Jawaban Pertanyaan

I. Ekstraksi DNA dengan Metode Chelex1. Jelaskan hasil yang telah didapatkan dari praktikum ini!

Jawab : Hasil yang didapatkan dari praktikum ini adalah kita dapat mengetahui DNA dari spesimen darah manusia yang menderita suatu penyakit misalnya TB dengan mengunakan metode chelex

2. Apa manfaat dari 20% Chelex?Jawab : Untuk mengikat zat-zat lain selain DNA seperti lipid, protein, dan lain-lain setelah dicuci endapannya dengan PBS 1x dan disentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruangan

3. Apa manfaat dari PBS?Jawab : Sebagai pengencer dan pencampur sampel. Selain itu, digunakan juga untuk mencuci sampel/menghilangkan kontaminasi agar diperoleh supernatant yang diinginkan

4. Apa manfaat sampel dididihkan?Jawab : Agar DNA dapat keluar dari sel dan dipisah untaiannya sehingga ddH2O mampu mengikat DNA tersebut

II. Pencampuran Komponen reaksi PCR1. Apa manfaat Enzim polymerase dalam PCR Mix?

Jawab : Bermanfaat sebagai katalisator sintesis DNA dan sebagai pencetak rangakain molekul DNA baru, dengan cara menyalin untai cetakan DNA dalam arah 3’ dan 5’ menghasilkan untaian baru dalam arah 5’ ke 3’.

2. Apa manfaat dNTP dalam PCR Mix?Jawab : Sebagai sumber nukleotida yang ikut menggandakan DNA. Fungsi lainnya yaitu untuk mengurangi misinkoorperasi, memperlambat dan mempercepat reaksi terminasi. dNTP merupakan kumpulan basa-basa penyusun DNA yang terdiri dari 4 macam basa yaitu A,T,G, dan C. dNTP ini digunakan oleh enzim DNA polymerase sebagai bahan untuk memperpanjang DNA.

3. Apa kegunaan primer dalam pemeriksaan PCR?Jawab : Primer sangat penting untuk keberhasilan PCR. Primer ini digunakan agar komplemen dengan cetakan DNA spesifik yang akan diperbanyak. Primer yang baik harus dihibridisasi secara efisien dengan sekuen DNA yang menjadi target, tanpa melakukan hibridisasi dengan sekuen lain pada DNA yang sama. Selain itu, primer juga berfungsi untuk menempel pada DNA sampel ketika DNA menjadi 1 utas, sebagai awal pembentukan utas baru. Penempelan ini berguna untuk membantu DNA Taq Polymerase melakukan tugasnya.

4. Berapa konsentrasi DNA sampel yang biasanya digunakan pada pemeriksaan PCR?Jawab : Biasanya konsentrasi DNA sampel yang digunakan adalah 1,5 mM

III. Elektroforesis1. Kenapa DNA bisa berjalan di dalam agar?

Jawab : Pada prinsipnya, DNA dapat berimigrasi di dalam gel dalam bentuk padat yang diletakkan dalam larutan penyangga yang dialiri arus listrik . Molekul DNA membawa muatan listrik negatif, karena mengandung gugus fosfat yang bermuatan negatif, sehingga jika dialiri arus listrik dengan gel yang dipakai akan bergerak/berimigrasi ke kutub positif. Jika gel ditempatkan ke dalam bak elektroforesis yang mengandung larutan buffer dan dihubungkan dengan listrik arus searah, maka molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke arah positif (anode).

2. Kenapa aliran listrik yang dialirkan pada mesin elektroforesi harus dari negatif ke positif?Jawab : Karena muatan listrik DNA adalah negatif. Jika dibuat pada arah yang sebaliknya (positif ke negatif) , DNA tidak akan bisa berpindah. DNA akan tetap di tempat, karena aliran listrik pasda gel (yang mengarah ke negatif) berlawanan arah dengan muatan listrik DNA (yang mengarah ke kutub positif). DNA hanya bisa bergerak berpindah jika dialirkan aliran listrik yang sama dengan arah DNA itu bergerak (kutub negatif ke kutub positif).

3. Mengapa kita harus menggunakan loading buffer?Jawab : Karena loading buffer dapat mempertahankan pH gel agarose dalam elektroforesis sehingga molekul DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah positif. Selain itu komposisi loading buffer merupakan salah satu faktor kecepatan pergerakan dari DNA.

4. Kenapa kita harus menggunakan ethidium bromide pada gel agarose dan apa bahayanya bila mengenai langsung kulit kita?Jawab : Ethidium bromide berfungsi sebagai pewarna DNA di dalam gel agarose yang merupakan pewarna yang dapat berfluorensensi di bawah sinar ultraviolet dan bahayanya bila langsung mengenai kulit kita ialah dapat menyebabkan kerusakan genetis dan ethidium bromide bersifat karsinogenik dan mutagenik.

5. Bagaimana mengetahui bahwa hasil PCR positif dan negatif?Jawab : Hasil positif bila tampak pita yang jelas dan terang apabila gel agarose yang membawa DNA tersebut ditempatkan di atas sinar ultraviolet kemudian difoto dengan Polaroid atau kamera digital 5 megapixel.