ISOLASI STEVIOID DARI DAUN STEVIA

KLASIFIKASI Kingdom : Plantae Divisi : SpermatophytaSub divisi : Angiospermae

(berbiji tertutup)Kelas : DicotyledoneaeOrdo : CampanulataeFamili : AsteraceaeGenus : Stevia

Asal Usul Tanaman• Stevia telah digunakan sejak 1500 tahun lalu oleh Orang Indian

Guarani (kaum pribumi Paraguay) sebagai pemanis dan obat ramuan yang dikenal sebagai “KAA he-he” (atau ramuan manis).

• Pada tahun 1887, ahli botani Moises Santiago Bertoni meneliti stevia sebagai pemanis dan ramuan obat secara terperinci.

• Pada tahun 1931, dua kimiawan Perancis mengisolasi glikosida yang diberi nama Stevioside dan Rebaudioside yang 250 dan 300 kali lebih manis dari pada gula biasa.

• Pada akhir 1950-an, Jepang mulai budidaya stevia dan pada tahun 1970 mulai menggunakan stevia secara komersial.

• Pada tahun 2006 WHO mengevaluasi secara menyeluruh tentang studi Stevia melalui serangkaian percobaan yang dilakukan pada hewan dan manusia yang kemudian menyimpulkan bahwa stevia mengandung glikosida steviol dan tidak ber-karsinogenik.

TANAMAN STEVIA• Stevia merupakan tumbuhan semak yang

mempunyai 150 spesies dari keluarga bunga matahari ( Asteraceae ). Tumbuhan ini adalah tumbuhan perdu asli dari paraguay. Cocok pada tanah berpasir dengan tinngi tanaman maksimal 80 cm

• Stevia tumbuh pada tempat dengan ketinggian 500-1000 mdiatas permukaan laut, didataran rendah stevia akan cepat berbunga dan mudah mati apabila sering dipanen.

• Suhu yang cocok berkisaran antara 14-270°C. Terdapat beberapa cara untuk memperbanyak stevia, yaitu dengan mengecambahkan biji stevia,steak batang, pemisahan rumpun maupun kultur jaringan

Teknik Budidaya

Penyiapan lahan

Pengolahan tanah Pembibita

n

Penanaman

PemeliharaanPanen

Pasca panen

Bagian tanaman stevia yang digunakan sebagai pemanis adalah daunnya. Daun stevia dapat langsung digunakan sebagai pemanis.

Kandungan 4 glikosida utama pada daun stevia :Komponen Persen

Derivat steviol (steviosid) (4-15%)

Rebausid A (2-4%)

Rebausid C (1-2%)

Dulkosida A (0,4-0,7%)

Kandungan Kimia• Dua senyawa utama pada

stevia adalah steviosida dan rebaudiosida A.

• Steviosida mempunyai dua molekul glukosa yang terikat pada bagian hidroksil, dimana rebaudiosida A mempunyai tiga, dengan glukosa ditengah-tengah dari tripletnya yang tersambungkan pada struktur steviol pusat.

• Senyawa ini stabil terhadap panas, stabil terhadap pH, dan tidak mengalami fermentasi. Senyawa ini juga tidak mempengaruhi glikemik bila dikonsumsi, yang membuat daya tarik steviol glikosida sebagai pemanis alami bagi para diabetik dan yang lain atas diet- karbohidrat terpantau.

• Mengandung bahan pemanis alami non kalori dan mampu menghasilkan rasa manis 70-400 kali dari manisnya gula tebu,dapat dijadikan bahan dasar industri gula non-kalori atau bahan dasar industri makanan serta minuman atau jamu tradisional

Ekstraksi

Metode soxhlet ini dipilih karena :• pelarut yang digunakan lebih sedikit (efisiensi bahan) • waktu yang dibutuhkan tidak terlalu banyak.

Metode ekstraksi seperti ini adalah pelarut yang digunakan harus mudah menguap (volatil) dan hanya digunakan untuk ekstraksi senyawa yang tahan panas saja. Stevioid merupakan salahsatu senyawa yang tidak akan rusak karena panas, maka untuk efisiensi pelarut dan waktu digunakanlah metode ini.

ALAT SOXHLET

• Nama-nama instrumen dan fungsinya :

1. Kondensor : berfungsi sebagai pendingin, dan juga untuk mempercepat proses pengembunan.

2. Timbal : berfungsi sebagai wadah untuk sampel yang ingin diambil zatnya.

3. Pipa F : berfungsi sebagai jalannya uap, bagi pelarut yang menguap dari proses penguapan.

4. Sifon : berfungsi sebagai perhitungan siklus, bila pada sifon larutannya penuh kemudian jatuh ke labu alas bulat maka hal ini dinamakan 1 siklus.

5. Labu alas bulat : berfungsi sebagai wadah bagi sampel dan pelarutnya.

6. Hot plate : berfungsi sebagai pemanas larutan

Serbuk stevia

Didestilasi dg metanol,etanol, spiritus,dan aquadet

Ekstrak cair

- Dipekatkan Ditambahkan 100 mL aquadestDiekstraksi dengan kloroform

F.Kloroform F.air

F.n-butanol F.air

Destilat

Alasan

• Pelarut yang digunakan :- Metanol : berfungsi pula untuk mengkristalkan larutan - Aquadest : untuk melarutkan residu • Khloroform,digunakan pada saat ekstraksi yang berfungsi

untuk menghilangkan warna hijau yang dihasilkan oleh Khlorophyl.

• N-Butanol, digunakan pada ekstraksi setelah ekstraksi dengan menggunakan khloroform merupakan senyawa non polar

FraksinasiMenggunakan Kromatografi cair Kinerja Tinggi

Keterangan Alat1. PompaPompa pendeteksian tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilakan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detector yang stabil jika detector peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak terbatas.2. InjectorCuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:3. KolomKolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparative.4. DetectorDetector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menggapai semua jenis senyawa. Jenis-jenis detector : UV/Vis, Retraktif indeks (RI) detector, Konduktifitas decetor, Elektroimia detector, PDA, ELSD, MS dectetor5. Fase gerak

PRINSIP KCKT

Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias)

Alasan :

• Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data

• Volume sampel kecil • Daya pisah tinggi • Merupakan metode analitis: - Cepat - Peka - Akurat -

Tepat - Reproducible - Preparatif • Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan

anorganik, bersifat volatile dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.

• Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

Identifikasi steviosida dilakukan dengan menggunakan KCKT. Sebagai fase diam KCKT adalah RP C18 dan fase geraknya adalah asetonitril, metanol, dan air dengan flow rate 1,5mL/menit.

Elusi fase gerak dilakukan secara isokratik menggunakan(aquades:methanol=70:20):(acetonitril)=76:24, dan volume sampel yang diinjeksikan adalah 20μL. Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Line Knauer pada panjang gelombang 217nm.

ISOLASI• Pada dasarnya isolasi senyawa kimia dari bahan

alam adalah sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni.

• Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami ini mentargetkan untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia. Antara lain manfaatnya dalam bidang pertanian, kesehatan dan pangan.

ISOLASI Daun (5 Kg)

-dikeringkan pada suhu 50°C -dilarutkan dengan pelarut organik non polar

-diserbukkan hingga ukurannya 20-30 mm

Serbuk Steviodes -diekstraksi dalam larutan air (1:10) disesuaikan hingga pH 3, pada 60°C,dengan agitasi-diinkubasi selama 6 jam

Ekstrak Kasar-didinginkan dan disaring

Filtrat Endapan +NaOH 0,1N -disaring Dipanaskan pd 60°C Larutan kaya stevioside selama 1jam dinetralkan denganlarutan kaya stevioside asam encer HCl 0,1 N dipisahkan melalui

ultrafiltration (UF) mem-brane of 30 kDa

Deteksi UV

Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Line Knauer pada panjang gelombang 217nm.

Analisis Spektra Steviosida dari Ektraksi Secara Spektroskopi

Kristal steviosida dilarutkan dalam metanol. Larutan steviosida kemudian dilihat pola serapan cahayanya pada panjang gelombang 200-400 nm.