isolasi metabolit sekunder dari fraksi aktif...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DARI FRAKSI

AKTIF ANTIOKSIDAN Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees

SKRIPSI

AISYAH

NIM : 1113102000030

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

AGUSTUS / 2017

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DARI FRAKSI AKTIF

ANTIOKSIDAN Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana Farmasi

AISYAH

NIM : 1113102000030

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

AGUSTUS / 2017

vi

ABSTRAK

Nama : Aisyah

Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi Metabolit Sekunder dari Fraksi Aktif Antioksidan

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Indonesia memiliki kawasan hutan hujan tropis yang merupakan tempat tumbuh

keanekaragaman hayati termasuk didalamnya lumut (Bryophyta). Informasi

mengenai lumut masih belum tereksplorasi secara penuh sehingga pengetahuan

mengenai lumut di Indonesia masih kurang, termasuk potensi pada komponen

bioaktif yang terkandung pada lumut. Lumut hati (Marchantyophyta) digunakan di

China untuk luka bakar, memar, luka luar, gigitan ular, TBC paru, fraktur, kejang,

melepuh, uropati, pneumonia, dan antipiretik. Penelitian melaporkan beberapa

aktivitas lumut hati diantaranya aktivitas sitotoksik, antibakteri, antijamur, relaksasi

otot, dan kardiotonik. Lumut hati di Indonesia seperti Marchantia emarginata

belum terekplorasi kandungan dan aktivitasnya. Marchantia sp. mengandung

terpenoid yang berpotensi sebagai antioksidan alami, karenanya dilakukan isolasi

terhadap fraksi aktif antioksidan. Uji antioksidan dilakukan dengan menggunakan

metode DPPH terhadap ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana.

Indeks antioksidan yang didapatkan untuk ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan

ekstrak n-heksana secara berurutan yaitu 0,66; 0,50; dan 0,10. Isolasi dilakukan

terhadap ekstrak metanol dengan metode pemisahan kromatografi kolom. Senyawa

B3036 didapatkan sebanyak 1,7 mg dengan Rf 0,28. Penentuan struktur senyawa

B3036 dilakukan dengan menggunakan GC-MS dan 1H-NMR. Senyawa B3036

diketahui merupakan senyawa non-volatile, memiliki gugus aromatik, aldehid dan

alkoksi

Kata Kunci : 1H-NMR, antioksidan, bryophyta, DPPH, GC-MS, isolasi, lumut hati,

Marchantia emarginata

vii

ABSTRACT

Name : Aisyah

Study Program : Pharmacy

Title : Isolation of Secondary Metabolites Compound from

Antioxidant Active Fraction of Marchantia emarginata

Reinw., Blume & Nees

Tropical rain forest in Indonesia is a place to grow variety biodiversity including

moss (bryophyte). In Indonesia, information about bryophyte was lacking, because

it has not been fully explored. Marchantyophyta in China has been used as burning

medicine, bruised wounds, snakebite, pulmonary tuberculosis, fractures, seizures,

blisters, uropathy, pneumonia, and antipyretics. It has been reported that

Marchantyophyta has cytotoxic, antibacteria, antifungal, muscle relaxacing, and

cardiotonic activity. Chemical content and activity of Marchantyophyta in

Indonesia such as Marchantia emarginata has not been explored. Marchantia sp.

contain terpenoids that has been reported to have antioxidant activity, hence

isolation was performed against the active fraction of antioxidants. Antioxidant test

(DPPH methode) was performed against methanol extract, ethyl acetate extract and

n-hexane extract. Antioxidant Activity Index (AAI) for methanol extract, ethyl

acetate extract and n-Hexane extract are 0.66; 0.50; and 0.10 respectively. Isolation

was performed to methanol extract by using Coloumn Chromatography Separation

methode. B3036 compound obtained as much as 1.7 mg with Rf 0.28. Chemical

structure of compound was determained by using GC-MS and 1H-NMR. 1H-NMR

data indicated that B3036 compound has an aldehyde, aromatic, and alkoxy

molecule.

Key Words : 1H-NMR, antioxidant, bryophyte, DPPH, GC-MS, isolation, liver

moss, Marchantia emarginata

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur atas segala nikmat dan karunia yang telah Allah

SWT berikan, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan judul

“Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Fraksi Aktif Antioksidan

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees”. Penulisan skripsi ini dilakukan

dalam rangka untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Kami menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,

sejak masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini sangatlah sulit bagi

kami untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, kami mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Ibu Ismiarni Komala, Ph.D., Apt selaku pembimbing I dan Ibu Dr. Nurmeilis

M.Si., Apt selaku pembimbing II yang telah meluangkan waktu, tenaga dan

pikiran untuk membimbing, mengarahkan, memberikan ilmu dan saran, sejak

proposal skripsi, pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi.

2. Bapak Prof. Dr. H. Arief Sumantri, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. Ibu Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua Bapak Drs. Ubaidillah dan Ibu Sutini, Abang Afi, Aan, Alul

serta keluarga yang terus memberi dukungan moril maupun materil.

5. Sahabat-sahabat sepermainan, Marrisa, Aulia Wardahani, Lisa Fizhilallin,

Luthfia Wikhdatul Akhsani dan Sagita Praja Pustikasari yang selalu

mengingatkan dan memberi dukungan kepada penulis.

6. Kawan-kawan seper-lumut-an, Rahma Atikah, Hasan Asy’ari, Puspa

Novadianti, Nurillah Dwi dan Zakiyatul Munawaroh yang selalu ada sejak

awal hingga akhir penelitian.

ix

7. Kawan seperjuangan, Keluarga Farmasi 2013 yang sanggup bertahan hingga

akhir.

8. Sahabat-sahabat lama Winny Khairunnisa, Annisa Pratiwi, Rafika Dewi, Diana

Wulandari, Ima Yunita, Sara Yunira dan Siti Hajarahmah yang selalu memberi

dukungan kepada penulis.

9. Ka Walid, Ka Tiwi, Ka Eris, Mba Rani dan Ka Rahmadi yang telah memberi

bantuan selama penelitian.

10. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan serta rekan-rekan mahasiswa di

Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

11. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh

karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna

tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala kerendahan hati,

penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan

akademis, khususnya bagi mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi

dunia ilmu pengetahuan.

Ciputat, 9 Agustus 2017

Penulis

x

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .. iError! Bookmark not defined.

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ........ Error! Bookmark not defined.

HALAMAN PENGESAHAN .................................. Error! Bookmark not defined.

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... xvi

BAB I

1.1. Latar Belakang .......................................................................................... 1

1.2. Batasan dan Rumusan Masalah ................................................................ 3

1.3. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3

1.4. Manfaaat Penelitian .................................................................................. 3

BAB II

2.1. Lumut (Bryophyta).................................................................................... 4

2.1. 1. Habitat Lumut ........................................................................................... 4

2.1. 2. Klasifikasi Lumut...................................................................................... 4

2.2. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ...................................... 5

2.2.1. Klasifikasi ................................................................................................. 5

2.2.2. Deskripsi ................................................................................................... 6

2.2.3. Habitat dan Distribusi ............................................................................... 6

2.2.4. Kandungan Kimia ..................................................................................... 6

2.2.5. Aktivitas Biologis ..................................................................................... 7

2.3. Ekstraksi .................................................................................................... 7

2.3.1. Ekstraksi Cara Dingin ............................................................................... 8

2.3.2. Ekstraksi Cara Panas ................................................................................. 8

2.4. Pelarut ....................................................................................................... 9

2.5. Kromatografi ............................................................................................. 9

2.5.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ............................................................ 10

2.5.2. KLT Preparatif ........................................................................................ 11

xi

2.5.3. Kromatografi Kolom ............................................................................... 12

2.5.3.1. Sephadex ................................................................................................. 13

2.5.3.2. Rekristalisasi ........................................................................................... 13

2.5.4. GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectroscopy) .......................... 15

2.6. Spektrofotometer UV-Vis ....................................................................... 15

2.7. Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) .............................. 16

2.8. Antioksidan ............................................................................................. 18

2.9. DPPH (2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazil) .................................................. 20

BAB III

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................. 22

3.2. Alat dan Bahan Penelitian ....................................................................... 22

3.3. Prosedur Penelitian ................................................................................. 22

3.3.1. Pengambilan Sampel ............................................................................... 22

3.2.2. Determinasi Sampel ................................................................................ 23

3.3.3. Preparasi Sampel ..................................................................................... 23

3.3.4. Pembuatan Ekstrak.................................................................................. 23

3.3.5. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH ............................................... 24

3.3.5.1. Uji Kualitatif Antioksidan dengan KLT ................................................. 24

3.3.5.2. Uji Kuantitatif Antioksidan..................................................................... 24

3.3.6. Isolasi dan Pemurnian Senyawa.............................................................. 26

3.3.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ............................................................ 26

3.3.6.2. Kromatografi Kolom ............................................................................... 26

3.3.6.3. Rekristalisasi ........................................................................................... 27

3.3.7. Penentuan Struktur Molekul Senyawa .................................................... 28

3.3.7.1. GC-MS .................................................................................................... 28

3.3.7.2. 1H-NMR .................................................................................................. 28

BAB IV

4.1. Preparasi Sampel ..................................................................................... 29

4.2. Ekstraksi .................................................................................................. 29

4.3. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH .................................................. 30

4.4. Isolasi Senyawa Murni ............................................................................ 35

4.5. Penentuan Struktur Senyawa .................................................................. 39

4.5.1. GC-MS .................................................................................................... 39

4.5.2. Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) ........................................... 39

xii

4.6. Uji Kemurnian Senyawa dengan KLT Dua Dimensi ............................. 41

BAB V

5.1. Kesimpulan ............................................................................................. 42

5.2. Saran ....................................................................................................... 42

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 43

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees .............................. 5

Gambar 2.2. Reaksi Penghambatan Antioksidan Primer terhadap Radikal Lipida

................................................................................................................................ 18

Gambar 2.3. Antioksidan Bertindak sebagai Prooksidan pada Konsentrasi Tinggi

................................................................................................................................ 19

Gambar 2.4. Reaksi DPPH dengan Antioksidan ................................................. 20

Gambar 3.1. Sampel Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ............... 22

Gambar 4.1. KLT Ekstrak Metanol ..................................................................... 31

Gambar 4.2. KLT Ekstrak Etil Asetat ................................................................. 31

Gambar 4.3. KLT Ekstrak n-Heksana ................................................................. 31

Gambar 4.4. Bagan Kromatografi Kolom Ekstrak Metanol ................................ 36

Gambar 4.5. Uji Kualitatif Antioksidan terhadap Fraksi A-J .............................. 37

Gambar 4.6. Bagan Kromatografi Kolom Fraksi B ............................................ 37

Gambar 4.7. KLT Fraksi B Vial Nomor 30-36 ................................................... 38

Gambar 4.8. KLT Senyawa B3036 ..................................................................... 38

Gambar 4.9. Spektrum 1H-NMR Senyawa B3036 .............................................. 41

Gambar 4.10. KLT Dua Dimensi ......................................................................... 41

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. Rendemen Ekstrak ............................................................................... 30

Tabel 4.2. Indeks Aktivitas Antioksidan ............................................................. 33

Tabel 4.3. Uji Kuantitatif Antioksidan terhadap Ekstrak .................................... 34

Tabel 4.4. Uji Kuantitatif Antioksidan terhadap Vitamin C ............................... 35

Tabel 4.5. Bobot Fraksi A-J ................................................................................ 36

Tabel 4.6. Karakteristik Senyawa B3036 ............................................................ 39

Tabel 4.7. Pergeseran Kimia 1H pada Senyawa Organik .................................... 40

Tabel 4.8. Tabel Pergeseran Kimia Senyawa B3036 .......................................... 40

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi Sampel ............................................................. 59

Lampiran 2. Bagan Alur Kerja ........................................................................... 60

Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Ekstrak ...................................................... 61

Lampiran 4. Panjang Gelombang Maksimum DPPH ......................................... 62

Lampiran 5. Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji

Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Marchantia

emarginata ...................................................................................... 63


Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etil Asetat Marchantia

emarginata ...................................................................................... 64


Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana Marchantia

emarginata ...................................................................................... 65

Lampiran 8. Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks Aktivitas

Antioksidan (AAI) ......................................................................... 66

Lampiran 9. KLT Hasil Kromatografi Kolom Ekstrak Metanol ......................... 68

Lampiran 10. KLT Hasil Kromatografi Kolom Fraksi B .................................... 71

Lampiran 11. Spektrum GC-MS Senyawa B3036 ............................................... 73

Lampiran 12. Spektrum 1H-NMR Senyawa B3036 ............................................ 74

xvi

DAFTAR SINGKATAN

1H-NMR 1H- Nuclear Magnetic Resonance (Resonansi Magnetik Inti

Proton)

AAI Antioxidant Activity Index (Indeks Aktivitas Antioksidan)

B3036 Hasil Kromatografi Kolom Fraksi B, vial No. 30-36

BHT Butylated hydroxytoluene

CDCl3 Deuterium Kloroform

DPPH 2,2 Diphenyl, 1-Picrylhydrazil

GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectroscopy

IC50 50% Inhibitory Concentration (Konsentrasi Hambat 50%)

KLT Kromatografi Lapis Tipis

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Resonansi Magnetik Inti)

PPM Parts Per Million

Rf Retardation Factor

δH Pergeseran Kimia Proton

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Allah SWT telah menciptakan bumi beserta isinya dengan sebaik-baiknya

seperti yang telah disebutkan dalam Qur’an, surat Al-Baqarah (2) ayat 29 yang

artinya “ Dia-lah Allah, yang menjadikan segala yang ada di bumi untuk kamu dan

Dia berkehendak (menciptakan) langit, lalu dijadikan-Nya tujuh langit dan Dia

Maha mengetahui segala sesuatu.” Allah SWT menciptakan bumi beserta isinya

agar bermanfaat bagi manusia, maka sebagai makhluk ciptaannya hendaklah kita

memanfaatkannya sebaik-baiknya. Salah satunya dengan mempelajari dan terus

mengeksplorasi sumber daya alam yang ada.

Kawasan hutan Indonesia umumnya merupakan hutan hujan tropis. Hutan

hujan tropis terkenal dengan keanekaragaman flora termasuk di dalamnya jenis

Bryophyta (lumut) (Windadri, 2009). Indonesia memiliki penyebaran lumut yang

sangat besar, tetapi informasi tersebut masih belum tereksplorasi secara penuh

sehingga pengetahuan mengenai lumut di Indonesia masih kurang, termasuk

potensi pada komponen bioaktif yang terkandung pada lumut (Fadhilla, 2010).

Lumut (Bryophyta) menurut Polunin (1990) merupakan salah satu

tumbuhan tingkat rendah yang hidup di lingkungan lembab. Habitat lumut secara

umum terdapat pada batang pohon, kayu lapuk, batuan dan tanah. Lumut memiliki

24,000 spesies dan dikelompokan menjadi 960 genus. Lumut diklasifikasikan

menjadi tiga kelas yaitu lumut sejati (Musci), lumut hati (Hepaticae), lumut tanduk

(Anthocerotae). Lumut hati terbagi dua subkelas yaitu Jungermanniidae dan

Marchantiidae dan 6 ordo, 49 famili, 130 genus dan 6.000 spesies (Asakawa, dkk.,

2009).

Lumut telah banyak digunakan sebagai tanaman obat di Cina, untuk

menyembuhkan luka bakar, memar, luka luar, gigitan ular, TBC paru, fraktur,

kejang, melepuh, uropati, pneumonia, dan antipiretik (Xiao, 2006; Asakawa, 2012;

Ludwiczuk et al, 2008). Salah satu jenis lumut yang banyak ditemukan di Indonesia

adalah lumut hati. Lumut hati banyak ditemukan di Borneo, Sumatra dan Papua

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Nugini tepatnya di hutan hujan (Asakawa, dkk., 2009). Dilaporkan lumut hati

mengandung senyawa lipofilik monoterpenoid, sesquiterpenoid, dan diterpenoid,

senyawa aromatik (bibenzyl, bis-benzyl, benzoat, sinamat, alkil fenol rantai

panjang, naftalen, isokumarin) dan asetogenin (Asakawa, dkk., 2009). Lumut hati

ini dapat dijadikan penuntun untuk pengembangan obat baru.

Salah satu filum dari lumut hati yaitu Marchantiophyta (Glime, 2013).

Marchantiophyta minyak tubuh yang menghasilkan terpenoid seperti

monoterpenoid, sesquiterpenoid, dan diterpenoid. Marchantiophyta umumnya

memiliki glikosida flavonoid (Glime, 2013). Dilaporkan bahwa beberapa

Marchantiophyta memiliki beragam aktivitas biologis seperti aktivitas sitotoksik,

antibakteri, antijamur, relaksasi otot, dan kardiotonik. Senyawa yang bertanggung

jawab atas aktivitas ini adalah marchantin A (Asakawa, dkk., 2009).

Asakawa, dkk telah berhasil mengisolasi riccardin F dan marchantin A dari

Marchantia tosana. Marchantin A–G telah berhasil diisolasi dari Marchantia sp.,

marchantin C dimetill ether, marchantin J–N, isomarchantin C dan isoriccardin C

juga telah diisolasi dari spesies Marchantia yang berbeda (Asakawa, dkk., 2000).

Huang, dkk. pada tahun 2009 melaporkan bahwa marchantin A yang diisolasi dari

Marchantia emarginata subsp. tosana di Taiwan menunjukan pontensi

menginduksi apoptosis pada sel kanker payudara manusia MCF-7 dengan IC50 4.0

µg/mL dan aktivitas antioksidan dengan IC50 20.0 µg/mL.

Antioksidan merupakan senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu

atau lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat

diredam (Suhartono, 2002). Radikal bebas ini cenderung mengadakan reaksi

berantai yang apabila terjadi di dalam tubuh akan dapat menimbulkan kerusakan-

kerusakan yang berlanjut dan terus-menerus (Sri, dkk., 2013). Stres oksidatif yang

diinduksi oleh radikal bebas diketahui dapat mempengaruhi terjadinya berbagai

penyakit degeneratif seperti kanker, penyakit kardiovaskular, arterosklerosis dan

katarak (Sri, dkk., 2013 ; Grassman, 2005).

Senyawa seperti terpenoid dan polifenol memiliki spektrum antioksidan

yang luas. Grassman menyatakan bahwa beberapa penelitian yang mempelajari

aktivitas antioksidan dari monoterpenoid dan diterpenoid atau minyak esensial

secara in vitro, hasilnya ditemukan antioksidan yang sangat efektif (Grassman,

3


2005). Lumut hati (Marchantia sp.) yang mengandung terpenoid berpotensi sebagai

antioksidan alami. Salah satu cara untuk menentukan aktivitas antioksidan yaitu

dengan metode DPPH (2,2-difenil-1, pikrilhidrazil). Metode ini dipilih karena

prosedur kerjanya yang sederhana, waktu pengerjaan yang relatif cepat dibanding

metode lain dan memiliki sensitivitas yang baik (Locatelli, dkk., 2009).

1.2. Batasan dan Rumusan Masalah

Dari hasil penelusuran pustaka diketahui bahwa belum ada penelitian

mengenai isolasi terhadap kandungan senyawa kimia dari Marchantia emarginata

Reinw., Blume & Nees yang tumbuh di Indonesia. Dengan latar belakang tersebut

dilakukanlah penelitian untuk mengisolasi senyawa dari fraksi aktif antioksidan

yang terdapat dalam tumbuhan lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume

& Nees yang tumbuh di Indonesia.

1.3. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan isolasi metabolit sekunder

dari ekstrak aktif antioksidan Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

1.4. Manfaaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah dapat diketahui apa

komponen kimia yang terdapat pada tumbuhan lumut hati Marchantia emarginata

Reinw., Blume & Nees yang tumbuh di Indonesia. Selain itu juga dapat melengkapi

data penelitian bahan alam, mengingat laporan mengenai tumbuhan lumut hati

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees masih terbatas.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Lumut (Bryophyta)

2.1. 1. Habitat Lumut

Lumut merupakan kelompok tumbuhan kecil yang tumbuh menempel pada

substrat berupa pohon, kayu mati, kayu lapuk, serasah, tanah dan batuan dengan

kondisi lingkungan lembab, dan penyinaran yang cukup. Di dalam kehidupannya,

faktor lingkungan sangat berpengaruh, seperti iklim yang lebih berpengaruh pada

pertumbuhan dan pekembangan lumut. Selain itu, dilaporkan satu pohon

merupakan habitat komplek bagi lumut. Perlekatan dan ketahanan hidupnya pada

pohon akan dipengaruhi oleh karakter perubahan kulit kayu dari ranting yang

termuda hingga cabang yang tua. Demikian juga dengan intensitas cahaya yang

sampai pada permukaan pohon tersebut (Hasan & Ariyanti 2004).

2.1. 2. Klasifikasi Lumut

Divisi Bryophyta terdiri dari 4 kelas yaitu Bryopsida (Musci),

Anthoceropsida (Anthoceroptae), Hepaticopsida (Hepaticae), Takakiopsida.

Hepaticopsida dikenal sebagai lumut hati. Gametofit lumut hati mempunyai

struktur morfologi bervariasi. Ada 2 tipe lumut hati yaitu lumut hati bertalus

(thallose liverwort) dan lumut hati berdaun (leafy liverwort). Lumut hati melekat

pada substrat dengan rhizoid uniselluler (Hasan dan Ariyanti, 2004).

Anthoceropsida atau lumut tanduk mempunyai gametofit bertalus dengan

sporofit indeterminate dan berklorofil. Berbeda dengan bryophyta lainnya, sel-sel

talus Anthocerpsida mempunyai satu kloroplas besar pada masing-masing selnya.

Kapsul berbentuk silindris memanjang dimulai dari bagian ujung kapsul (Hasan dan

Ariyanti, 2004).

Bryopsida dikenal sebagai lumut daun atau lumut sejati, merupakan kelas

yang terbesar dalam bryophyta. Hampir semua anggotanya mempunyai gametofit

5


yang telah terdiferensiasi sehingga dapat dibedakan bentuk-bentuk seperti batang,

cabang dan daun. Sporofit bryopsida berumur panjang, berwarna kecokelatan

terdiri atas kaki yang berfungsi untuk menyerap nutrien dari gametofit, dan kapsul

yang disangga oleh suatu tangkai disebut seta. Spora masak dibebaskan dari kapsul

setelah operculum (struktur semacam tutup pada kapsul) membuka secara perlahan-

lahan melalui satu atau dua baris gigi-gigi yang disebut peristom (Hasan dan

Ariyanti, 2004).

2.2. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

2.2.1. Klasifikasi

Secara taksonomi, Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

diklasifikasikan sebagai berikut (Goffinet & Shaw, 2009)

Gambar 2.1. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

(Sumber : Koleksi pribadi, 2016)

Kingdom : Plantae

Filum : Marchantiophyta

Kelas : Marchantiopsida

Ordo : Marchantiales

Famili : Marchantiaceae

Genus : Marchantia

Spesies : Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

6


2.2.2. Deskripsi

Marchantia sp. memiliki tubuh gematofit haploid yang biasa disebut dengan

talus. Talus berwarna hijau, dorsiventral dan bercabang dua. Talus dewasa

memiliki panjang beragam sekitar 2-10 cm dan lebar sekitar 0,5-3 cm. Permukaan

dorsal menebal di tengah secra luas, gelap yang kemudian membentuk poligonal

atau area yang disebut areoles atau areolae. Pori udara terletak pada bagian tengah

setiap areole. Pada permukaan dorsal talus, terdapat struktur seperti piala kecil

disebut gemma-cup yang bertanggung jawab untuk multiplikasi vegetatif (Kumar,

dkk., 2015).

Rizoidnya tumbuh uniselular dan biasanya tidak berwarna atau coklat pucat.

Terdapat dua tipe rhizoid yaitu rhizoid dengan dinding halus dan rizoid tuberculate.

Rizoid dengan dinding halus lebih lebar dengan dinding halus dan tipis yang

membantu penyerapan air dan mineral dari tanah. Sedangkan rizoid tuberculate

memiliki dinding tebal., biasanya membentuk sistem konduksi kapiler untuk

membantu air mencapai area penyerapan pada talus (Kumar, dkk., 2015).

2.2.3. Habitat dan Distribusi

Marchantiophyta (liverwort) terdapat dua subkelas yaitu Jungermanniidae

dan Marchantiidae dan 6 ordo, 49 famili, 130 genus dan 6.000 spesies. Terdapat 54

genus endemik di negara bagian selatan bumi seperti New Zealand dan Argentina.

Di Asia telah tercatat terdapat genus endemik dalam jumlah yang besar

dibandingkan Afrika Selatan, Madagaskar dan Amerika Utara. Pada negara tropis

seperti Borneo, Sumatra dan Papua Nugini, terdapat banyak hutan hujan yang

merupakan tempat banyak ditemukannya liverworts (Asakawa, dkk., 2009).

2.2.4. Kandungan Kimia

Hampir semua liverworts kandungan utamanya adalah lipofilik

monoterpenoid, sesquiterpenoid, dan diterpenoid, senyawa aromatik (bibenzyl, bis-

benzyl, benzoat, sinamat, alkil fenol rantai panjang, naftalen, isokumarin) dan

asetogenin. Thalloid liverworts tidak hanya mengandung marchantin A, marchantin

7


B, marchantin D dan marchantin E tetapi juga mengandung bis-benzil asiklik,

perrottetin F dan paleatin B (Asakawa, dkk., 2009)

2.2.5. Aktivitas Biologis

Asakawa, dkk., melaporkan bahwa marsupellone dan acetoxymarsupellone

dari Marchantia emarginata di Jepang menunjukan aktivitas sitotoksik (ID50 1

µg/ml) terhadap P388. Marchantin A menunjukan aktivitas kardiotonik

(meningkatkan aliran darah koroner 2,5 ml/menit pada 0,1 mg). Marchantin A dari

berbagai spesies Marchantia, menunjukan aktivitas antibakteri terhadap

Acinetobacter calcoaceticus (MIC 6,25 µg/ml), Bacillus cereus (MIC 12,5 µg/ml),

Bacillus Subtilis (MIC 25 µg/ml), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonela typhimurium (MIC 100 µg/ml) dan Staphylococcus aureus (MIC 25

µg/ml). Marchantin A juga menunjukan aktivitas antijamur terhadap Aspergillus

fumigatus (MIC 100 µg/ml), Aspergillus niger (MIC 25-100 µg/ml), Candida

albicans (MIC 100 µg/ml), Penicillium chrysogenum (MIC 100 µg/ml),

Saccharomyces cerevisae (MIC 100 µg/ml) (Asakawa, 2007).

2.3. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif

dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut disiapkan dan

massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku

yang ditetapkan (Depkes RI, 1995). Ekstraksi merupkan pemisahan senyawa aktif

dari jaringan tumbuhan maupun hewan dengan menggunakan pelarut selektif

berdasarkan standar prosedur.

Parameter yang mempengaruhi kualitas dari ekstrak, meurut Tiwari, dkk.,

adalah bagian dari tumbuhan yang digunakan, pelarut yang digunakan untuk

ekstraksi dan prosedur ekstraksi. Selama proses ekstraksi, pelarut akan berdifusi

sampai ke material padat dari tumbuhan dan akan melarutkan senyawa dengan

polaritas yang sesuai dengan pelarutnya. Efektivitas ekstraksi senyawa kimia dari

tumbuhan bergantung pada bahan-bahan tumbuhan yang diperoleh, proses

ekstraksi dan ukuran partikel (Tiwari, 2011). Beberapa metode ekstraksi dengan

8


menggunakan pelarut dibagi menjadi dua cara, yaitu cara panas dan cara dingin

(Depkes RI, 2000).

2.3.1. Ekstraksi Cara Dingin

1. Maserasi

Pada maserasi, seluruh simplisia bersentuhan dengan pelarut dalam wadah

tertutup selama periode tertentu dengan beberapa kali diguncang hingga zat terlarut.

Metode ini sangat baik untuk senyawa yang termolabil (Tiwari, 2011).

2. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi

penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses

perkolasi terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap

perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus-menerus sampai

diperoleh ekstrak (perkolat) (Depkes RI, 2000).

2.3.2. Ekstraksi Cara Panas

1. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya

selama waktu tertentu dan dalam jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan

dengan adanya pendinginan balik (Depkes RI, 2000).

2. Digesti

Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada temperatur yang

lebih tinggi dari temperatur kamar yaitu pada 40-50oC (Depkes RI, 2000).

3. Soklet

Ekstraksi dengan soklet dibutuhkan jika senyawa yang diinginkan memiliki

kelarutan yang terbatas pada pelarut dan pengotornya tidak larut dengan pelarut.

Jika komponen yang diinginkan memiliki kelarutan yang tinggi di dalam pelarut

maka filtrasi dapat dilakukan untuk memisahkan komponen dari substansi tak larut.

Metode ini tidak dapat digunakan untuk komponen termolabil dikarenakan

pemanasan dapat memicu komponen terdegradasi (Tiwari, 2011).

9


2.4. Pelarut

Keberhasilan determinasi komponen aktif biologis dari tumbuhan menurut

Tiwari sangat bergantung pada pelarut yang digunakan pada prosedur ekstrasi.

Karakteristik pelarut yang baik adalah toksisitas rendah, mudah menguap pada

pemanasan rendah, berperan sebagai pengawet, tidak menyebabkan ekstrak

membentuk kompleks atau terdisosiasi. Faktor yang mempengaruhi pemilihan

pelarut yaitu fitokimia yang ingin diekstraksi, kecepatan ekstraksi, keanekaragaman

komponen yang terekstraksi, mudah untuk penanganan dalam proses selanjutnya,

toksisitas pelarut pada proses bioassay dan potensi bahaya kesehatan dari

ekstraktan (Tiwari, 2011).

1. Metanol

Metanol menurut Thompson (1985) merupakan pelarut yang bersifat

universal sehingga dapat melarutkan analit yang bersifat polar dan nonpolar.

Metanol dapat menarik alkaloid, steroid, saponin, dan flavonoid dari tanaman.

(Astarina, 2013)

2. Etil Asetat

Etil asetat merupakan pelarut dengan karekateristik semipolar. Etil asetat

secara selektif akan menarik senyawa yang bersifat semipolar seperti fenol dan

terpenoid (Pranoto, dkk., 2012).

3. n-Heksana

n-Heksana mempunyai karakteristik sangat tidak polar, volatile,

mempunyai bau khas yang dapat menyebabkan pingsan. Berat molekul heksana

adalah 86,2 gram/mol dengan titik leleh -94,3°C sampai -95,3°C. Titik didih

heksana pada tekanan 760 mmHg adalah 66°C sampai 71°C (Daintith, 1994). n-

Heksana biasanya digunakan sebagai pelarut untuk ekstraksi minyak nabati.

2.5. Kromatografi

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunkan teknik kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu

campuran berdasarkan perbedaan migrasi analit diantara dua fase, yaitu fase diam

10


dan fase gerak, dimana fase diamnya dapat berupa zat padat atau zat cair dan fase

geraknya dapat berupa gas atau zat cair (Sudjadi, 1985).

Prinsip pemisahan kromatografi berdasarkan Sudjadi (1985) yaitu adanya

distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan sifat

fisik komponen yang akan dipisahkan. Pada dasarnya semua cara kromatografi

menggunakan dua fase, yaitu fase diam (stationer) dan fae gerak (mobile). Teknik

kromatografi ada empat yaitu kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis

(KLT). Kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi kinerja tinggi (KCKT)

(Harborne, 1987).

Adrianingsih (2009) menyatakan persyaratan utama kromatografi yaitu ada

fase diam dan fase gerak (fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase gerak),

komponen sampel harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi dengan fase diam,

fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam harus

terikat kuat di posisinya.

2.5.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan fisika,

kimia dan kromatografi cair paling sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca

atau plat aluminium yang dilapisi silika gel dan menggunakan pelarut tertentu

(Harborne, 1987). Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform)

pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat alumunium

atau plat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini adalah bentuk terbuka

dari kromatografi kolom (Gritter, dkk., 1991).

Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT

merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik

yang memiliki tingkat polaritas tertentu, mampu melarutkan senyawa, dan tidak

bereaksi dengan adsorban (Gritter, dkk., 1991). Adsorban yang bisa digunakan

sebagai fase diam pada kromatografi lapis tipis antara lain Gel silika G, Gel silika

GF254, Kieselguhr (mengandung pengikat kalsium sulfat sebagai penyangga)

(Watson, 2009).

11


Pemisahan pada KLT akan optimal jika sampel ditotolkan dengan ukuran

bercak sekecil dan sesempit mungkin. Setelah sampel ditotolkan pada lempeng

KLT, tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel tersebut dalam suatu

bejana kromatografi (chamber) yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase

gerak). Selama proses pengembangan, bejana kromatografi harus tertutup rapat.

Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Jumlah volume fase gerak harus

mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan.

Setelah lempeng terelusi, dilakukan deteksi bercak (Gandjar dan Rohman, 2007).

Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai Retardation

factor (Rf). Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh

zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak (Gandjar dan Rohman,

2007). Ada beberapa kemungkinan cara mendeteksi senyawa tidak berwarna pada

kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan

penyerapan di daerah UV gelombang pendek (radiasi utama kira-kira 254 nm) atau

jika senyawa itu dapat dieksitasi ke fluoresensi radiasi UV gelombang pendek dan

gelombang panjang (365 nm). Pada senyawa yang mempunyai dua ikatan rangkap

atau lebih dan senyawa aromatik seperti turunan benzena, mempunyai serapan kuat

± di daerah 230-300 nm (Stahl, 1985).

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai

hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem

pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom

(Gritter, dkk., 1991). Keuntungan KLT yaitu karena tingkat kesensitifannya sangat

besar dan jumlah sampel lebih sedikit.

2.5.2. KLT Preparatif

Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang

memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar.

Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar

pemakainya hanya dalam jumlah miligram. KLTP bersama-sama dengan

kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi

mengenai isolasi bahan alam (Hostettmann, 2006).

12


Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada KLTP

adalah sekitar 0,5-2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x

40 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi

jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penjerap yang paling umum

digunakan ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil

maupun campuran senyawa hdrofil (Hostettmann, 2006).

Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan

pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri (heksana, diklorometana,

etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi

cuplikan harus sekitar 5%-10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus

sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita (Hostettmann,

2006).

Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat

menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang

dengan bantuan kertas saring yang diletakkan berdiri disekeliling permukaan

bagian dalam bejana (Hostettmann, 2006). Kebanyakan Penjerap KLT preparatif

mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita yang

terpisah pada senyawa yang menyerap sinar ultraviolet (Hostettmann, 2006).

2.5.3. Kromatografi Kolom

Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar adalah

menggunakan kromatografi kolom. Pada kromatografi kolom fasa diam yang

digunakan dapat berupa silika gel, selulosa atau poliamida. Sedangkan fasa

geraknya dapat dimulai dari pelarut non-polar kemudian ditingkatkan kepolarannya

secara bertahap, baik dengan pelarut tungal ataupun kombinasi dua pelarut yang

berbeda kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat kepolaran yang

dibutuhkan (Stahl, 1969).

Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung dan dimonitor

dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram

yang sama digabung kemudian pelarutnya diuapkan sehingga akan diperoleh

13


beberapa fraksi. Noda pada plat KLT dideteksi dengan lampu ultraviolet pada

panjang gelombang 254 nm atau 366 nm untuk senyawa-senyawa yang mempunyai

gugus kromofor (Stahl,1969).

Senyawa hasil isolasi sulit didapatkan berupa senyawa murni karena terdiri

dari banyak senyawa gabungan. Untuk senyawa berbentuk kristal pemurniannya

dapat dilakukan dengan rekristalisasi, yaitu berdasarkan perbedaan kelarutan antara

zat utama yang dimurnikan dengan senyawa minor dalam suatu pelarut tunggal atau

campuran pelarut yang cocok (Stahl, 1969).

2.5.3.1. Sephadex

Filtrasi gel dapat digunakan untuk purifikasi protein dan DNA. Filtrasi gel

merupakan metode yang mudah digunakan untuk pemisahan molekul dengan

ukuran molekul yang berbeda. Molekul yang lebih besar akan keluar kolom lebih

dahulu dibanding molekul yang lebih kecil.

Sephadex merupakan cross linked berpori agarosa dengan ikatan kovalen.

Medianya memiliki stabilitas fisik yang tinggi, karena cross linked dari matrix

agarosa. Kestabilan dari sephadex membuatnya cocok untuk digunakan untuk

kolom. Kolom filtrasi gel Sephadex G stabil pada pH 3–12.

Filrasi gel sephadex dapat memisahkan biomolekul dari kontaminan seperti

garam dan pewarna. Sephadex dipreparasi dengan menyambungsilangkan dekstran

dengan epiklorohidrin. Perbedaan tipe sephadex beragam berdasarkan derajat

sambung silang, derajat swelling dan selektivitas untuk ukuran molekul spesifik

(Amersham Pharmacia Biotech AB, 1998)

2.5.3.2. Rekristalisasi

Rekristalisasi merupakan metode yang sangat penting untuk pemurnian

komponen larutan organik. Ada tujuh metode dalam rekristalisasi yaitu memilih

pelarut, melarutkan zat terlarut, menghilangkan warna larutan, memindahkan zat

padat, mengkristalkan larutan, mengumpul dan mencuci kristal, mengeringkan

produknya (Williamson, 1999).

14


Rekristalisasi adalah pemurnian suatu zat padat dari campuran atau

pengotornya dengan cara mengkristalkan kembali zat tersebut setelah dilarutkan

dalam pelarut yang cocok. Prinsip rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara

zat yang akan dimurnikan dengan kelarutan zat pencampur atau pencemarnya.

Larutan yang terjadi dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat yang

diinginkan dikristalkan dengan cara menjenuhkannya. Proses kristalisasi adalah

kebalikan dari proses pelarutan (Anita, 2011).

Mula-mula molekul zat terlarut membentuk agregat dengan molekul

pelarut, lalu terjadi kisi-kisi diantara molekul zat terlarut yang terus tumbuh

membentuk kristal yang lebih besar diantara molekul pelarutnya, sambil

melepaskan sejumlah energi. Kristalisasi dari zat akan menghasilkan kristal yang

identik dan teratur bentuknya sesuai dengan sifat kristal senyawanya. Dan

pembentukan kristal ini akan mencapai optimum bila berada dalam kesetimbangan.

Senyawa dilarutkan kedalam pelarut yang sesuai kemudian dipanaskan sampai

semua senyawanya larut sempurna.. Pemanasan hanya dilakukan apabila senyawa

tersebut belum atau tidak larut sempurna pada keadaan suhu kamar (Anita, 2011).

Salah satu faktor penentu keberhasilan proses kristalisasi dan rekristalisasi

adalah pemilihan zat pelarut. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam memilih

pelarut yang sesuai yaitu pelarut tidak hanya bereaksi dengan zat yang akan

dilarutkan, elarut hanya dapat melarutkan zat yang akan dimurnikan dan tidak

melarutkan zat pencemarnya, titik didih pelarut harus rendah (hal ini akan

mempermudah pengeringan kristal yang terbentuk), titik didih harus lebih rendah

dari titik leleh zat yang akan dimurnikan agar zat tersebut tidak terurai (Anita,

2011).

Ukuran kristal yang terbentuk selama pengendapan, tergantung pada dua

faktor penting yaitu laju pembentukan inti (nukleasi) dan laju pertumbuhan kristal.

Jika laju pembentukan inti tinggi, banyak kristal yang akan terbentuk, tetapi tidak

besar, jadi terbentuk endapan yang terdiri dari partikel-partikel kecil (Svehla, 1979).

Laju pembentukan inti tergantung pada derajat lewat jenuh dari larutan.

Semakin tinggi derajat lewat jenuh, semakin besar kemungkinan untuk membentuk

15


inti baru, jadi semakin besar laju pembentukan inti. Laju pertumbuhan kristal

merupakan faktor lain yang mempengaruhi ukuran kristal yang terbentuk selama

pengendapan berlangsung. Jika laju ini tinggi, kristal-kristal yang besar akan

terbentuk (Svehla, 1979).

2.5.4. GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectroscopy)

Kromatografi gas dan spektrofotometri massa dapat digunakan untuk

memisahkan komponen dengan memberikan waktu retensi dan puncak elusi yang

dapat dimasukkan ke dalam spektrofotometer massa untuk memperoleh berat

molekul, karakteristik dan informasi fragmentasi (Heinrich, 2004). Teknik ini juga

dapat digunakan untuk komponen yang polar (senyawa yang larut dalam air) seperti

polihidroksil alkaloid jika dibuat turunannya dengan komponen yang sesuai

(trimetilsilil klorida) untuk meningkatkan volatilitasnya (Heinrich, 2004).

Kromatografi gas saat ini merupakan metode analisa yang penting dalam

kimia organik untuk menentukan senyawa tunggal dalam campuran.

Spektrofotometri massa sebagai metode deteksi yang memberikan data bermakna,

yang diperoleh dari penentuan langsung molekul zat atau fragmen (Heinrich, 2004).

2.6. Spektrofotometer UV-Vis

Serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang sangat encer

dengan pembanding blanko pelarut serta menggunakan spektrofotometer yang

merekam otomatis. Senyawa tidak berwarna diukur pada jangka 200-400 nm,

senyawa berwarna pada jangka 200-700 nm. Prinsip kerja spektrofotometer UV-

Vis adalah interaksi sinar ultraviolet atau tampak dengan molekul sampel. Energi

cahaya akan mengeksitasi elektron terluar molekul ke orbital lebih tinggi

(Harborne, 1987).

Pada kondisi ini, elektron tidak stabil dan dapat melepas energi untuk

kembali ke tingkat dasar, dengan disertai emisi cahaya. Besarnya penyerapan

cahaya sebanding dengan molekul, sesuai dengan hukum lambert-Beer (Day &

Underwood, 1980).

16


A= ɛ B C

Keterangan

A : Serapan/absorbansi

ɛ : Absortivitas molar

B : Tebal kuvet

C : Konsentrasi komponen

Sumber radiasi pada spektrofotometer UV-Vis berdasarkan panjang

gelombang terbagi menjadi dua, yaitu lampu deuterium dan tungstent. Lampu

deuterium menghasilkan sinar 160-500 nm. Lampu tungstent digunakan di daerah

sinar tampak 350-3500 nm. Sumber radiasi dikatakan ideal jika memancarkan

spektrum radiasi yang kontinyu, intensitasnya tinggi dan stabil pada semua panjang

gelombang.

2.7. Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Karakterisasi yang dilakukan terhadap senyawa murni adalah dengan

menggunakan alat spektrometer resonansi magnet inti proton (1H-NMR).

Spektrometri resonansi magnet inti proton (1H-NMR) merupakan alat yang berguna

pada penentuan struktur molekul organik. Spektrometri resonansi magnetik inti

proton (1H-NMR) didasarkan pada pengukuran absorbsi radiasi elektromagnetik

pada daerah frekuensi radio 4-600 MHz atau panjang gelombang 75-0,5 m, oleh

partikel (inti atom) yang berputar di dalam medan magnet. Teknik ini memberikan

informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul (Harbone, 1987).

Spektrum 1H-NMR memberikan informasi mengenai lingkungan dan

struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen (Harbone, 1987).

Sedangkan spektrometri resonansi magnetik isotop karbon 13 (13C-NMR)

digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom

karbon pada senyawa tersebut (Sudjadi, 1985). Spektrometer (1H-NMR) biasanya

ditentukan dari larutan substansi yang akan dianalisis. Untuk itu pelarut yang

digunakan tidak boleh mengandung atom hidrogen karena akan mengganggu

puncak spektrum.

17


Ada dua cara untuk mencegah ganggguan oleh pelarut. Pertama dapat

digunakan pelarut seperti tetraklormetana, CCl4 yang tidak mengandung hidrogen

atau pelarut yang atom hidrogennya telah diganti dengan isotopnya yaitu deuterium,

sebagai contoh CDCl3. Atom-atom deuterium mempunyai sifat megnetik yang

sedikit berbeda dengan hidrogen, sehingga mereka akan menghasilkan puncak pada

area spektrum yang berbeda (Sudjadi, 1985).

Terbentuknya sinyal-sinyal terjadi karena perbedaan lingkungan kimia dari

atom hidrogen. Perbedaan kedudukan tersebut akan memberikan frekuensi

resonansi yang berbeda. Perbedaan dalam kurva sinyal 1H-NMR dikenal sebagai

geseran kimia. Definisi dari geseran kimia adalah rasio antara kekuatan

perlindungan terhadap inti dengan medan terapan yang digunakan. Semakin kecil

frekuensi resonansinya, semakin besar kerapatan elektronnya, semakin kecil pula

pergeseran kimia proton tersebut. Sebaliknya semakin besar frekuensi

resonansinya, semakin kecil kerapatan elektronnya, semakin besar pergeseran

kimia poton tersebut (Silverstein, Basseler dan Morrill, 1991).

Adapun faktor yang mempengaruhi pergeseran kimia adalah faktor induktif,

faktor anisotropik, faktor sterik, ikatan hidrogen dan pealrut yang dipakai. Selain

dipakai untuk menentukan kedudukan proton-proton, 1H-NMR dapat menentukan

perbandingan jumlah relatif proton-proton tersebut yaitu dengan mengukur

intensitas dari sinyal-sinyal proton dengan alat integrator yang ada pada 1H-NMR

(Silverstein, Basseler dan Morrill, 1991).

Langkah yang dilakukan dalam menginterpretasikan kurva spektrum 1H-

NMR adalah jumlah sinyal menggambarkan seberapa banyak jenis proton yang

berada pada molekul analit. Kedudukan sinyal menggambarkan jenis lingkungan

kimia tempat proton tersebut berada. Intensitas sinyal menggambarkan jumlah dari

proton pada lingkungan kimia tertentu. Pemecahan puncak (splitting)

menggambarkan lingkungan kimia proton lainnya yaitu proton yang berdekatan

(bertetangga) (Silverstein, Basseler dan Morrill, 1991).

18


2.8. Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa-senyawa yang dapat mendonorkan satu atau

lebih atom hidrogen. Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat

atau mencegah terjadinya oksidasi (Schuler, 1990). Senyawa antioksidan biasanya

digunakan untuk mencegah kerusakan yang dapat ditimbulkan oleh senyawa

radikal bebas. Zat oksidan atau lebih dikenal senyawa radikal bebas merupakan

atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil (mempunyai satu atau lebih

elektron tanpa pasangan) sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa

ini sangat reaktif dan merusak jaringan. Dengan adanya senyawa antioksidan,

senyawa radikal bebas yang tadinya sangat tidak stabil dan bersifat merusak sel

tubuh dapat menjadi stabil dan kerusakan sel tubuh dapat dicegah (Sri, dkk., 2013).

Radikal bebas dipercaya berkontribusi banyak pada penyakit manusia,

terutama penyakit-penyakit kronis dan hubungannya dengan proses penuaan.

Beberapa penyakit yang dapat timbul karena adanya radikal bebas antara lain

kanker, atherosclerosis termasuk penyakit serangan jantung koroner, stroke,

arthritis, parkinson, alzheimer, katarak, serta berbagai kasus penuaan dini (Sri, dkk.,

2013).

Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut

sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara

cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil,

sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil

dibanding radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan,

yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar

mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke

bentuk yang lebih stabil (Gordon, 1990).

Gambar 2.2. Reaksi Penghambatan Antioksidan Primer Terhadap Radikal Lipida

(Sumber: Gordon, 1990)

Inisiasi : R* + AH RH + A*

Propagasi : ROO* + AH ROOH + A*

19


Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada

lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak.

Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun

propagasi (Gambar 2.2). Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada

reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat

bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Gordon, 1990).

Besar konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada

laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering

lenyap bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah

konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi dan

sampel yang akan diuji.

Gambar 2.3. Antioksidan Bertindak sebagai Prooksidan pada Konsentrasi Tinggi

(Sumber: Gordon, 1990)

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas daripada

polyunsaturated fatty acid (PUFA), sehingga kecil kemungkinan dalam terjadinya

reaksi berantai yang cepat. Serangan radikal bebas terhadap protein sangat jarang

kecuali bila sangat ekstensif. Hal ini terjadi hanya jika radikal tersebut mampu

berakumulasi (jarang pada sel normal), atau bila kerusakannya terfokus pada daerah

tertentu dalam protein. Salah satu penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein

berikatan dengan ion logam transisi (Droge, 2002).

Seperti pada protein, kecil kemungkinan terjadinya kerusakan di DNA

menjadi suatu reaksi berantai, biasanya kerusakan terjadi bila ada lesi pada susunan

molekul, apabila tidak dapat diatasi, dan terjadi sebelum replikasi maka akan terjadi

mutasi. Radikal oksigen dapat menyerang DNA jika terbentuk disekitar DNA

seperti pada radiasi biologis (Allen, dkk., 2000).

AH + O A* + HOO*

AH + ROOH RO* + H2O + A

20


Antioksidan alami banyak terdapat dalam tanaman pada seluruh bagian dari

tanaman seperti akar, daun, bunga, biji, batang dan sebagainya. Senyawa-senyawa

yang umumnya terkandung dalam antioksidan alami adalah fenol, polifenol, dan

yang paling umum adalah flavonoid (flavonol, isoflavon, flavon, katekin,

flavonon), turunan asam sinamat, tokoferol, dan asam organik polifungsi (Pratt,

dkk., 1990).

2.9. DPPH (2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazil)

DPPH merupakan suatu radikal bebas yang banyak digunakan untuk

pengujian aktivitas antioksidan. Prinsip kerja metode ini adalah pengukuran

aktivitas antioksidan berdasarkan penurunan absorbansi DPPH sebagai akibat dari

adanya suatu senyawa antioksidan. Warna ungu pekat DPPH disebabkan oleh

delokalisasi elektron bebas pada molekulnya. (Pisoschi, dkk., 2009).

Gambar 2.4. Reaksi DPPH dengan Antioksidan

(Sumber: Pisoschi, dkk., 2009)

Metode DPPH merupakan metode yang paling umum digunakan untuk

mengukur aktivitas antioksidan secara in vitro. Keuntungan metode ini antara lain

prosedur kerjanya yang sederhana, waktu pengerjaan yang relatif cepat dibanding

metode lain dan memiliki sensitivitas yang baik. DPPH merupakan senyawa

nitrogen organik yang memiliki karakteristik warna ungu dengan daerah serapan

pada 515-520 nm (Locatelli, dkk., 2009).

Adanya antioksidan sebagai pendonor elektron akan berpasangan dengan

elektron bebas DPPH, menyebabkan turunnya intensitas warna larutan. Turunnya

absorbansi dan intensitas warna sebanding dengan jumlah elektron yang ditangkap

21


oleh antioksidan. Adanya senyawa antioksidan menyebabkan perubahan warna

violet menjadi kuning. Makin kuat senyawa antioksidan, makin jelas perubahan

warna yang terjadi. Perubahan intensitas warna dapat diukur secara

spektrofotometri dan hasilnya dinyatakan sebagai IC50 yaitu jumlah antioksidan

yang diperlukan untuk menghambat 50% aktivitas DPPH (Pisoschi, dkk., 2009).


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2016 hingga bulan Mei 2017.

Penelitian dilakukan di Laboratorium Obat dan Pangan Halal, Laboratorium

Mikrobiologi dan Laboratorium Penelitian II, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan (FKIK), Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan Penelitian

Sampel yang digunakan pada penelitian ini yaitu Marchantia emarginata

yang didapatkan dari Curug Cigamea, Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor,

Jawa Barat. Bahan yang digunakan yaitu n-heksana, Etil Asetat, Metanol, Metanol

Pro Analisa Merck, Bubuk Gel Silika 60 Merck, DPPH Sigma Aldrich, Sephadex

LH-20® Sigma Aldrich, dan L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu rotary evaporator, neraca

analitik, blender, labu ukur, corong pisah, plat KLT, buret, vortex, alat-alat gelas

seperti erlenmayer, gelas beker, gelas ukur, tabung reaksi, spatel, vial dan batang

pengaduk, Spektrofotometer UV-Vis, GC-MS, dan Spektrometer NMR

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1. Pengambilan Sampel

Pengambilan Sampel dilakukan di Curug Cigamea, Kecamatan Ciampea,

Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Pengambilan sampel dilakukan pada tanggal 19

November 2016. Sampel lumut hati yang diambil seperti pada gambar 3.1

Gambar 3.1. Sampel Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

23


3.3.2. Determinasi Sampel

Sebelum dilakukan penelitian, sampel terlebih dahulu dilakukan

determinasi untuk mengidentifikasi sampel yang akan diteliti. Determinasi

dilakukan di Herbarium Bogorience, Puslit Biologi Bidang Botani, LIPI Cibinong.

3.3.3. Preparasi Sampel

Sampel yang telah diambil, dicuci dengan menggunakan air yang mengalir

beberapa kali untuk menghilangkan tanah dan pasir. Sampel kemudian dikeringkan

dengan cara diangin-anginkan. Sampel yang telah dikeringkan kemudian

ditimbang. Didapatkan sampel kering Marchantia emarginata sebanyak 78,91 g.

Sampel kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender.

3.3.4. Pembuatan Ekstrak

Simplisia yang telah disiapkan di maserasi pada botol maserasi. Maserasi

dilakukan dengan menggunakan pelarut dengan tikat kepolaran berbeda. Pertama-

tama maserasi dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksana, kemudian

dilanjutkan dengan menggunakan pelarut etil asetat dan metanol.

Simplisia Marchantia emarginata dimaserasi dengan n-heksana. Maserasi

dilakukan berulang hingga maserat tidak berwarna atau bening. Maserat disaring

kertas saring. Pelarut diuapkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator

dengan suhu 37oC. Maserasi kemudian dilanjutkan dengan menggunakan etil asetat

dengan jumlah yang sama untuk masing-masing simplisia. Maserasi dilakukan

hingga diperoleh maserat tidak berwarna. Maserat kemudian disaring dengan

menggunakan kertas saring. Pelarutnya diuapkan dengan menggunakan vacum

rotary Evaporator dengan suhu 37oC.

Maserasi kemudian dilanjutkan kembali dengan menggunakan metanol

dengan jumlah yang sama untuk masing-masing simplisia. Maserasi dilakukan

hingga dihasilkan maserat tidak berwarna. Maserat kemudian disaring dengan

menggunakan kertas saring. Pelarutnya kemudian diuapkan dengan menggunakan

vacum rotary evaporator dengan suhu 38oC. Ketiga ekstrak yang didapatkan

24


ditimbang dengan menggunakan neraca analitik. Rendemen dihitung terhadap

simplisia awal.

3.3.5. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH

3.3.5.1. Uji Kualitatif Antioksidan dengan KLT

Uji pendahuluan sebagai antioksidan penangkap radikal dilakukan sesuai

metode yang dilakukan Zhao, dkk. (2010) dan Demirezer dkk (2001) dengan

modifikasi. Uji kualitatif antioksidan dilakukan terhadap ketiga ekstrak yaitu

ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana. Kromatogram yang telah

dielusi, dikeringkan dan disemprot dengan larutan 0,04% DPPH dalam metanol pro

analisa. Kromatogram diperiksa 30 menit setelah penyemprotan. Senyawa aktif

penangkap radikal bebas akan menunjukkan bercak berwarna putih kekuningan

dengan latar belakang ungu (Sri, dkk., 2013).

3.3.5.2. Uji Kuantitatif Antioksidan

Uji kuantitatif antioksidan dengan metode berdasarkan Chyau, dkk.,

dialkukan terhadap ketiga ekstrak yaitu ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan

ekstrak n-heksana dilakukan (Komala, dkk., 2015). Absorbansi diukur dengan

menggunakan spektrofotometer Uv-vis dengan kuvet 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm.

1. Pembuatan Larutan DPPH 0,25 mM

DPPH ditimbang sebanyak 4,9 mg dan dilarutkan dengan metanol pro

analisa hingga 50 ml dalam labu ukur.

2. Pembuatan Larutan Stok Uji

Larutan stok 1000 ppm disiapkan dengan cara 10 mg ekstrak kental

ditimbang masing dan dilarutkan dengan metanol absolut sambil dihomogenkan,

volume akhir dicukupkan metanol pro analisa sampai 10 ml dalam labu ukur.

25


3. Pembuatan Larutan Stok Vitamin C Murni

Larutan stok 1000 ppm disiapkan dengan cara menimbang 10 mg vitamin C

murni dan dilarutkan dengan metanol pro analisa, volume akhir dicukupkan hingga

10 ml labu ukur.

4. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH

a. Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum Larutan DPPH 0,25 mM

Larutan DPPH 0,25 mM dipipet sebanyak 1 ml dan dicukupkan volumenya

sampai 5 ml dengan metanol pro analisa dalam labu terukur. Larutan ini kemudian

dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit, selanjutnya panjang gelombang

ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer Uv-vis.

b. Pengukuran Serapan Larutan Blanko DPPH

Larutan DPPH 0,25 mM dipipet sebanyak 1 ml dan dicukupkan volumenya

sampai 5 ml dengan metanol pro analisa dalam labu terukur. Larutan ini kemudian

dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit, selanjutnya serapan diukur dengan

spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 516,1 nm (panjang gelombang

yang sebelumnya telah ditentukan).

c. Pengukuran Aktivitas Pengikatan Radikal bebas DPPH dengan Sampel Uji

Pengujian dilakukan dengan cara, dibuat pengenceran sampel dari larutan

sampel induk 1000 ppm dengan konsentrasi 200; 100; 50; 25; 12,5; dan 6,25

µg/mL. Kemudian dari masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 4 ml dan

ditambahkan larutan DPPH 1 ml kedalam labu ukur. Selanjutnya dihomogenkan

dengan vortex dan dibiarkan selama 30 menit, lalu diukur serapan dengan

spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 516,1 nm.

Besarnya persentase pengikatan radikal bebas dihitung dengan rumus :

Nilai IC50 (50% Inhibitory Concentration) ditentukan menggunakan kurva

persamaan regresi linear dengan memplotkan konsentrasi ekstrak dengan besarnya

nilai pengikat radikal. AAI dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut

26


𝐴𝐴𝐼 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝐷𝑃𝑃𝐻 (

𝜇𝑔𝑚𝑙

)

𝐼𝐶50(𝜇𝑔𝑚𝑙

)

5. Pengukuran Aktivitas Pengikatan Radikal bebas DPPH dengan Vitamin C

Murni

Pengujian dilakukan dengan dibuat pengenceran dari larutan stok vitamin C

dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4, dan 5 µg/mL. Kemudian dipipet sebanyak 4 ml dan

ditambah 1 ml DPPH 0,25 mM ke dalam labu ukur. Larutan dihomogenkan dengan

vortex dan dibiarkan selam 30 menit. Selanjutnya serapan diukur dengan

spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 516,1 nm.

3.3.6. Isolasi dan Pemurnian Senyawa

3.3.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pengujian dengan KLT dilakukan dengan menggunakan plat silikagel 60

GF sebagai fase diam. Plat silika gel dibuat dengan ukuran lebar 1 cm dan panjang

5 cm pada ujung atas dan bawah diberi batas 0,5 cm. Untuk menentukan

pengembang yang optimum, dicoba berbagai komposisi pengembang.

KLT diujikan terhadap ketiga ekstrak yaitu ekstrak metanol, etil asetat dan

n-heksana. KLT juga diujikan terhadap fraksi yang didapatkan setelah dilakukan

pemisahan (kromatografi kolom). Ekstrak atau fraksi yang akan diuji dilarutkan

dalam beberapa mililiter pelarut yang sesuai (larutan uji), lalu ditotolkan pada titik

awal pergerakan dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah totolan kering,

dilakukan pengelusian di dalam bejana KLT yang telah dijenuhkan dan ditutup

rapat. Lempeng dikeluarkan dan dikeringkan setelah eluen mencapai garis atas.

Bercak diamati secara visual, dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm

dan 366 nm

3.3.6.2. Kromatografi Kolom

Pemisahan dengan kromatografi kolom dilakukan dilakukan terhadap

ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik yaitu ekstrak metanol

27


Marchantia emarginata dengan menggunakan fase diam silika gel 60. Kolom

dipasang pada statif. Pada ujung bagian bawah dalam kolom diberi kapas kemudian

dialiri dengan pelarut n-heksana. Kolom yang digunakan berdiameter 2 cm dan

tinggi 17 cm. Silika gel 60 (fase diam) sebanyak 30 g yang telah ditimbang

kemudian dimasukkan ke dalam gelas beker dan ditambahkan pelarut n-heksana

secukupnya lalu diaduk-aduk, selanjutnya dimasukkan ke dalam kolom sedikit

demi sedikit, kemudian kolom diketuk-ketuk hingga silika gel 60 memadat dan

permukaannya rata.

Sebanyak 2 g ekstrak yang telah ditimbang, ditambahkan dengan sedikit

metanol kemudian dimasukkan ke dalam kolom. Campuran pelarut ditambahkan

sebagai fase gerak yang bertingkat kepolarannya yaitu digunakan n-heksana, etil

asetat dan metanol dengan berbagi perbandingan. Fase gerak dibuat sebanyak 300

mL dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil kran dibuka, eluat yang

keluar dari kolom ditampung dalam vial dan diberi nomor.

Uji dengan KLT dilakukan pada setiap vial dengan eluen yang sesuai.

Kemudian setiap fraksi dilakukan penggabungan berdasarkan kesamaan pola

kromatogramnya dan dilakukan pemurnian selanjutnya dengan menggunakan

menggunakan Sephadex. Adapun pelarut yang digunakan adalah metanol. Kolom

yang digunakan berdiameter 1,5 cm dengan tinggi 25,5 cm.

3.3.6.3. Rekristalisasi

Hasil sephadex dan hasil kromatografi kolom yang berbentuk kristal

dimurnikan dengan cara rekristalisasi. Kristal yang masih terdapat pengotor

dilarutkan dengan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai, kemudian

ditambahkan dengan pelarut dengan tingkat kepolaran berbeda. Kemudian kristal

dipisahkan dari pengotornya.

3.3.6.4. KLT Dua Dimensi

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis

tipis dua dimensi. KLT dua dimensi dilakukan terhadap senyawa aktif antioksidan

yang didapatkan (B3036). Plat KLT dibuat dengan bentuk bujur sangkar yang

setiap sisinya memiliki ukuran 5 cm. Kemudian senyawa dilarutkan dengan n-

28


heksana dan ditotolkan pada salah satu sisi plat dengan pipa kapiler, selanjutnya

plat KLT dielusi dengan fase gerak n-heksana dan etil asetat (4:1) dan dibiarkan

kering sesaat. Kemudian plat KLT dielusi kembali pada sisi lainnya dengan

menggunakan fase gerak yang sama, bercak dilihat dibawah lampu UV 254 nm.

3.3.7. Penentuan Struktur Molekul Senyawa

3.3.7.1. GC-MS

Senyawa yang didapatkan (B30360 kemudian ditentukan strukturnya

dengan menggunakan GC-MS. Senyawa dilarutkan dengan metanol pro analisa

kemudian diinjeksikan ke dalam GC-MS.

3.3.7.2. 1H-NMR

Identifikasi dan penentuan struktur molekul dilakukan terhadap senyawa murni

(B3036) dengan spektrometri resonansi magnetik inti proton (1H-NMR). Sejumlah

1 mg senyawa murni dilarutkan dengan 1 mL pelarut khusus untuk NMR yaitu

CDCl3. Selanjutnya diukur dengan alat spektroskopi 1H-NMR.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Preparasi Sampel

Tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah lumut hati

Marchantia emarginata Reiwn, Blume & Nees yang diperoleh di Curug Cigamea,

Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor, Jawa Barat yang kemudian dideterminasi

di herbarium bogoriense LIPI, Cibinong, Bogor (Lampiran 1). Talus dipisahkan

dari rizoidnya, dicuci dengan air untuk menghilangkan kotoran, lalu dikeringkan

dengan cara diangin-anginkan pada suhu kamar.

Ekstrak dari senyawa yang akan diisolasi memiliki aktivitas antioksidan,

maka pengeringan dilakukan dengan cara diangin-anginkan, tidak dijemur dibawah

sinar matahari langsung karena akan merusak fisik dan kandungannya. Hal ini

bertujuan untuk menghindari terjadinya kerusakan senyawa akibat pemanasan dan

meminimalisir terjadinya kehilangan senyawa yang mudah menguap (atsiri) apabila

kemungkinan dalam tanaman tersebut mengandung senyawa minyak atsiri.

Simplisia yang telah kering disortasi kembali dari kotoran-kotoran yang

tertinggal. Simplisia yang telah disortir, kemudian dihaluskan dengan blender

sampai halus. Simplisia halus yang didapatkan sebanyak 78,91 g. Simplisia

dihaluskan dengan tujuan untuk memperbesar luas permukaan simplisia sehingga

kontak dengan pelarut semakin besar dan proses ekstraksi pun dapat berjalan lebih

maksimal. Simplisia yang telah halus disimpan dalam wadah bersih, kering dan

terlindung dari cahaya untuk mencegah kerusakan bahan atau mutu simplisia.

4.2. Ekstraksi

Simplisia yang telah halus kemudian diekstraksi. Ekstraksi dilakukan

dengan metode maserasi. Pada maserasi, seluruh simplisia bersentuhan dengan

pelarut dalam wadah tertutup selama periode tertentu dengan beberapa kali

diguncang hingga zat terlarut. Metode ini digunakan karena sangat baik untuk

senyawa yang termolabil (Tiwari, 2011). Ekstraksi dilakukan secara bertingkat

dimulai dengan tingkat kepolaran yang rendah yaitu n-heksana, dilanjutkan dengan

30


pelarut semi polar yaitu etil asetat dan pelarut polar yaitu metanol. Maserasi

dilakukan hingga dihasilkan maserat dengan warna bening yang berarti tidak ada

lagi senyawa yang dapat ditarik.

Maserat yang telah disaring kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary

evaporator dengan suhu ± 38oC. Didapatkan ekstrak n-heksan sebanyak 1,09 g,

esktrak etil asetat sebanyak 1,55 g dan ekstrak metanol sebanyak 2,32 g. Rendemen

kemudian dihitung terhadap berat awal simplisia (Lampiran 3). Rendemen

didapatkan seperti pada tabel berikut

Tabel 4.1. Rendemen Ekstrak

Ekstrak % Rendemen

n-Heksana 1,39

Etil Asetat 1,97

Metanol 2,95

Rendemen seharusnya juga dihitung terhadap berat sampel segar. Salah satu

kekurangan dari penlitian ini adalah tidak ditimbangnya bobot dari sampel segar

sehingga rendemen terhadap bobot sampel segar tidak dapat dihitung.

4.3. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH

Uji antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (2,2-Diphenyl-1-Picryl

hidrazyl). Uji dilakukan terhadap ketiga ekstrak Marchantia emarginata yaitu

ekstrak n-heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol untuk kemudian dilihat

ekstrak dengan aktivitas antioksidan paling baik. Uji antioksidan dilakukan secara

kualitatif dan kuantitatif. Metode ini dipilih karena prosedur kerjanya yang

sederhana, waktu pengerjaan yang relatif cepat dibanding metode lain dan memiliki

sensitivitas yang baik (Locatelli, dkk., 2009).

Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan plat KLT. Ekstrak n-heksana,

etil asetat dan metanol dilarutkan sedikit ke dalam pelarutnya. Masing-masing

ekstrak ditotolkan ke atas plat KLT dengan panjang 5 cm. Plat KLT kemudian

dielusi dengan eluen yang sesuai. Eluen yang digunakan untuk ekstrak n-heksana

yaitu n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 4:1, untuk ekstrak etil asetat

yaitu n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 3:2, sedangkan untuk ekstrak

metanol yaitu etil asetat dan metanol dengan perbandingan 4 :1. Larutan DPPH 0,04

% kemudian disemprotkan ke atas plat KLT yang telah dielusi (Zhao, dkk., 2010).

31


(a)

(b)

(c)

Gambar 4.1. KLT Ekstrak Metanol (a) Pada Panjang Gelombang 254 nm, (b) Pada Panjang Gelombang 366 nm, (c) Uji Kualitatif

Antioksidan dengan DPPH

(a)

(b)

(c)

Gambar 4.2. KLT Ekstrak Etil Asetat (a) Pada Panjang Gelombang 254 nm, (b) Pada Panjang Gelombang 366 nm, (c) Uji Kualitatif


(a)

(b)

(c)

Gambar 4.3. KLT Ekstrak n-Heksana (a) Pada Panjang Gelombang 254 nm, (b) Pada Panjang Gelombang 366 nm, (c) Uji Kualitatif


32


Kelebihan dari uji kualitatif dengan metode DPPH yaitu analisisnya mudah,

cepat dan efisien, serta memungkinkan mengetahui adanya senyawa yang bersifat

sebagai antioksidan yang dapat dilihat secara visual. Hasil uji kualitatif menunjukan

bahwa terdapat bercak dengan warna kekuningan dengan latar ungu. Hal ini

menunjukan bahwa dalam ekstrak terdapat senyawa yang aktif sebagai antioksidan

(Pisochi, dkk., 2009). Uji antioksidan kemudian dilanjutkan ke uji kuantitatif.

Uji kuantitatif dilakukan dengan metode dari Chyau, dkk yaitu melarutkan

DPPH 4,9 mg ke dalam 50 ml metanol pro analisa sehingga didapatkan DPPH 0,25

mM. Blanko dibuat dengan memasukan DPPH 0,25 mM sebanyak 1 ml ke dalam

4 ml metanol pro analisa. Panjang gelombang maksimum (λmax) diukur dengan

menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang maksimum yang

didapatkan yaitu 516,1 nm (Lampiran 4). Hal ini menunjukan bahwa DPPH yang

digunakan adalah benar karena dalam literatur tercantum bahwa DPPH memiliki

panjang gelombang maksimum 515-520 nm (Locatelli, dkk., 2009).

Larutan DPPH uji yang digunakan adalah larutan DPPH dengan konsentrasi

0,25 mM. Sharma dan Bhat (2009) menyatakan bahwa profil absorbansi DPPH

yang dilarutkan dalam metanol terbaik yaitu pada rentang konsentrasi 0,01 mM-0,2

mM. Konsentrasi 0,25 mM digunakan dikarenakan absorbansi yang terukur pada

spektrofortometer Uv-vis yaitu diantara 0,4-0,9. Jika absorbansi diatas 0,9

memungkinkan ketidakakuratan dan jika absorbansi dibawah 0,4 perbedaan antara

sampel dan blanko sulit dibedakan sehingga dipilih konsentrasi 0,25 mM (Hartwig,

dkk., 2012).

Larutan uji dibuat dengan menimbang masing-masing ekstrak sebanyak 10

mg kemudian dilarutkan ke 10 ml metanol pro analisa dalam labu ukur sehingga

didapatkan larutan induk 1000 ppm. Larutan dengan berbagai konsentrasi masing-

masing ekstrak dibuat dengan mengambil 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; dan 0,0312

mL dengan mikropipet, kemudian dilarutkan kedalam metanol pro analisa dalam

labu ukur 5 ml. Didapatkan larutan uji dengan seri konsentrasi 200; 100; 50; 25;

12,5 dan 6,25 ppm. Blois, 1958 menyatakan bahwa antioksidan sangat kuat jika

nilai IC50 < 50 ppm, antioksidan kuat untuk IC50 50-100 ppm, antioksidan sedang

33


jika IC50 bernilai 101-150 ppm dan aktivitas lemah jika IC50 bernilai 151-200 ppm.

Seri konsentrasi uji kemudian dipilih mewakili keempat kategori IC50 tersebut.

Larutan didiamkan selama 30 menit dalam ruang gelap. Larutan uji diukur

serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis. Prinsip dari metode DPPH adalah

interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal

hidrogen pada DPPH akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH. Jika

semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan maka warna larutan

berubah dari ungu tua menjadi kuning terang (Rajauria, dkk., 2007). Pengukuran

serapan dilakukan setelah dilakukan inkubasi selama 30 menit agar terjadi reaksi

antara DPPH sebagai radikal bebas dengan sampel yang diuji.

Didapatkan absorbansi rerata seperti pada tabel 4.3 (lampiran 5). Persentase

inhibisi kemudian dihitung dengan rumus. Pesamaan regresi linear didapatkan

dengan memplotkan konsentrasi terhadap persentase inhibisi. Didapatkan

persentase inhibisi untuk ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana

secara berurutan yaitu 147,80; 195,87; dan 935,07 ppm. Indeks aktivitas

antioksidan (AAI) diperoleh dengan membandingkan konsentrasi DPPH yang

digunakan dengan persentase inhibisi.

Tabel 4.2. Indeks Aktivitas Antioksidan

(sumber : Arulpriya, dkk., 2014)

AAI Kategori

AAI < 0.5 Aktivitas antioksidan lemah

AAI 0.5 – 1.0 Aktivitas antioksidan sedang (Moderate)

AAI 1.0 – 2.0 Aktivitas antioksidan kuat

AAI > 2.0 Aktivitas antioksidan sangat kuat

Indeks aktivitas antioksidan ekstrak metanol yaitu 0,66 yang menunjukan

bahwa ekstrak metanol Marchantia emarginata memiliki aktivitas antioksidan

sedang (Arulpriya, dkk., 2014). Indeks aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat yaitu

0,50 yang menunjukan bahwa ekstrak etil asetat Marchantia emarginata memiliki

aktivitas antioksidan sedang (Arulpriya, dkk., 2014). Indeks aktivitas antioksidan

ekstrak n-heksana yaitu 0,10 yang menunjukan bahwa ekstrak n-heksana

Marchantia emarginata memiliki aktivitas antioksidan lemah (Arulpriya, dkk.,

34


2014). Ekstrak metanol Marchantia emarginata memiliki indeks aktivitas

antioksidan tertinggi dibandingkan dengan ekstrak etil asetat dan n- heksana yaitu

0,66, selain itu juga memiliki bobot yang lebih besar dibandingkan ekstrak etil

asetat dan n-heksana, maka ekstrak metanol dipilih untuk diisolasi lebih lanjut.

Tabel 4.3. Uji Kuantitatif Antioksidan terhadap Ekstrak

Konsentrasi Absorbansi

Rata-rata

% Inhibisi Rata-

rata

IC50

(ppm) AAI

Ekstrak Metanol

Blanko 0,49 -

147,80 0,66

200 ppm 0,18 63,77

100 ppm 0,30 38,07

50 ppm 0,38 22,84

25 ppm 0,41 16,99

12,5 ppm 0,43 12,10

6,25 ppm 0,44 9,72

Ekstrak Etil Asetat

Blanko 0,81 -

195,86 0,50

200 ppm 0,49 48,74

100 ppm 0,30 30,39

50 ppm 0,18 18,30

25 ppm 0,09 9,23

12,5 ppm 0,05 4,72

6,25 ppm 0,02 1,95

Ekstrak n-Heksana

Blanko 0,64 -

935,07 0,11

200 ppm 0,57 11,44

100 ppm 0,60 6,64

50 ppm 0,61 4,28

25 ppm 0,62 2,19

12,5 ppm 0,63 1,78

6,25 ppm 0,53 1,36

Kontrol positif atau pembanding yang digunakan adalah Vitamin C.

Vitamin C lebih banyak digunakan daripada BHT karena vitamin C merupakan

antioksidan alami yang lebih baik dibandingkan antioksidan sintetik. Atom

hidrogen pada gugus hidroksil berikatan dengan radikal bebas sehingga

meningkatkan stabilitas radikal bebas. Vitamin C memiliki empat gugus hidroksil

sedangkan BHT hanya memiliki satu gugus hidroksil, sehingga aktivitas

antioksidan vitamin C jauh lebih kuat dibandingkan BHT (Muharni, dkk., 2013).

35


Vitamin C dibuat pada konsentrasi 1, 2, 3, 4, dan 5 ppm. Data yang

didapatkan seperti pada tabel 4.4. Konsentrasi hambat 50% (IC50) didapatkan 1,81

ppm dan indeks aktivitas antioksidan sebesar 54,26 yang menunjukan bahwa

aktivitas antioksidan yang dimilikinya sangat kuat. Jika dibandingkan, aktivitas

antioksidan yang dimiliki oleh ektsrak metanol Marchantia emarginata tidak

sekuat aktivitas yang dimiliki vitamin C.

Tabel 4.4. Uji Kuantitatif Antioksidan terhadap Vitamin C

Konsentrasi Absorbansi

Rata-rata

% Inhibisi

Rata-rata

IC50

(ppm) AAI

Blanko 0,38 -

1,81 54,26

1 ppm 0,28 25,76

2 ppm 0,15 59,65

3 ppm 0,08 78,34

4 ppm 0,02 95,55

5 ppm 0,01 96,16

4.4. Isolasi Senyawa Murni

Ekstak metanol Marchantia emarginata kemudian diisolasi dengan metode

pemisahan kromatografi kolom. Sebanyak 2 g ekstrak dimasukan ke dalam kolom

berisi gel silika 60 yang telah disiapkan, kemudian dielusi dengan elusi gradien.

Elusi gradien dilakukan dengan campuran pelarut untuk memisahkan senyawa

berdasarkan tingkat kepolarannya. Elusi isokratik atau eluen dengan rasio tetap

tidak digunakan karena tidak dapat memisahkan ekstrak kasar (Saifudin, 2014).

Eluen yang digunakan dimulai dengan tingkat kepolaran yang rendah yaitu

n-heksana : etil asetat (9:1, 4:1, 3:2, 2:3 dan 1:4), etil asetat 100%, etil asetat :

metanol (9:1, 4:1, 3:2, 2:3 dan 1:4) dan metanol 100%. Didapatkan 198 vial,

kemudian setiap nomor genap dilakukan KLT dengan eluen campuran dari n-

heksana dan etil asetat (lampiran 9).

Hasil KLT dengan spot yang sama, kemudian digabungkan. Vial nomor 1-

9 digabungkan kemudian dilabel sebagai fraksi A, vial nomor 10-22 sebagai fraksi

B, vial nomor nomor 23-24 sebagai fraksi C, vial nomor 25-28 sebagai fraksi D,

vial nomor 29-31 sebagai fraksi E, vial nomor 32-34 sebagai fraksi F, vial nomor

35-40 sebagai fraksi G, vial nomor 41-44 sebagai fraksi H, vial nomor 45-51

sebagai fraksi I dan vial nomor 52-70 sebagai fraksi J

36


Tabel 4.5. Bobot Fraksi A-J

Fraksi Nomor Vial Bobot (mg)

A 1-9 57,3

B 10-22 41,7

C 23-24 7,9

D 25-28 14,1

E 29-31 10,4

F 32-34 8,4

G 35-40 10,3

H 41-44 2,3

I 45-51 60,4

J 52-70 30,0

Uji antioksidan terhadap fraksi hanya dilakukan secara kualitatif, hal ini

dikarenakan sedikitnya bobot fraksi yang didapatkan, dikhawatirkan jika dilakukan

uji kuantitatif sulit untuk mengisolasi senyawa yang ada pada fraksi. Hasil uji

kualitatif antioksidan didapatkan hasil seperti pada gambar 4.5. Fraksi yang

memberikan pola bercak dengan aktivitas antioksidan yang banyak adalah fraksi B

Kromatografi Kolom Eluen : n-Heksana, Etil Asetat dan Metanol

(berbagai perbandingan)

Fase diam : 20 g Silika Gel

Ekstrak Metanol 2 g

Vial

No.1-9

Fraksi A

Vial

No.10-22

Fraksi B

Vial

No.23-24

Fraksi C

Vial

No.25-28

Fraksi D

Vial

No.29-31

Fraksi E

Vial

No.32-34

Fraksi F

Vial

No.35-40

Fraksi G

Vial

No.41-44

Fraksi H

Vial

No.45-51

Fraksi I

Vial

No.52-70

Fraksi J

Uji Kualitatif Antioksidan (Metode DPPH)

Gambar 4.4. Bagan Kromatografi Kolom Ekstrak Metanol

37


dengan bobot 41,7 mg, sehingga terhadap fraksi tersebut dilakukan pemisahan lebih

lanjut dengan kromatografi kolom menggunakan sephadex.

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 4.5. Uji Kualitatif Antioksidan terhadap Fraksi A-J (a) Fraksi A dan B (n-heksana : etil asetat, 4:1), (b) Fraksi C, D, E, F, G (n-heksana : etil asetat,

3:2), (c) Fraksi H (n-heksana : etil asetat, 5:5), (d) Fraksi I dan J (n-heksana : etil asetat, 9:1)

Purifikasi dengan kromatografi kolom lebih lanjut dilakukan terhadap fraksi

dengan bobot antara 0,1-4 g. Digunakan sephadex LH-20 untuk memekatkan

molekul kecil. Sephadex sangat menguntungkan untuk isolasi polifenol, sedangkan

silika gel seringkali menjerap senyawa polifenol (Saifudin, 2014). Fraksi B

dimasukan kedalam kolom yang berisi sephadex, kemudian dielusi menggunakan

metanol.

Didapatkan 36 vial, kemudian diuji aktivitas antioksidannya secara

kualitatif. Eluen yang digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat dengan

KLT & Uji Kualitatif Antioksidan

(Metode DPPH)

Fraksi B

Kromtografi Kolom Fase diam : Sephadex LH20

Eluen : Metanol

36 fraksi

Vial No. 30-36

Rekristalisasi, KLT & Uji Kualitatif Antioksidan (Metode DPPH)

Gambar 4.6. Bagan Kromatografi Kolom Fraksi B

A B C D E F G H I J

38


perbandingan 4:1. Didapatkan senyawa aktif dengan satu bercak yang sama pada

plat KLT pada vial nomor 30 sampai 36 yang selanjutnya digabung dan dilabel

sebagai B3036. Senyawa B3036 kemudian dilakukan KLT dua dimensi dan

penentuan struktur dengan 1H-NMR.

Gambar 4.7. KLT Fraksi B Vial Nomor 30-36 (a) Pada panjang gelombang 254 nm, (b) Pada panjang gelombang 365 nm, (c) Uji Kualitatif


Gambar 4.8. KLT Senyawa B3036 (a) Pada panjang gelombang 254 nm, (b) Pada panjang gelombang 365 nm, (c) Uji Kualitatif


(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

39


Tabel 4.6. Karakteristik Senyawa B3036

4.5. Penentuan Struktur Senyawa

4.5.1. GC-MS

Senyawa dianalisis dengan menggunakan alat kromatografi gas –

spektroskopi massa. Senyawa B3036 dilarutkan dengan menggunakan metanol

kemudian diinjek ke dalam alat. Pada spektrum kromatografi gas, jika sampel

mengandung banyak senyawa, terlihat dari banyaknya puncak (peak) dalam

spektrum tersebut. Berdasarkan data waktu retensi yang sudah diketahui dari

literatur, bisa diketahui senyawa apa saja yang ada dalam sampel.

Namun, hasil analisa menunjukan tidak ada peak yang muncul (lampiran

11). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa B3036 yang dianalisis tidak terdeteksi

dengan menggunakan alat tersebut. Senyawa B3036 yang tidak terdeteksi

kemungkinan dikarenakan senyawa tersebut bukanlah senyawa yang mudah

menguap.

4.5.2. Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Penentuan struktur dilakukan dengan menggunakan resonansi magnetik inti

proton (1H-NMR). Analisis struktur kimia dengan 1H-NMR, memungkinkan untuk

mengetahui adanya proton dalam suatu struktur molekul. Data yang dihasilkan dari

1H-NMR berupa pergeseran kimia yang dapat dianggap sebagai ciri bagian tertentu

dari suatu struktur molekul dan dapat membantu mengidentifikasi tiap gugus suatu

Bentuk : Kristal

Warna : Kuning kecoklatan

Kelarutan : Larut dalam etil asetat dan

kloroform

Bau : Tidak berbau

Bobot : 1,7 mg

Eluen : n-Heksana : Etil asetat (4:1)

Rf : 0,28

40


senyawa. Analisa 1H-NMR dilakukan dengan menggunakan pelarut CDCl3, sistem

konsol DD2, yang beroperasi pada frekuensi 500 MHz (1H) dan 125 MHz (13C).

Tabel 4.7. Pergeseran Kimia 1H pada Senyawa Organik (Sumber : Field, dkk., 2007)

Group δ 1H

(ppm dari TMS)

Trimetilsilen (CH3)4Si 0

Gugus Metil terikat pada atom C terhibridisasi sp3 0.8-1.2

Gugus Metilen terikat pada atom C terhibridisasi sp3 1.0-1.5

Gugus Metin terikat pada atom C terhibridisasi sp3 1.2-1.8

Proton Asetilen 2-3.5

Proton Oleofinik 5-8

Proton Aromatik dan Heterosiklik 6-9

Proton Aldehid 9-10

Proton –OH pada alkohol, fenol atau asam karboksiat, proton –SH pada tiol, proton –

NH pada amina dan amida tidak memiliki range pergeseran kimia tetap

Senyawa B3036 yang telah dianalisis menunjukan spektrum seperti pada

Gambar 4.9 (Lampiran 12). Hasil analisis menunjukan bahwa senyawa memiliki

proton aromatik atau heterosiklik yaitu pada δH 7,08 – 7,64. Pada δH 9,23 terlihat

sebuah peak yang menunjukan bahwa senyawa memiliki proton aldehid. Pada δH

4,06 dan δH 4,13 terdapat gugus metilen yag berikatan dengan gugus alkoksi (Field,

dkk., 2007).

Tabel 4.8. Tabel Pergeseran Kimia Senyawa B3036

No. δH Gugus Fungsi

1. 4,06 2H(CH2-O)

2. 4,13 2H (CH2-O)

3. 5,84 1H (CH=CH2)

4. 7,09-7,10 1H (Aromatik)

5. 7,24 1H (Aromatik)

6. 7,44-7,49 2H (Aromatik)

7. 7,58-7,64 2H (Aromatik)

8, 9,23 CHO

41


Gambar 4.9. Spektrum 1H-NMR Senyawa B3036

4.6. Uji Kemurnian Senyawa dengan KLT Dua Dimensi

KLT dua dimensi digunakan untuk menguji kemurnian suatu senyawa

dilihat dari bercak yang dihasilkan dengan kromatografi secara dua arah. Senyawa

dikatakan murni apabila memiliki bercak tunggal setelah dilakukan pengujian

dengan KLT dua dimensi. Hasil KLT dua dimensi dari senyawa B3036

menunjukkan bercak tunggal dengan nilai Rf 0,28 sehingga dapat diindikasikan

bahwa senyawa telah murni.

1

2

Gambar 4.10. KLT Dua Dimensi


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Isolasi dilakukan terhadap fraksi aktif antioksidan terbaik yaitu ekstrak

metanol dengan AAI sebesar 0,66 yang termasuk ke dalam antioksidan moderate.

Senyawa murni aktif antioksidan yang didapatkan yaitu senyawa B3036 dengan

bobot sebesar 1,7 mg dari 2,33 g ekstrak metanol. Senyawa B3036 memiliki Rf

0,28 merupakan senyawa non volatile, dan memiliki gugus aromatik, aldehid dan

alkoksi

5.2. Saran

1. Diperlukan pengambilan sampel segar lebih banyak agar senyawa yang

disolasi lebih banyak

2. Diperlukan penimbangan sampel segar awal sebelum dikeringkan

3. Diperlukan data lebih lanjut mengenai penentuan struktur dari senyawa B3036

yang meliputi data FTIR, LC-MS, 13C-NMR dan NMR dua dimensi (HMBC,

HMQC dan NOESY) sebagai data pendukung dari struktur senyawa B3036.

4. Diperlukan uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif dari senyawa B3036

untuk mengetahui seberapa kuat aktivitas antioksidan dari senyawa tersebut.

5. Diperlukan adanya penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa metabolit

sekunder dari tanaman ini karena beberapa fraksi yang potensial masih

berpeluang untuk ditemukannya senyawa-senyawa lain.

43


DAFTAR PUSTAKA

Adrianingsih, R. 2009. Penggunaan High Permformance Liquid Chromatography

(HPLC) Dalam Proses Analisa Ion. Berita Dirgantara Vol. 10 No. 4.

Allen RG, Tressini M. 2000. Oxidative Stress and Gene Regulation. Free Radical

BioMed, 463-99

Amersham Pharmacia Biotech. 1998. Gel Filtration: Principles and Methods.

Sweden: Amersham Pharmacia Biotech.

Anita Pinalia. 2011. Penentuan Metode Rekristalisasi yang Tepat untuk

meningkatkan Kemurnian Kristal Amonium Perklorat. LAPAN : Majalah

Sains dan Teknologi DirgantaraVol.6 No.2 Juni 2011, 64-70.

Arulpriya, P and P.Lalitha.2014. Anti-inflammatory and Antioxidant Activity Index

of The Aerial Roots of Rhaphidophora aurea (Linden Ex Andre) Intertwined

Over Different Host Trees. India : Journal of Pharmacy Research

2014,8(7),893-898, ISSN: 0974-6943

Asakawa, Y, Ludwiczuk, A, Nagashima, F, Masao Toyota, Toshihiro Hashimoto,

Motoo Tori, Yoshiyasu Fukuyama dan Liva Harinantenaina. 2009.

Bryophytes: Bio- and Chemical Diversity, Bioactivity and Chemosystematics.

Tokushima : Heterocycles, Vol.77, No.1 DOI: 10.3987/REV-08-SR(F)3

Asakawa, Y. Masao Toyota, Motoo Tori dan Toshihiro Hashimoto. 2000. Chemical

Structures of Macrocyclic Bis(bibenzyls) Isolated from Liverworts

(Hepaticae). Jepang : IOS Press Spectroscopy 14 (2000) 149–175 149

Asakawa, Y., 2012. Medicinal and Aromatic Plants Liverworts-Potential Source of

Medicinal Compounds. , 1(3), pp.1–2.

Asakawa, Yoshinori. 2007. Biologically Active Compounds from Bryophytes.

Tokushima : Pure Appl. Chem., Vol. 79 No. 4, DOI:

10.1351/pac200779040557

Astarina, N. W. G., Astuti, K. W., Warditiani, N. K. 2013. Skrining Fitokimia

Ekstrak Metanol Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.). Bali : Jurnal

Farmasi UDayana

Daintith, J (Editor). 1994. Kamus Lengkap Kimia. Terjemahan Suminar Achmadi.

Jakarta: Erlangga

Day,R. A., dan Underwood, A. L., 1999, Analisis Kimia Kuantitatif (Penerjemah

Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Ph.D.). Jakarta: Penerbit Erlangga

Departemen Agama RI. 2008. Al-Qur’an dan terjemahannya. Bandung:

Diponegoro.

44


Departemen Kesehatan RI. 1995. Materia Medika Indonesia jilid VI. Jakarta:

Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Jakarta: Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan

Droge W. 2002. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol

Rev 82:47—95

Fadhilla, R. 2010. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Tumbuhan Lumut Hati

(Marchantia paleacea) Terhadap Bakteri Patogen dan Pembusuk Makanan.

Sekolah Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.

Field L D, S. Sternhell, dan J R Kalman. 2007. Organic Structures from Spectra

Fourth Edition. New york: John Wiley and Sons Ltd

Gandjar, I, G. , Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar.

Yogyakarta

Glime, J. M. 2013. Meet the Bryophytes. Chapt. 2-1. In: Glime, J. M. Bryophyte

Ecology. Volume 1. Physiological Ecology. Ebook; diakses pada 3 Mei 2017

Goffinet, B., dan Shaw, A. J., 2009. Bryophyte Biology, 2nd ed. New York :

Cambrige University Press

Gordon, M. H. 1990. The Mechanism of Antioxidant Action in vitro. Di dalam :

Hudson, B. J. F. (ed). London : Food Antioxidants. Elsevier Applied Science.

Grassman J. 2005. Terpenoids as Plant Antioxidants. German : Elsevier Vitamins

and Hormones Vol. 72, DOI: 10.1016/S0083-6729(05)72015-X

Gritter, R. J. Bobbit, J.M dan Scawarting, A.E,. 1991. Pengantar Kromatografi,

Edisi II, Penerjemah: Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB Press

Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Ed II., Diterjemahkan Oleh Kosasih

Patmawinata dan Iwang Sudiro. Bandung: ITB

Hartwig, Vanessa Graciela, Brumovsky, Luis Alberto, Fretes, Raquel María, Lucila

Sánchez Boado. 2012. A Novel Procedure to Measure The Antioxidant

Capacity of Yerba Maté Extracts. Argentina :Ciênc. Tecnol. Aliment.,

Campinas, 32(1): 126-133, Jan.-Mar. 2012

Hasan, M. dan Ariyanti, N. S. 2004. Mengenal Bryophyta (Lumut) Taman Nasional

Gunung Gede Pangrango Volume 1. Balai Taman Nasional Gunung Gede

Pangrango, Cibodas

Heinrich, M. Barnes, J. Gibbons, S. Williansom, M, E. Fundamental of

Pharmacognosy and Phytotherapy. Philadelpia : Penerbit Elsevier.

45


Hostettman, K; Hostettman, M; Maerston. 1995. Preparative Chromatography

Technique:Application in Natural Product Isolation. (diterjemahkan Oleh

Kosasih P) Bandung: Penerbit ITB.

Huang, Wei-Jan, Chia-Li Wu, Chia-Wei Lin, Li-Ling Chi, Pen-Yuan Chen, Chun-

Jung Chiu, Chung-Yang Huang, Chia-Nan Chen. 2009. Marchantin A, a

Cyclic Bis-(Bibenzyl Ether), Isolated from Liverwort Marchantia

Emarginata subsp. Tosana Induces Apoptosis in Human MCF-7 Breast

Cancer. Taiwan : Elsevier, DOI : 10.1016/j.canlet.2009.10.006

Komala, Ismiarni, Azrifitria, Yardi, Ofa Suzanti Betha, Finti Muliati, dan

Maliyathun Ni’mah. 2015. Antioxidant and Anti-Inflamatory Activity of The

Indonesian Ferns, Nephrolepis falcata and Pyrrosia lanceolata. Indonesia :

Internasional Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, Vol. 7 I 12,

ISSN 0975-1491

Kumar Gupta, Subash., Anand Shrma dan Saurav Moktan. 2015. A Review on Some

Spescies of Marchantia with Reference to Distribution, Characterization and

Importance. India: World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences

Vol. 4 ISSN 2278 – 4357

Locatelli, M., Gindro, R., Travaglia, F., Coïsson, J.D., Rinaldi, M., & Arlorio, M.

(2009). Study of the DPPH-scavenging activity: Development of a free

software for the correct interpretation of data. Food Chemistry, 114,889–

897.

Ludwiczuk, A., et al. 2008. Volatile Components from Selected Mexican,

Ecuadorian, Greek, German, and Japanese Liverworts. Natural Product

Communication. Vol 3(2) : 133- 140

Manvi, F.V., Nanjawade, B.K, dan Singh, S. 2011. Pharmacological Sreening of

Combined Extract of Annova Squamosa and Nigella Sativa. Pharmacology,

Vol 2.

Muharni, Elfita, Amanda. 2013. Aktivitas Antioksidan Senyawa (+) Morelloflavon

Dari Kulit Batang Tumbuhan Gamboge (Garcinia xanthochymus).

Lampung :ESProsiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

Pisoschi AM, Negulescu GP. 2011. Methods for Total Antioxidant Activity

Determination: A Review. Biochem & Anal Biochem 1:106. DOI:

10.4172/2161-1009.1000106

Polunin, N. 1990. Pengantar Geografi Tumbuhan dan beberapailmu serumpun,

(Terjemahan Gembong Tjitrosoepomo). Fakultas Biologi Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta

Pranoto, E.N., Widodo, F.M., dan Delianis P. (2012). Kajian Aktivitas Bioaktif

Ekstrak Teripang Pasir (Holothuria scabra) Terhadap Jamur Candida

albicans. Jurnal Pengolahan dan Bioteknologi Hasil Perikanan. 1(1): 1-8

46


Pratt, D.E dan B.J.F Hudson. 1990. Natural Antioxidant Not Exploited

Commercially. Di dalam Food antioxidant. Hudson, B.J.F (ed). London:

Elsevier Applied science

Rajauria, G., Jaiswal, A.K., Abu-Ghannam, N., Gupta, S. 2012. Antimicrobial,

Antioxidant and Free Radical-Scavenging Capacity of Brown Seaweed

Himanthalia Elongata from Western Coast of Ireland. Journal of Food

Biochemistry. doi:10.1111/j.1745-4514.2012.00663.x

Saifudin, Azis. 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik

Pemurnian Ed. 1. Yogyakarta: Deepublish ISBN 978-602-280-472-7

Schuler, P. 1990. Natural Antioxidant Exploited Commercially. In : Food

Antioxidants. B. J. F. Hudson (ed). London : Elsevier Applied Science.

Silverstein, R.M., Basseler, G.C., Morrill, T.C. 1991. Spectrometric Identification

of Organic Compound (5th Edition.). New York Jhon Wiley & Sons, Inc.

Sri Wahdaningsih, S.W. and E.P.S., 2013. Isolation and Identification of

Antioxidant Compounds in Fern Stems (Alsophila Glauca J.Sm) using DPPH

Method (2,2-Diphenyl- 1-Picrylhydrazyl). , 18(January), pp.5–10.

Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerjemah :

Kosasih Padmawinata. Bandung : Penerbit ITB

Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Organik, cetakan 1, Jakarta: Ghalia.

Suhartono. 2002. Uji Kandungan Vitamin E dan Aktivitas Antioksidan pada

Kecambah Kacang Hijau dan Kedelai dengan Umur Berbeda. Skripsi tidak

diterbitkan. Malang : Jurusan Biologi FSAINSTEK UIN Malang.

Svehla, 1979. Buku Ajar Vogel: Analisis Anorganik Kuantitatif Makro dan

Semimikro. Jakarta: PT Kalman Media Pusaka.

Tiwari, P. Kumar, B. Kaur, G. Kaur H. 2011. Phytochemical Screening and

Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia. Vol.I, Issue,I.

Vasi, S.M. et al., 2012. Biological Activities of Extracts from Cultivated Granadilla

Passiflora alata. , pp.208–218.

Watson, D,G,. 2009. Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan

Praktisi Kimia Farmasi. Penerjemah: Winny R. Syarief, Edisi kedua. Jakarta

: EGC.

Williamson. 1999. Macroscale and Microscale Organic Experiments. Houghton

Mifflin Company, USA.

Windadri, F.I. 2009. Keanekaragaman Lumut di Resort Karang Rajang, Taman

Nasional Ujung Kulon Banten. Jurnal Teknik Lingkungan Vol:10 No 1, hal

47


:19-25. Bidang Botani, Pusat Penelitian Bologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI), Jakarta

Xiao, J.B, X.Q. Chen, Y.W. Zhuang, X.Y. Jiang dan M. Xu. 2006. Cytotoxicity of

Marchantia convulta Leaf Extracts to Humat Liver and Lung Cancer. China

: Brazilian Journal of Medical and Bioloical Research 39 (6) ISSN 0100-

879X

Zhao, Jing, Jiang-sheng Zhang, Bin Yang, Guang-Ping Lv dan Shao-Ping Li. 2010.

Free Radical Scavenging Activity and Characterization of Sesquiterpenoids

in Four Species of Curcuma Using a TLC Bioautography Assay and GC-MS

Analysis. China : Molecules 2010, 15, 7547-7557;

doi:10.3390/molecules15117547 ISSN 1420-3049

48


Lampiran 1. Hasil Determinasi Sampel

49


Dibersihkan, disortasi basah, dikeringkan

dan dihaluskan

Dimaserasi dengan pelarut dengan

kepolaran bertingkat, disaring dan

dipekatkan dengan Rotary Evaporator

Fase diam: Sephadex, Fase gerak:

Metanol

Fase diam: Silika Gel G60,

Fase gerak: sesuai dengan

yang digunakan pada KLT

Eluen disesuaikan

GC-MS dan NMR

Lampiran 2. Bagan Alur Kerja


Reinw., Blume & Nees

Simplisia


Ekstrak Etil Asetat

M. emarginata

Uji Kualitatif Antioksidan dengan DPPH

Uji Kuantitatif Antioksidan dengan DPPH

Kromatografi Kolom

Kristal Non-Kristal

KLT

Uji Antioksidan dengan DPPH

KLT

Kromatografi Kolom

Rekristalisasi Fraksi

Penentuan Struktur Senyawa

Ekstrak N-heksana

M. emarginata

Ekstrak Metanol

M. emarginata

KLT

50


Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Ekstrak

Simplisia Serbuk = 78,91 g

Ekstrak Metanol = 2,32 g

Ekstrak Etil Asetat = 1,55 g

Ekstrak n-Heksana = 1,09 g

Perhitungan Rendemen Ekstrak Metanol

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 𝐸𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑀𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 = 2,3247 𝑔

78,91 𝑔× 100%

= 2,9460 %

Perhitungan Rendemen Ekstrak Etil Asetat

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 𝐸𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝐸𝑡𝑖𝑙 𝐴𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 = 1,5526 𝑔

78,91 𝑔× 100%

= 1,97 %

Perhitungan Rendemen Ekstrak n-Heksana

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 𝐸𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑛 − 𝐻𝑒𝑘𝑠𝑎𝑛𝑎 = 1,0942 𝑔

78,91 𝑔× 100%

= 1,39 %

51


Lampiran 4. Panjang Gelombang Maksimum DPPH

Peak Start (nm) Apex (nm) End (nm) Height (Abs) Area (Abs*nm) Valley (nm) Valley (abs)

1 600.0 515.8 400.0 0.470 56.148 400.0 0.120

52



Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Marchantia emarginata

Ekstrak Metanol Absorbansi Absorbansi Rata-rata %Inhibisi

Blanko

0,490

0,49 0,491

0,490

200 ppm

0,172

0,18 63,77 0,186

0,175

100 ppm

0,303

0,30 38,07 0,298

0,310

50 ppm

0,379

0,38 22,84 0,380

0,376

25 ppm

0,411

0,41 16,99 0,405

0,405

12,5 ppm

0,435

0,431 12,10 0,425

0,433

6,25 ppm

0,446

0,44 9,72 0,441

0,441

y = 0,2769x + 9,0763R² = 0,9978

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200 250

%In

hib

isi

Konsentrsi (ppm)

Ekstrak Metanol

53



Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etil Asetat Marchantia emarginata

y = 0,2389x + 3,2079R² = 0,9778

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250

%In

hib

isi

Konsentrasi (ppm)

Ekstrak Etil Asetat

Ekstrak Etil

Asetat Absorbansi Absorbansi Rata-Rata % Inhibisi

Blanko

0,840

0,80 - 0,809

0,766

200 ppm

0,416

0,41 48,74 0,414

0,408

100 ppm

0,562

0,56 30,39 0,561

0,558

50 ppm

0,672

0,66 18,30 0,634

0,667

25 ppm

0,727

0,73 9,23 0,744

0,721

12,5 ppm

0,767

0,76 4,72 0,769

0,765

6,25 ppm

0,787

0,79 1,95 0,795

0,786

54



Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana Marchantia emarginata

Ekstrak

n-Heksana Absorbansi Absorbansi Rata-rata % Inhibisi

Blanko

0,649

0,64 - 0,629

0,636

200 ppm

0,569

0,57 11,44 0,564

0,562

100 ppm

0,593

0,60 6,64 0,598

0,596

50 ppm

0,607

0,61 4,28 0,615

0,61

25 ppm

0,624

0,62 2,19 0,626

0,622

12,5 ppm

0,63

0,63 1,78 0,625

0,625

6,25 ppm

0,63

0,63 1,36 0,629

0,629

y = 0,0522x + 1,1894R² = 0,9942

0

2

4

6

8

10

12

14

0 50 100 150 200 250

%In

hib

isi

Konsentrasi (ppm)

Ekstrak n-Heksana

55


Lampiran 8. Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks Aktivitas

Antioksidan (AAI)

Ekstrak Persamaan Regresi Linear R2

Metanol y = 0,2769x + 9,0763 0,9978

Etil Asetat y = 0,2389x + 3,2079 0,9778

n-Heksana y = 0,0522x + 1,1894 0,9942

Ekstrak Metanol

𝑰𝑪𝟓𝟎 → 𝒚 = 𝟎, 𝟐𝟕𝟔𝟗𝐱 + 𝟗, 𝟎𝟕𝟔𝟑

50 = 0,2769 𝑥 + 0,0763

𝑥 =50−0,0763

0,2769

𝑥 = 147,79 𝑝𝑝𝑚

𝑨𝑨𝑰 → 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻

𝐼𝐶50

𝑲𝒐𝒏𝒔𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒔𝒊 𝑫𝑷𝑷𝑯 = 4,9 𝑚𝑔

50 𝑚𝑙

= 98 𝑝𝑝𝑚

𝑨𝑨𝑰 = 98 𝑝𝑝𝑚

147,7923 𝑝𝑝𝑚

= 0,66

Ekstrak Etil Asetat

𝑰𝑪𝟓𝟎 → 𝐲 = 𝟎, 𝟐𝟑𝟖𝟗𝐱 + 𝟑, 𝟐𝟎𝟕𝟗

50 = 0,2389 𝑥 + 3,2079

𝑥 =50−3,2079

0,2389

𝑥 = 195,86 𝑝𝑝𝑚


𝐼𝐶50


50 𝑚𝑙

= 98 𝑝𝑝𝑚


195,8648 𝑝𝑝𝑚

= 0,50

Ekstrak n-Heksana

𝑰𝑪𝟓𝟎 → 𝐲 = 𝟎, 𝟎𝟓𝟐𝟐𝐱 + 𝟏, 𝟏𝟖𝟗𝟒

50 = 0,0522 𝑥 + 1,1894

𝑥 =50−1,1894

0,0522

𝑥 = 935,07 𝑝𝑝𝑚


𝐼𝐶50


50 𝑚𝑙

= 98 𝑝𝑝𝑚


935,0689 𝑝𝑝𝑚

= 0,10

HASIL KOLOM

NO. 254 nm 356 nm DPPH

2-20

20-42

Lam

pira

n 9

. KL

T H

asil Kro

mato

grafi K

olo

m E

kstrak

Metan

ol

56

UIN

Syarif H

idayatu

llah Jakarta

52-70

72 – 88

57

UIN

Syarif H

idayatu

llah Jakarta

90-108

58

UIN

Syarif H

idayatu

llah Jakarta

1-12

13-24

Lam

pira

n 1

0. K

LT

Hasil K

rom

atografi K

olo

m F

raksi B

59

UIN

Syarif H

idayatu

llah Jakarta

25-36

60

UIN

Syarif H

idayatu

llah Jakarta

61

Lampiran 11. Spektrum GC-MS Senyawa B3036

62

Lampiran 12. Spektrum 1H-NMR Senyawa B3036

isolasi metabolit sekunder dari fraksi aktif...

Documents