan microwave hingga mendidih selama 1 menit.
16
Kemudian ditunggu hingga hangat-hangat kuku dan ditambahkan pewarna Gel Red
sebanyak 1 µl. Kemudian digoyang-goyangkan hingga tercampur. Setelah itu,
cetakan gel disiapkan dengan memasang gel comb, kemudian gel dituang ke dalam
cetakan gel hingga menyeluruh. Lalu ditunggu hingga mengeras. Setelah mengeras
gel comb dapat diangkat dan terlihat cetakan sumur yang terbentuk. Selanjutnya,
Buffer TBE 1x dituang ke dalam chamber sampai tanda maksimum. Gel
dimasukkan ke dalam casting tray pada submarine electrophoresis system.
Sebanyak 2 µl sampel hasil ekstraksi atau amplifikasi dimasukkan ke dalam sumur
gel. Kemudian DNA ladder 1 Kb sebanyak 2 µl dimasukkan juga ke dalam sumur
gel untuk visualisasi hasil ekstraksi DNA genom total. Untuk visualisasi hasil
amplifikasi digunakan 2 µl DNA ladder 100 bp. Setelah sampel dimasukkan ke
dalam sumur, mesin elektroforesis dilakukan proses running selama 30 menit
dengan voltase sebesar 100 V.
Proses visualisasi DNA hasil elektroforesis menggunakan Electrophoresis
Printgraph (Gel Doc). Agar yang telah dilakukan proses running dimasukkan ke
dalam alat yang akan disinari ultraviolet (UV). Posisi, fokus kamera dan perbesaran
diatur sesuai dengan yang diinginkan. Kemudian sinar UV dimatikan dan dipiih
tombol freeze. Selanjutnya dipilih ok dan save, kemudian dokumentasi foto yang
telah didapatkan selanjutnya dicetak.
3.3.7. Sekuensing DNA
Tahapan ini diawali dengan proses PCR yang dinamakan cycle sequencing.
Perbedaan dengan PCR biasa terletak pada penambahan ddNTP di samping dNTP
pada campuran PCR. ddNTP mengandung komponen pewarna (big dye) yang dapat
dibaca oleh mesin sekuenser. Reaksi sekuensing otomatis dilakukan menggunakan
ABI Prism® BigDyeTM Terminator Ready Cycle Sequencing kit pada Biosystems
Terapan HITACHI 3100 Genetic Analyzer Automated Sequencer menggunakan
primer PCR region ITS dengan protokol tahapan kerja sesuai instruksi produsen.
Pengerjaan DNA sekuensing dalam penelitian ini dilakukan oleh jasa Laboratorium
First Base (1ˢᵗ Base) Pte Ltd Malaysia.
17
3.3.8. Pengamatan Morfologi
Spesimen herbarium kering di Herbarium Bogoriense (BO) dari G.
atrosanguinea yang digunakan dalam penelitian ini semua informasi yang ada pada
setiap label specimen dicatat. Morfologi dari setiap lembar spesimen satu persatu
diamati dan diukur dengan terperinci menggunakan penggaris dan Mikroskop
lengan (Amscope 7X-45X trinocular stereo). Karakter morfologi yang diamati
adalah teruk berdaun, helaian daun dan perbungaan yang meliputi ukuran, bentuk
dan permukaan.
3.3.9. Pemetaan Distribusi Globba atrosanguinea berdasarkan data
Herbarium Bogoriense (BO)
Informasi lokasi tumbuhnya G. atrosanguinea yang didapatkan dari label
semua koleksi Herbarium. Terdapat 33 spesimen Herbarium yang informasi di
dalam labelnya adalah berupa titik koordinat atau nama lokasinya saja. Kemudian,
lokasi disesuaikan pada Google earth Pro untuk mengetahui secara detail lokasi
persebarannya. Peta dibuat dengan menggunakan perangkat lunak ArcGis 10.3 dan
menggunakan lisensi ArchMap dan ArchCatalog untuk mengatur unit peta yang
akan dibuat, menentukan skala tampilan, menentukan sistem koordinat dan
mengatur grid koordinat pada layout.
3.4. Analisis In silico
3.4.1. Analisis Sekuens DNA
Purifikasi dan sekuensing DNA menghasilkan elektroferogram berupa
grafik hasil pembacaan basa nukleotida dalam format .ab1. Perbedaan basa
ditunjukkan dengan perbedaan warna yang tertera mewakili setiap jenis basa. Setiap
puncak yang terbentuk diterjemahkan menjadi basa andenin (A), guanine (G),
sitosin (C), atau timin (T) (Dale & Park, 2010). Elektroferogram merupakan grafik
hasil pembacaan mesin sekuens Automated Capillary Sequencer dengan
menggunakan metode Dye-Terminator Sequencing dengan melabel ddNTP
menggunakan empat label fluorescent yang berbeda-beda. Untuk lebih memberikan
tingkat akurasi yang tinggi pada hasil pembacaan basa, setiap puncak diperiksa
kembali secara manual. Pengolahan data penyatuan (contig) sekuens dilakukan
menggunakan program ChromasPro versi 1.7.4 (Technelysium Pty Ltd., Tewantin,
18
Australia) untuk mendapatkan sekuens konsensus dari sekuens DNA reverse dan
forward (Lampiran 3). Langkah awal dari proses contig adalah dengan melakukan
pemotongan (trimming) dari sekuens forward maupun reverse pada bagian ujung
setiap sekuens yang memiliki kualitas puncak yang kurang bagus. Puncak yang
rusak dapat menyebabkan tingkat akurasi menjadi rendah dan tidak representatif
untuk dijadikan data. Setelah dipotong, sekuens DNA amplikon ITS 5P dan ITS 8P
digabungkan (assemble) sehingga menghasilkan satu buah sekuens utuh yang
merupakan sekuens konsensus dari masing-masing sekuens forward dan reverse.
Analisis ini bertujuan untuk mencari daerah overlapping dari kedua sekuens
sehingga dapat menghasilkan satu unit sekuens.
Penyejajaran (alignment) sekuens DNA dilakukan menggunakan program
MUSCLE yang terintegrasi pada program MEGA versi 7.0.26 (Kumar, Stecher, &
Tamura, 2016). Penyejajaran MUSCLE secara default akan melakukan
penyejajaran dengan target akurasi yang tinggi (Aprilyanto & Sembiring, 2015).
Penyejajaran sekuens DNA dilakukan dengan melihat kesamaan dari setiap urutan
basa terhadap data sekuens spesies Zingiberaceae lain khususnya G. atrosanguinea
yang terdapat pada GenBank National Centre for Biotechnology Information
(NCBI) berdasarkan region ITS. Data sekuens tambahan diambil dari NCBI
Genbank setelah dilakukan Basic Local Alignment Search Tools Nucleotide
(BLASTN). BLASTN bertujuan untuk mencari urutan dengan kemiripan sekuens
DNA tertinggi. Tingkat kesamaan 80-100% menunjukkan bahwa spesies yang
diperoleh adalah berdekatan atau sama. Penyejajaran sekuens DNA sampel G.
atrosanguinea region ITS disejajarkan bersama dengan sekuens spesies marga
Globba spp. lain yang diambil dari NCBI GenBank (Lampiran 5). Beserta 2 spesies
dari genus lain sebagai outgroup yang diambil dari NCBI Genbank. Region DNA
yang diperbandingkan yaitu dimulai dari region ITS1, region 5.8S, dan region ITS2.
Setelah itu, dilakukan analisis homologi dari sekuens basa nukleotida keempat
sampel G. atrosanguinea dengan sister taxa pada penelitian ini dapat dievaluasi
dengan berbagai parameter statistik seperti jumlah panjang karakter yang
konservatif, karakter konstan, karakter singleton dan karakter bersifat informatif
parsimoni untuk mengetahui variasi nukleotida.
19
3.4.2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik
Hasil penyejajaran sekuens DNA region ITS kemudian di rekonstruksi
pohon filogenetik menggunakan distance method dengan Metode Neighbor-Joining
(NJ) dengan model p-distance dalam program MEGA versi 7.0.26 (Kumar et al.,
2016). Menurut Tamura et al., (2011) Rekonstruksi pohon menggunakan Metode
Neighbor-Joining (NJ) dapat memberikan representasi grafis dari perbedaan
genetik antara spesies. Setelah itu, untuk melihat matriks jarak genetik dari sampel
yang dianalisis bersama dengan sekuens spesies marga Globba spp. lain yang
diambil dari NCBI GenBank diimplementasikan pada pairwise distance
calculation. Evaluasi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan analisis
bootstrap sebanyak 1000 ulangan (Sulistyaningsih, Ardiyani, Abinawanto, &
Salamah, 2018). Nilai bootstrap dikategorikan kuat (>85%), sedang (70% – 85%),
lemah (50% –69%) atau buruk (<50%) (Kress, Prince, & Williams, 2002).
Bootstrap >50% ditampilkan pada pohon filogenetik.
20
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Karakterisasi Morfologi Globba atrosanguinea
Pengamatan karakter morfologi G. atrosanguinea dilakukan pada seluruh
koleksi herbarium (spesimen voucher) yang disimpan di Herbarium Bogoriense
(BO). Sebanyak 33 spesimen G. atrosanguinea aksesi Kalimantan dikelompokkan
menjadi 3 kelompok berdasarkan kemiripan karakter morfologi (Tabel 1).
Tabel 1. Pengelompokan Globba atrosanguinea berdasarkan hasil pengamatan
karakterisasi morfologi
No. Karakter Kelompok pertama Kelompok kedua Kelompok ketiga
1.
Tinggi teruk berdaun
(cm) 12 – 50.5 12.5 – 34 28.5 – 33
2.
Panjang helaian daun
(cm) 13 – 21 8.6 – 11.5 14 – 25
3.
Lebar helaian daun
(cm) 2.6 – 10.5 3.9 – 5.7 2.3 – 5
4. Bentuk helaian daun
Bulat panjang
melanset Bulat telur menjorong Panjang melanset
5. Bentuk ujung daun Bertaring melancip Meruncing Meruncing
6. Bentuk pangkal daun Meruncing Menumpul Meruncing
7. Permukaan atas daun Gundul Gundul Gundul
8.
Permukaan bawah
daun Gundul, Berambut Gundul Gundul
9.
Panjang tangkai
daun (mm) 1 – 5 2 – 4 2 – 3
10.
Lebar tangkai daun
(mm) 1 – 2.2 1 – 2 1
11.
Permukaan tangkai
daun Gundul, Berambut Gundul Gundul
12.
Panjang lidah daun
(mm) 0.1 – 4 1 – 3 1 – 1.3
13.
Permukaan lidah
daun Gundul, Berambut Berambut Berambut
14.
Panjang gagang
permukaan(cm) 0.2 – 1.5 1 – 2 0.8 – 2
15.
Panjang daun gagang
(mm) 10 – 19 6 – 10 9 – 10
16.
Lebar daun gagang
(mm) 2 – 12 4 3 – 5
17. Bentuk daun gagang Memanjang Memanjang Memanjang
18. Warna daun gagang
Jingga – kemerahan,
Merah n.a Merah
19. Panjang ikalan (cm) 0.2 – 0.4 0.2 0.2
20. Warna bibir bunga Kuning – kemerahan Merah Kuning – kemerahan
21
21.
Warna mahkota
bunga Merah n.a n.a
22.
Warna kelopak
bunga Jingga n.a n.a
22.
Panjang kelopak
bunga (mm) 7 n.a n.a
n.a. = not available
Berdasarkan data yang diperoleh hasil pengelompokan dari 33 spesimen
hasil pengelompokan pertama sebanyak 24 spesimen, pengelompokan kedua
sebanyak 6 spesimen dan pengelompokan ketiga sebanyak 3 spesimen, Tujuan
pengamatan karakter morfologi ini adalah untuk mengetahui kelompok variasi dari
morfologi G. atrosanguinea. Karakter morfologi yang diamati adalah: teruk
berdaun, helaian daun dan perbungaan meliputi ukuran, bentuk dan permukaan
(Gambar 5). Karakterisasi morfologi yang diamati pada penelitian ini
memperlihatkan terdapat bentuk helaian daun yang sedikit berbeda yaitu bentuk
helaian daun cenderung bulat panjang melanset, bulat telur menjorong dan panjang
melanset (Gambar 6). Karakter perbungaan seperti bentuk daun gagang, permukaan
tangkai daun dan permukaan atas daun sifatnya stabil di dalam G. atrosanguinea
aksesi ini.
Berdasarkan hasil pengamatan morfologi G. atrosanguinea dikelompokkan
menjadi 3 kelompok. Hasil pengelompokan pertama bentuk helaian daun G.
atrosanguinea berbentuk bulat telur menjorong dengan permukaan helaian daun
atas yang berbulu, tangkai daun dan lidah daun memiliki permukaan bawah daun
ini beberapa spesimen memiliki yang gundul atau berbulu. Selain itu, variasi warna
gagang daun jingga ke kemerahan hingga cenderung merah. Hasil pengelompokan
kedua memperlihatkan bentuk helaian daun berbentuk bulat panjang melanset
dengan warna bibir cenderung merah dibandingkan dengan hasil pengelompokan
pertama dan ketiga yaitu kuning ke kemerahan, sedangkan hasil pengamatan
pengelompokan ketiga memperlihatkan bentuk helaian daun berbentuk panjang
melanset dengan warna gagang daun cenderung merah.
Adanya variasi karakter morfologi ini umum terjadi di dalam suatu spesies
yang tumbuh di beberapa lokasi berbeda. Berdasarkan Aprilyanto & Sembiring
(2015) fenotip suatu organisme merupakan ekspresi dari informasi genetik yang
dibawa dan diturunkan pada generasi berikutnya serta interaksinya dengan faktor
22
Gambar 5. Spesimen Globba atrosanguinea aksesi Kalimantan (BO-1518989)
Koleksi Herbarium Bogoriense (BO) (Dokumentasi Pribadi, 2019)
23
Gambar 6. Bentuk helaian daun Globba atrosanguinea aksesi Kalimantan Koleksi
Herbarium Bogoriense (BO) A. Bulat telur menjorong B. Bulat panjang melanset
C. Panjang melanset ((Dokumentasi Pribadi, 2019)
lingkungan. Hal ini dikarenakan karakter morfologi selain diatur oleh genetik juga
dipengaruhi oleh lingkungan, sehingga karakter morfologinya kurang spesifik
(Hikmah et al., 2016). Menurut Zein & Prawiradilaga (2013) kajian karakter
morfologi sangat penting dilakukan untuk mengenal dan mengkonfirmasi identitas
suatu spesies, tetapi tidak mudah untuk memecahkan spesies kompleks karena
tingkat objektivitas dari peneliti sangat berpengaruh dan menentukan hasil dalam
observasi. Selain itu, proses identifikasi secara morfologi juga sulit untuk dilakukan
pada kondisi sampel yang tidak utuh (Ubaidillah & Sutrisno, 2009).
Oleh karenanya, karakterisasi molekuler dengan menggunakan teknik
barkoding DNA juga dilakukan. Data molekuler dapat digunakan untuk melengkapi
kekurangan data morfologi salah satunya karakter morfologi berevolusi dengan
pola yang kurang seragam dibandingkan dengan karakter molekuler (Aprilyanto &
Sembiring, 2015). Penyebabnya karena karakter molekuler dianggap lebih mudah
dan menyediakan karakter yang lebih berlimpah dibandingkan morfologi, sitologi
dan informasi karakter lainnya (Graur & Li, 2000).
4.1.1. Kelompok Pertama G. atrosanguinea aksesi Kalimantan
Berdasarkan data yang diperoleh hasil pengelompokan dari kelompok
pertama didapatkan sebanyak 24 spesimen yang diamati berdasarkan data yang
diperoleh dari label herbarium.
Spesimen yang diobservasi: Kalimantan Barat, Bentiang. Di dekat air terjun
Kembayung. 600 m. berbunga, 9 Oktober 1980, Garry Shea. BO-0084402 (BO,
24
Canb); Gunung Sekaju. 800 m. berbunga, 6 November 1980, Garry Shea. BO-
0084403 (BO); Gunung Sekaju. Di lereng hutan. 850 m. berbunga, 6 November
1980, Garry Shea. BO-0085211 (BO, Canb, Lv); Gunung Serimbu. Hutan
Dipterokarpa, 0o43’N, 110o6’E, 50-100 m, berbunga, 1 November 1995, T.
Kohyama, T. Yamada, T. Partomihardjo. BO-0118326 (BO, KAG); T. N. Gunung
Palung. Dekat dengan air terjun pertama cabang Panti Research Site, 1o13’S,
110o6’E. 150 m, berbunga, 26 Oktober 1996, T. G. Laman, Ismail. A, Rachman, E.
Mirwanto. BO-1807428 (BO, HUH); Gunung Serimbu. Di dekat aliran sungai
Meruban ke Danau Bangbung, 0o52’N, 110o9’E, 100 m, berbunga, 13 Desember
1996, M. Kato.H. Okada, R. Imaichi, H. Tsukaya, Y. Mori, K. Aso, D. Komara. BO-
1520465 (BO); T.N. Bukit Baka. Hutan Dipterokarpa di tanah lempung merah
sekitar aliran Sungai Ella, 0o 38’N, 112o17’E, 320 m, berbunga, 21 Oktober 1993,
Church, A-C. Mahyar, U.W. Ruskadi, A. Nurdin. BO-1337391 (BO, HUH); Gunung
Senujuh. Hutan dataran rendah, 01o25’967”N, 109o26’719”E, 20 m, berbunga, 31
Mei 2013, M. Magandhi, D. Latifah, A.R. Kartonegoro, Syarifudin, Megawati, H.
Ruswadi, A.F. Hidayat. BO-1908770 (BO); T.N. Betung Kerihun. DAS Embaloh,
01o23’23.8”N, 112o28’24.1”E, 237 m, berbunga, 25 Desember 2011, M. Ardiyani,
D. Darnaedi, H. Okada, H. Tsukaya, A. Sujima, Mustarrudin, Agon, P. Batu,
Junaedi. BO-1895950 (MA639) (BO); T.N. Betung Kerihun. DAS Sibau,
01o13’02.1”N, 113o02’45.8”E, 121 m, berbunga, 28 Desember 2011, M. Ardiyani,
D. Darnaedi, H. Okada, H. Tsukaya, A. Sujima, Mustarrudin, Anong, Edi. BO-
1895905 (MA643) (BO); Gunung Niut. Di hutan primer, 01o05’50.4”N,
109o51’56.8”E, 401 m, berbunga, 12 Juli 2017, M. Ardiyani, B. Sepito, Roni, R.
Agusti. (WEKBOE40) (BO); Kalimantan Timur, Kutai Barat. Daerah basah. 130
m, berbunga, 25 Oktober 1925, F.H Endert. BO-0082656 (BO); Hutan Lindung
Sungai Wain Balikpapan. Tanah lempung berpasir. 60 m. berbunga, 1950,
Kosterar. BO-0084377 (BO); Kalimantan Tengah, Murung Raya. Di belakang
Tumbang Naan. 00o09’03”N, 113o45’04”E. berbunga, 20 Desember 2004, Okada,
H. Nagamasu, H. Tsukaya, H. Takano, A. Naiki, A. BO-1881595 (BO); Murung
Raya. Di sebelah Sungai Joloi aliran atas Sungai Barito, 00o11’00”N, 113o31’59”E.
berbunga, 20 Desember 2004, Okada, H. Nagamasu, H. Tsukaya, H. Takano, A.
Naiki, A. BO-1881596 (BO); Murung Raya. Sungai Joloi di belakang Muara Sopan.
25
00o13’35”N, 113o31’39”E. berbunga, 20 Desember 2004, Okada, H. Nagamasu, H.
Tsukaya, H. Takano, A. Naiki, A. BO-1881754 (BO); Bukit Jaya. Hutan
Dipterokarpa. 0o45’S, 112o 47’E, 250-400 m, berbunga, 29 Januari 1983, H.P
Nooteboom, A. Brader, J. Mogea, R.A.A. oldeman, I.G.M. Tantra, J.F. Veldicamp,
W.J.J.O. de wilde, H. Wiriadinata. BO-0082351 (BO, L); Kuala Kuayan. Hutan
primer, diarea terbuka oleh aliran sungai dengan kondisi pohon berguguran (tanah
pasir basah). 2o00’S, 112o28’E, 50 m, berbunga, 6 April 1984,C. Hansen. BO-
0082627 (BO,C); Kalimantan Selatan, Jaro Dam dan Muara Uya. Dataran rendah
basah di hutan Dipterokarpa. 100 m, 10 November 1971, J. Dransfield, D.
Saerudin, BO-0081916 (BO, L). Gunung Meratus. Hutan primer. 800-900 m,
berbunga, 16 Juli 1952, W. Meijer. BO-0082674 (BO); Gunung Meratus. Hutan
primer. 800-850 m, berbunga, 18 Juli 1952, W. Meijer. BO-0082675 (BO);
Kalimantan Utara, Sekatak Tarakan. Hutan hujan tropis, berbunga, 4 Februari
1979, G. Murats, K. Iwatski, M. Hirokato, Y. P. Mogea. BO-0087038 (BO); Pa
Lidio. Sungai di hutan hujan di lereng gunung, 3o 49’N, 115o45’E, 950 m, berbunga,
14 September 2003, A.D Paulsen, D. Darius. BO-1518989 (BO); Camp Seturan
CIFOR. Di hutan rawa, 3o 0’N, 116o 30’E, 125 m, berbunga, 1 September 2003,
A.D Paulsen, D. Daniel. BO-1519175 (BO, WAN, L).
4.1.2. Kelompok Kedua G. atrosanguinea aksesi Kalimantan
Berdasarkan data yang diperoleh hasil pengelompokan dari kelompok
kedua didapatkan sebanyak 6 spesimen yang diamati berdasarkan data yang
diperoleh dari label herbarium.
Spesimen yang diobservasi: Kalimantan Barat, Sukalanting. berbunga, 1893, H.
Hattler. BO-0082687 (BO); Gunung Kenepai. berbunga, 19 Juli 1893, BO-0084379
(BO); T.N. Betung Kerihun. Sungai Tambaloh, anak Sungai Tekelan DAS
Embaloh, 01o23’04.6”N, 112o28’14.4”E, 130 m, berbunga, 23 Desember 2011, M.
Ardiyani, D. Darnaedi, H. Okada, H. Tsukaya, A. Sujima, Mustarrudin, Agon, P.
Batu, Junaedi. BO-1896019 (MA621) (BO); Kalimantan Timur, Kutai Barat.
Daerah basah. 700 m, berbunga, 25 Oktober 1925, F.H Endert. BO-0082658 (BO);
Kutai Barat. berbunga, 25 Oktober 1985, F.H Bandert. BO-0086552 (BO, L); Kutai
Timur region Sungai Menubar. Punggung bukit di tanah lempung berkapur. 20 m,
berbunga, 9 Juni 1951, A. Kostermans. BO-0082663 (BO, L, Kew).
26
4.1.3. Kelompok Ketiga G. atrosanguinea aksesi Kalimantan
Berdasarkan data yang diperoleh hasil pengelompokan dari kelompok
ketiga didapatkan sebanyak 3 spesimen yang diamati berdasarkan data yang
diperoleh dari label herbarium.
Spesimen yang diobservasi: Kalimantan Barat, Gunung Sekaju. Di lereng hutan.
850 m. berbunga, 6 November 1980, Garry Shea. BO-1472638 (BO, Canb, Lv);
Gunung Sekaju. Di lereng hutan. 850 m. berbunga, 6 November 1980, Garry Shea.
BO-1472639 (BO, Canb, Lv); Kalimantan Utara, Longbawan Krayan. Di pinggir
aliran sungai, 4o 8’N, 115o45’E, 1,100 m, berbunga, 29 Juli 1981, M. Kato, M.
Okamoto, E.B Walujo. BO-0086732 (BO).
4.1.4. Distribusi Globba atrosanguinea
Data persebaran G. atrosanguinea aksesi Kalimantan berdasarkan spesimen
di Herbarium Bogoriense (BO) menunjukkan habitat spesies ini. Berdasarkan hasil
yang diperoleh G. atrosanguinea aksesi Kalimantan terdistribusi di semua provinsi
di Pulau Kalimantan (Gambar 7). Berdasarkan hasil yang diperoleh, G.
atrosanguinea paling banyak tersebar di provinsi Kalimantan Barat. Lokasi habitat
tumbuhnya G. atrosanguinea berada di pegunungan meliputi: Gunung Kanepai,
Gunung Sekaju, Gunung Serimbu, Gunung Senujuh dan Gunung Niut dan di
beberapa Taman Nasional (TN) seperti T.N. Gunung Palung, T.N. Bukit Baka dan
T.N. Betung Kerihun dengan habitat alaminya tumbuh di hutan Dipterokarpa
dataran rendah dengan ketinggian <850 mdpl dekat dengan Daerah Aliran Sungai
(DAS) dengan kondisi tanah lempung.
Beberapa hal yang memungkinkan G. atrosanguinea banyak tersebar di
Kalimantan Barat adalah eksplorasi dan survei tumbuhan yang lebih banyak dan
intensif dilakukan di Kalimantan Barat. Selain itu, habitat di wilayah ini
kemungkinan cukup mendukung pertumbuhan dan perkembangan G.
atrosanguinea dikarenakan provinsi ini banyak memiliki DAS. Provinsi
Kalimantan Barat memiliki julukan “Seribu Sungai” karena di wilayahnya terdapat
ratusan sungai besar dan kecil (Kalbarprov.go.id, 2015). DAS Sungai Kapuas
tersebut merupakan salah satu habitat G. atrosanguinea di Kalimantan Barat.
Sungai Kapuas memiliki kondisi geografis yang luas dan termasuk sungai
terpanjang di Indonesia dengan jumlah 9 DAS yang menaungi sungai tersebut
27
Gambar 7. Peta Persebaran Globba atrosanguinea aksesi Kalimantan berdasarkan
data Spesimen di Herbarium Bogoriense (BO)
(Susilowati, Leksono, & Harsono, 2012). Semua grup hasil pengelompokan
morfologi ditemukan di provinsi ini. Hal ini dikarenakan banyaknya jumlah G.
atrosanguinea yang temukan di provinsi ini. Provinsi Kalimantan Timur juga
merupakan lokasi tumbuhnya G. atrosanguinea. Jenis ini pun tumbuh disekitar
DAS Menubar dan DAS Wain di wilayah Kutai Barat dan Kutai Timur dengan
ketinggian <700 mdpl. Kondisi tanahnya yang berlempung adalah syarat tempat
tumbuh G. atrosanguinea dengan kondisi sedikit berkapur dan berpasir. Di provinsi
ini dijumpai 2 variasi morfologi yaitu bentuk helaian daun berbentuk bulat panjang
melanset dan bulat telur menjorong. Provinsi Kalimantan Tengah G. atrosanguinea
28
ditemukan di beberapa kabupaten yaitu: Murung Raya, Bukit Jaya dan Kuala
Kuayan. Lokasi tumbuhnya jumlah terbanyak yaitu di Kabupaten Murung Raya.
Murung raya merupakan salah satu kabupaten yang di lewati khatulistiwa dan
berada di pedalaman Kalimantan dan di dalamnya terdapat Sungai Joloi yang
merupakan anak Sungai Barito Hulu (Salmani, Fakhrirrazi, & Wahyudi, 2013). Di
provinsi ini dijumpai 1 variasi morfologi yaitu bentuk helaian daun berbentuk bulat
panjang melanset. Lokasi tumbuhnya G. atrosanguinea masih terdapat di hutan
Dipterokarpa dekat dengan area terbuka DAS yang dalam waktu tertentu pohonnya
menggugurkan daun dengan kondisi tanah sedikit berpasir dan basah, spesies ini
berada di ketinggian <400 mdpl. Habitat G. atrosanguinea di Kalimantan Selatan
berada di Gunung Meratus dan dataran rendah hutan primer Dipterokarpa yang
basah dengan ketinggian <900 mdpl. Di provinsi ini dijumpai 1 variasi morfologi
yaitu bentuk helaian daun berbentuk bulat panjang melanset. Di lokasi provinsi
terbaru, Kalimantan Utara ditemukan di Longbawan Krayan, Pa Lidio, Kawasan
Camp. Seturan CIFOR Malinau, lokasi tumbuhnya G. atrosanguinea ini sama
dengan lokasi di provinsi lainnya yaitu dekat DAS dan Hutan di lereng gunung
dengan ketinggian <950 mdpl. Provinsi ini terdapat 1 variasi bentuk helaian daun
yaitu berbentuk panjang melanset.
Oleh karenanya, dapat disimpulkan bahwa G. atrosanguinea tersebar di
semua provinsi di Kalimantan karena habitat alaminya tumbuh dekat dengan DAS
yang banyak ditemukan di provinsi Kalimantan Barat. Kondisi geografis G.
atrosanguinea berupa kondisi tanah lempung dan sedikit berpasir seperti di
beberapa hutan primer Dipterokarpa di Taman Nasional (TN) dan pegunungan
dengan habitat ketinggian <950 mdpl. Pada tiap-tiap provinsi di Kalimantan ini
memiliki satu atau lebih dari variasi morfologi baik pada kelompok 1, 2 atau 3.
Variasi morfologi terbanyak berada di provinsi Kalimantan Barat yang memiliki 3
variasi bentuk helaian daun berbentuk bulat panjang melanset, bulat telur
menjorong dan panjang melanset.
29
4.2. Hasil Karakterisasi Molekuler Globba atrosanguinea
4.2.1. Analisis Filogenetik berdasarkan Region ITS
Berdasarkan hasil pohon filogenetik dengan metode kriteria Neighbor-
Jonining (NJ) diperoleh 5 seksi (Gambar 12). Pengelompokan seksi tersebut
disesuaikan berdasarkan literatur yang mengelompokan seksi tersebut berdasarkan
jumlah embelan (appendages) yang berada di kepala sari (anther) (Cao, Newman,
Kirchoff, & Ronse De Craene, 2019; Williams et al., 2004).
Jumlah sekuens yang dianalisis yaitu sekuens terdiri atas 4 sekuens sampel
G. atrosanguinea hasil sekuens sendiri, 18 sekuens Globba spp. (Lampiran 5)
beserta 2 spesies dari genus lain sebagai outgroup yang diambil dari pangkalan data
NCBI Genbank. Rekonstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menempatkan 2
spesies outgroup dari spesies Zingiberaceae. Pemilihan spesies outgroup mengacu
pada penelitian William et al. (2004) yaitu: Hemiorchis rhodorrhachis dan
Hedychium bordelonianum. Penambahan outgroup dalam suatu taksa dilakukan
guna mendapatkan informasi yang lebih meyakinkan dari sekuens yang berdekatan
Gambar 8. Pohon filogenetik marga Globba dengan metode Neighbor-Joining
(NJ) berdasarkan region ITS
30
dengan kelompok taksa yang sedang dipelajari. Outgroup ini sangat dibutuhkan
untuk digunakan sebagai pembanding dan dilibatkan dalam analisis kekerabatan
(Rahayu & Nugroho, 2015).
Klad atau kelompok cabang pada pohon filogenetik memperlihatkan nilai
bootstrap yang cukup tinggi. Nilai bootstrap pada seksi Haplanthera dan seksi
Mantisia cukup tinggi yaitu sebesar 100%, seksi Nudae sebesar 59%, seksi
Ceratanthera sebesar 99% dan seksi Globba sebesar 90%. Pohon filogenetik yang
dihasilkan menunjukkan bahwa G. atrosanguinea sampel MA621, MA639 dan
MA643 berada dalam klad seksi Globba dengan nilai bootstrap cukup kuat sebesar
89%. Pohon filogenetik juga menggambarkan sampel G. atrosanguinea
WEKBOE40 dengan nilai bootstrap sebesar 99%. Berdasarkan Kress et al. (2002)
nilai bootstrap dikategorikan kuat jika lebih dari 85%. Nilai bootstrap tersebut
memperlihatkan cukup tingginya tingkat kepercayaan cabang atau simpul yang
terbentuk. Hasil yang dilaporkan Williams et al. (2004) yang melakukan barkoding
DNA region ITS dalam marga Globba (Zingiberaceae) ini memiliki nilai bootstrap
pada seksi Globba sebesar 99%. Selain itu, bootstrap dengan nilai tinggi juga
dihasilkan pada seksi Globba yang di dalamnya terdapat spesies G. atrosanguinea
sebesar 90% (Takano & Okada, 2002).
Pohon filogenetik memperlihatkan G. atrosanguinea memiliki hubungan
kekerabatan yang dekat satu dengan lainnya yaitu G. atrosanguinea (AF478753.1),
G. atrosanguinea var. sumatrana (AB049315.1) dan G. atrosanguinea var.
atrosanguinea (AB049316.1), juga berkerabat dekat (sister taxa) dengan G. fecuda,
G. flavibracteata, G. acehensis, G. talangensia. Sister taxa tersebut merupakan 4
spesies baru marga Globba yang dipertelakan berasal dari aksesi Sumatra (Takano
& Okada, 2000). Hal tersebut menandakan bahwa di dalam penelitian ini, region
ITS belum mampu membedakan aksesi karena cabang dalam satu klad yang
terbentuk belum memisahkan antara spesies G. atrosanguinea aksesi Kalimantan
yang dianalisis terutama pada sampel MA621, MA639 dan MA643. Selain itu juga,
belum dapat membedakan antar spesies sister taxa yang berasal dari aksesi berbeda
yaitu aksesi Sumatra.
Cabang yang dihasilkan pada ketiga sampel MA621, MA639 dan MA643
yang dianalisis membentuk cabang yang politomi, namun pada sampel
31
WEKBOE40 mengelompok sendiri. Hubungan cabang pada bagian dalam pohon
merefleksikan tingkatan sekuens berbeda saling berhubungan (Rahayu & Nugroho,
2015). Hal tersebut sejalan dengan hasil pohon filogenetik yang direkonstruksi
William et al. (2004) Seksi Globba membentuk tiga klad (dua klad besar dengan
tambahan spesies G. fragilis) dalam suatu politomi dengan seksi Nudae dan Seksi
Ceratanthera ser. Medioccalcaratae. Namun, dalam penelitian ini tidak melibatkan
seksi Ceratanthera ser. Medioccalcaratae. Seksi Globba yang dihasilkan pada
pohon tersebut menggambarkan tiga seksi Globba yang membentuk polifiletik
tetapi tidak pada penelitian ini yang hanya membentuk seksi Globba dengan satu
klad. Politomi dipengaruhi oleh nodus yang tidak terselesaikan dalam pohon
filogenetik pengaruhnya terhadap matriks filogenetik tertentu seperti ukuran
ketidakseimbangan topologi, tingkat diversifikasi dan ukuran keanekaragaman
filogenetik (Kuhn, Mooers, & Thomas, 2011). Dengan demikian tidak dapat
disimpulkan hubungan kekerabatan antar spesies-spesies dalam klad tersebut.
Hasil karakter molekuler yang dikorelasikan dengan data morfologi juga
belum mendapatkan hasil yang efektif. Pada sampel MA621 yang merupakan
spesimen voucher (BO-1896019) termasuk ke dalam kelompok kedua setelah
dilakukan pengamatan morfologi memiliki bentuk helaian daun yang cenderung ke
bulat telur menjorong (ovate-elliptic) tidak terdiskriminasi pada cabang yang
terbentuk terlihat pada pohon filogenetik yang dihasilkan. Sampel MA639 (BO-
1895950) dan MA643 (BO-189590) dan sampel WEKBOE40 termasuk ke dalam
kelompok pertama memiliki bentuk helaian daun cenderung bulat panjang melanset
(elliptic-lanceolate) tidak terlihat mengelompok bersama pada pohon yang
dihasilkan, hal yang terjadi adalah pohon filogenetik terlihat pada sampel
WEKBOE40 membentuk cabang yang baru.
Oleh karenanya, hasil tersebut menunjukkan bahwa penggunaan region
universal ITS untuk barkoding DNA berhasil untuk dilakukan amplifikasi,
identifikasi dan diskriminasi pada tingkat spesies Globba spp. namun belum dapat
mendiskriminasikan antara spesies G. atrosanguinea, G. fecunda, G.
flavibracteata, G. acehensis, dan G. talangensis dan belum mampu membedakan
antar aksesi. Dalam hal ini region ITS belum mendukung untuk
mendiskriminasikan sempurna pada spesies tertentu terutama pada spesies G.
32
atrosanguinea. Di dalam analisis barkoding DNA yang belum mendapatkan hasil
memuaskan dalam rekonstruksi filogenetik, maka sangat diperlukan untuk mencari
kandidat gen lain yang cocok pada taksa ini (Zein & Prawiradilaga, 2013). Namun,
dalam hal ini penggunaan region ITS mampu mengungkap hubungan kekerabatan
(filogenetik) G. atrosanguinea dengan spesies Globba spp. lain.
4.2.2. Jarak Genetik Sekuens DNA Globba atrosanguinea
Berdasarkan hasil penyejajaran terlihat bahwa region ITS memiliki variasi
sekuens diperlihatkan oleh adanya perbedaan basa di daerah tertentu pada sekuens
masing-masing spesies G. atrosanguinea. Matriks data posisi sekuens DNA region
ITS Globba dengan karakter informatif yang dapat menunjukkan urutan divergensi
beberapa spesies (Lampiran 6). Analisis homologi dari sekuens DNA keempat
sampel G. atrosanguinea pada penelitian ini dievaluasi dengan berbagai parameter
statistik yaitu sekuens DNA region ITS yang dianalisis memiliki panjang karakter
sebesar 579 bp dengan 425 bp karakter konstan atau konservatif, 70 karakter
singleton, 79 karakter bersifat informatif parsimoni sehingga persentase variasi
nukleotida pada keseluruhan G. atrosanguinea menunjukan angka 13,65%.
Jarak genetik sekuens G. atrosanguinea dengan spesies lain dari NCBI
GenBank digunakan untuk memperlihatkan hubungan kedekatan dengan spesies
yang sama (intraspesies) maupun spesies lain (interspesies). Nilai matriks jarak
genetik yang nilainya semakin rendah memiliki arti bahwa hubungan kekerabatan
(filogenetik) nya semakin dekat dapat dilihat pada (Tabel 2). Jarak genetik
merupakan metode perhitungan yang diukur berdasarkan derajat dari region gen
antara populasi atau spesies (Anggraini, 2015). Globba atrosanguinea membentuk
lima seksi utama dengan pemilihan sampel jarak genetik yang diuji berdasarkan
hasil rekonstruksi pohon filogenetik dengan masing-masing seksi representasikan.
Keempat sampel G. atrosanguinea dan pangkalan data NCBI Genbank yang
dianalisis memiliki nilai jarak genetik dalam spesies yang sama (intraspesies)
sebesar 0,0-0,07% dan antar spesies dalam beberapa seksi berbeda (interspesies)
sebesar 0,3-0,71%. Nilai matriks dalam spesies yang sama memiliki jarak terendah
ditunjukkan antara: G. atrosanguinea (AF478753.1) dengan G. atrosanguinea var.
sumatrana (AB049315.1), G. atrosanguinea (AF478753.1) dengan G.
atrosanguinea (MA621), G. atrosanguinea (AF478753.1) dengan G.
33
atrosanguinea (MA643), G. atrosanguinea (MA621) dengan G. atrosanguinea var.
atrosanguinea (AB049316.1), G. atrosanguinea (MA643) dengan G.
atrosanguinea var. atrosanguinea (AB049316.1) dan G. atrosanguinea (MA643)
dengan G. atrosanguinea (MA621) dengan nilai 0,000 yang artinya dalam 100
urutan basa nukleotida tidak terdapat basa nukleotida yang berbeda, untuk jarak
genetik dalam spesies yang sama dengan nilai terbesar ditunjukkan antara spesies
G. atrosanguinea var. sumatrana (AB049315.1) dengan G. atrosanguinea
(WEKBOE40) sebesar 0,007 yang artinya dalam 100 urutan rantai basa terdapat 7
basa nukleotida yang berbeda. Jarak genetik antar spesies dengan nilai jarak
terendah ditunjukkan antara spesies G. gracilis (AY339669.1) dengan G.
atrosanguinea (AF478753.1), G gracilis (AY339669.1) dengan G. atrosanguinea
var. atrosanguinea (AB049316.1), G. gracilis (AY339669.1) G. atrosanguinea
(MA643) dan G. gracilis (AY339669.1) dengan G. atrosanguinea (WEKBOE40)
dengan nilai 0,030 yang artinya dalam 100 urutan terdapat 30 basa nukleotida yang
berbeda. Untuk jarak genetik antar spesies dengan nilai terbesar ditunjukkan antara
spesies G. wengeri (AF478770.1) dengan G. atrosanguinea var. sumatrana
(AB049315.1) dan G. spathulate (AF478769.1) dengan G. atrosanguinea var.
sumatrana (AB049315.1) ditunjukkan nilai sebesar 0,071 yang artinya dalam 100
urutan rantai basa terdapat 71 basa nukleotida yang berbeda. Hal tersebut masih
relatif rendah dengan perbedaan yang signifikan dalam membentuk seksi yang
berbeda antara seksi Globba dan seksi mantisia. Nilai matriks yang semakin rendah
menunjukkan bahwa kekerabatan setiap spesies semakin dekat dan dibuktikan oleh
bentuk pohon filogenetik (Gambar 12). Faktor yang mempengaruhi perbedaan
genetik antar spesies biasanya dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti genetic drift
dan natural selection (Freeland, 2005). Data jarak genetik dapat digunakan untuk
pengukuran mengenai disimilaritas atau derajat perbedaan antar organisme
(Aprilyanto & Sembiring, 2015).
Nilai jarak genetik menunjukkan kekerabatan dari G. atrosanguinea dengan
sister taxa nya. Semakin tinggi nilai jarak genetik maka semakin jauh hubungan
kekerabatannya, begitu juga dengan sebaliknya semakin rendah nilai jarak genetik
maka semakin dekat hubungan kekerabatannya. Berdasarkan hasil jarak genetik
spesies G. atrosanguinea (MA639) memiliki jarak yang lebih variatif. Hasil yang
34
Tabel 2. Matriks Jarak genetik sekuens DNA Globba atrosanguinea dengan spesies lain dari NCBI GenBank
No. Spesies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1. AF478753.1 Globba atrosanguinea 2. AB049315.1 Globba atrosanguinea var. sumatrana 0,004 3. AB049316.1 Globba atrosanguinea var. atrosanguinea 0,000 0,004 4. Globba atrosanguinea MA621 0,000 0,004 0,000 5. Globba atrosanguinea MA639 0,002 0,005 0,002 0,002 6. Globba atrosanguinea MA643 0,000 0,004 0,000 0,000 0,002 7. Globba atrosanguinea WEKBOE 40 0,004 0,007 0,004 0,004 0,005 0,004 8. AY339669.1 Globba gracilis 0,030 0,034 0,030 0,030 0,032 0,030 0,030 9. AB049295.1 Globba franciscii 0,032 0,036 0,032 0,032 0,034 0,032 0,032 0,005 10. AY339677.1 Globba expansa 0,034 0,037 0,034 0,034 0,036 0,034 0,034 0,034 0,032 11. AY339672.1 Globba nuda 0,037 0,041 0,037 0,037 0,039 0,037 0,037 0,036 0,034 0,009 12. AF478755.1 Globba macroclada 0,050 0,053 0,050 0,050 0,052 0,050 0,050 0,062 0,061 0,062 0,062 13. KJ872138.1 Globba multiflora 0,050 0,053 0,050 0,050 0,052 0,050 0,050 0,062 0,061 0,062 0,062 0,007 14. AF478770.1 Globba wengeri 0,068 0,071 0,068 0,068 0,070 0,068 0,064 0,075 0,073 0,075 0,077 0,071 0,071 15. AF478769.1 Globba spathulate 0,068 0,071 0,068 0,068 0,070 0,068 0,064 0,075 0,073 0,073 0,075 0,071 0,071 0,007
35
didapatkan jarak genetik G. atrosanguinea (MA639) dengan G. atrosanguinea
(AF478753.1) sebesar 0,002 yang artinya dalam 100 urutan terdapat 2 basa
nukleotida yang berbeda, G. atrosanguinea (MA639) dengan G. atrosanguinea
var. sumatrana (AB049315.1) sebesar 0,004 yang artinya dalam 100 urutan
terdapat 4 basa nukleotida yang berbeda, G. atrosanguinea (MA643) dengan G.
atrosanguinea var. atrosanguinea (AB049316.1) sebesar 0,002 dan G.
atrosanguinea (MA621) dengan, G. atrosanguinea (MA621) sebesar 0,002. Hasil
tersebut mengindikasikan bahwa adanya variasi nukleotida pada sampel MA639
karena jarak genetik tergolong lebih besar dibandingkan dengan spesies G.
atrosanguinea yang dianalisis. Hal tersebut diduga oleh adanya estimasi jumlah
substitusi nukleotida yang pada umumnya dipeoleh dari pembanding pasangan
urutan yang diyakini berdivergensi dari satu leluhur yang sama yang menyebabkan
perbedaan nukleotida antar urutan pada satu spesies (Aprilyanto & Sembiring,
2015).
36
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Studi karakterisasi morfologi G. atrosanguinea aksesi Kalimantan (BO)
menghasilkan 3 kelompok yang memiliki perbedaan bentuk helaian daun. Hasil
karakter molekuler yang dikorelasikan dengan data morfologi belum mendapatkan
hasil yang mendiskriminasi sempurna. Persebaran G. atrosanguinea berdasarkan
data spesimen di BO terdistribusi di setiap provinsi di pulau Kalimantan. Pohon
filogenetik menunjukkan aksesi G. atrosanguinea dari Kalimantan tertanam di
seksi Globba dengan nilai bootstrap yang tinggi. Keempat aksesi G. atrosanguinea
dari Kalimantan dan dari NCBI Genbank memiliki jarak genetik intraspesies
sebesar 0.0–0.07% dan interspesies sebesar 0.3–0,71%. Barkoding DNA region ITS
dapat digunakan untuk mengungkapkan hubungan filogenetik antara G.
atrosanguinea dengan jenis lainnya, tetapi tidak dapat membedakan antar aksesi G.
atrosanguinea karena variasi nukleotida yang sangat rendah.
5.2. Saran
Disarankan untuk menggunakan region lain selain ITS, Berdasarkan literatur
region DNA yang berpotensi untuk identifikasi tumbuhan dapat menggunakan
DNA dari kloroplas seperti matK dan trnH-psbA maupun beberapa kombinasinya
untuk dapat lebih mengevaluasi efisiensi barkode DNA potensial di G.
atrosanguinea dan dapat pula menggunakan pendekatan molekuler dalam studi
populasi genetik seperti sidik jari DNA (DNA fingerprinting) meliputi RAPD,
ISSR, AFLP atau SRAP.
37
DAFTAR PUSTAKA
Andila, P., & Tirta, I. (2019). Distribution and phytocomponent in the ethanol
extract of Globba candida gagnep. (Zingiberaceae) by GC-MS analysis.
Journal of Tropical Life Science, 9(1), 43–51.
https://doi.org/10.11594/jtls.09.01.07
Anggraini, N. P. (2015). Sistematika molekuler DNA barcoding dan
keanekaragaman genetika lamun di Pulau Panggang, Pulau Pramuka dan
Pulau Karya, Kepulauan Seribu, Jakarta. (Skripsi). Institut Pertanian Bogor,
Bogor, Indonesia.
Aprilyanto, V., & Sembiring, L. (2015). Filogenetika Molekuler: Teori dan
Aplikasi. Yogyakarta, Indonesia: Innosain.
Bleeker, W., Klausmeyer, S., Peintinger, M., & Dienst, M. (2008). DNA sequences
identify invasive alien Cardamine at lake Constance. Biological Conservation,
141(3), 692–698. https://doi.org/10.1016/j.biocon.2007.12.015
Boldsystems. (2019). Globba atrosanguinea (species). Retrieved from
http://v3.boldsystems.org/index.php/
BPDAS Mahakam Berau. (2009). Laporan final rencana pengelolaan DAS terpadu
di DAS Mahakam. Samarinda, Indonesia: Departemen Kehutanan, Direktorat
Jendral Rehabilitasi Lahan Dan Perhutanan Sosial.
Cao, L., Newman, M. F., Kirchoff, B. K., & Ronse De Craene, L. P. (2019).
Developmental evidence helps resolve the evolutionary origins of anther
appendages in Globba (Zingiberaceae). Botanical Journal of the Linnean
Society, 189(1), 63–82. https://doi.org/10.1093/botlinnean/boy071
Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., … Leon, C. (2010). Validation
of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant
species. PLoS ONE, 5(1), 1–8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008613
Clay, H., & James, H. (1987). Tropical Exotics. Honolulu, United States: University
of Hawaii Press.
Dale, J. W., & Park, S. F. (2010). Molecular Genetics of Bacteria (5th ed.). Oxford,
United Kingdom: John Wiley and Sons Ltd.
De Groot, G. A., During, H. J., Maas, J. W., Schneider, H., Vogel, J. C., & Erkens,
R. H. J. (2011). Use of rbcl and trnl-f as a two-locus DNA barcode for
identification of NW-European ferns: an ecological perspective. PLoS ONE,
6(1), 1–10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016371
Dharmayanti, N. L. P. I. (2011). Filogenetika Molekuler: Metode taksonomi
organisme berdasarkan sejarah evolusi. Wartazoa, 21(1), 1–10.
38
Doyle, JJ; Doyle, J. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12(1),
13–15.
Ekasari, T. W. D., Retnoningsih, A., & Widianti, T. (2012). Analisis
keanekaragaman kultivar pisang menggunakan penanda PCR-RFLP pada
Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosom. Jurnal MIPA, 35(1), 21–30.
Gao, T., Yao, H., Song, J., Liu, C., Zhu, Y., Ma, X., … Chen, S. (2010).
Identification of medicinal plants in the family fabaceae using a potential
DNA barcode ITS2. Journal of Ethnopharmacology, 130(1), 116–121.
https://doi.org/10.1016/j.jep.2010.04.026
Gonzalez, M. A., Baraloto, C., Engel, J., Mori, S. A., Pétronelli, P., Riéra, B., …
Chave, J. (2009). Identification of Amazonian trees with DNA barcodes. PLoS
ONE, 4(10). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007483
Graur, B. dan, & Li, W. (2000). Fundamentals of Molecular Evolution.
Massachusetts, United States: Sinauer Associates Inc.
Hebert, P. D. N., Cywinska, A., Ball, S. L., & DeWaard, J. R. (2003). Biological
identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B:
Biological Sciences, 270(1512), 313–321.
https://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218
Hebert, P. D. N., Stoeckle, M. Y., Zemlak, T. S., & Francis, C. M. (2004).
Identification of birds through DNA barcodes. PLoS Biology, 2(10), 1657–
1663. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0020312
Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia Jilid I. Jakarta, Indonesia:
Koperasi karyawan Departemen Kehutanan.
Hikmah, R., Retnoningsih, A., & Habibah, N. (2016). Keragaman durian
berdasarkan fragmen Internal Transcribed Spacers (ITS) DNA ribosomal
melalui analisis PCR-RFLP. Jurnal MIPA, 39(1), 11–18.
Jaakola, L., Suokas, M., & Häggman, H. (2010). Novel approaches based on DNA
barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses
of berry species. Food Chemistry, 123(2), 494–500.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.04.069
Kalbarprov.go.id. (2015). Gambaran umum aspek geografis Kalimantan Barat.
Retrieved from http://www.kalbarprov.go.id/
Karmana, I. wayan. (2009). Kajian evolusi berbasis urutan nukleotida. GeneC
Swara, 3(3), 75–81.
Kress, W. J. (2017). Plant DNA barcodes: applications today and in the future.
Journal of Systematics and Evolution, 55(4), 291–307.
39
https://doi.org/10.1111/jse.12254
Kress, W. J., Prince, L. M., & Williams, K. J. (2002). The phylogeny and a new
classification of the gingers (Zingiberaceae): evidence from molecular data.
American Journal of Botany, 89(10), 1682–1696.
https://doi.org/10.3732/ajb.89.10.1682
Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., & Janzen, D. H. (2005).
Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the
National Academy of Sciences, 102(23), 8369–8374.
https://doi.org/10.1073/pnas.0503123102
Kuhn, T. S., Mooers, A., & Thomas, G. H. (2011). A simple polytomy resolver for
dated phylogenies. Methods in Ecology and Evolution, 2(5), 427–436.
https://doi.org/10.1111/j.2041-210X.2011.00103.x
Kumar, S., Stecher, G., & Tamura, K. (2016). MEGA7: Molecular evolutionary
genetics analysis version 7.0 for bigger datasets brief communication.
Molecular Biology and Evolution, 33(7), 1870–1874.
https://doi.org/10.1093/molbev/msw054
Lamb, A., Gobilik, J., Ardiyani, M., & Poulsen, A. D. (2013). A Guide to Gingers
of Borneo. Sarawak, Malaysia: Natural History Publications (Borneo).
Lemmens, R. H. M. J., & Bunyapraphatsara, N. (2003). Plant Resources of South-
east Asia (12(3)). Leiden, Netherlands: Backhuys Publishers.
Letchuman, S. (2018). Short introduction of DNA barcoding. International Journal
of Research, 05(04), 673–686.
Luscombe, N. M., Greenbaum, D., & Gerstein, M. (2001). A proposed definition
and overview of the field. Methods of Information in Medicine, 40(4), 346–
358.
Möller, M., & Cronk, Q. C. B. (1997). Origin and relationships of Saintpaulia
(Gesneriaceae) based on ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer (ITS)
sequences. American Journal of Botany, 84(7), 956–965.
https://doi.org/https://doi.org/10.2307/2446286
Mulyatni, A. S., Priyatmojo, A., & Purwantara, A. (2011). Sekuen Internal
Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae dan
jamur sekerabat pembanding. Menara Perkebunan, 79(1), 1–5.
Rahayu, D. A., & Nugroho, E. D. (2015). Biologi Molekuler dalam Perspektif
Konservasi. Yogyakarta, Indonesia: Plantaxia.
Salimi, Y. K., & Bialangi, N. (2014). Kajian senyawa antioksidan dan antiinflamasi
tumbuhan obat Binahong (Andredera cordifolia (ten.) steenis) asal Gorontalo.
40
(Skripsi). Universitas Negeri Gorontalo, Gorontalo, Indonesia.
Salmani, Fakhrirrazi, & Wahyudi, M. (2013). Analisa ketersediaan air Daerah
Aliran Sungai Barito hulu dengan menggunakan debit hasil perhitungan
metode nreca. Jurnal Intekna, 13, 114–118.
Sam, Y. Y., & Ibrahim, H. (2016). A new Globba with large white floral bracts
from Peninsular Malaysia. PhytoKeys, 73, 117–124.
https://doi.org/10.3897/phytokeys.73.9737
Schander, C., & Willassen, E. (2005). What can biological barcoding do for marine
biology? Marine Biology Research, 1(1), 79–83.
https://doi.org/10.1080/17451000510018962
Schmidt, H. A. (2003). Phylogenetic trees from large Datasets. (Dissertation).
Universität of Düsseldorf. Düsseldorf. Germany. Retrieved from
http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.87.1104&rep=rep1
&type=pdf%5Cnpapers://0bf253c3-7396-4811-afa5-
28e5fa189e15/Paper/p22437
Segersäll, M. (2011). DNA barcoding of commercialized plant; an examination of
amomum (Zingiberaceae) in South-east Asia. Uppsala, Sweden: Uppsala
university.
Status Lingkungan Hidup Ekoregion Kalimantan. (2011). Daerah Aliran Sungai
(DAS). Retrieved from https://docplayer.info/52903430-Daerah-aliran-
sungai-das.html
Sulistyaningsih, L. dwi, Ardiyani, M., Abinawanto, & Salamah, A. (2018). Short
communication: phylogenetic analysis and molecular identification of Canar
(Smilax spp.) in Java, Indonesia based on DNA barcoding analysis.
Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 19(2), 364–368.
https://doi.org/10.13057/biodiv/d190202
Susilowati, Y., Leksono, B. E., & Harsono, E. (2012). Potensi sumberdaya air untuk
pembangkit listrik mikrohidro wilayah perbatasan Kalimantan Barat.
Prosiding Pemaparan Hasil Penelitian Pusat Penelitian Geoteknologi LIPI,
137–152.
Takano, A., & Okada, H. (2000). Four new Globba (Zingiberaceae) species from
Sumatra, Indonesia. Nordic Journal of Botany, 20(1), 61–66.
Takano, A., & Okada, H. (2001). A new variety of Globba atrosanguinea
(Zingiberaceae) from Sumatra, Indonesia. Nordic Journal of Botany, 21(2),
161–164. https://doi.org/10.1111/j.1756-1051.2001.tb01353.x
Takano, A., & Okada, H. (2002). Multiple occurrences of triploid formation in
Globba (Zingiberaceae) from molecular evidence. Plant Systematics and
41
Evolution, 230(3–4), 143–159. https://doi.org/10.1007/s006060200001
Takano, A., & Okada, H. (2003). Taxonomy of Globba (Zingiberaceae) in Sumatra,
Indonesia. Systematic Botany, 28(3), 524–546. https://doi.org/10.1043/01-
52.1
Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., & Kumar, S. (2011).
MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum
likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.
Molecular Biology and Evolution, 28(10), 2731–2739.
https://doi.org/10.1093/molbev/msr121
Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., & Khan, I. A. (2014). DNA barcoding of medicinal
plant material for identification. Current Opinion in Biotechnology, 25, 103–
110. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2013.09.010
Ubaidillah, R., & Sutrisno, H. (2009). Pengantar Biosistematika: Teori dan
Praktek. Bogor, Indonesia: LIPI Press.
Utami, N., & Ardiyani, M. (2015). Phylogenetic study of Sumatran Impatiens
(Balsaminaceae) using nuclear and plastid DNA sequences. Acta
Phytotaxomoica et Geobotanica, 66(2), 81–90.
https://doi.org/10.18942/apg.KJ00010001422
Washikah. (2016). Tumbuhan Zingiberaceae Sebagai Obat-obatan. Serambi
Saintia, 4(1), 27–34.
Williams, K. J., Kress, W. J., & Manos, P. S. (2004). The phylogeny, evolution, and
classification of the genus Globba and tribe Globbeae (Zingiberaceae):
appendages do matter. American Journal of Botany, 91(1), 100–114.
https://doi.org/10.3732/ajb.91.1.100
Zein, M. S. A., & Prawiradilaga, D. M. (2013). DNA Barcode Fauna Indonesia (1st
ed.). Jakarta, Indonesia: Kencana. Retrieved from
https://books.google.co.id/books/
Zhang, D., Duan, L., & Zhou, N. (2013). Application of DNA barcoding in Roscoea
(Zingiberaceae) and a primary discussion on taxonomic status of Roscoea
cautleoides var. pubescens. Biochemical Systematics and Ecology, 52, 14–19.
https://doi.org/10.1016/j.bse.2013.10.004
42
LAMPIRAN
Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian Karakterisasi Molekuler
Ekstraksi DNA Globba atrosanguinea (Doyle & Doyle 1990) yang
dimodifikasi
Analisis kualitatif DNA
Proses amplifikasi PCR menggunakan primer ITS
Analisis kualitatif hasil PCR
Purifikasi dan sekuensing DNA
Analisis filogenetik dan Jarak genetik
43
Lampiran 2. Tahap Ekstraksi DNA (Doyle & Doyle 1990) yang dimodifikasi
44
Lampiran 3. Penyatuan sekuens forward dan reverse Globba atrosanguinea
menggunakan program ChromasPro ver 1.7.4
45
Lampiran 4. Alur Kerja Proses Barkoding DNA
Translasi primer DNA (F dan R) ke protein dipastikan tidak ditemukannya
stopkodon
Analisis peak elektroferogram hasil sekuensing
Membuat consensus sequences (menggabungkan primer F dan R)
Mencocokkan kebenaran sekuens gen yang didapat adalah 'benar' gen target
(BLASTn)
Identifikasi spesies dan mengetahui kekerabatan dengan database
Alignment (Penyejajaran sekuens dan translasi protein gen ITS antara sampel
dan kerabatnya)
Rekonstruksi Filogenetik dan matriks Jarak genetik
https://web.expasy.org/
Finch TV dan Chromaspro
http://ncbi.nlm.nih.gov/
MUSCLE MEGA 7.0.26
MEGA 7.0.26
Chromaspro
http://ncbi.nlm.nih.gov/
http://boldsystems.org/
46
Lampiran 5. Hasil BLAST Sekuens DNA Globba atrosanguinea region ITS dari
NCBI GenBank
Kode Akses Spesies
Max
total/score
Query
cover
Identity
E-
value
AB049316.1 Globba atrosanguinea var.
atrosanguinea 1053/1053 100% 99.82% 0.0
AB049323.1 Globba flavibracteata 1050/1050 100% 99.82% 0.0
AY339735.1 Globba talangensis 1048/1048 100% 99.82% 0.0
AY339732.1 Globba acehensis 1048/1048 100% 99.82% 0.0
AF478753.1 Globba atrosanguinea 1048/1048 100% 99.82% 0.0
AY339734.1 Globba fecunda 1144/1144 100% 99.65% 0.0
AB049315.1 Globba atrosanguinea var.sumatrana 1042/1042 100% 99.65% 0.0
KX065412.1 Globba marantina 970/970 100% 97.37% 0.0
AY339669.1 Globba gracilis 917/917 100% 95.64% 0.0
AB049295.1 Globba franciscii 911/911 100% 95.47% 0.0
AY339677.1 Globba expansa 907/907 100% 95.30% 0.0
AY339700.1 Globba xantholeuca 880/880 100% 94.43% 0.0
AF478755.1 Globba macroclada 859/859 100% 93.89% 0.0
KJ872138.1 Globba multiflora 859/859 100% 93.89% 0.0
AF478770.1 Globba wengeri 804/804 100% 92.15% 0.0
AF478769.1 Globba spathulata 804/804 100% 92.15% 0.0
47
Lampiran 6. Matriks posisi sekuens DNA Region ITS yang menunjukkan variasi
Spesies Posisi nukleotida 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
1 3 4 4 5 5 6 7 7 8 8 9 0 0 1 1 1 3 3 3 4 4 5 6 7 7 8 8 2
4 5 0 3 6 9 7 4 6 5 7 4 4 9 1 4 5 0 6 8 2 6 8 8 7 9 0 1 2
1. AF478753.1 Globba atrosanguinea A T G C T C T T A A A C C - A A T A C T G C C C C A G G G
2. AB049315.1 Globba atrosanguinea var. sumatrana . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .
3. AB049316.1 Globba atrosanguinea var. atrosanguinea . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .
4. Globba atrosanguinea MA621 . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .
5. Globba atrosanguinea MA639 . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .
6. Globba atrosanguinea MA643 . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .
7. Globba atrosanguinea WEKBOE 40 . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .
8. AY339669.1 Globba gracilis . C . . C T . C . T C . . A . . . . . . . T . . . C . . .
9. AB049295.1 Globba franciscii . C . . C T . C . T C . . A . . . . . . . T . . . C . . .
10. AY339677.1 Globba expansa . . . T C . C C . . C T . A . . . . . . . . . . . C . . .
11. AY339672.1 Globba nuda . . . T C . C C . . C T . A . . . . . . . . . . . C . . .
12. AF478755.1 Globba macroclada G . . . . . A . G . C . . - C G C G T - . . . . . C A A .
13. KJ872138.1 Globba multiflora G . . . . . A . G . C . . - C G C G T - . . . . . C A . .
14. AF478770.1 Globba wengeri . . C T . . . C . . C . T - . G . . . - C G T T G C . . T
15. AF478769.1 Globba spathulata . . C T . . . C . - - . T - . G . . . - C G T T G C . . T
48
Lampiran 7. Lanjutan Matriks posisi sekuens DNA Region ITS yang menunjukkan variasi
Spesies Posisi nukleotida
3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
3 4 5 6 7 7 8 9 1 1 2 3 4 5 7 7 7 8 8 8 8 8 9 0 0 0 0 0 1 2 3 3 4 4 5 5 5 6 6
1 8 2 7 6 9 6 3 2 7 5 8 8 7 2 4 6 0 2 5 6 7 3 0 3 5 7 9 7 5 0 3 7 8 1 2 8 1 3
1. C G C A T T C A A G T A C C G C C C G T T C C C C T T C T A C C T C G G G C A
2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . T .
8. . . . . C . T T . . C . . . . T . . . . . . T . G . . G . . . T . . . . . . .
9. . . . . C . T T T . C . . . . T . . . . . . T . G . . G . . . T . . . . . . .
10. . C . . . . . . T . . T . . . T . . . . . . T . G . C A . . . T G . T . . . .
11. . C . . . . . . T . . T . . . T . . . . . . T . G A C G . . . T G . T . . . .
12. . . . . . . . . T A . . . T . . T . . A A T T T . C . G C G . T . . . . . . G
13. . . . . . . . . T A . . T . . T . . A A T T T . C . G C G . T . . . . . . G
14. T . T G . A . . T A . A . A . T A C A A T T . . . . G . G A T . A . C T T .
15. T A T G . A . . T A . A . A . T A C A A T T . . . . G . G A T . A . C T T .