isolasi dan pengklonan dan analisis ekspresi gen penyandi cooper
DESCRIPTION
TeTRANSCRIPT
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN ANALISIS EKSPRESI GEN PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE
(CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L.
SALEHA HANNUM
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Isolasi,
Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide
Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum L” adalah karya bersama
saya dan pembimbing yang belum pernah diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
Bogor, Januari 2012 Saleha Hannum NIM G361040041
ABSTRACT
SALEHA HANNUM. Isolation, Cloning, and Expression Analysis of Gene Coding Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) from Melastoma malabathricum L. Supervised by SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO, and ALEX HARTANA.
Melastoma malabathricum L. is an indigenous plant in tropical Southeast
Asia with exceeding tolerance to aluminum (Al) stress in acid soils. Although increasing evidence suggests that Al-stress is accompanied by oxidative damages in plants, little has been described on the antioxidative components in this tolerant plant. Copper/zinc SOD (CuZn-SOD) is one of aluminum-induced genes. Analysis of the expression of genes induced by Al in M. malabathricum requires internal control genes. Actin is belong to housekeeping genes commonly used as an internal control. This study aimed to isolate and clone the cDNA fragment of MmACT encoding for actin of M. malabathricum, and isolate, clone and expression analysis of copper/zinc SOD (CuZn-SOD) from M. malabathricum L. Total RNA was isolated and used as template for cDNA synthesis by reverse transcription. Four of cDNAs clones were isolated, and were called MmACT1, MmACT2, MmACT3, and MmACT4. The size of MmACT1 and MmACT2 is 617 bp, whereas MmACT3 and MmACT4 is 735 bp. The sequence of MmACT cDNAs was registered in GenBank / EMBL / DDBJ database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689. Full length cDNA of MmCuZn-SOD had been successfully isolate by RACE. The size of MmCuZn-SOD is 824 bp that encoded a 152-amino acid polypeptide with a predicted pI value of 5.77, and showed high homology to other cytosolic CuZn-SODs from higher plants. Semi-quantitative RT-PCR showed that MmCuZn-SOD mRNA was highly expressed in the leaf tissues than stem and root. The Al treatment strongly induced the expression of MmCuZn-SOD both in the leaf and root tissues. These results suggested the fortification of the anti-oxidative defense system under Al stress in this acid soil-tolerant wild plant. Overexpression vectors was successfully constructed and each has been introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 by triparental mating (TPM). N.benthamiana and Nicotiana tabacum transgenics had been obtained by mediated-A. tumefaciens. Analysis of segregation of T1 transgenic plants
based on analysis of Khi-Quadrat (2) showed that the T1 transgenic plants accordance with 3:1 of Mendelian inheritance pattern. RNAi vector had been successfully constructed using GATEWAYTM cloning technology and it had been introduced into M. malabathricum L. mediated by Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Transgenic plants analyzes to Al stress showed that in the MS medium containing 1 mM Al (AlCl36H2O), the transgenic plants underwent growth suppression, whereas non-transgenic plants underwent growth normally. These results suggested that suppression of MmCuZn-SOD gene expression by RNAi to M. malabathricum L. caused the plant became sensitive to Al.
Key words : actin gene, aluminum stress, CuZn-SOD gene, Melastoma
malabathricum, RNAi.
RINGKASAN
SALEHA HANNUM. Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum L. Dibimbing oleh SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO, dan ALEX HARTANA.
Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman asli Asia Tenggara yang toleran terhadap cekaman aluminium (Al) pada tanah asam. Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Gen superoxside dismutase (SOD) merupakan salah satu gen yang ekspresinya diinduksi Al. SOD diduga memiliki peran dalam ketahanan M. malabathricum. Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada M. malabathricum L, informasi housekeeping gene dari tumbuhan tersebut juga sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Salah satu housekeeping gene yang populer dijadikan sebagai internal kontrol adalah gen aktin. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari M. malabathricum L, selanjutnya melakukan isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi copper/zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum L, dan mempelajari ekspresi gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi ekspresi berlebih (overekspresi) di tanaman model Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen MmCuZn-SOD melalui RNAi di M. malabathricum L. RNA total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Empat fragment cDNA yang menyandi aktin dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb. Antar keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1% MmACT1, MmACT2, MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha, sementara MmACT4 mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium hirsutum, dan kedua kelompok ini terpisah dengan aktin dari tumbuhan monokotil. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689. Selanjutnya fragmen cDNA yang menyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum juga telah berhasil diisolasi. Gen utuh MmCuZn-SOD yang berhasil diisolasi dengan metode RACE berukuran 824 pb, terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino dengan prediksi nilai pI 5.77. Analisis filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol tanaman tingkat tinggi. Berdasarkan analisis semi-kuantitatif RT-PCR menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, batang dan akar. Perlakuan Al menginduksi ekspresi MmCuZn-SOD baik dalam jaringan daun maupun akar. Untuk mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD, vektor ekspresi telah berhasil dikonstruksi yaitu pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD, dan masing-masing telah diintroduksikan ke Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 melalui metode triparental mating (TPM). Tanaman transgenik N. benthamiana dan N. tabacum yang mengandung gen MmCuZn-SOD telah diperoleh melalui A.
tumefaciens. Analisis segregasi pada tanaman N. benthamiana dan N. tabacum
transgenik generasi T1 berdasarkan analisis Khi-Kuadrat (2) menunjukkan bahwa tanaman transgenik T1 yang diuji sesuai dengan pola pewarisan Mendel 3 : 1. Konstruksi pembungkaman gen MmCuZn-SOD juga telah berhasil dilakukan melalui RNAi. Vektor RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M. malabathricum L. melalui Agrobacterium tumefaciens LBA4404 untuk mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD dalam detoksifikasi cekaman Al. Uji toleransi tanaman transgenik terhadap cekaman Al menunjukkan bahwa pada media MS yang mengandung 1 mM Al (AlCl36H2O), tanaman transgenik mengalami hambatan pertumbuhan sampai mati, sementara non-transgenik tidak mengalami hambatan. Hal ini menunjukkan bahwa penghambatan ekspresi gen MmCuZn-SOD dengan RNAi pada tanaman M. malabathricum L. menyebabkan tanaman menjadi sensitive terhadap Al. Hal ini menjelaskan bahwa gen MmCuZN-SOD diduga berperan penting dalam detoksifikasi Al pada M. malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini isolasi fragmen gen penyandi aktin dari M. malabathricum L, isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum L, dan mempelajari ekspresi gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi ekspresi berlebih (overexpression) di tanaman model Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen MmCuZn-SOD melalui RNAi pada M. malabathricum L merupakan penelitian yang belum pernah dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, keempat topik penelitian di atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini. Kata kunci : cekaman aluminium, gen CuZn-SOD, gen aktin, Melastoma
malabathricum, RNAi.
©Hak Cipta milik IPB, Tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN ANALISIS EKSPRESI GEN PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE
(CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L.
SALEHA HANNUM
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup, 19 Desember 2011: 1. Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc 2. Dr. Ir. Miftahudin, M.Si Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka 3 Januari 2012: 1. Dr. Ir. Satoto, M.S 2. Dr. Sintho W. Ardie
Judul Disertasi : Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum L.
Nama Mahasiswa : Saleha Hannum Nomor Pokok : G361040041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr. Ir. Suharsono, DEA Ketua
Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc Anggota Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr.Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr.
Tanggal Ujian Terbuka : 3 Januari 2012 Tanggal lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji hanya untuk Allah SWT yang telah memberikan
kemudahan dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian
dan penulisan disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang dilakukan di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The
Netherland (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) IPB dan Laboratorium Plant Differentiation and Morphogenesis, Nara
Institute Science and Technology (NAIST) Japan. Disertasi ini memuat hasil
penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi
copper/zinc superoxide dismutase dari tanaman Melastoma malabathricum L.
Shalawat dan salam disampaikan kepada Rasulullah Muhammad SAW atas
keteladanannya.
Selama penelitian ini penulis telah banyak mendapat bantuan dan
bimbingan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan
penghargaan yang tinggi dan ucapan terima kasih kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA selaku ketua komisi pembimbing, Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti
Suharsono, M.Si. dan Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc selaku anggota
komisi pembimbing atas segala bantuan, arahan, dan bimbingan yang telah
diberikan kepada penulis mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan, hingga
penulisan disertasi ini. Demikian juga penulis menyampaikan terimakasih dan
penghargaan yang tinggi kepada Prof. Dr. Akiho Yokota dan Dr. Kinya Akashi
yang telah memberikan arahan, bimbingan, dan fasilitas laboratorium di Nara
Institute Sciences and Technology (NAIST) Japan. Kepada Tim Beasiswa
Pendidikan Pascasarjana (BPPS), Rektor Universitas Sumatera Utara (USU)
Medan, Program Sandwich dan Hibah Pascasarjana dari Ditjen Dikti Depdiknas,
dan Hibah Kompetensi dengan judul:”Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka
perakitan tanaman yang toleran terhadap cekaman asam dan aluminium an.
Dr.Suharsono,DEA dengan nomor kontrak 039/HIKOM/DP2M/2008/ tanggal 13
agustus 2008, 219/SP2H/PP/DP2M/V/2009 tanggal 30 Mei 2009, dan 224/
SP2H/PP/DP2M/III/2010 tanggal 1 Maret 2010, terimakasih atas bantuannya
dalam menyediakan biaya pendidikan dan penelitian.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Rektor, Dekan Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), dan Ketua Jurusan Biologi
Universitas Sumatera Utara Medan, atas izin yang diberikan kepada penulis
untuk melanjutkan pendidikan di SPs IPB; Rektor IPB, Dekan Sekolah
Pascasarjana (SPs) IPB, dan Ketua Program Studi Biologi SPs IPB, atas
kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di SPs
IPB Bogor. Kepada seluruh staf pengajar dan administrasi Sps IPB, penulis
menyampaikan banyak terimakasih atas ilmu dan kelancaran adminstrasi selama
penulis menjadi mahasiswa di SPs IPB. Penulis juga menyampaikan terimakasih
kepada staf PPSHB IPB atas bantuannya dalam kelancaran pelaksanaan
penelitian di laboratorium.
Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan mahasiswa
seperjuangan di Laboratorium BIORIN, yaitu Bu Srilis, Bu Yohana, Pak Ulung,
Bu Ratna, Pak Radit, Bu Ifa, Pak Asri, Muchdar, Anita, Nurul, Ophie, Delih,
Nikson, Ila, Iin, Lian, dan Mia, serta yang telah lulus, yaitu Pak Muzuni, Firdaus,
Agustina, Pak Hadi, Yasinta, Niken, Ulfa, Yassir, Jaya, Zahro, Lulu, Go To, Fajri,
Indah, dan Lita; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan di Program Studi Biologi,
yaitu Bu Iin, Bu Dorly, Bu Nursahara, Bu Sri, dan Bu Ida atas dorongan dan
kerjasamanya. Terimakasih juga disampaikan kepada Pak Mulya, Mbak Pepi,
Pak Adi, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, Bu Dewi, Bu Ika, Bu Emi, Bu Eni,
dan Pak Iri atas bantuan dan kerjasamanya.
Ucapan terima kasih yang tulus ikhlas juga penulis sampaikan kepada
kedua orang tua penulis ayahanda dan ibunda (almarhum) yang senantiasa
mencurahkan cinta dan kasih sayangnya, dan selalu memanjatkan doa demi
kesuksesan penulis, serta dorongan moril sehingga penulis dapat menyelesaikan
pendidikan S3. Semoga Allah swt menyayangi mereka seperti menyayangi
penulis. Kepada kakak, abang, adek, dan keponakan penulis, terimakasih atas
segala perhatian, kasih sayang, pengorbanan, pengertian, dorongan moril, serta
doa yang diberikan kepada penulis selama ini.
Sebagai penutup, semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan dapat
memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan di Indonesia.
Bogor, Januari 2012
Saleha Hannum
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pidoli Dolok pada tanggal 31 Agustus 1971, sebagai
anak ketiga dari enam orang bersaudara pasangan ayahanda H. Muhammad
Saleh Nasution, BA dan ibunda Hj. Masdewa Harahap (alm).
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 12 Kota Padang
Sidimpuan pada tahun 1984, pendidikan menengah dan lanjut di Madrasah
Tsanawiyah dan Madarasah Aliyah Pondok Pesantren K.H.Ahmad Dahlan
Sipirok, Tapanuli Selatan pada tahun 1987 dan 1990. Penulis melanjutkan
pendidikan di Universitas Andalas, Padang jurusan Biologi dan lulus 1996. Tahun
1998 melalui program DUE (Dikti) penulis melanjutkan pendidikan Pascasarjana
pada program studi Biologi di Institut Pertanian Bogor dan lulus 2001. Tahun
2000 penulis diangkat menjadi staf pengajar di Universitas Sumatera Utara,
Medan sampai sekarang. Tahun 2004 penulis mendapat kesempatan untuk
melanjutkan ke jenjang doktor pada program studi Biologi di Institut Pertanian
Bogor. Tahun 2008 penulis mendapat kesempatan melaksanakan penelitian di
Nara Institute Science and Technology (NAIST), Jepang selama 6 bulan melalui
program Sandwich, DIKTI.
BAB I PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lahan asam merupakan salah satu lingkungan yang membatasi produksi
pertanian. Sekitar 50% lebih dari lahan pertanian di dunia adalah lahan asam
(Bot et al. 2000). Sementara Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha tanah
Podsolik Merah Kuning (CSAR 1997) yang bersifat asam dengan kelarutan
aluminium (Al) yang tinggi.
Foy (1988) menjelaskan bahwa kemasaman tanah adalah faktor
cekaman terbesar yang mempengaruhi pertumbuhan tanaman dengan
keberadaan Al merupakan faktor pembatas pertumbuhan pada tanah asam.
Pada pH dibawah 5, Al menjadi terionisasi yang sangat beracun bagi tanaman
(Kinraide & Parker 1990; Kochian et al. 2004; Meriga et al. 2010 ). Aluminium
telah bersifat racun bagi tanaman meskipun konsentrasinya masih sangat
rendah. Walaupun demikian Al yang membentuk ikatan dengan ligand adalah
tidak beracun bagi tanaman seperti aluminium silikat. Bentuk Al yang bersifat
toksik bagi tanaman adalah ion Al3+ yang dominan pada kondisi asam
(Matsumoto 2000; Kochian et al. 2004). Kelarutan Al yang tinggi di dalam tanah
sangat merugikan tanaman karena dapat menghambat pertumbuhan akar
(Delhaize & Ryan 1995; Rout et al. 2001; Kochian et al. 2005).
Tumbuhan yang hidup di tanah asam umumnya adalah tumbuh-
tumbuhan yang dapat beradaptasi dengan lingkungan tersebut. Salah satu jenis
tumbuhan yang banyak dijumpai pada Tanah Podsolik Merah Kuning adalah
Melastoma (Tjitrosoedirdjo 1991). Melastoma merupakan anggota famili
Melastomataceae, tersebar di daerah Tropik Asia dan seluruh Indonesia sebagai
gulma. Salah satu spesiesnya adalah Melastoma malabathricum L. yang banyak
dijumpai di lahan asam. Pertumbuhan akar M. malabathricum L. tidak
mengalami gangguan pada pH 4.0 dan terganggu pada pH 3.0 (Muhaemin
2008). Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada tanah asam yang
tumbuhan lain tidak tumbuh sehingga dapat dijadikan sebagai tumbuhan
indikator pada tanah asam. Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa M.
malabathricum L. mampu mengakumulasi lebih dari 14.4 g Al kg-1 daun tua dan
lebih dari 8 g Al kg-1 daun muda tanpa mengalami keracunan. Analisis
akumulasi Al pada M. affine D.Don. (sinonim dengan M. malabathricum L.) yang
mendapat cekaman 3.2 mM Al pH 4 pada media cair menunjukkan bahwa
2 M.affine D.Don. mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan
perlakuan (Mutiasari 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman
(Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat
dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya
diinduksi Al (Darko et al. 2004), beberapa diantaranya adalah gen-gen yang
mengkode enzim antioksidan, seperti glutathione-S-transferase (GST),
ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide dismutase (SOD)
(Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003; Meriga et al. 2010).
Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis perubahan radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Superoksida merupakan salah satu
radikal bebas turunan (derivate) oksigen reaktif (ROS) yang umumnya terdapat
dalam sel tanaman sebagai hasil samping dari proses metabolisme normal.
Akumulasi radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan makromolekul sel dan
bahkan kematian sel (Bowler et al. 1992; Scandalios 1993). Konsentrasi radikal
bebas di dalam sel tanaman dapat meningkat ketika tanaman merespon
cekaman biotik dan abiotik. Namun tanaman juga memiliki sistem pertahanan
yang dapat mencegah peningkatan radikal bebas ini dengan adanya enzim
antioksidan seperti SOD. Ada tiga tipe enzim SOD sesuai dengan logam yang
berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzimnya, yaitu copper/zinc (CuZn-
SOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (Mn-SOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol,
kloroplas, dan peroksisom; Mn-SOD di mitokhondria; dan Fe-SOD di kloroplas
(Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992; Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al.
1998).
Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman
abiotik, seperti cahaya tinggi dan suhu rendah (Allen et al. 1997), sulfur dioksida
(Tseng et al. 2008), kekeringan (Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), dan
aluminium (Cakmak & Horst 1991; Basu et al. 2001; Du et al. 2010). Brassica
napus yang tahan Al mengekspresikan gen SOD secara berlebih (Basu et al.
2001). Aktivitas enzim SOD juga meningkat dengan cekaman Al pada kedelai
(Cakmak & Horst 1991; Du et al. 2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi
3
(Meriga et al. 2010). Cekaman Al dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan
terbentuknya oksigen radikal (ROS) (Panda et al. 2003).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat
(Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002). Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen
CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3. CSD1 dan CSD2 terekspresi pada
akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan
kloroplas. Sementara target potein CSD3 di peroksisom karena ujung
karboksilnya mengandung tripeptida Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pada M. malabathricum L., beberapa gen yang diduga terlibat dalam
cekaman asam dan Al telah diisolasi seperti multidrug resistance associated
protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono
et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010), dan sitrat sintase
(Mushofa 2011). Namun sampai saat ini belum ada informasi tentang gen CuZn-
SOD pada M. malabathricum L. yang diduga juga terlibat dalam toleransi
terhadap cekaman asam dan Al. Untuk mempelajari ekspresi gen secara
kuantitatif pada M. malabathricum L, informasi housekeeping gene dari
tumbuhan tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini
informasi tersebut belum ada. Menurut Maroufi et al. (2010) aktin termasuk
salah satu kontrol internal yang paling stabil.
Beberapa metode dapat digunakan untuk mengisolasi gen antara lain
melalui penapisan terhadap pustaka genom dan pustaka cDNA, serta RT-PCR
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). Selain itu ada juga yang
menggunakan metode RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) untuk
memperoleh gen utuh, yaitu sintesis cDNA dengan menggunakan mRNA
sebagai cetakan dan sekuen internal yang sudah diketahui urutan nukleotidanya
serta adapter pada ujung 3’ atau 5’ sebagai primer. Metode RACE telah
digunakan untuk isolasi gen utuh (full length) mannose-binding lectin dari umbi
Zephyranthes grandiflora (Kai et al. 2006), gen penyandi Gibberellin 20-Oxidase
dari Helianthus annuus (Carzoli et al. 2008), dan gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari M. malabathricum L. (Muzuni et al. 2010).
Peranan suatu gen dalam tanaman dapat dipelajari minimal dengan
pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen dengan mengkonstruksi
vektor over expression dan pendekatan kedua dengan menghentikan dan
4 menurunkan ekspresi atau pembungkaman gen antara lain dengan
mengkonstruksi vektor RNAi (RNA interference). RNAi menyebabkan mRNA
terdegradasi sehingga gen menjadi tidak berfungsi. Teknologi RNAi telah
digunakan untuk mempelajari peranan gen penyandi H+-ATPase pada M.
malabathricum L. (Muzuni et al. 2011), membungkam gen OsGEN-L pada padi
(Moritoh et al. 2005), dan menurunkan ekspresi gen ornithine decarboxylase
pada tanaman Nicotiana tabacum L. (DeBoer et al. 2011). Pada penelitian ini,
telah dilakukan isolasi dan pengklonan fragmen gen penyandi aktin dari M.
malabathricum L, selanjutnya dilakukan isolasi, pengklonan, dan analisis
ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.
malabathricum L. Ekspresi gen dilakukan di tanaman model Nicotiana
benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen dilakukan di M.
malabathricum L.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Mengisolasi dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari Melastoma
malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen penyandi copper/zinc
superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.malabathricum L. (MmCuZn-SOD).
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi gen MmCuZn-SOD untuk ekspresi berlebih
pada tanaman Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum.
4. Mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi vektor RNAi untuk
pembungkaman gen pada tanaman M. malabathricum L.
Strategi Penelitian
Strategi yang digunakan untuk mencapai tujuan dengan membagi
penelitian menjadi 4 aspek kajian (Gambar 1), yaitu:
1. Mengisolasi dan mengklon gen penyandi aktin dari M. malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen MmCuZn-SOD pada
M. malabathricum L. yang diberi perlakuan cekaman abiotik.
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi untuk ekspresi berlebih gen MmCuZnSOD
pada tanaman model N. benthamiana dan N. tabacum.
4. Mengkonstruksi vektor ekspresi RNAi untuk pembungkaman gen MmCuZn-
SOD pada tanaman M. malabathricum L.
5
Gambar 1. Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, analisis ekspresi, analisis ekspresi berlebih pada tanaman model dan pembungkaman pada M.malabathricum L. gen penyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum L. RACE, Rapid Amplification cDNA Ends; RNAi, RNA interference.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Melastoma malabathricum L.
Melastoma adalah salah satu genus dari famili Melastomataceae yang
termasuk dalam ordo Myrtales. Genus ini terdiri dari 22 spesies yang tersebar di
Asia Tenggara, India, Cina Selatan, Jepang dan Australia Utara (Meyer 2001).
Melastoma malabathricum L. merupakan salah satu spesies tumbuhan berkayu
yang tumbuh di tanah asam dengan keasaman yang sangat tinggi dan miskin
unsur hara (seperti N dan P), dan tersebar di daerah tropis Asia, Australia, dan
Polynesia (Osaki et al. 1997). Di Indonesia tumbuhan ini juga banyak ditemukan
tumbuh di tanah asam, khususnya tanah Podsolik Merah Kuning dengan
kelarutan aluminium (Al) yang tinggi yang menjadi faktor pembatas bagi
pertumbuhan tanaman. Ketahanan tanaman M. malabathricum L. pada tanah
asam berhubungan dengan kemampuannya mengakumulasi Al di daun tanpa
menyebabkan gejala keracunan dan bahkan Al memacu pertumbuhannya
(Watanabe et al. 1998), sehingga tanaman ini dikenal juga sebagai akumulator Al
(Watanabe & Osaki 2002; Watanabe et al. 2005).
Menurut Watanabe et al. (1997), M. malabathricum L. yang ditumbuhkan
pada media cair dengan cekaman Al sebesar 0.5 mM selama 6 minggu mampu
mengakumulasi Al lebih dari 10 g kg-1 pada daunnya, sementara pada daun
muda tanaman ini mengakumulasi Al lebih dari 7 g kg-1. Analisis akumulasi Al
pada M. affine D.Don (sinonim dari M. malabathricum L.) yang mendapat
cekaman 3.2 mM Al pada pH 4 di dalam media cair menunjukkan bahwa M.
affine D.Don mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan
perlakuan (Mutiasari 2008). Tanaman akumulator Al yang lain seperti tanaman
teh (Camellia sinensis (L.) Kuntze) dapat mengakumulasi Al hingga 30 g kg-1
pada daun tua dan 0.6 g kg-1 pada daun muda (Matsumoto et al. 1976). Daun
Hydrangea macrophylla dapat mengakumulasi Al sebesar 3 g kg-1 (Ma et al.
1997).
Tanaman mencegah toksisitas Al melalui mekanisme ekslusi dan
mekanisme toleransi internal. Pada mekanisme ekslusi, Al didetoksifikasi
dengan mengeksudasi senyawa-senyawa organik yang dapat mengikat Al.
Sedangkan dalam mekanisme toleransi internal, Al didetoksifikasi setelah Al
8
diserap tanaman. Bentuk-bentuk kimia Al pada tanaman toleran telah
diidentifikasi menggunakan spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
Menurut Watanabe et al. (1998) bentuk Al pada daun M. malabathricum L.
adalah Al3+, Al-oksalat, Al(oksalat)2, dan Al-(oksalat)3. Sementara Watanabe &
Osaki (2001) menjelaskan bahwa Al diangkut dari akar ke pucuk tanaman M.
malabathricum dalam bentuk kompleks Al-sitrat. Jadi, asam organik dengan
berat molekul kecil memainkan peranan penting dalam detoksifikasi internal pada
jaringan tanaman dan transport Al dari akar ke pucuk melalui pembentukan
kompleks asam organik. Hal yang sama juga ditemukan pada tanaman
akumulator Al lainnya seperti buckwheat (Ma & Hiradate 2000) dan teh (Morita et
al. 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman
(Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat
dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya
diinduksi Al yang telah dilaporkan (Darko et al. 2004). Beberapa diantaranya
adalah gen-gen yang mengkode enzim antioksidan, seperti glutathione-S-
transferase (GST), ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide
dismutase (SOD) (Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003;
Meriga et al. 2010). Pada M. malabathricum L., gen yang diduga terlibat dalam
toleransi tanaman terhadap cekaman asam dan Al telah diisolasi, yaitu multidrug
resistance associated protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein
type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al.
2010), dan sitrat sintase (Mushofa 2011).
Toksisitas Aluminium
Secara normal, aluminium (Al) berada dalam bentuk oksida dan kompleks
aluminosilikat yang tidak larut dan tidak toksik. Pada pH netral, Al membentuk
kompleks dengan ion hidroksida yang tidak larut, sedangkan pada pH asam, Al
berada dalam bentuk Al3+ yang merupakan bentuk Al yang paling toksik (Kinraide
& Parker 1990; Kinraide et al. 1994; Matsumoto 2000). Pada larutan dengan pH
yang lebih rendah dari 5.0, ion Al berada dalam bentuk oktahedral heksahidrat,
Al(H2O)63+, sering disingkat dengan Al3+. Pada larutan yang keasamannya
9
berkurang, Al(H2O)63+ mengalami deprotonasi menjadi Al(OH)2+ dan Al(OH)2
+.
Pada larutan netral menyebabkan Al(OH)3 mengendap dan larut kembali pada
larutan basa dengan membentuk formasi tetrahedral, Al(OH)4- (Delhaize & Ryan,
1995; Marschner, 1995).
Keracunan Al merupakan salah satu kendala dalam produksi tanaman
pada tanah asam. Pada kondisi tersebut umumnya ketersediaan hara dan
kemampuan tanaman untuk menyerap hara sangat terbatas. Dari beberapa
percobaan diketahui bahwa penyerapan P, Ca, Mg, dan K oleh tanaman
berkurang secara nyata. Pada tanaman barley yang ditanam pada media yang
mengandung Al, kandungan Ca2+ dan K+ hanya setengahnya jika dibandingkan
dengan kontrol (Matsumoto et al.1988). Al biasanya meningkatkan kandungan P
pada akar dan menurunkan kandungan P pada pucuk (Liang et al. 2001; Quartin
et al. 2001). Hal ini berhubungan dengan bentuk kompleks antara P dan Al pada
akar yang menghambat transportasi P ke pucuk.
Aluminium dapat mengikat anion anorganik, seperti sulfat, fosfat, fluor,
dan silikat membentuk suatu kompleks yang mempunyai afinitas tinggi terhadap
oksigen atau air (Hodson & Evans 1995). Interaksi antara Al dengan anion
tersebut berpotensi untuk meningkatkan pH perakaran sekaligus dapat membuat
rancu pengaruh toksisitas Al dengan defisiensi unsur tertentu (seperti fosfat)
karena terbentuknya kompleks Al-fosfat (baik di larutan tanah maupun di dalam
sel) yang tidak tersedia bagi tanaman. Kemampuan tanaman untuk dapat
memanfaatkan kandungan P yang rendah secara efisien selalu dihubungkan
dengan sifat toleransi tanaman terhadap cekaman Al. Kation trivalen Al3+
menghambat transport Ca2+ secara efektif ke dalam akar, protoplasma dan
membran vesikel. Hasil studi pada lipid bilayer menunjukkan bahwa Al dapat
memblok Ca2+ dan saluran K+ (Ryan et al. 1997; Jones et al. 1998). Pada akar
barley, perlakuan Al menurunkan kandungan Ca pada membran hingga 50% dan
menyebabkan penurunan aktivitas H+-ATPase dalam menghidrolisis ATP
(Matsumoto & Yamaya 1988).
Pengaruh Aluminium pada Tanaman
Kelebihan konsentrasi Al dalam larutan tanah pada umumnya berakibat
buruk terhadap pertumbuhan tanaman, kecuali beberapa tanaman seperti teh
yang mampu bertahan pada konsentrasi Al tinggi. Gangguan penyerapan hara
10
mineral tanah asam disebabkan dua hal yang sangat berkaitan, yaitu efek
langsung dengan menghambat penyerapan hara secara langsung, dan efek tidak
langsung dengan menghambat pertumbuhan sehingga secara tidak langsung
menghambat penyerapan hara (Marschner 1995).
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa target utama keracunan Al
adalah jaringan akar tanaman (Delhaize & Ryan 1995; Kochian et al. 2004).
Penelitian pada gandum (Triticum aestivum) menggunakan kultivar yang sensitif
Al (Neepawa) dan toleran Al (PT741) menunjukkan bahwa setelah 3 hari
ditumbuhkan pada media yang mengandung berbagai konsentrasi Al, terlihat
penurunan pertambahan panjang akar pada kultivar sensitif sebanyak 57% pada
konsentrasi Al 25 µM, tetapi pada kultivar resisten Al belum berpengaruh (Basu
et al. 1994).
Aluminium banyak ditemukan pada inti dan dinding sel pada tanaman
yang sensitif. Pada dinding sel, penghambatan terjadi karena Al menggantikan
kedudukan Ca2+ pada lamella tengah. Aluminium berikatan dengan molekul
pektin dinding sel atau komponen dinding sel yang bermuatan negatif pada sel-
sel epidermis dan korteks akar (Delhaize et al. 1993; Marienfeld et al. 2000;
Schmohl & Horst 2000; Schmohl et al. 2000; Rout et al. 2001; Kochian et al.
2005). Gugus karboksil bebas pada molekul pektin yang terdemetilasi mengikat
ion Al toksik. Menurut Schmohl et al. (2000), perlakuan enzim pectin
methylesterase (PME) pada suspensi sel Zea mays menurunkan resistensi
terhadap Al, sehingga overekspresi PME pada tanaman kentang transgenik lebih
sensitif terhadap Al daripada non transgenik. Hal ini menunjukkan bahwa
matriks pektin pada apoplas sel-sel apikal akar berperanan penting dalam
memfasilitasi sinyal stress pada sitoskeleton sel-sel tersebut. Akumulasi Al yang
tinggi dalam apoplas akar merupakan karakteristik sensitifitas Al (Rincon &
Gonzales 1992; Schmohl & Horst 2000). Ikatan Al dengan gugus karboksil akan
menimbulkan ikatan yang kuat sehingga sel tidak dapat membesar (Marschner
1995). Pada inti sel, Al berasosiasi dengan DNA sehingga menghentikan proses
pembelahan sel pada meristem apikal (Matsumoto 1991; Rout et al. 2001).
Aluminium dalam bentuk polimer memiliki muatan positif yang besar serta
memiliki banyak situs pengikatan. Polimer Al ini dapat mengikat fosfat yang ada
pada kedua utas DNA, sehingga menghambat proses replikasi (Matsumoto
11
1991). Sedangkan menurut Silva et al. (2000) bahwa Al dapat terakumulasi
dalam nukleus dengan konsentrasi yang rendah.
Pada membran sel, pengaruh Al lebih banyak disebabkan oleh adanya
perubahan atau kerusakan sifat permeabilitas. Pada membran sel akar barley, Al
ditemukan berasosiasi dengan gugus fosfolipid membran yang menyebabkan
kerusakan struktur membran atau perubahan dalam permeabilitas membran. Hal
ini menyebabkan penyerapan hara yang dikatalisis oleh pompa proton menjadi
terhambat (Matsumoto 1991; Rout et al. 2001). Ion Al yang bermuatan positif
dapat berasosiasi dengan gugus fosfat dari ATP atau fosfolipid pada membran
yang akan mempengaruhi efektivitas transport proton (Kochian et al. 2004).
Toleransi Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Tanaman yang toleran terhadap Al tinggi mengembangkan mekanisme
toleransi melalui berbagai cara. Beberapa tanaman toleran Al mengeluarkan
asam-asam organik sebagai bahan pengkhelat Al pada daerah rizosfer.
Beberapa jenis tanaman diketahui mengeluarkan eksudat berupa asam sitrat,
seperti yang terjadi pada Phaseolus vulgaris (Miyasaka et al. 1991) dan kacang
kedelai (Yang et al. 2000). Pada tanaman gandum yang toleran Al
mengeluarkan asam malat dari ujung akarnya (Delhaize et al. 1993). Tanaman
talas mengeluarkan eksudat asam oksalat (Ma & Miyasaka, 1998).
Taylor (1991) menyatakan bahwa resistensi Al dimediasi oleh protein
membran yang secara aktif mengeluarkan Al, sebagai enzim yang terlibat dalam
sintesis atau pengeluaran ligan kelator, atau enzim yang bertanggungjawab
terhadap sintesis komponen seluler yang mempunyai sifat mengubah resistensi
Al. Sopandie et al. (2003), juga mendapatkan tanaman kedelai yang toleran
terhadap Al mengekspresikan suatu protein pada daerah meristem akar.
Beberapa tanaman dapat bertindak sebagai tanaman pengumpul
(akumulator) Al, karena dapat menyerap Al dan mengakumulasinya dalam
jaringan tanaman. Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa tanaman
M. malabathricum L. mampu mengakumulasi Al dalam jaringan mesofil daun
maupun dalam jaringan penyusun akar, terutama pada jaringan epidermis dan
endodermis. Tanaman teh (Camellia sinensis L.) dapat mengakumulasi Al pada
daun tua sebesar 30 g kg-1 (Matsumoto et al. 1976). Sementara tanaman
Conostegia xalapensis yang mengakumulasi Al dalam jaringan epidermis dan
12
mesofil daunnya dapat mengandung 19.000 mg Al kg-1 bobot kering daun
(Gonzalez-Santana et al. 2011).
Gen-Gen yang Berhubungan dengan Toleransi Aluminium
Taylor (1991) mengungkapkan bahwa respon toleransi tanaman terhadap
Al sangat berkaitan dengan gen-gen yang terlibat di dalamnya. Beberapa gen-
gen telah diketahui baik secara langsung maupun tidak langsung mengendalikan
toleransi terhadap Al. Aniol (1995) menunjukkan bahwa pada lengan panjang
kromosom 2D tanaman gandum terdapat faktor genetik yang mencegah
akumulasi Al pada meristem apikal akar. Delhaize et al. (1993) menyatakan
bahwa toleransi Al pada gandum dikendalikan oleh gen dominan Alt yang
mengendalikan ekspresi malat ketika tanaman tersebut mengalami cekaman Al.
Hal yang sama juga dilaporkan Sasaki et al. (2004), bahwa gen ALMT1 yang
terlibat dalam eksudasi malat dapat meningkatkan toleransi terhadap Al pada sel
tembakau. Eksudasi berbagai asam organik seperti malat, sitrat, dan oksalat
terjadi pada tanaman yang diberi cekaman Al (Delhaize et al. 1993; Kidd et al.
2001; Kochian et al. 2005). Pembungkaman gen penyandi H+-ATPase membran
plasma melalui RNAi pada tanaman M. malabathricum L. transgenik
menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi terhadap cekaman 3.2 mM Al dan pH 4
dibandingkan tanaman non transgenik. Hal ini menunjukkan bahwa gen ini
berperan dalam toleransi M.malabathricum L. terhadap cekaman Al (Muzuni
2011).
Delhaize et al. (2004) melaporkan bahwa ekspresi berlebih Al-inducible
malate transporter (ALMT) meningkatkan toleransi Al pada tanaman Hordeum
vulgare. Overekspresi SbMATE yang menyandi putative citrate transporter dapat
meningkatkan toleransi terhadap cekaman Al pada Arabidopsis dan gandum
(Magalhaes et al. 2007; Liu et al. 2009). Gen ALS3 yang menyandi ABC
transporter- like protein juga diperlukan dalam toleransi Al pada Arabidopsis dan
dapat berperan untuk mendistribusikan akumulasi Al dari jaringan yang sensitif
untuk melindungi pertumbuhan akar dari keracunan Al (Larsen et al. 2005).
Cekaman Al dapat menyebabkan pembentukan cekaman oksidatif.
Salah satu mekanisme keracunan Al adalah terjadinya peroksidasi lipid yang
merupakan cekaman oksidatif (Gutteridge et al. 1985; Kochian et al. 2004).
Aluminium dapat menginduksi kompleks gen-gen yang terlibat dalam cekaman
13
oksidatif, sehingga meningkatkan aktivitas beberapa enzim cekaman oksidatif
(Ricards et al. 1998; Cakmak & Horst 1991; Foyer & Noctor 2005).
Richards et al. (1998) telah berhasil mengisolasi gen-gen cekaman
oksidatif dari Arabidopsis thaliana yang ekspresinya terinduksi oleh cekaman Al,
yaitu gen-gen penyandi metallothionein-like protein, glutathione-s-transferase
(GST), peroksidase, dan superoxide dismutase (SOD). Hal yang sama juga
dilakukan oleh Ezaki et al. (1995) yang berhasil mengisolasi gen-gen tembakau
yang menyandikan GST, Peroxidase (PER), dan GDP Dissociation Proteinase
Inhibitors (GDI) yang diinduksi oleh cekaman Al. Pada tanaman kedelai, Anwar
et al. (2000) berhasil mengklon fragmen cDNA dari gen-gen kedelai yang toleran
terhadap cekaman Al, antara lain gmali1 (Glycine max aluminum induced),
gmali14, gmali49, dan gmali50, masing-masing menyandikan H+-ATPase
membran plasma, protein histon H3, NADH-dehidrogenase dan Auxin-induced
protein. Semua gen tersebut di atas terekspresi untuk mempertahankan diri dari
cekaman lingkungan. Pada Melastoma affine (sinonim M. malabathricum),
Suharsono et al. (2009) telah berhasil mengisolasi gen metallothionein type 2
(MaMt2) yang ekspresinya diinduksi oleh cekaman Al (Trisnaningrum 2009).
Superoxide Dismutase (SOD)
Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2 (Bowler et al. 1992; Fridovich 1995;
Tseng et al. 2008). Pada kondisi normal, radikal superoksida yang merupakan
derivat reactive oxygen species (ROS) terdapat di dalam sel tanaman sebagai
produk sampingan dari proses metabolisme. Akumulasi ROS dapat
menyebabkan kerusakan berbagai fungsi seluler seperti kerusakan DNA,
protein, dan peroksidasi lipid, sehingga enzim ini sangat penting sebagai
antioksidan untuk pertahanan pada hampir semua sel yang terpapar oksigen
(Bowler et al. 1992; Fridovich 1995; Dong et al. 2009). Akumulasi ROS dapat
disebabkan oleh berbagai cekaman lingkungan (Allen et al. 1997: Foyer & Noctor
2005).
SOD merupakan enzim antioksidan yang berada pada garis depan
sebagai pertahanan terhadap radikal superoksida (Fridovich 1995). Ada tiga tipe
SOD sesuai dengan logam yang berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif
14
enzimnya, yaitu copper-zinc (CuZn-SOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (Mn-
SOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di
mitokhondria dan Fe-SOD di kloroplas (Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992;
Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al. 1998; Dong et al. 2009). Pemberian logam
Mn, Cu, Zn, atau Fe ke dalam media kultur dapat meningkatkan ekspresi dan
aktivitas SOD. Shi et al. (2005) melaporkan bahwa aktivitas SOD, terutama
aktivitas Mn-SOD meningkat seiring dengan peningkatan Mn pada tanaman
mentimun, sedangkan menurut Fernando and Miguel (2000) aktivitas SOD tidak
dipengaruhi oleh konsentrasi Mn pada padi. Pada Arabidopsis thaliana yang
ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi Cu2+ yang tinggi mampu
meningkatkan aktivitas total SOD (Maria et al. 2007).
Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman
abiotik, seperti cahaya tinggi (Allen et al. 1997) sulfur dioksida (Tseng et al. 2007;
Tseng et al. 2008), ozon (Pitcher and Zilinskas 1996), kekeringan (Mittler &
Zilinskas 1994; Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), suhu rendah (Hernandez-
Nistal et al. 2002; Lee & Lee 2000; Gao et al. 2009), garam ( Sreenivasulu et al.
2000), dan aluminium (Basu et al. 2001; Darko et al. 2004; Du et al. 2010; Meriga
et al. 2010). Tang et al. (2006) dan Lim et al (2007) melaporkan ekspresi gen
CuZnSOD yang meningkat terhadap berbagai cekaman lingkungan pada
tanaman kentang transgenik.
Basu et al. (2001) melaporkan bahwa Brassica napus yang tahan Al
mengekspresikan gen SOD secara berlebih. Aktivitas enzim SOD juga
meningkat dengan cekaman Al pada kedelai ( Cakmak & Horst 1991; Du et al.
2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi (Meriga et al. 2010). Menurut Du et
al. (2010) perlakuan Al meningkatkan aktivitas SOD pada akar dan kalus dari 2
genotipe kedelai (Al-tolerant PI 416937 (PI) dan Al-sensitive Young). Aktivitas
SOD pada kedua genotipe tersebut berbeda dalam merespon cekaman Al dan
bergantung pada konsentrasi Al dan lama perlakuan. Aktivitas SOD pada akar
yang tahan (PI) lebih tinggi dibandingkan akar yang rentan (Young) pada lama
perlakuan cekaman Al 36 atau 48 jam. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan
aktivitas enzim antioksidan merupakan salah satu mekanisme toleransi Al. Pada
akar barley, SOD juga terlibat dalam mekanisme detoksifikasi Al pada dosis
sangat beracun dan perlakuan Al yg panjang (Simonovicova et al. 2004).
15
Peixoto et al. (1999) melaporkan bahwa aktivitas SOD pada akar gandum
yang resisten Al lebih tinggi dibandingkan gandum yang tahan Al pada kondisi
tanpa cekaman Al, namun dengan perlakuan cekaman Al, aktivitas SOD
meningkat lebih tinggi pada kultivar gandum yang tahan dibandingkan yang
resisten. Tingginya peningkatan aktivitas SOD pada gandum yang tahan dengan
perlakuan Al kemungkinan adalah hasil dari peningkatan konsentrasi H2O2.
Salah satu mekanisme toksisitas Al adalah menyebabkan peroksidasi lipid
(Gutteridge et al. 1985; Cakmak & Horst 1991).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat
(Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002). Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen
CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3. CSD1 dan CSD2 terekspresi pada
akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan
kloroplas. Sementara target potein CSD3 di peroksisom karena ujung
karboksilnya mengandung tripeptida Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pengklonan DNA dengan Rekombinasi Situs Spesifik
Teknologi pengklonan DNA sangat penting dalam bidang biologi,
terutama genetika dan biologi molekular. Pengklonan DNA dibutuhkan untuk
analisis fungsional gen dan ekspresi gen. Saat ini telah berkembang teknik
pengklonan DNA dengan menggunakan prinsip rekombinasi situs spesifik yang
lebih efisien dibandingkan dengan teknik pengklonan yang menggunakan enzim
restriksi (Hartley et al. 2000).
Pengklonan sistem Gateway merupakan salah satu metode pengklonan
dengan rekombinasi situs spesifik secara in vitro yang ditemukan dan
dikomersialisasikan oleh Invitrogen sejak akhir 1990-an. Metode Gateway
cloning adalah metode biologi molekuler untuk mentransfer fragmen DNA antar
plasmid dengan efisien menggunakan situs rekombinasi, yaitu situs " gateway
att", dan dua enzim campuran, yang disebut LR Clonase dan BP Clonase.
Gateway cloning secara efektif telah menggantikan enzim restriksi dan ligase.
Sistem ini memerlukan awal penyisipan fragmen DNA ke plasmid dengan dua
sekuens rekombinasi pengapit yang disebut "att L1" dan "att L2", untuk
membentuk Gateway clone entry (Magnani et al. 2006; Karimi et al. 2007;
16
Nakagawa et al. 2007). Metode ini sangat efisien, karena keberhasilannya lebih
dari 90% (Patton 2000; Freuler et al. 2008).
Secara umum, teknologi Gateway melibatkan proses dua-langkah. Gen
target pertama diklon ke entry vector melalui suatu reaksi yang disebut reaksi BP
dengan enzim BP clonase, dan menghasilkan entry clone. Ketika membuat entry
clone, maka perlu untuk mengubah urutan ujung gen target agar kompatibel
dengan situs rekombinasi Gateway (situs pengenalan rekombinase), namun
tidak melibatkan enzim restriksi selama proses pengklonan secara keseluruhan.
Selanjutnya, gen target yang ada di dalam entry vector (entry clone) disubklon ke
destination vector (plasmid biner) melalui reaksi LR menggunakan enzim LR
clonase. Jadi, hanya dengan sekali membuat entry clone, maka entry clone
dapat digunakan ke berbagai plasmid biner sesuai dengan tujuan hanya dengan
reaksi LR, dan ini merupakan salah satu keuntungan dari teknologi Gateway
(Invitrogen Co. 2003 ; Katzen 2007; Xu & Li 2008).
Salah satu entry vector yang tersedia saat ini adalah pENTR™/D-TOPO®
kloning kit (Invitrogen), dengan menambahkan 4 nukleotida (CACC) pada primer
5'-PCR (forward) untuk amplifikasi gen, produk PCR yang berujung rata sudah
terarah untuk diklon ke vektor TOPO untuk menghasilkan clone entry (Gambar
2). Dengan demikian, teknologi TOPO dengan mudah menghasilkan klon entry
(Xu and Li 2008). DNA sasaran yang yang telah tersisipi di klon entry akan lebih
mudah masuk ke vektor biner dengan hanya menggunakan reaksi LR (Hartley et
al. 2000; Patton 2000).
Gambar 2. Vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen 2006).
17
Tekhnologi gateway ini telah diaplikasikan untuk konstruksi vektor dalam
analisis ekpresi berlebih (overexpression) (Karimi et al 2002; Curtis &
Grossniklaus 2003; Earley et al. 2006), antisense (Karimi et al. 2002), RNAi
(Muzuni 2011), analisis promoter (Curtis & Grossniklaus 2003; Earley et al.
2006; Karimi et al. 2007), analisis ekspresi gen induksi (inducible gene) (Joube`s
et al. 2004; Brand et al. 2006; de Schutter et al. 2007), dan analisis ekspresi
beberapa gen (multisite) (Karimi et al. 2005).
RNA interference (RNAi)
RNA interference (RNAi) merupakan potongan kecil RNA yang dapat
menginduksi penghancuran mRNA tertentu sebelum dapat menyandi protein di
dalam sitoplasma. Prinsip dasarnya adalah masuknya double-stranded RNA
(dsRNA) ke dalam sitoplasma akan membungkam ekspresi suatu gen di tingkat
post-transkripsi (Fire et al. 1998; Kalantidis et al. 2008). Pada awalnya, proses
gangguan (interference) menggunakan RNA tidak berhasil, karena para peneliti
mengunakan dsRNA dengan panjang lebih dari 30 nukleotida. Hal ini
menyebabkan supresi dari gen yang tidak seharusnya terbungkam (non-specific
suppression gene). Pada perkembangannya, penggunaan dsRNA dengan
nukleotida yang lebih pendek, 21-23 nukleotida, berhasil membungkam ekspresi
gen yang dikehendaki pada sel mamalia, yang dikenal dengan small interfering
RNA (siRNA) (Fire et al. 1998; Waterhouse et al. 2001; Hannon 2002; Pickford &
Cogoni 2003)
Penghambatan ekspresi gen dengan memasukkan dsRNA ini,
sebenarnya ditemukan secara tidak sengaja oleh Napoli et al (1990) ketika
bermaksud meningkatkan ekspresi warna bunga Petunia. Namun hasil yang
mereka peroleh dengan memasukkan dsRNA yang komplementer dengan gen
yang berperan dalam biosintesia warna bunga tidak seperti yang mereka
harapkan. Ekspresi warna bunga yang diharapkan adalah menjadi ungu tua
sebagaimana umumnya warna bunga Petunia, namun mereka mendapatkan
sebaliknya, yaitu bunga Petunia yang berwarna ungu keputih-putihan
Penemuan ini merangsang berbagai kelompok peneliti mengikutinya dengan
tujuan untuk mempelajari efek tertekannya (suppression) ekspresi gen akibat
introduksi dsRNA ke dalam sel.
18
Mekanisme dasar RNAi dalam membungkam gen berhasil dijelaskan Fire
et al. (1998) dan Montgomery & Fire (1998) dengan menggunakan
Caenorhabditis elegans. Mekanisme ini terdiri dari beberapa proses (Gambar 3):
1. Rantai dsRNA masuk kedalam sitoplasma sel (baik dalam bentuk alami
ataupun sintetis) dan akan langsung dikenali oleh enzim dicer (RNAse tipe
III). Enzim ini akan memotong rantai dsRNA menjadi rantai yang pendek-
pendek (21 pb, termasuk 2 nukleotida dengan ujung 3’ di kedua ujungnya).
2. Dicer-dicer tersebut bersama co-factor lainnya akan sangat aktif
memotong-motong dsRNA sehingga akan terdapat banyak potongan-
potongan kecil dsRNA, yang disebut dengan small interfering RNA
(siRNA) yang masih memiliki rantai ganda.
3. Selanjutnya siRNA akan dikenali dan ditangkap oleh kompleks multi-
protein yang mengandung ribonuklease (ribonuclease-containing multi-
protein complex) atau diistilahkan dengan RNA-Induced Silencing
Complex (RISC). RISC mengandung enzim Argonaut, pada tahap ini
siRNA akan terdenaturasi menjadi utas tunggal yang akan mengaktifkan
RISC.
4. RISC yang aktif akan segera mencari mRNA hasil transkripsi yang keluar
dari inti sel, dan siRNA di dalam RISC akan dengan tepat mengenali target
dan mengikat pasangan basa komplemennya di mRNA.
5. Setiap RISC mengandung aktifitas enzim endonuclease (Argonaut
subunit) yang bertugas memotong target mRNA menjadi bagian-bagian
kecil, sehingga tidak dapat ditranslasi menjadi protein. Pada hewan,
mRNA yang terpotong ini akan teridentifikasi oleh sel sebagai mRNA yang
rusak (aberrant mRNA) dan langsung terdegradasi secara alami dengan
mekanisme endogenous. Sementara pada tumbuhan, potongan-potongan
mRNA ini selain terdegradasi secara alami oleh metabolisme sel, dapat
juga menjadi cetakan yang akan teridentifikasi oleh enzim RNA-dependent
RNA polymerase (RdRp) untuk melakukan polimerisasi dan menjadikan
mRNA yang awalnya berutas tunggal menjadi dsRNA. Selanjutnya
dsRNA ini akan kembali teridentifikasi oleh dicer dan seterusnya berulang-
ulang.
Teknologi RNAi ini telah digunakan untuk mempelajari fungsi suatu gen
pada tanaman (Wesley et al. 2001; DeBoer et al. 2011; Muzuni 2011), menapis
19
gen fungsional untuk mengidentifikasi target terapi pada hewan (Soutchek et al.
2004; Shen et al. 2005; Raoul et al; 2005), pengobatan infeksi virus berbahaya
pada manusia (Leonard & Schaffer 2006; Ma et al. 2007), dan pengobatan terapi
kanker (Yin et al. 2003; Abdelrahim et al. 2006; Pai et al. 2006).
DeBoer et al. (2011) melaporkan bahwa metode RNAi telah digunakan
untuk down-regulate level transkripsi ornithine decarboxylase (ODC) pada
tembakau (N. tabacum). Pembungkaman gen penyandi H+-ATPase pada
M. malabathricum melalui teknik RNAi, dapat menyebabkan penghambatan
pertumbuhan terutama pertumbuhan akar dan daun (Muzuni 2011).
Gambar 3. Model umum tahapan-tahapan dalam mekanisme RNAi (http://www.
ambion.com/techlib/tn/101/7.html)
20
Teknik Transformasi
Metode transformasi pada tanaman dapat dilakukan menggunakan
partikel bombardemen dan menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens
(Dai et al. 2001). Teknik transformasi dengan partikel bombardemen adalah
mentransfer gen yang dioperasikan secara fisik menggunakan partikel yang
dibungkus DNA langsung ke sel atau jaringan tanaman (Klein et al. 1992;Kikkert
et al. 2004). Teknik ini secara ekonomi lebih mahal dibandingkan dengan
menggunakan bakteri A. tumefaciens. Teknik transformasi menggunakan
A. tumefaciens mampu mentransfer gen kedalam eksplan tanaman dan
mempunyai regenerasi tinggi (Hiei & Komari 2008).
Kemampuan bakteri A. tumefaciens mentransformasi sel tanaman
berhubungan dengan adanya T-DNA yang dapat berintegrasi ke dalam genom
tanaman. T-DNA adalah suatu bagian pada tumor inducing (Ti) plasmid yang
terdapat di dalam sel A. tumefaciens. Ti-plasmid berukuran sekitar 200-800 kb
dan T-region (T-DNA)nya sendiri berukuran sekitar 10% nya (10-30 kb). T-region
ini dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border) yaitu right border (RB) dan left
border (LB) yang mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid yang tidak kalah
pentingnya adalah vir-region yang mengandung sejumlah gen-gen virulen (virA,
virB, virC, virD, virE, virF,virG dan virH) yang berfungsi didalam proses transfer
T-DNA ke dalam sel tanaman (Zambryski et al. 1983: Gelvin 2000; Karami et al.
2009).
Interaksi antara A. tumefaciens dengan sel tanaman didahului dengan
penginderaan (sensing) A. tumefaciens terhadap sel yang luka. Mekanisme ini
terjadi secara kimiawi dimana sel tanaman yang luka menghasilkan suatu
metabolit yang berperan sebagai isyarat bagi A. tumefaciens. Metabolit tersebut
dapat berupa senyawa gula, asam, asam amino atau senyawa fenol (Tinland
1996; Karami et al. 2009). Adanya isyarat tersebut maka A. tumefaciens akan
bergerak aktif menuju ke sel sasaran. Gerakan yang bersifat kemotaksis ini
dipandu oleh senyawa yang disekresikan oleh sel tanaman rentan yang luka.
Interaksi dilanjutkan dengan adanya kontak antara A. tumefaciens dengan sel
tanaman sasaran. Untuk memperkuat kontak tersebut A. tumefaciens
mengeluarkan suatu metabolit yaitu β-1-2-glukan. Beberapa gen dalam
kromosom A. tumefaciens diketahui merupakan penyandi enzim yang berperan
21
dalam sintesis berbagai suatu senyawa glukan, yaitu chvA, chvB, dan exoC
(Sheng & Citovsky 1996; Tinland 1996; Gelvin 2000).
Tahap selanjutnya adalah induksi faktor virulensi (vir) yang akan
mengatur proses pemotongan dan transfer T-DNA kel sel tanaman. Beberapa
metabolit yang disekresi oleh tanaman, akan menginduksi faktor virulensi.
Metabolit tersebut adalah asetosiringon, hidroksi asetosiringone, koniferil alkohol
dan etil firulat (Gelvin 2000; Kumar et al. 2006; Sarangi et al. 2011). Proses
transfer T-DNA diwali dengan dideteksinya senyawa fenol dari sel tanaman yang
luka oleh A. tumefaciens. Hal ini menyebabkan terjadinya proses aktivasi
ekspresi gen virulensi. Protein dari virA ini akan menginduksi fosforilasi produk
dari virG yang selanjutnya mengaktifkan ekspresi berbagai vir lainnya. Protein
yang dihasilkan oleh gen vir akan memotong T-DNA pada kedua sekuen
berulang yang mengapit T-DNA yaitu batas kiri (LB) dan batas kanan (RB).
Transfer bersifat polar, yaitu bergerak dari batas kanan ke batas kiri. Jika batas
kanan dibuang maka transfer T-DNA tidak akan terjadi, tetapi jika batas kiri yang
dibuang maka transfer T-DNA tetap terjadi. Selama induksi, T-DNA dipotong
tepat pada utas bawah di dalam batas berulang oleh protein virD. Akibat
kejadian ini dihasilkan utas T yang berutas tunggal, kemudian utas tunggal ini
dipindahkan melalui membrane bakteri ke dalam sitoplasma sehingga
terintegrasi ke dalam genom tanaman inang (Sheng & Citovsky 1996; Gelvin
2000; Karami et al. 2009).
Hal penting dalam proses transformasi melalui A. tumefaciens ini adalah
transfer T-DNA ke inti tanaman target yang diinduksi oleh ekspresi gen-gen vir
serta ekspresi gen-gen yang tertransformasi. Selain itu, integrasi T-DNA yang
membawa transgen ke dalam genom resipien, akan mengalami sedikit
pengaturan kembali secara intra dan intermolekuler, untuk memulihkan sistim
transkripsi dan translasi genom tanaman resipiennya. Transformasi melalui
A. tumefaciens lebih menjamin kestabilan genom tanaman resipien (Slamet-
Loedin 1994; Sheng & Citovsky 1996; Gelvin 2003).
Transfer dengan sistim A. tumefaciens ini biasanya menggunakan vektor
biner (binary vector). Pada sistem ini digunakan dua plasmid, yaitu plasmid Ti
yang mengandung bagian virulen, dan plasmid kedua yang mengandung T-DNA
dan gen yang disisipkan. Alasan penggunaan vektor biner adalah sulitnya
22
menemukan sisi pemotongan yang unik dengan enzim restriksi pada plasmid Ti
yang berukuran sangat besar (Slamet-Loedin 1994).
Agrobacterium adalah bakteri yang hidup bebas dalam tanah dan dapat
menimbulkan penyakit pada tanaman yang terinfeksi. Pada budidaya pertanian
penyakit ini tergolong penting dan sebagian besar terjadi pada tanaman dikotil.
Menurut Miller & Bassler (2001) terdapat dua species Agrobacterium yang
bersifat patogen yaitu A. tumefaciens sebagai penyebab penyakit tumor (crown
gall) dan A. rhizogenes sebagai penyebab penyakit akar rambut (hairy root) pada
berbagai tanaman dikotil yang peka.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam transfer gen yaitu konstruksi
gen dengan jenis promoter yang tepat dan dapat terekspresi pada jaringan target
yang diinginkan, kemampuan jaringan target untuk menerima gen asing, dan
kemampuan beregenerasi dari jaringan target. Keberhasilan transformasi
genetik tanaman ditandai dengan terintegrasinya gen yang diintroduksikan ke
dalam genom tanaman dan terekspresi serta tetap terpelihara dalam seluruh
proses pembelahan sel sampai regenerasi tanaman. Untuk pembuktian
terintegrasinya gen asing, umumnya digunakan gen penanda, misalnya gen gus
yang menyandikan β-glucuronidase, yang ekspresinya ditunjukkan dengan
timbulnya warna biru setelah uji histokimia (Jefferson et al. 1987). Untuk
mengetahui integrasi gen kedalam tanaman juga dapat dilakukan dengan
menggunakan marka seleksi resistensi terhadap antibiotik (Hiei & Komari 2008).
Aktin
Aktin adalah protein yang sangat penting bagi sel eukariotik. Protein ini
berperan penting dalam membentuk jaringan yang memberikan dukungan
mekanik sel, menentukan bentuk sel, pergerakan sel, dan juga pembelahan sel
(Vantard & Blanchoin 2002; Blessing et al. 2004). Aktin juga penting dalam
morphogenesis sel pada tumbuhan, sebagai komponen dinding sel, terlibat
dalam pertumbuhan rambut akar, sel trikom, tabung pollen, perpanjangan sel
dan apikal meristem (Gilliland et al. 2003). Kehilangan ekspresi gen ACT11 pada
jaringan vegetatif dapat menyebabkan perubahan morfologi organ tanaman
Arabidopsis (Kandasamy et al. 2002), dan pembungkaman gen aktin GhACT1
pada tanaman kapas menyebabkan terhambatnya pemanjangan serat kapas (Li
et al. 2005). Aktin mengontrol pertumbuhan sel melalui berbagai interaksi
23
dengan protein lain seperti actin depolarizing factor (Chen et al. 2002) dan Rho
family GTPase (Fu et al. 2002).
Aktin disandi oleh multigene family pada tanaman (Li et al. 2005; Feng et
al.2006). Pada Arabidopsis thaliana, famili gen aktinnya terdiri dari 10 gen yang
berbeda, delapan diantaranya adalah gen fungsional dan dua gen adalah
pseudogen (McDowell et al. 1996). Li et al. (2005) telah mengisolasi 15 gen
aktin (GhACT) dari kapas.
Pada Arabidopsis ada dua kelompok gen aktin yaitu kelompok vegetatif,
yang diekspresikan dominan pada daun, batang, akar, petal, dan sepal, dan
kelompok generatif yang diekspresikan secara kuat pada pollen, ovule, dan
jaringan embrionik (McDowell et al. 1996; Kandasamy et al. 1999). Gen-gen
aktin Arabidopsis tersebut tersebar di kromosom 1, 2, 3, dan 5 (McKinney et al.
1996). Adapun pada kedelai dikenal dengan mu-aktin, kappa-aktin, dan lambda-
aktin (McLean et al. 1990).
Gen aktin termasuk housekeeping gene (Tu et al. 2007), yaitu gen yang
memiliki tingkat eksperesi yang stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan
perkembangan. Sifat gen yang seperti ini menjadikan gen aktin digunakan
sebagai kontrol internal pada analisis ekspresi, khususnya analisis ekspresi gen
dengan metode qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain reaction)
yang merupakan metode analisis ekspresi yang berkembang saat ini (Bas et al.
2004). Gen aktin adalah salah satu gen yang paling sering digunakan sebagai
internal kontrol pada studi qRT-PCR (Bezier et al. 2002; Thomas et al. 2003;
Chen et al. 2010).
Gen aktin telah digunakan sebagai kontrol ekspresi gen pada kentang
(Nicot et al. 2005), kedelai (Jan et al. 2008), gandum (Paolacci et al. 2009),dan
padi (Zhang et al. 2009). Menurut Maroufi et al. (2010), aktin termasuk salah
satu kontrol internal yang paling stabil pada uji ekspresi gen di daun dan akar
Cichorium intybus. Hal yang sama direkomendasikan untuk uji ekspresi gen
pada padi (Ambavaram & Preira 2011) dan uji ekspresi gen perkembangan
bantalan buah pada kurma China (Sun et al. 2009). Bahkan Olbrich et al. (2008)
hanya merekomendasikan aktin sebagai kontrol internal untuk qRT-PCR pada
tanaman Fagus sylvatica L., setelah menguji kestabilan beberapa housekeeping
gene, yaitu aktin, 18 rRNA, glyceraldehyd 3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH1, GAPDH2), a-tubulin,dan ubiqitin like protein.
BAB III ISOLASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI AKTIN
DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak
Melastoma malabathricum L. adalah tumbuhan akumulator aluminium (Al) yang dapat tumbuh baik pada tanah asam dengan kelarutan Al yang tinggi, sehingga dapat digunakan sebagai tanaman model untuk toleransi terhadap cekaman aluminium dan asam. Ekspresi gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada tanaman M. malabathricum memerlukan gen kontrol internal. Aktin adalah termasuk gen housekeeping yang biasa digunakan sebagai kontrol internal. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengklon fragmen cDNA MmACT yang menyandi aktin dari M. malabathricum. RNA total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Empat fragment cDNA yang menyandi aktin dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb. Antar keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1% MmACT1, MmACT2, MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha, sementara MmACT4 mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium hirsutum, dan kedua kelompok ini terpisah dengan aktin dari tumbuhan monokotil. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor
aksesi AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689.
Abstract
Melastoma malabathricum is accumulator plant of aluminum (Al) which can grow well in acidic soil with high Al solubility, thereby it can be used as a model plant for tolerance to aluminum and acid stresses. Analysis of the expression of genes induced by Al in M. malabathricum requires internal control genes. Actin is belong to housekeeping genes commonly used as an internal control. This study aimed to isolate and clone the cDNA fragment of MmACT encoding for actin of M. malabathricum. Total RNA was isolated and used as template for cDNA synthesis by reverse transcription. Four cDNA fragments encoding for actin from M. malabathricum have been isolated and inserted into plasmid pGEM-T Easy. Four of cDNAs clones were isolated, and were called MmACT1, MmACT2, MmACT3, and MmACT4. The size of MmACT1 and MmACT2 is 617 bp, whereas MmACT3 and MmACT4 is 735 bp. Comparing among these four actin cDNA showed that they are about 78%-99% similarities based on nucleotide sequence and about 98%-100% similarities based on amino acid sequence. Analysis of phylogenetic relationship based on amino acid sequence showed that at 1% dissimilarity the MmACT1, MmACT2, MmACT3 and the ACT5 Populus trichocarpha are clustered in one group, while the MmACT4 is grouped with ACT9 P. trichocarpa and ACT1 Gossypium hirsutum, and these two groups are separated with actin group of monocotyl plants. The sequence of MmACT cDNAs was registered in GenBank / EMBL / DDBJ database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689.
Keywords: actin gene, cDNA, cloning, internal control gene, Melastoma
malabathricum L.
26
Pendahuluan
Aktin adalah protein yang sangat penting bagi sel eukariotik. Protein ini
berperan penting dalam membentuk jaringan yang memberikan dukungan
mekanik sel, menentukan bentuk sel, pergerakan sel, dan juga pembelahan sel
(Vantard & Blanchoin 2002; Blessing et al. 2004). Aktin juga penting dalam
morfogenesis sel pada tumbuhan, sebagai komponen dinding sel, terlibat dalam
pertumbuhan rambut akar, sel trikom, tabung pollen, perpanjangan sel dan apikal
meristem (Gilliland et al. 2003).
Gen aktin termasuk housekeeping gene (Tu et al. 2007; Chen et al. 2010),
yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang stabil di berbagai jaringan pada
semua tahapan perkembangan. Sifat gen yang seperti ini menjadikan gen aktin
digunakan sebagai kontrol internal pada analisis ekspresi, khususnya analisis
ekspresi gen dengan metode qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain
reaction) yang merupakan metode analisis ekspresi yang berkembang saat ini.
Gen aktin telah digunakan sebagai kontrol ekspresi gen pada kentang (Nicot et
al. 2005), kedelai (Jan et al. 2008), dan padi (Zhang et al. 2009). Aktin termasuk
salah satu kontrol internal yang paling stabil pada uji ekspresi gen di daun dan
akar pada tanaman Cichorium intybus (Maroufi et al. 2010) dan akar tanaman
Eucommia ulmoides Oliver (Chen et al. 2010).
Melastoma malabathricum adalah tumbuhan yang dapat tumbuh dengan
baik pada tanah asam dengan konsentrasi aluminium (Al) yang tinggi (Watanabe
et al. 1998; Watanabe et al. 2002). Tumbuhan ini sangat toleran terhadap
cekaman asam dan Al, sehingga sangat baik digunakan sebagai tanaman
model untuk toleransi terhadap asam dan Al. Untuk mempelajari ekspresi gen-
gen pada M. malabathricum, informasi housekeeping gene dari tumbuhan
tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini informasi
tersebut belum ada. Sementara itu, beberapa gen dari M. malabathricum yang
diduga terlibat dalam toleransi tumbuhan tersebut terhadap cekaman asam dan
Al seperti, multidrug resistance associated protein (Suharsono et al. 2008),
metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), dan H+-ATPase membran
plasma (Muzuni et al. 2010) belum dipelajari ekspresinya. Penelitian ini
bertujuan untuk mengisolasi dan mengklon gen aktin dari M. malabathricum.
27
Bahan dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun tumbuhan M.
malabathricum yang tumbuh di lahan asam Jasinga Bogor Jawa Barat.
Fragmen cDNA yang menyandi aktin M. malabathricum diisolasi dengan PCR
menggunakan degenerate primer untuk aktin tumbuhan (McDowell 1996) yaitu
PlAc46S (5’-ATGGTNGGNATGGGNCARAA-3’) sebagai forward primer, dan
PlAc245N (5’-GTDATNACYTGNCCRTCNGG-3’) dan PlAc284N (5’-
ATRTCNACRTCRCAYITCATDAT-3’) sebagai reverse primer. Plasmid pGEM-T
Easy (3015 pb) (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan. E. coli DH5α
digunakan sebagai inang dari plasmid rekombinan.
Metode Penelitian
Isolasi RNA Total. Isolasi RNA mengikuti metode CTAB (Suharsono et
al. 2008) yang dimodifikasi. Daun sebanyak 0.1 g digerus dengan bantuan
nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan dimasukkan
ke tabung 1.5 ml yang telah berisi 500 µl buffer ekstraksi (2 % CTAB, 2% PVP
40000, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl dan 1% β-mercapto
ethanol), kemudian divortex dan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit.
Sebelum ditambahkan 1 x volume kloroform:isoamil alkohol (24:1), suspensi
didinginkan terlebih dahulu. Campuran kemudian divortex dan disentrifugasi
pada kecepatan 18000 x g (TOMY MX-205) pada suhu 4oC selama 10 menit.
Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru, ditambahkan 0.25
volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu -30oC selama 2.5 jam. Campuran
disentrifugasi pada 18000 x g pada suhu 4oC selama 15 menit. Cairan dibuang,
dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µl TE (10 mM Tris pH 7.4, 1
mM EDTA) dan ditambahkan 1 x volume phenol pH 9, divortek dan disentrifugasi
pada 18000 x g pada suhu 20oC selama 10 menit. Cairan bagian atas yang
mengandung RNA total diambil, dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan
diekstraksi kembali dengan 1 x volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1),
divortek dan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g suhu 4oC selama 10
menit. Cairan bagian atas diambil, dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru,
kemudian ditambah dengan 0.25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu
30oC selama 2.5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g, suhu
28 4oC selama 15 menit. Endapan RNA total dibilas dengan 500 µl alkohol 70% dan
disentrifugasi pada 18000 x g suhu 4oC selama 5 menit. Endapan RNA total
dikeringkan dengan vaccum dryer, dan disuspensikan di dalam dH2O. Kualitas
dan kuantitas RNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan RNA total dianalisis dengan
elektroforesis pada gel agarose 1% di dalam larutan penyangga TAE 1x.
Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip)
setelah diwarnai dengan EtBr (0.5 µg/ml) selama 15 menit dan dibilas dengan
air.
Sintesis cDNA Total. Sintesis cDNA total dilakukan dengan
mencampurkan 1 µg RNA total, 10 pmol oligo(dT), dan ditambah dH2O untuk
volume total reaksi 20 µl, kemudian inkubasi di 65oC selama 5 menit dan 4oC
selama 5 menit. Selanjutnya, ke dalam campuran ditambahkan 1x RT buffer,
1mM dNTP, 40 U RNAse inhibitor, dan 100 U enzim ReverTraAce (Toyobo).
Campuran diinkubasi 42oC selama 30 menit, 99oC 5 menit, dan 4oC 5 menit.
Isolasi Fragmen cDNA MmACT. Fragmen cDNA MmACT diisolasi
dengan PCR menggunakan degenerate primer untuk aktin tumbuhan (McDowell
1996) yaitu PlAc46S sebagai forward primer, dan PlAc245N dan PlAc284N
sebagai reverse primer. Komposisi PCR untuk amplifikasi cDNA MmACT adalah
1µl cDNA, 1x buffer taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer forward, 10 pmol
primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (Toyobo), dan dH2O dengan
volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR pada suhu 94oC
selama 5 menit, denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada
52oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 1 menit, dengan 30
siklus, dan pasca PCR pada 72oC selama 5 menit, diikuti dengan 15oC selama
10 menit.
Pengklonan Fragmen cDNA MmACT. Fragmen MmACT diligasikan
dengan pGEM-T Easy (Promega Inc.) dengan mencampur 1 µl hasil PCR, 25 ng
pGEM-T Easy, 1.5 U T4 DNA ligase, 2.5 µl 2x rapid buffer ligasi, dan dH2O
dalam volume total 5 µl, dan diinkubasi 1 jam dalam suhu ruang. Hasil ligasi
diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5α mengikuti prosedur Suharsono
(2002).
Seleksi E.coli yang Mengandung Vektor Rekombinan. E. coli galur
DH5α yang mengandung pGEMT-Easy rekombinan diseleksi menggunakan
antibiotik ampisilin dan seleksi biru putih. Konfirmasi koloni putih mengandung
29 vektor rekombinan yang tersisipi fragmen MmACT dilakukan menggunakan PCR
koloni dan memotong plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1 (Promega Inc.).
Pengurutan DNA dan Analisis Urutan DNA. Pengurutan DNA
dilakukan dengan menggunakan automatid DNA sequencer (ABI Prism 3700
squencer, Perkin Elmer, USA). Analisis kesejajaran cDNA MmACT dilakukan
menggunakan program BLAST (Altschul et al. 1997). Analisis phylogenetik
dilakukan dengan menggunakan program MEGA4 (Tamura et al. 2007).
Hasil dan Pembahasan
Isolasi RNA Total
RNA total telah berhasil diisolasi dari daun muda tanaman M.malabathricum.
Berdasarkan pengukuran spektrofotometer, rasio OD260/OD280 dari RNA total
adalah 1.91 yang menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai
kemurnian yang tinggi. Elektroforesis RNA total untuk analisis keutuhannya
menunjukkan adanya 2 pita RNA yang dominan (Gambar 4). Kedua pita ini
adalah RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S. Hasil ini menunjukkan bahwa RNA
total yang diisolasi ini mempunyai keutuhan yang tinggi sehingga sangat baik
digunakan sebagai cetakan (template) untuk sintesis cDNA total.
Gambar 4. RNA total dari daun M. malabathricum. Isolasi Fragmen cDNA MmACT Melalui PCR PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer degenerate
PlAc46S dan PlAc245N menghasilkan fragmen cDNA berukuran sekitar 600 pb
dan dengan primer PlAc46S dan PlAc284N menghasilkan 750 pb (Gambar 5).
Fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT (aktin M. malabathricum).
PCR dgn primer reverse PIAc245N menghasilkan fragmen cDNA yang
lebih pendek (600 pb) dibanding primer reverse PIAc284N (750 pb),
menunjukkan bahwa letak primer PIAc245 N lebih ke arah hulu (ujung 5’)
dibanding primer PIAc284N. Hasil ini sesuai dengan posisi primer yang
30 digunakan pada struktur umum gen aktin Arabidopsis thaliana, yang
menunjukkan bahwa primer PIAc254N berada lebih ke arah hulu dari primer
PIAc284N (McDowell et al. 1996).
Gambar 5. Fragmen MmACT hasil PCR menggunakan primer PlAc46S dan
PlAc245N (1), dan primer PlAc46S dan PlAc284N (2). Pengklonan Fragmen MmACT ke dalam Plasmid pGEM-T Easy Fragmen cDNA kandidat MmACT yang berukuran sekitar 600 pb dan 750
pb telah diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy di tengah gen lacZ dan hasil
ligasi telah diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5α, dan diseleksi di media
seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. E.coli yang tumbuh di
media seleksi mengandung plasmid, koloni yang berwarna putih mengandung
plasmid rekombinan, dan koloni yang berwarna biru mengandung plasmid non-
rekombinan. Adanya sisipan fragmen MmACT di tengah lacZ menyebabkan gen
lacZ yang menyandi β-galactosidase (β-gal) yang berfungsi mengubah substrat
X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru, tidak diekspresikan sehingga
E.coli yang mengandung plasmid rekombinan menjadi berwarna putih.
Empat koloni putih, yaitu masing-masing dua koloni dari klon rekombinan
yang tersisipi fragmen 600 pb dan dua koloni dari klon rekombinan yang tersisipi
750 pb dikonfirmasi dengan PCR . PCR terhadap koloni putih menghasilkan
fragmen DNA yang berukuran 600 pb dan 750 pb (Gambar 6). Hasil ini
menunjukkan bahwa koloni putih mengandung fragmen MmACT. Untuk
memastikan bahwa fragmen MmACT tersisip di dalam plasmid pGEM-T Easy,
DNA plasmid telah diisolasi dari koloni putih.
Gambar 6. PCR koloni dari fragmen target 750 pb (1 & 2) dan 600 pb (3 & 4).
31 Pemotongan terhadap DNA plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1
yang mengapit daerah penyisipan menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen
DNA berukuran 3000 pb dan 600 pb untuk klon rekombinan yang tersisipi
fragmen cDNA 600 pb, dan untuk plasmid yang tersisipi fragmen cDNA
berukuran 750 pb, menghasilkan fragmen DNA 3000 pb dan 750 pb. Fragmen
DNA berukuran 3000 pb adalah vector pGM-T Easy, sementara pita yang
berukuran 600 pb dan 750 pb merupakan fragmen MmACT (Gambar 7). Hasil ini
menunjukkan bahwa keempat fragmen MmACT telah berhasil disisipkan ke
dalam pGEM-T Easy.
Gambar 7. Verifikasi DNA plasmid rekombinan target 600 pb (1 & 2) dan 750 pb (3 & 4) dengan enzim restriksi EcoR1.
Analisis Fragmen MmACT Pengurutan DNA terhadap ke empat fragmen MmACT menghasilkan
urutan DNA (sequence) yang berbeda antara satu sisipan dengan sisipan
lainnya. Hal ini terjadi karena primer yang digunakan untuk isolasi MmACT
adalah primer degenerate yang memungkinkan menghasilkan fragmen DNA
yang urutan nukleotidanya berbeda. Selain itu, aktin juga disandi oleh famili gen
pada tanaman (Li et al. 2005; Feng et al.2006). Famili gen aktin pada A.
thaliana, terdiri dari 10 gen yang berbeda, delapan diantaranya adalah gen
fungsional dan dua gen adalah pseudogen (McDowell et al. 1996). 15 gen aktin
(GhACT) pada kapas telah berhasil diisolasi (Li et al. 2005).
Keempat sisipan yang berbeda ini selanjutnya disebut MmACT1, MmACT2,
MmACT3, dan MmACT4. Pengurutan nukleotida fragmen MmACT1 dan
MmACT2 menghasilkan 617 pb dan menyandikan 192 asam amino, sementara
MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb dan menyandikan 231 asam amino.
Antar keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki 78%-99% kemiripan
32 nukleotida (Tabel 1), dan antar keempat MmACT memiliki kemiripan asam amino
sekitar 98%-100%.
Tabel 1. Persentase (%) kemiripan nukleotida antar cDNA MmACT
cDNA MmACT1 MmACT2 MmACT3
MmACT1 100 MmACT2 99 100 MmACT3 89 89 100 MmACT4 78 78 80
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida MmACT
menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 memiliki kemiripan 83%
dengan bagian aktin 7 Populus trichocarpa, MmACT3 memiliki kemiripan 83%
dengan aktin 5 P. trichocarpa (XM_002316253), dan MmACT4 memiliki
kemiripan 87% dengan aktin 9 P. trichocarpa (XM_002331844).
Adanya kesamaan yang tinggi (83%%-87%) fragmen MmACT dengan
urutan nukleotida gen aktin tanaman lain yang telah lebih dahulu diisolasi (bank
data) menunjukkan bahwa fragmen MmACT yang telah diisolasi dari
M.malabathricum adalah kandidat gen aktin. Keempat fragmen MmACT ini telah
didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ, masing-masing dengan nomor
aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB500689 (Lampiran 1).
Keempat fragmen gen aktin ini adalah gen aktin yang pertama diisolasi dari M.
malabathricum. Gen aktin ini sangat penting untuk analisis ekspresi gen dari
tanaman M. malabathricum, khususnya untuk analisis ekspresi gen secara
kuantitatif. Analisis ekspresi gen secara kuantitatif dengan qRT-PCR
memerlukan gen referensi sebagai kontrol internal. Gen aktin umum digunakan
sebagai kontrol internal untuk analisis qRT-PCR pada kentang (Nicot et al.
2005), kedelai (Jan et al. 2008), padi (Zhang et al. 2009), dan C. intybus (Maroufi
et al. 2010). Analisis ekspresi semua gen dari tanaman M. malabathricum dapat
menggunakan keempat gen MmACT ini.
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan asam amino menunjukkan
bahwa asam amino MmACT memiliki kemiripan yang tinggi dengan aktin P.
trichocarpa, bahkan MmACT4 memiliki kemiripan 100% dengan bagian gen aktin
9 P. trichocarpa. Untuk melihat hubungan genetik MmACT dengan aktin dari
33 tanaman lain, analisis filogenetik yang berdasarkan pada urutan asam amino
telah dilakukan (Gambar 8).
Gambar 8. Hubungan filogenetik antara aktin Melastoma malabathricum (Mm),
Populus trichocarpa (Pt), Gossypium hirsutum (Gh), Arabidopsis thaliana (At), Oryza sativa (Os), Zea mays (Zm) dan Musa acuminate AAA Group (Ma). Angka menunjukkan ketidakmiripan .
Analisis hubungan filogenetik menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan
sekitar 1% MmACT1, MmACT2, dan MmACT3 mengelompok dengan ACT5 P.
trichocarpa dan terpisah dengan MmACT4 yang mengelompok dengan ACT9 P.
trichocarpha dan ACT1 Gossypium hirsutum. Gen aktin tumbuhan monokotil,
yaitu Oryza sativa, Zea mays, dan Musa acuminate AAA Group mengelompok
dan terpisah dari tumbuhan dikotil. Sementara gen aktin A. thaliana
mengelompok dengan yang lain pada ketidakmiripan lebih dari 2%. Hasil ini
semakin menguatkan bahwa fragmen cDNA yang diisolasi dari M. malabathricum
adalah fragmen gen aktin.
Berdasarkan struktur umum gen aktin pada A. thaliana (McDowell et al.
1996), maka MmACT yang diisolasi dalam penelitian ini terletak di daerah antara
ekson 2 dan ekson 3 (Gambar 9). Posisi MmACT di antara ekson 2 dan ekson 3
ini sangat penting dalam mendesain primer aktin yang digunakan untuk verifikasi
keberhasilan cDNA yang bebas dari kontaminasi DNA genom (Muzuni et al.
2010). Sepasang primer yang didesain berdasarkan dua daerah ekson yang
berbeda yang mengapit daerah intron dapat digunakan untuk mengetahui
keberhasilan sintesis dan kemurnian cDNA. Amplifikasi dengan cetakan cDNA
34 yang murni menghasilkan ukuran yang berbeda dibandingkan dengan
menggunakan cetakan cDNA yang terkontaminasi oleh DNA genom. cDNA yang
murni akan menghasilkan fragmen DNA aktin yang ukurannya lebih pendek
dibandingkan dengan cDNA yang terkontaminasi DNA genom, karena hasil
amplifikasi cDNA yang murni tidak mengandung intron.
Gambar 9. Posisi fragmen MmACT dalam struktur umum gen aktin A. thaliana
(McDowell et al. 1996).
Simpulan
Empat fragmen cDNA aktin dari M. malabathricum yang berhasil diisolasi
berukuran 617 pb (MmACT1, MmACT2) dan 735 pb (MmACT3, MmACT4).
Keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-
99% , dan kemiripan asam amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan
filogenetik berdasarkan urutan asam amino aktin menunjukkan bahwa keempat
fragmen MmACT ini mengelompok dengan ACT P. tricocharpa. Fragmen
MmACT terletak diantara ekson 2 dan ekson 3 pada struktur umum gen aktin
A.thaliana. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data
GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688,
dan AB500689.
BAB IV ISOLASI, PENGKLONAN, DAN EKSPRESI GEN PENYANDI
COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE PADA Melastoma malabathricum L.
Abstrak
Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman asli Asia Tenggara yang toleran terhadap cekaman aluminium (Al) pada tanah asam. Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Gen superokside dismutase (SOD) merupakan salah satu gen yang ekspresinya diinduksi Al. SOD diduga memiliki peran dalam ketahanan M. malabathricum. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengkarakterisasi dan menguji ekspresi cDNA MmCuZn-SOD yang menyandi copper/zinc superokside dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum. RNA total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang menyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi. Gen utuh MmCuZn-SOD yang berhasil diisolasi dengan metode RACE berukuran 824 pb, terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino dengan prediksi nilai pI 5.77. Analisis filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol tanaman tingkat tinggi. Berdasarkan analisis semi-kuantitatif RT-PCR menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, batang dan akar. Perlakuan Al menginduksi ekspresi MmCuZn-SOD baik dalam jaringan daun maupun akar.
Abstract
Melastoma malabathricum L. is an indigenous plant in tropical Southeast
Asia with exceeding tolerance to aluminum (Al) stress in acid soils. Although increasing evidence suggests that Al-stress is accompanied by oxidative damages in plants, little has been described on the antioxidative components in this tolerant plant. In this study, the cDNA structure and expression profile of MmCuZn-SOD, encoding copper/zinc SOD (CuZn-SOD), are characterized in this plant. MmCuZn-SOD encoded a 152-amino acid polypeptide with a predicted pI value of 5.77, and showed high homology to other cytosolic CuZn-SODs from higher plants. Semi-quantitative RT-PCR showed that MmCuZn-SOD mRNA was highly expressed in the leaf tissues than stem and root. The Al treatment strongly induced the expression of MmCuZn-SOD both in the leaf and root tissues. These results suggested the fortification of the anti-oxidative defense system under Al stress in this acid soil-tolerant wild plant. Keywords: aluminum stress, Melastoma malabathricum L., superoxide
dismutase
Pendahuluan
Lahan asam merupakan salah satu lingkungan yang membatasi
pertumbuhan tanaman khususnya tanaman pertanian. Sekitar 50% lebih dari
lahan pertanian di dunia adalah lahan asam (Bot et al. 2000). Sementara
36
Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha tanah Podsolik Merah Kuning (CSAR
1997) yang bersifat asam dengan kelarutan aluminium (Al) yang tinggi.
Aluminium pada lahan asam dapat bersifat toksik bagi tumbuhan (Delhaize &
Ryan 1995), namun ada juga tumbuhan yang mampu hidup pada kondisi ekstrim
ini (Watanabe et al. 2005).
Melastoma malabathricum L. adalah tumbuhan yang banyak ditemukan di
daerah tropis Asia Tenggara terutama di lahan asam dengan konsentrasi Al yang
tinggi. Tumbuhan ini mampu mengakumulasi Al di daun lebih dari 10.000 mg Al
kg-1 berat daun kering, dan tidak meyebabkan gejala keracunan dan bahkan Al
memacu pertumbuhannya (Watanabe et al. 1998). Tumbuhan ini diduga
mempunyai sistem pertahanan terhadap cekaman asam dan Al, sehingga sangat
penting sebagai sumber gen toleransi Al untuk merakit tanaman yang toleran
terhadap asam dan kadar Al tinggi.
Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem
toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya diinduksi Al yang
telah dilaporkan (Darko et al. 2004). Beberapa diantaranya adalah gen-gen yang
mengkode enzim antioksidan, seperti glutathione-S-transferase (GST),
ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide dismutase (SOD)
(Ezaki et al. 2000). Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok
metalloenzim yang mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis
dismutase radikal superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Ada tiga tipe enzim
SOD sesuai dengan kofaktornya, yaitu copper/zinc (CuZn-SOD), besi (Fe-
SOD), dan manganese (Mn-SOD). CuZn-SOD pada umumnya ditemukan di
sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di mitokondria dan Fe-SOD di
kloroplas (Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992; Bueno et al. 1995;
Kliebenstein et al. 1998).
Basu et al. (2001) melaporkan ekspresi berlebih gen SOD pada Brassica
napus yang tahan Al. Aktivitas enzim SOD juga meningkat dengan cekaman Al
pada kedelai (Cakmak & Horst 1991) dan gandum (Darko et al. 2004). Gen
penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat (Perl-
Treves et al. 1988), Brassica (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002). Tiga gen CuZnSOD telah diisolasi dari tanaman
Arabidopsis thaliana, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3. CSD1 dan CSD2
terekspresi pada akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di
sitosol dan kloroplast. Sementara CSD3 di peroksisom karena ujung
37
karboksilnya mengandung tripeptida Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pada M. malabathricum L., telah diisolasi gen yang diduga terlibat dalam
cekaman asam dan Al, yaitu multidrug resistance associated protein (MRP)
(Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009),
H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010), dan sitrat sintase (Mushofa
2011). Namun sampai saat ini belum ada informasi tentang gen CuZn-SOD
pada Melastoma yang diduga juga terlibat dalam toleransi terhadap cekaman
asam dan Al. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menganalisis ekspresi gen
CuZn-SOD pada M. malabathricum L.
Bahan dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan tanaman untuk mengisolasi gen CuZn-SOD adalah M.
malabathricum L. yang berasal dari habitat asli tanah asam Jasinga, Bogor,
Indonesia. Analisis ekspresi gen MmCuZn-SOD menggunakan benih M.
malabathricum L. yang diambil dari Jasinga-Bogor dan ditumbuhkan dalam
chamber (16 jam terang dan 8 jam gelap, suhu sekitar 25°C - 35°C, dan
kelembaban 50%-60%) di NAIST (Nara Institute of Science and Technology)
Jepang. Setelah berumur 4 bulan, tanaman diperlakukan dengan cekaman Al.
Cekaman dilakukan dengan menyiramkan larutan AlCl3 pH 4 pada media
(tanah) tanaman dengan konsentrasi 0.4, 0.8, 1.6, dan 3.2 mM selama 7 hari.
Metode Penelitian
Isolasi RNA. Isolasi RNA mengikuti metode CTAB (Suharsono et al.
2008) yang dimodifikasi seperti pada BAB III.
Sintesis cDNA Total. cDNA total disintesis menggunakan Superscript III
Reverse Transcriptase (Invitrogen). Komposisi sintesis cDNA total adalah 1µg
RNA total, 1x RT Buffer, 20 pmol oligodT, 4 mM dNTP, 10mM DTT, 40 U enzim
SuperScript TMIII RTase dan air DEPC dengan volume reaksi 20 µl. Sintesis
cDNA dilakukan pada suhu 42 oC selama 50 menit.
Isolasi gen CuZn-SOD. Fragmen cDNA CuZn-SOD telah diisolasi
dengan PCR menggunakan sepasang primer degenerate (primer forward
SODF3; 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GCW GTT YTK A- 3’, dan primer reverse
38
SODR4; 5’-ADG GCT GCA RRC CAA TRA TAC CAC A-3’) yang didesain
berdasarkan cDNA copper/zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari
beberapa tumbuhan dikotiledon. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose
1% (w/v) dengan larutan penyangga 1x TAE (0,9 mM Tris-HCl dan 2 mM EDTA
pH 7.6). Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan di atas transluminator UV
(Hoever) dan difoto menggunakan kamera digital yang dihubungkan ke
komputer dengan menggunakan program Digidoc. Selanjutnya fragmen cDNA
disisipkan ke dalam vektor pGEM®-T-Easy (Promega, Madison, WI, USA)
mengikuti prosedur Promega. Klon putih diverifikasi dengan PCR, kemudian
diisolasi plasmidnya. Plasmid diverifikasi lagi menggunakan enzim EcoR1.
Plasmid diurutkan menggunakan DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer,
Perkin Elmer, Massachusetts, USA). ABI Prism Model 3100 Versi 3.7
Ujung 5’- dan 3’- dari cDNA CuZn-SOD diisolasi dengan metode 5’-
RACE dan 3’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) System ( Invitrogen,
California, USA) mengikuti prosedur Invitrogen. Primer-primer yang digunakan
telah didesain dari urutan cDNA fragmen MmCuZn-SOD. Fragmen cDNA hasil
amplifikasi dengan 3’- dan 5’- RACE disisipkan ke pGEM-T Easy vektor
(Promega, Madison, WI, USA) dan ditransformasi ke E. coli strain DH5α. Klon
target diurutkan dengan DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin
Elmer, Massachusetts, USA).
Analisis urutan cDNA CuZn-SOD. Urutan basa nukleotida dan deduksi
asam amino CuZn-SOD dianalisis homologinya dengan database gen di
GenBank menggunakan program NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Analisis kesamaan deduksi asam
aminonya dengan CuZn-SOD lain menggunakan program Clustal W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html), filogenetik menggunakan
program MEGA4, dan analisis hidrofobisitas dengan program FASTA
(http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1).
Analisis ekspresi gen CuZn-SOD . Analisis ekspresi gen CuZn-SOD
pada M.malabathricum dengan metode semi-quantitative reverse transcriptase-
polymerase chain reaction (RT-PCR). RNA diisolasi dari daun dan akar
M.malabathricum yang telah diperlakukan dengan cekaman aluminium. cDNA
total disintesis menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen).
Ekspresi gen CuZn-SOD diuji dengan sepasang primer spesifik MmCuZn-SOD
dengan target berukuran 200 pb (MmCuZn-SOD-F2: 5’-CCG TTG GAG ATG
39
ACG GTA CT; MmCuZn-SOD-R1 : 5’-TTA ACC CTG GAG ACC AAT GAT- 3’).
Untuk standar ekspresi menggunakan primer spesifik aktin (forward, 5’-ATG
GTN GGN ATG GGN CAR AA-3’; reverse, 5’-ATR TCN ACR TCR CAW TCA
TDA T- 3’).
Hasil dan Pembahasan
Isolasi RNA Total
RNA total dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi dari daun, batang,
pucuk dan akar (Gambar 10). Pengujian kemurnian RNA total dari kontaminan
protein menunjukkan bahwa RNA total daun, batang, pucuk, dan akar yang
diperoleh mempunyai rasio OD260/OD280 1.85, 1.82, 1.91 dan 1.87 berturut-turut.
Analisis keutuhan RNA total yang dilakukan dgn elektroforesis menunjukkan
bahwa RNA yang telah diisolasi dalam keadaan utuh karena terdapat 2 pita
rRNA (28S dan 18S).
Gambar 10. RNA total dari daun (1), batang (2), pucuk (3) dan akar (4). Isolasi Fragmen cDNA CuZn-SOD dengan PCR RNA total yang telah diisolasi digunakan sebagai cetakan untuk sintesis
cDNA melalui proses transkripsi balik. Reverse transcription (RT) PCR dengan
primer oligo(dT)n, hanya mRNA yang dapat disintesis menjadi cDNA melalui
transkripsi balik, karena mRNA mempunyai poli(A) pada ujung 3’ sedangkan
rRNA dan tRNA tidak mempunyai poli(A). PCR cDNA total pucuk Melastoma
menggunakan spesifik SODF3 dan SODR4 menghasilkan fragmen cDNA
berukuran sekitar 450 pb. Fragmen ini disebut sebagai fragmen MmCuZn-SOD
yang merupakan fragmen kandidat gen penyandi CuZn-SOD dari M.
malabathricum L.
Fragmen MmCuZn-SOD telah diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy di
tengah gen lacZ dan hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli galur
DH5α, yang kemudian diseleksi di media seleksi yang mengandung antibiotik
ampisilin, X-gal dan IPTG. E. coli yang dapat bertahan hidup di media seleksi
40
mengandung plasmid, dan koloni E. coli yang berwarna putih di media seleksi
adalah E. coli yang mengandung plasmid rekombinan, dan yang berwarna biru
adalah E. coli yang mengandung plasmid non-rekombinan. Gen lacZ menyandi
β-galactosidase (β-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna
menjadi berwarna biru. Bila fragmen MmCuZn-SOD menyisip di dalam gen lacZ,
maka gen lacZ tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E.coli berwarna putih.
Bila tidak ada penyisipan pada lacZ, maka koloni yang terbentuk berwarna biru.
Adanya fragmen MmCuZn-SOD di dalam koloni E. coli putih dikonfirmasi
dengan PCR-koloni. PCR-koloni terhadap koloni putih menghasilkan pita DNA
yang berukuran sekitar 450 pb yang menunjukkan bahwa koloni putih
mengandung fragmen MmCuZn-SOD. Untuk memastikan fragmen MmCuZn-
SOD adalah kandidat gen CuZn-SOD, DNA plasmid rekombinan telah diisolasi
dari koloni putih, kemudian dilakukan pengurutan DNA.
Pengurutan DNA terhadap fragmen MmCuZn-SOD menghasilkan 457 pb
(Gambar 11). Analisis kesejajaran berdasarkan urutan nukleotida dengan bank
data di GenBank dengan program BLASTn menunjukkan bahwa fragmen
MmCuZn-SOD mempunyai kesamaan 83% dengan CuZn-superoksida
dismutase Codonopsis lenceolata , 82% dengan CuZn-SOD Populus trichocarpa
dan cytosolic CuZn-SOD Mesembryanthemum crystallinum, dan 81% dengan
cytoplasmic CuZn-SOD P. suaveolens dan CuZn-SOD Arachis hypogaea (Tabel
2).
1 TTGGTGAAGG CTGTGGCTGT TCTTGGCAAC AGCGAGGGTG TGAGCGGCAC TGTCTACTTC
61 ACTCAAGAAG GAGATGGACC CACTACTGTG ACTGGGAGTC TTTCAGGCTT GAAGCCTGGA
121 CTCCACGGTT TCCATGTCCA TGCTCTTGGG GACACTACCA ACGGCTGCAT GTCTACTGGA
181 CCTCACTTCA ATCCTGCCGG AAAGGAGCAT GGTGCCCCTG AAGATGAGAA CCGGCATGCA
241 GGTGACTTGG GCAATGTCAC CGTTGGAGAT GACGGTACTG CTACATTCAC CATCACAGAC
301 AAGCAGATTC CTCTCTTTGG ACCTAACTCT ATTATTGGAA GGGCTGTTGT TGTCCATGCT
361 GATCCTGATG ATCTCGGAAA GGGTGGCCAT GAACTCAGCA AGTCGACTGG CAATGCTGGT
421 GGAAGGATTG CTTGTGGTAT CATTGGTCTG CAGCCTT
Gambar 11. Urutan basa fragmen MmCuZn-SOD .
Adanya kesamaan yang tinggi (81%-83%) fragmen MmCuZn-SOD dengan
urutan gen CuZn-SOD tumbuhan lain yang telah lebih dahulu diisolasi
(Genbank) menunjukkan bahwa fragmen MmCuZn-SOD yang telah diisolasi dari
M.malabathricum adalah kandidat gen CuZn-SOD.
41
Tabel 2. Analisis kesejajaran fragmen nukleotida MmCuZn-SOD dengan program BLASTn.
No Aksesi Deskripsi Score Query
coverage E-value
Max Ident
1 AY833718.1 Codonopsis lanceolata CuZn superoxide dismutase (SODCc) mRNA, complete cds
327 98% 2e-86 83%
2 EF405967.1 Populus trichocarpa Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) mRNA, complete cds
313 98% 4e-82 82%
3 U80069.1 Mesembryanthemum crystallinum cytosolic CuZn-superoxide dismutase (SODcyt1) mRNA, complete cds
309 98% 4e-81 82%
4 DQ481231.1 Populus suaveolens cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase mRNA, complete cds
304 98% 2e-79 81%
5 DQ097721.1 Arachis hypogaea Cu-Zn superoxide dismutase mRNA, complete cds
304 98% 2e-79 81%
Isolasi gen utuh MmCuZn-SOD
Berdasarkan fragmen MmCuZn-SOD yang telah diperoleh (Gambar 11),
dirancang primer untuk mengisolasi ujung 5’ dan 3’ gen MmCuZn-SOD, yaitu
primer SOD-3race (ACT TCA CTA CAA GAA GGA GAT GGA C) dari basa ke 56
sampai dengan 79, SOD-3race-nested (ATG TCT ACT GGA CCT CAC TTC AAT
C) dari basa ke 169 sampai dengan 193, SOD-5race1 (AGT CGA CTT GCT
GAG TTC AT) reverse komplemen dari basa ke 389 sampai dengan 408 , dan
SOD-5race2 (GTC TGT GAT GGT GAA TGT AGC AGT A ) dari basa ke 276
sampai dengan 300. Gen utuh MmCuZn-SOD dari M.malabathricum telah
berhasil diisolasi dengan ukuran sebesar 824 pb dengan metode 5’ RACE dan
3’RACE (Gambar 12) dan telah disisipkan di plasmid pGEMT-Easy yang
dinamakan pGEM-MmCuZn-SOD (Gambar 13).
Urutan nukleotida MmCuZn-SOD telah didaftarkan ke bank data
GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500685. cDNA utuh MmCuZn-
SOD terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam
amino, mulai dari kodon awal ATG (nukleotida ke-115) dan berakhir pada kodon
akhir TAA (nukleotida ke-571). MmCuZn-SOD memiliki sinyal poliadenilasi
putatif AATAAT, 67 pb setelah kodon akhir. Poliadenilasi dikenal sebagai
mekanisme regulasi yang utama pasca transkripsi pada eukariot.
cDNA ujung 5’ dari MmCuZn-SOD mempunyai urutan kodon akhir TAA
(posisi nukleotida 94-96) di depan kodon awal metionin yang ada pada posisi
115-117, yang merupakan indikasi bahwa MmCuZn-SOD tidak memiliki peptida
transit untuk target kloroplas. Hal ini menunjukkan bahwa lokasi protein yang
42
ditranslasi dari gen MmCuZn-SOD yang telah diisolasi adalah di sitosol bukan di
kloroplas. Deduksi asam amino MmCuZn-SOD memiliki berat molekul sekitar
15.3 kDa dengan perkiraan titik isoelektrik adalah 5.77.
ttgaacgaacgacacaacaacgacacaacagtcctcatcgtactgctcggcgtcgtcttc
ccattttctcttcgaactcgataaggggtgctctgagatcacaggattaagaggatggtg
M V
aaggctgtggttgttcttggcaacagcgagggtgtgagcggcactgtctacttcactcaa
K A V V V L G N S E G V S G T V Y F T Q
gaaggagatggacccactactgtgactgggagtctttcaggcttgaagcctggactccac
E G D G P T T V T G S L S G L K P G L H
ggtttccatgtccatgctcttggggacactaccaacggctgcatgtctactggacctcac
G F H V H A L G D T T N G C M S T G P H
ttcaatcctgccggaaaggagcatggtgcccctgaagatgagaaccggcatgcaggtgac
F N P A G K E H G A P E D E N R H A G D
ttgggcaatgtcaccgttggagatgacggtactgctacattcaccatcacagacaagcag
L G N V T V G D D G T A T F T I T D K Q
attcctctctttggacctaactctattattggaagggctgttgttgtccatgctgatcct
I P L F G P N S I I G R A V V V H A D P
gatgatctcggaaagggtggccatgaactcagcaagtcgactggcaatgctggtggaagg
D D L G K G G H E L S K S T G N A G G R
attgcttgtgggatcattggtctccagggttaagctacctctgctacgcttccgccatgt
I A C G I I G L Q G -
ctcctagaggtgctatgttggactgtttaccttgtctcgaataattgtggcaccctgtct
cccttatgcttagaactttctgctcttgcgattgtacaaaatggtgcaaatgtgctgagt
ataatttcagtgtaaaaccaaaccgggtgttactgatcttgggtttagacaagtggttgt
tgttgggttggatctactttgcttagcttaacagtggatcatgcaaaaaaaaaaaaaaaa
Gambar 12. Urutan nukleotida gen utuh MmCuZn-SOD dan deduksi asam
aminonya, dengan ORF (open reading frame) dari nukleotida ke-115 sampai dengan 573. Huruf tertulis miring adalah kodon akhir pada 5’UTR MmCuZn-SOD. Huruf dalam kotak menunjukkan kodon awal dan kodon akhir. Nukleotida yang digaris bawahi adalah sinyal poliadenilasi putatif.
Gambar 13. Peta plasmid pGEM-MmCuZn-SOD (3839 pb) yang terdiri dari vektor pGEM-T Easy (3015 pb) dan cDNA MmCuZn-SOD (824pb).
43
Analisis Kemiripan
Deduksi asam amino MmCuZn-SOD telah dibandingkan dengan protein
CuZn-SOD baik yang sitosol maupun kloroplas dari tanaman Gossypium
hirsutum dan Arabidopsis thaliana (Gambar 14). Urutan asam amino MmCuZn-
SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan protein CuZn-SOD sitosol dari
Gossypium hirsutum (ABA00453; kemiripan 92%) dan Arabidopsis thaliana
(NP172360; kemiripan 85%). Sebaliknya, MmCuZn-SOD memiliki kemiripan
yang lebih rendah dengan CuZn-SOD kloroplas Gossypium hirsutum
(ACC93637; kemiripan 68%) maupun Arabidopsis thaliana (AAD10208;
kemiripan 66%).
Urutan deduksi asam amino MmCuZn-SOD juga memiliki residu-residu
yang dibutuhkan untuk koordinat copper (His-42, -45, -62, dan -119) dan zinc
(His-62, -70, -79, dan Asp-82), demikian juga dengan dua residu sistein (C-56
dan C-145) yang merupakan bentuk ikatan disulfida tunggal. Residu-residu
tersebut merupakan urutan yang konservatif yang telah dilaporkan ada pada gen
CuZn-SOD (Shin et al. 2005). Residu konservatif sistein berperan penting untuk
fungsi enzim dan proses signaling, khususnya respon terhadap lingkungan.
Gambar 14. Kesejajaran urutan asam amino MmCuZn-SOD dengan asam amino CuZn-SOD sitosol dan kloroplast dari Gossypium hirsutum dan Arabidopsis thaliana. Residu asam amino yang terkonservasi berada dalam kotak. Residu domain Cu ditandai dengan segitiga tertutup, residu domain Zn ditandai dengan segitiga terbuka, dan residu sistein dengan lingkaran tertutup.
Berdasarkan analisis hirofobisitas, MmCuZn-SOD menunjukkan profil
yang sama dengan CuZn-SOD sitosol Gossypium hirsutum (Gambar 15). Kurva
44
yang berada di atas 0 menunjukkan fragmen yang bersifat hidrofobik dan
dibawah 0 bersifat hidrofilik. Hasil analisis ini menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD
bersifat hidrofilik, karena sebagian besar dari kurva profil hidrofobisitas Kyte &
Doolittle berada pada daerah di bawah 0.
Gambar 15. Profil hidrofobisitas MmCuZn-SOD dan CuZn-SOD sitosol Gossypium hirsutum menggunakan skala Kyte & Doolittle.
Analisis filogenetik menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD mengelompok
menjadi satu group dengan CuZn-SOD sitosol dan terpisah dengan group CuZn-
SOD kloroplas (Gambar 16). Hasil analisis ini semakin menguatkan bahwa
MmCuZn-SOD adalah CuZn-SOD sitosol.
Gambar 16. Hubungan filogenetik MmCuZn-SOD dengan CuZn-SOD sitosol dan kloroplas dari R. communis (EEF49740), M. xiaojinensis (AT66935), G.hirsutum (ABA00453), P. trichocarpa (ABK93317), M. truncatula (ACJ83988), A. thaliana (NP172360), A.thaliana-chl (AAD10208), G. hirsutum-chl (ACC93637), S. lycopersicum-chl (P14831), dan B. gymnorhiza-chl (CAM98444).
45
Analisis Ekspresi Semi-kuantitatif MmCuZn-SOD berdasarkan RT-PCR
Pola ekspresi MmCuZn-SOD pada berbagai jaringan tanaman M.
malabthricum telah diuji menggunakan analisis reverse transcriptase-polymerase
chain reaction (RT-PCR) dengan primer forward (MmCuZn-SOD-F1: 5’-CCG
TTG GAG ATG ACG GTA CT) dan reverse (MmCuZn-SOD-R1 : 5’-TTA ACC
CTG GAG ACC AAT GAT- 3’) yang telah didesain dari ORF MmCuZn-SOD .
Gen MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, akar dan batang ( Gambar
17). Ekspresi pada daun lebih tinggi dibanding jaringan lainnya. Untuk
membuktikan bahwa pita yang terdeteksi adalah mRNA bukan DNA genom,
maka cDNA tanpa enzim RT (reverse transcriptase) digunakan sebagai kontrol.
Jika ada pita terdeteksi pada kontrol menunjukkan bahwa RNA total yang
diisolasi terkontaminasi DNA. Tidak adanya pita yang terdeteksi pada kontrol
menunjukkan bahwa tidak ada kontaminasi DNA genom pada ekspresi tersebut.
Kleibenstein et al. (1998) telah melaporkan bahwa gen AtSOD2 yang
merupakan gen SOD yang diisolasi dari Arabidopsis, terekspresi pada daun,
batang dan akar tanaman Arabidopsis.
Gambar 17. Pola ekspresi MmCuZn-SOD pada daun (L), akar (R), dan batang (S). (+ =cDNA dengan RT, - = cDNA tanpa RT sebagai kontrol).
Ekspresi gen MmCuZn-SOD pada Melastoma yang mendapat perlakuan
cekaman aluminium telah diamati pada jaringan daun (Gambar 18A) dan akar
(Gambar 18B). Analisis RT-PCR menunjukkan bahwa tingkat ekspresi MmCuZn-
SOD meningkat dengan perlakuan cekaman Al baik pada daun maupun akar.
Pada kedua jaringan tersebut ekspresi MmCuZn-SOD berangsur meningkat
sejalan dengan peningkatan konsentrasi AlCl3 yang diberikan, dan ekspresi
tertinggi telah nampak pada perlakuan 0.8 sampai 3.2 mM AlCl3. Hasil ini
menunjukkan bahwa Al menginduksi ekspresi gen CuZn-SOD sitosol pada M.
malabathricum.
46
Gambar 18. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD dengan cekaman aluminium
pada M. malabathricum. A. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD pada daun, B. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD pada akar. Gen aktin M. malabathricum digunakan sebagai kontrol internal untuk menstandarkan jumlah RNA yang digunakan.
Boscolo et al. (2003) telah melaporkan bahwa aktivitas SOD pada akar
tanaman yang sensitif Al meningkat hampir sejalan dengan peningkatan
perlakuan konsentrasi Al3+. Peningkatan aktivitas SOD ini menunjukkan bahwa
Al3+ menginduksi pembentukan radikal superoksida. Hal ini mengindikasikan
bahwa Al3+ menginduksi sel untuk inisiasi sintesis SOD. Hasil yang sama telah
dilaporkan pada tanaman kedelai (Cakmak & Horst 1991; Du et al. 2010 ).
Menurut Du et al. (2010) peningkatan aktivitas enzim antioksidan SOD
merupakan salah satu mekanisme toleransi Al.
Simpulan
Gen CuZn-SOD dari M. malabathricum (MmCuZn-SOD) telah berhasil
diisolasi dan berukuran 840 pb. Gen MmCuZn-SOD terdiri dari 459 pb ORF
yang menyandi 152 deduksi asam amino berdasarkan analisis blastp. Berat
massa proteinnya sekitar 15.3 kDa dengan perkiraan titik isoelektrik adalah 5.77.
MmCuZn-SOD adalah CuZn-SOD sitosol. MmCuZn-SOD terekspresi
pada jaringan daun, akar dan batang. Perlakuan cekaman Al meningkatkan
ekspresi MmCuZn-SOD pada daun dan akar M.malabathricum. Cekaman Al
menginduksi ekspresi gen CuZn-SOD sitosol pada M.malabathricum.
BAB V KONSTRUKSI VEKTOR DAN REKAYASA EKSPRESI
BERLEBIH GEN MmCuZn-SOD PADA Nicotiana benthamiana DAN N. tabacum
Abstrak
Radikal bebas yang berlebihan dapat membahayakan tanaman. Namun secara normal, tanaman mempunyai strategi yang sistematis untuk menanggulangi pembentukan radikal bebas atau untuk mempercepat degradasi senyawa tersebut yaitu sistem pertahanan preventif bersifat enzimatis seperti enzim superoksida dismutase (SOD). Teknologi rekayasa genetik memberikan peluang untuk mengetahui ekspresi gen SOD dengan mengintroduksikannya ke tanaman. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi vektor ekspresi berlebih gen CuZn-SOD dari Melastoma malabathricum (MmCuZn-SOD) dan mengintroduksikannya ke tanaman model Nicotiana benthamiana dan N. tabacum. Vektor ekspresi telah berhasil dikonstruksi yaitu pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD, dan masing-masing telah diintroduksikan ke Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 melalui metode triparental mating (TPM). Tanaman transgenik N. benthamiana dan N. tabacum yang mengandung gen MmCuZn-SOD telah diperoleh melalui A. tumefaciens. Analisis segregasi pada tanaman N. benthamiana dan N. tabacum transgenik generasi T1 berdasarkan
analisis Khi-Quadrat () menunjukkan bahwa tanaman transgenik T1 yang diuji sesuai dengan pola pewarisan Mendel 3 : 1.
Abstract
Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as by products of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic mechanisms such as superoxide dismutase (SOD). While genetic engineering technology provides the opportunity to study expression of SOD in plant. This study aimed to construct the overexpression vector of MmCuZn-SOD and introduce into Nicotiana benthamiana and N. tabacum. Overexpression vectors (pMSH-MmCuZn-SOD and pGWB-MmCuZn-SOD) was successfully constructed and each has been introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 by triparental mating (TPM). N.benthamiana and N. tabacum transgenic plants that overexpress MmCuZn-SOD gene have been obtained by mediated-A. tumefaciens. Analysis of segregation of T1 transgenic plants based on analysis of
Khi-Quadrat () showed that the T1 transgenic plants accordance with 3:1 of Mendelian inheritance pattern. Key words: Overexpression vector, CuZn-SOD, Nicotiana benthamiana,
Nicotiana tabacum.
Pendahuluan
Radikal bebas sangat diperlukan bagi kelangsungan beberapa proses
fisiologis dalam tanaman, terutama untuk transportasi elektron. Pada kondisi
normal, radikal bebas yang merupakan derivat reactive oxygen species (ROS)
48
terdapat di dalam sel tanaman sebagai produk sampingan dari proses
metabolisme (Foyer & Noctor 2005). Namun radikal bebas yang berlebihan
dapat membahayakan tanaman karena dapat merusak makromolekul dalam sel
seperti karbohidrat, protein, DNA dsb. Kerusakan makro molekul selanjutnya
dapat mengakibatkan kematian sel (Halliwel & Gutteridge, 1999; Apel & Hirt
2004). Salah satu faktor yang dapat menyebabkan meningkatnya radikal bebas
pada tanaman adalah cekaman lingkungan abiotik.
Secara normal, tanaman mempunyai strategi yang sistematis untuk
menanggulangi pembentukan radikal bebas atau untuk mempercepat degradasi
senyawa tersebut, yaitu sistim pertahanan preventif yang bersifat enzimatis
seperti enzim superoxide dismutase, catalase, dan glutation peroxidase
(Fridovich 1975; Bowler et al. 1992; Fridovich 1995; Apel & Hirt 2004; Dong et al.
2008). Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Pada kondisi normal, radikal bebas
superoksida yang merupakan derivat reactive oxygen species (ROS) terdapat di
dalam sel tanaman sebagai produk sampingan dari proses metabolisme. Ada
tiga tipe SOD sesuai dengan kofaktornya, yaitu copper/zinc (CuZn-SOD), besi
(Fe-SOD), dan mangan (Mn-SOD). CuZn-SOD pada umumnya ditemukan di
sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di mitokondria, dan Fe-SOD di
kloroplas tanaman (Bannister et al. 1987).
MmCuZn-SOD adalah gen CuZn-SOD yang telah berhasil diisolasi dari
tanaman Melastoma malabathricum L. Pentingnya peran gen SOD dalam
merespon cekaman lingkungan termasuk cekaman Al mendorong penelitian
untuk menguji ekspresi gen MmCuZn-SOD. Teknologi rekayasa genetik
memberikan peluang untuk mengetahui ekspresi gen ini di dalam tanaman.
Transgenesis biasa digunakan dalam pengujian peranan suatu gen melalui
ekspresi secara berlebih (over expression) atau peniadaan ekspresi (knock-out)
dari gen tersebut. Untuk mengetahui fungsinya, gen CuZn-SOD dari Melastoma
perlu diuji ekspresinya di tanaman model Nicotiana benthamiana dan N.
tabacum.
Perkembangan teknologi rekayasa genetika yang sangat pesat memberikan
harapan baru dalam memanipulasi tanaman agar dihasilkan varietas-varietas
baru dengan sifat-sifat unggul termasuk tanaman yang tahan terhadap cekaman
49
abiotik. Transformasi genetika dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
sebagai perantara transformasi merupakan salah satu metoda yang banyak
digunakan karena pola integrasinya yang stabil di dalam tanaman (Zupan &
Zambryski 1995; Dai et al. 2001; Travella et al. 2005; Bartlett et al. 2008;
Bhattacharjee et al. 2010).
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen yang dapat
menyebabkan crown gall pada tanaman. Bakteri ini mampu mentransfer segmen
DNA dari plasmid Ti ke dalam sel tanaman dan mengintegrasikannya ke dalam
kromosom tanaman. Kemampuan ini menjadikan A. tumefaciens banyak
digunakan sebagai cara untuk mentransfer gen ke dalam genom tanaman (Raj et
al. 2005; Bartlett et al. 2008; Muzuni 2011). Metode ini mempunyai beberapa
keunggulan diantaranya efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal lebih
tinggi dan dapat dilakukan dengan peralatan laboratorium yang sederhana serta
biaya yang murah dibandingkan dengan metode transformasi yang lain seperti
penembakan partikel (microprojectile bombardment) (Travella et al. 2005; Gao et
al. 2008).
Konstruksi plasmid dan metode transfer yang tepat merupakan salah satu
faktor penentu keberhasilan perakitan tanaman transgenik. Dalam penelitian ini
gen MmCuZn-SOD disisipkan ke dalam plasmid biner untuk mengatasi sulitnya
menemukan sisi pemotongan yang unik dengan enzim restriksi pada plasmid Ti
yang sangat besar (Slamet-Loedin 1994). Transformasi plasmid biner ke dalam
A. tumefaciens dilakukan dengan metode triparental mating.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan plasmid biner yang mengandung
gen MmCuZn-SOD, dan tanaman N.benthamiana dan N. tabacum transgenik
yang membawa gen MmCuZn-SOD.
Bahan dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Plasmid pGEM-MmCuZn-SOD digunakan sebagai sumber gen MmCuZn-
SOD. Plasmid biner pMSH1 dan pGWB5 digunakan sebagai vektor ekspresi gen
MmCuZn-SOD, plasmid pENTR-D/TOPO (Invitrogen, USA) sebagai entry clone
ke plasmid biner pGWB5, A. tumefaciens LBA 4404 digunakan untuk
mentransfer gen ke genom tanaman, E. Coli HB 101 yang membawa helper pRK
2013 sebagai plasmid konyugasi untuk memindahkan plasmid biner rekombinan
yang mengandung gen MmCuZn-SOD dari bakteri E.coli ke A. tumefaciens.
50
E.coli DH5α digunakan untuk memperbanyak plasmid biner rekombinan yang
telah mengandung gen MmCuZn-SOD, dan kultur invitro N.benthamiana dan N.
tabacum digunakan sebagai bahan tanaman.
Metode Penelitian
Konstruksi Vektor Ekspresi pMSH1 untuk MmCuZn-SOD. Fragmen
MmCuZn-SOD diperoleh dengan mengamplifikasi plasmid rekombinan pGEM-
MmCuZn-SOD dengan primer spesifik (MmSODXba-F : 5’-GCT CTA GAA TGG
TGA AGG CTG TGG TTG TTC-3’ ; MmSODSpe-R : 5’-GAC TAG TTT AAC CCT
GGA GAC CAA TG-3’). Primer didesain memiliki situs pemotongan enzim
restriksi XbaI untuk primer forward dan site pemotongan SpeI untuk primer
reverse. Komposisi PCR untuk amplifikasi plasmid pGEM-MmCuZn-SOD adalah
1µl plasmid sebagai cetakan, 1x buffer Taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer
forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (RBC
Bioscience), dan dH2O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi
pra PCR pada 94oC selama 5 menit, denaturasi pada 94oC selama 30 detik,
penempelan primer pada 55oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC
selama 1 menit, dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72oC selama 5 menit,
diikuti dengan 15oC, selama 10 menit. Hasil PCR MmCuZn-SOD dan plasmid
biner pMSH1 (koleksi Yokota laboratories, NAIST, Japan) masing-masing
dipotong dengan enzim restriksi XbaI dan SpeI. Hasil pemotongan dengan
enzim restriksi dipurifikasi dengan GenJETTM Gel Extraction Kit (Fermentas,
Lithuania) sesuai protokol kit. Fragmen MmCuZn-SOD diligasikan dengan
plasmid pMSH1 dengan enzim T4 DNA ligase (Invitrogen, USA). Hasil ligasi
diintroduksikan ke dalam E. coli strain DH5α. Klon rekombinan di verifikasi
dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik (MmSOD-F1 : 5’-ATG GTG
AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG ATG ACG GTA
CT-3’).
Konstruksi Vektor pGWB5 Ekspresi untuk MmCuZn-SOD. Fragmen
MmCuZn-SOD diperoleh dengan PCR terhadap plasmid rekombinan pGEM-
MmCuZn-SOD menggunakan primer spesifik (MmSODpENTER F: 5’-CAC CAT
GGT GAA GGC TGT GGT-3’ dan MmSODpENTER R: 5’-ACC CTG GAG ACC
AAT GAT CC-3’). Primer didesain dengan penambahan CACC pada ujung 5’
untuk primer forward, supaya dapat disisipkan pada plamid pENTR-D/TOPO
sebagai entry vektor dalam metode gateway cloning (Gambar 2). Komposisi
51
PCR untuk amplifikasi plasmid pGEM-MmCuZn-SOD adalah 1µl plasmid
sebagai cetakan, 1x buffer taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer forward, 10
pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (RBC Bioscience), dan
dH2O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR 94oC
selama 5 menit, denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada
55oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 1 menit, dengan 30
siklus, dan pasca PCR pada 72oC selama 5 menit, diikuti dengan 15oC, selama
10 menit. Hasil PCR MmCuZn-SOD direaksikan dengan plasmid pENTR-
D/TOPO (Invitrogen, USA) sesuai manual protokol Invitrogen. Hasil reaksi
diintroduksikan kedalam E. coli DH5α. Koloni yang tumbuh di media seleksi
kanamisin diperbanyak sebagai sumber plasmid yang membawa MmCuZn-SOD.
Plasmid diisolasi dengan GenJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania)
sesuai protokol kit.
Plasmid pENTR-D/TOPO yang membawa gen MmCuZn-SOD (pENT-
MmCuZn-SOD) direaksikan dengan plasmid biner (destination vektor) pGWB5
(Invitrogen, USA) dengan ezim LR sesuai dengan protokol gateway cloning
(Invitrogen, USA). Hasil ligasi diintroduksikan kedalam E. coli strain DH5α.
Klon rekombinan di verifikasi dengan PCR koloni menggunakan perimer spesifik
(MmSOD-F1 : 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG
TTG GAG ATG ACG GTA CT-3’).
Triparental Mating (TPM). Introduksi plasmid biner yang mengandung
gen MmCuZn-SOD ke dalam A. tumefaciens LBA4404 dilakukan dengan cara
triparental mating (Liberty et al. 2008). Transformasi menggunakan 3 macam
bakteri yaitu E.coli yang mengandung plasmid pMSH1 atau pGWB5 rekombinan
(mengandung gen MmCuZn-SOD), bakteri E.coli HB 101 yang mengandung
helper pRK 2013, dan A. tumefaciens LBA 4404. Ketiga bakteri ini ditumbuhkan
di dalam media LB padat (Lampiran 2). E. coli yang membawa masing-masing
plasmid pMSH1 rekombinan dan pGWB5 rekombinan ditumbuhkan dalam media
LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L dan higromisin 50
mg/L, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. E. coli yang membawa
plasmid helper ditumbuhkan pada media LB padat dengan penambahan
antibiotik kanamisin 50 mg/L. Bakteri A. tumefaciens ditumbuhkan dalam media
LB padat yang mengandung antibiotik 50 mg/L streptomisin dan diinkubasi pada
suhu 28oC selama 32 jam. Biakan diambil satu gores dan dilarutkan didalam 1
52
ml media LB cair. Biakan dicampur di media LB padat dengan memasukkan 20
µl secara berurutan E.coli yang membawa pMSH1 atau pGWB5 rekombinan, E.
coli yang membawa helper pRK 2013 dan A. tumefaciens. Biakan diinkubasi
pada suhu 28oC selama 32 jam. Biakan yang tumbuh diambil satu gores dan
dilarutkan dalam 500 µl media LB cair dan 5 µl biakan ini dicampur dengan 495
µl LB cair. Sebanyak 10 µl dari hasil pengenceran disebarkan dalam media
seleksi LB + 50 mg/L kanamisin + 50 mg/L higromisin + 50 mg/L streptomisin,
dan diinkubasi pada suhu 28oC selama 32 jam. A. tumefaciens transforman
diverifikasi dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik (MmSOD-F1 : 5’-
ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG ATG
ACG GTA CT-3’).
Perbanyakan Benih dan Tanaman In Vitro. Sterilisasi permukaan biji
N.benthamiana dan N. tabacum dilakukan dengan cara merendam biji di dalam
larutan alkohol 70% dengan digoyang selama beberapa menit. Selanjutnya biji
dicuci menggunakan air steril dan direndam dalam larutan pemutih-desinfektan
komersial (NaClO 5,25%, Jhonson) 20% selama 10 menit dan digoyang. Biji
dicuci kembali menggunakan air steril sebanyak lima kali. Biji ditumbuhkan
dalam media dasar Murashige dan Skoog (MS0) yang mengandung garam-
garam MS (Lampiran 3), vitamin, 30 g/L sukrosa, dan 3 g/L agar, lalu diletakkan
di ruang gelap selama 2 hari dan kemudian dipindahkan ke ruangan bercahaya,
suhu 26º-27ºC. Setelah berumur 1 bulan, tanaman disubkultur ke botol yang
lebih besar. Daun diambil dari tanaman yang berumur 2 bulan sebagai eksplan.
Perbanyakan Biakan Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens LBA
4044 yang telah membawa gen MmCu/Zn-SOD diperbanyak dengan
menumbuhkan koloni tunggal di dalam 10 mL Luria broth (LB) cair yang
mengandung 50 mg/L higromisin, 50 mg/L kanamisin dan 50 mg/L streptomisin,
digoyang pada 160 rpm, suhu 28ºC selama 30 jam. Sebanyak 1.5 ml biakan
diendapkan menggunakan alat mikrosentrifus pada 5000 rpm selama 5 menit.
Endapan Agrobacterium diresuspensi menggunakan larutan media cair yang
mengandung garam-garam MS (Caisson), 0,1 mg/L naphthalene acetic acid
(NAA), 1 mg/L N6-benzyl adenine purin (BAP) (Ma et al. 2007) dan 40 mg/L
asetosiringon hingga OD600 mencapai 0.5 – 0.8.
Transformasi, Seleksi, dan Regenerasi Tanaman. Transformasi
dilakukan dengan menggunakan A. tumefaciens menurut prosedur Akashi et al.
53
(2005) yang dimodifikasi. Daun dari tanaman N. benthamiana dan N. tabacum
hasil perbanyakan in vitro berumur 8 minggu dipotong dengan ukuran 1cm x
1cm. Ko-kultivasi dilakukan dengan merendam eksplan dalam suspensi A.
tumefaciens OD600 0.5 – 0.8 selama 15 menit, digoyang 100 rpm pada suhu
ruang. Selanjutnya eksplan dikeringkan dengan kertas tissue steril dan diletakkan
pada media MS0 dengan penambahan 0,1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP dan 40
mg/L asetosiringon, lalu diinkubasi selama 3 hari di ruang gelap. Setelah ko-
kultivasi, eksplan dicuci dengan air steril sebanyak tiga kali dan dilanjutkan
dengan larutan 500 mg/L carbenicillin dan 200 mg/L cefotaxime. Eksplan
dikeringkan dan dipindahkan ke dalam media MS0 yang mengandung 1 mg/L
NAA, 0.5 mg/L BAP, 100 mg/L kanamisin, 30 mg/L higromisin, 200 mg/L
carbenicillin dan 100 mg/L cefotaxime. Biakan tanaman disimpan di ruang
dengan suhu 26º-27ºC, 16 jam penyinaran dan 8 jam tanpa cahaya (gelap).
Setelah 3-4 minggu eksplan yang berkalus atau bertunas dipindahkan ke
dalam media MS0 yang mengandung 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L
kanamisin. Setiap 3 minggu sekali eksplan yang masih hidup disubkultur
(regenerasi) ke media yang sama sampai eksplan tunas menjadi besar. Jumlah
eksplan yang digunakan sebanyak 50.
Tanaman yang telah berumur 2 bulan dan telah membentuk akar
diaklimatisasi dalam media sekam selama 2 minggu. Selanjutnya dipindahkan
dalam media tanam dan ditumbuhkan di rumah kaca PPSHB IPB (Pusat
Penelitian Studi Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor) sampai
menghasilkan biji.
Identifikasi Tanaman Transgenik. Tanaman transgenik diidentifikasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik MmSOD-F1 : 5’- ATG GTG AAG
GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R2 : 5’-CAT CTC CAA CGG TGA CAT TG-3’
untuk N. benthamiana dan primer spesifik primer spesifik 35S-F : 5’-AAA CCT
CCT CGG ATT CCA TT-3’ dan MmSOD-R2 : 5’-CAT CTC CAA CGG TGA CAT
TG-3’ untuk untuk N. benthamiana. DNA tanaman diisolasi dengan
menggunakan DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Komposisi PCR yang
digunakan adalah 100 ng DNA, 0.5 µM MmSOD-F1, 0.5 µM MmSOD-R2, 1x
buffer Taq, 0.2 mM dNTP mix, 1.25 U Taq DNA polymerase (RBC Bioscience)
dan ddH2O hingga volume akhir 20 µl. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus
dengan kondisi pra-PCR 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 1 menit; penempelan
54
primer 55oC, 30 detik; pemanjangan 72oC, 1 menit, dan pasca –PCR 72oC, 5
menit.
Uji Segregasi Tanaman Transgenik T1. Biji tanaman transgenik
generasi T1 disterilisasi dan ditumbuhkan dalam media dasar Murashige dan
Skoog (MS) yang mengandung garam-garam MS, vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L
agar, dan antibiotik 50 mg/L higromisin. Biji ditumbuhkan di ruang gelap selama
2 hari dan kemudian dipindahkan ke ruangan bercahaya, suhu 26º-27ºC.
Setelah berumur 1 bulan, tanaman yang tumbuh diamati dan dihitung berapa
yang masih tumbuh dengan baik dan berapa yang mati. Uji segregasi generasi
T1 dilakukan dengan uji statistik Khi-Kuadrat (2).
Hasil dan Pembahasan
Konstruksi Plasmid Biner pMSH1
Konstruksi plasmid biner pMSH1 dimulai dengan memotong plasmid
menggunakan enzim restriksi XbaI dan SpeI, berdasarkan peta plasmid pMSH1
(Gambar 21). Gen MmCuZn-SOD telah disolasi dari klon pGEM-MmCuZn-SOD
dengan PCR menggunakan primer spesifik. Primer forward didesain untuk bisa
dipotong dengan enzim XbaI dengan penambahan nukleotida GCTCTAGA pada
ujung 5’, dan primer reverse didesain untuk bisa dipotong dengan enzim SpeI
dengan penambahan nukleotida GACTAGT pada ujung 5’. Hasil pemotongan
plasmid pMSH1 adalah satu fragmen berukuran sekitar 14.000 pb. Sementara
hasil PCR pGEM-MmCuZn-SOD adalah fragmen berukuran sekitar 450 pb
(Gambar 19). Hasil PCR telah dipotong dengan enzim Xba dan SpeI untuk
mendapatkan ujung-ujung fragmen yang tidak rata.
Fragmen gen MmCuZn-SOD dan plasmid pMSH1 dielusi dari gel agarose
untuk digunakan pada proses ligasi. Enzim T4 DNA ligase digunakan utuk
meligasikan fragmen MmCuZn-SOD dengan plasmid pMSH1. Hasil ligasi
diintroduksikan ke dalam sel E.coli DH5α kompeten. E. coli ditumbuhkan pada
media seleksi LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L dan
higromisin 50 mg/L. Penambahan antibiotik pada media LB dimaksudkan agar
koloni yang tumbuh pada media adalah koloni yang sudah membawa plasmid
pMSH1, karena plasmid pMSH1 membawa gen antibiotik kanamisin dan
higromisin.
55
Gambar 19. Hasil pemotongan fragmen PCR MmCuZn-SOD dan pMSH1 dengan dengan enzim restriksi Xba1 dan Spe1 (M= Marka. 1= fragmen MmCuZn-SOD, 2= pMSH1)
Delapan koloni yang tumbuh di media seleksi dikonfirmasi lagi dengan
PCR koloni untuk memastikan bahwa koloni ini mengandung plasmid
rekombinan yang membawa gen MmCuZn-SOD. Hasil PCR koloni dengan
primer MmSOD-F1 dan MmSOD-R1 menunjukkan bahwa kedelapan koloni
membawa fragmen gen penyandi MmCuZn-SOD yang berukuran sekitar 450 pb
(Gambar 20). Hasil ini sesuai dengan ukuran gen MmCuZn-SOD yang telah
disisipkan di plasmid pMSH1 (Gambar 19).
Gambar 20. Hasil PCR dengan primer spesifik MmCuZn-SOD dari koloni bakteri E.coli hasil transformasi dengan plasmid pMSH1 rekombinan. (M=Marka, 1-8 = koloni E.coli transforman)
Hasil PCR koloni tersebut menunjukkan bahwa plasmid biner
rekombinan yang membawa gen MmCuZn-SOD di bawah promoter p35S CaMV
telah berhasil dikonstruksi, dan selanjutnya plasmid ini disebut pMSH-MmCuZn-
SOD (Gambar 21).
56
Gambar 21. Konstruksi plasmid biner pMSH1 yang membawa gen MmCuZn-SOD
(pMSH-MmCuZn-SOD). Konstruksi Plasmid Biner pGWB5 Fragmen MmCuZn-SOD yang berukuran 459 pb telah berhasil diisolasi
dari plasmid pGEM-MmCuZn-SOD menggunakan PCR primer spesifik, yang
didesain dengan menambahkan nukleotida CACC pada ujung 5’ sehingga
ujungnya cocok dengan pENTRTM/D-TOPO® (Gambar 2). PCR dilakukan
dengan menggunakan enzim Taq polymerase yang menghasilkan ujung yang
tumpul (blunt end) yang tidak mengandung nukleotida A. Hal ini dimaksudkan
agar ujung 5’ fragmen hasil PCR adalah CACC supaya dapat tersisipi ke vektor
pENTRTM/D-TOPO®.
Fragmen gen MmCuZn-SOD dan plasmid pENTRTM/D-TOPO® telah
diligasikan menggunakan reaksi LR (Invitrogen, USA). Hasil ligasi telah
diintroduksikan ke dalam sel E.coli DH5α kompeten, dan ditumbuhkan pada
media seleksi LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L.
Penambahan antibiotik pada media LB dimaksudkan agar koloni yang tumbuh
pada media adalah koloni yang sudah membawa plasmid pENTRTM/D-TOPO®
rekombinan, karena plasmid pENTRTM/D-TOPO® membawa gen antibiotik
kanamisin. Koloni bakteri E.coli yang tumbuh pada media seleksi diverifikasi lagi
dengan PCR dengan primer spesifik untuk memastikan bahwa koloni tersebut
mengandung gen MmCuZn-SOD. Hasil PCR dengan primer spesifik MmSOD-F1
: 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG
ATG ACG GTA CT-3’ menunjukkan adanya pita berukuran sekitar 459 pb
(Gambar 22). Hasil ini menunjukkan bahwa gen target MmCuZn-SOD yang
berukuran 459 pb telah berhasil tersisipi ke dalam pENTR, selanjutnya disebut
plasmid pENT-MmCuZn-SOD. cDNA yang tersisipi ke dalam pENTR dapat
dipastikan memiliki arah yang tepat karena kesepesifikan pada ujung 5’nya.
57
Gambar 22. Hasil PCR dengan primer spesifik MmCuZn-SOD dari koloni bakteri E.coli hasil transformasi dengan plasmid pENTR rekombinan (M=Marka, 1-4 = koloni E.coli transforman).
Plasmid pENT-MmCuZn-SOD telah direaksikan dengan plasmid biner
pGWB5 menggunakan enzim LR (Invitrogen, USA). Enzim LR membantu untuk
memindahkan fragmen MmCuZn-SOD yang sudah tersisipi di pENTRTM/D-
TOPO® ke plasmid biner pGWB5. Setelah inkubasi selama 5 jam pada suhu
ruang, reaksi ditransformasikan ke E.coli kompeten dan ditumbuhkan pada
media seleksi LB padat yang ditambah 50 mg/L kanamisin dan 50 mg/L
higromisin. Sebanyak 6 koloni dari media seleksi telah dikonfirmasi dengan PCR
koloni menggunakan primer spesifik MmCuZn-SOD. Hasil PCR dari ke 6 koloni
menunjukkan adanya pita target yang berukuran 459 pb (Gambar 23). Hasil ini
menunjukkan bahwa gen target MmCuZn-SOD telah tersisipi di dalam plasmid
ekspresi pGWB5 di bawah promotor 35S CaMV (Gambar 24), dan selanjutnya
disebut plasmid pGWB-MmCuZn-SOD.
Gambar 23. Hasil PCR dengan primer spesifik MmCu/Zn-SOD dari koloni bakteri E.coli hasil transformasi dengan plasmid pGWB5 rekombinan (M=Marka; 1-6 = koloni E.coli transforman).
58
Gambar 24. Konstruksi plasmid biner pGWB5 yang membawa gen MmCuZn-
SOD (pGWB-MmCuZn-SOD). Introduksi Plasmid Biner pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD ke dalam Bakteri Agrobacterium tumefaciens Plasmid biner pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD secara
terpisah telah berhasil dimasukkan ke dalam A. tumefaciens LBA 4404 melalui
triparental mating (TPM) (Lampiran). Masing-masing plasmid pMSH-MmCuZn-
SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD yang terdapat pada E.coli DH5α hasil
transformasi (sebagai donor) dipindahkan ke dalam A.tumefaciens LBA 4044
(sebagai resipien) melalui proses konyugasi dengan bantuan E.coli HB 101 (pRK
2013) yang resisten terhadap antibiotik kanamisin. Bakteri yang mampu hidup
pada media seleksi yang mengandung 50 mg/L kanamisin +50 mg/L higromisin +
50 mg/L streptomisin hanya A. tumefaciens LBA 4404 yang mengandung
plasmid pMSH-MmCuZn-SOD atau pGWB-MmCuZn-SOD.
Koloni hasil TPM yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya telah
dianalisis dengan PCR untuk membuktikan adanya plasmid biner pMSH-
MmCuZn-SOD atau pGWB5-MmCuZn-SOD di dalam A.tumefaciens. PCR
dengan primer spesifik MmSOD-F1 dan MmSOD-R1 terhadap koloni A.
tumefaciens menghasilkan produk PCR berukuran 459 pb (Gambar 25). Hal ini
menunjukkan bahwa proses TPM telah berhasil dan menghasilkan A.tumefaciens
yang mengandung plasmid biner pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-
SOD. A.tumefaciens dapat digunakan untuk melakukan transformasi tanaman
model maupun tanaman lainnya dengan gen MmCuZn-SOD. Raj et al. (2005)
telah melaporkan menggunakan metode TPM untuk memasukkan vektor
ekspresi yang membawa gen coat protein (CP) dari tomato leaf curl virus (TLCV)
ke A. tumefaciens. Liberty et al. (2008) juga telah berhasil memindahkan gen
cry1Ab yang disisipkan ke dalam vektor ekspresi ke A.tumefaciens LBA 4404
59
menggunakan metode TPM. Wise et al. (2006) menjelaskan bahwa TPM adalah
salah satu metode yang efektif untuk mentransfer gen yang dibawa oleh plasmid
nonconjugative ke bakteri A. tumefaciens dengan bantuan plasmid helper pRK
2013 sebagai plasmid conjugative.
Gambar 25. Hasil PCR dengan primer spesifik terhadap koloni bakteri A. tumefaciens LBA 4404 hasil triparental mating. (M=Marka, 1= plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD; 2-3 = koloni Agrobacterium transforman pGWB-MmCu/Zn-SOD; 4-5 = koloni Agrobacterium transforman pMSH-MmCu/Zn-SOD; 6 = plasmid pMSH-MmCu/Zn-SOD)
Transformasi N.benthamiana dan N. tabacum dengan A.tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens yang mengandung plasmid rekombinan pMSH-
MmCuZn-SOD telah ditransformasikan ke tanaman Nicotiana benthamiana, dan
yang mengandung plasmid rekombinan pGWB-MmCu/Zn-SOD
ditransformasikan ke tanaman N. tabacum. Efisiensi transformasi N.
benthamiana dengan pMSH-MmCuZn-SOD melalui perantaraan A. tumefaciens
adalah 82%, sedangkan N.tabacum dengan pGWB-MmCu/Zn-SOD adalah 92%
(Tabel 3). Efisiensi transformasi ditentukan berdasarkan rasio antara eksplan
yang bertunas dan keseluruhan eksplan yang ditumbuhkan di media seleksi
selama 4 minggu.
Tabel 3. Persentase keberhasilan transformasi genetik N.tabacum dan N. benthamiana dengan menggunakan eksplan daun.
Tanaman Jumlah eksplan transformasi
Jumlah eksplan bertunas
N. benthamiana 50 46 N. tabacum 50 41
Tunas yang tumbuh dari eksplan di media seleksi adalah tunas transgenik
(Gambar 26). Tunas transgenik ini setelah dipisahkan dari eksplan dipindah ke
media MS yang mengandung 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L kanamisin.
60
Gambar 26. Tanaman transgenik umur 8 minggu setelah transformasi pada media seleksi mengandung 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L kanamisin. (A) N.benthamiana transgenik B. N.tabacum transgenik. (1 = tanaman transgenik; 2 = tanaman non transgenik).
Adanya integrasi MmCuZn-SOD di dalam genom tanaman transgenik ini
telah dikonfirmasi dengan PCR menggunakan primer spesifik. Primer yang
dipakai dalam pengujian dengan PCR pada DNA tanaman N. benthamiana
transgenik adalah primer spesifik MmSOD-F1 dan MmSOD-R2 yang didesain
dari sekuen gen MmCuZn-SOD. Hasil amplifikasi dengan primer ini adalah
fragmen DNA berukuran 270 pb. PCR terhadap DNA tanaman N. benthamiana
transgenik menghasilkan DNA berukuran 270 pb, sedangkan terhadap DNA
tanaman non transgenik tidak menghasilkan amplikon (Gambar 27).
Gambar 27. PCR DNA genom N. benthamiana hasil transformasi dengan primer spesifik MmSOD-F1 dan MmSOD-R2, (M = marker 1 Kb; 1-5 = tanaman transgenik; 6 = tanaman non transgenik; 7 = kontrol plasmid pMSH-MmCuZn-SOD).
Sedangkan primer yang dipakai dalam pengujian dengan PCR pada DNA
tanaman N. tabacum transgenik adalah primer spesifik 35S-F dan MmSOD-R2
yang didesain dari sekuen plasmid ekspresi pGWB-MmCuZn-SOD. Hasil
amplifikasi dengan primer ini adalah fragmen DNA berukuran 633 pb yang
berasal dari amplifikasi bagian ujung 3’ promoter 35S CaMV (sekitar 363 pb) dan
bagian ujung 5’ gen MmCuZn-SOD (270 pb). PCR terhadap DNA tanaman N.
tabacum transgenik menghasilkan DNA berukuran 633 pb, sedangkan terhadap
DNA tanaman non transgenik tidak menghasilkan pita (Gambar 28).
61
Gambar 28. PCR DNA genom N. tabacum hasil transformasi dengan primer spesifik 35S-F dan MmSOD-R2, (M = marker 1 Kb; 1-5 = tanaman transgenik; 6 = tanaman non transgenik; 7 = kontrol plasmid pGWB-MmCuZn-SOD).
Hasil ini menunjukkan bahwa gen MmCuZn-SOD telah berhasil
dimasukkan ke dalam genom tanaman N. benthamiana dan N. tabacum melalui
A. tumefaciens. Soliman et al. (2009) melaporkan telah berhasil mendapatkan
N.tabacum transgenik yang disisipi gen Na+/H+antiporter vacuolar (AtNHX1)
melalui A. tumefaciens. Menurut Dai et al. (2001) transformasi genetika dengan
menggunakan A. tumefaciens sebagai perantara merupakan salah satu metoda
yang banyak digunakan karena integrasinya yang stabil di dalam tanaman.
Teknik ini juga menghasilkan tanaman transgenik yang lebih stabil pada generasi
berikutnya (Travella et al. 2005).
Segregasi T1 dari Tanaman Transgenik N. benthamiana dan N.tabacum
Tanaman transgenik yang mengandung gen MmCu/Zn-SOD
diperbanyak, kemudian dipindahkan ke dalam pot. Tanaman transgenik
dipelihara di rumah kaca sampai menghasilkan biji (Gambar 29). Biji-biji dipanen
untuk analisis segregasi gen hpt yang terletak berdampingan dengan gen
MmCu/Zn-SOD di dalam tanaman N. benthamiana dan N.tabacum. Biji tanaman
transgenik dapat dipanen 8 minggu setelah dipindahkan ke dalam pot. Namun
tidak semua dari tanaman transgenik yang dapat dipanen bijinya, karena ada
beberapa tanaman yang kapsulnya tidak mengandung biji. Hal ini terjadi diduga
merupakan hasil variasi somaklonal. Ramulu (1984) menjelaskan bahwa variasi
somaklonal dapat terjadi karena penggunaan zat pengatur tumbuh dalam kultur
in vitro serta periode kultur. Purnamaningsih (2006) yang melakukan
transformasi tanaman tomat dengan gen DefH9-RI-iaaM melaporkan adanya
tanaman tomat yang tidak menghasilkan biji karena hasil variasi somaklonal.
Biji tanaman transgenik ditumbuhkan dalam media seleksi higromisin 50
mg/L. Biji-biji yang mengekspresikan gen hpt akan tumbuh baik dalam media
seleksi sementara yang tidak membawa gen tersebut akan mati pada 4 minggu
setelah tanam (Gambar 30).
62
Gambar 29. Tanaman transgenik N.benthamiana (atas) dan N. tabacum
(bawah). A. Tanaman transgenik di dalam botol kultur; B. Tanaman transgenik di dalam pot; C. Tanaman transgenik berbunga.
Stabilitas gen yang diwariskan kepada turunannya merupakan aspek
yang sangat penting dalam rekayasa genetika tanaman. Travella et al. (2005)
menjelaskan bahwa tanaman transgenik yang diperoleh melalui infeksi
Agrobacterium diwariskan secara stabil ke generasi berikutnya. Umumnya gen
yang diintroduksikan ke tanaman dengan perantara Agrobacterium diwariskan ke
generasi berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel monohibrid.
Gambar 30. Hasil seleksi biji tanaman transgenik generasi T1 umur 4 minggu
menggunakan 50 mg/L higromisin. A. N.benthamiana B. N.tabacum (T = transgenik; NT = Non Transgenik).
Analisis pola segregasi gen telah dilakukan pada biji (T1) dari 4 galur N.
benthamiana transgenik dan 5 galur N. tabacum transgenik yang diambil secara
acak (Tabel 4). Hasil uji T1 di dalam media seleksi berdasarkan uji Khi-Kuadrat
63
(2) menunjukkan pola segregasi gen hpt pada populasi T1 tanaman transgenik
N. benthamiana dan N. tabacum 3 : 1. Hasil ini sesuai dengan pendapat Rashid
et al. (1996) yang menyatakan bahwa umumnya gen yang diintroduksikan ke
tanaman menggunakan perantara Agrobacterium diwariskan ke generasi
berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel monohibrid.
Pola pewarisan Mendel 3:1 pada generasi T1 atau F2 dari tanaman N.
benthamiana dan N.tabacum transgenik menunjukkan bahwa di dalam tanaman
transgenik tersebut terdapat satu gen fungsional untuk hpt. Karena gen hpt
difusikan dengan MmCuZn-SOD (Gambar 21 dan Gambar 24), maka kedua gen
ini mempunyai kecenderungan diwariskan ke generasi berikutnya secara
bersama-sama. Karena jarak kedua gen tersebut sangat dekat, kedua gen
tersebut sangat kecil bersegregasi.
Tabel 4. Hasil pengujian resistensi tembakau transgenik generasi T1 terhadap
higromisin.
Galur Jumlah Resistensi higromisin Sensitif higromisin
Segregasi
(= 3.84)
NB S5.2 124 89 35 0.688 3:1
NB S5.3 135 107 28 0.363 3:1
NB S6.3 103 83 20 1.712 3:1
NB S12.2 127 93 34 0.213 3:1
NT S2.1 105 79 26 0.003 3:1
NT S4.1 45 32 13 0.363 3:1
NT S10.3 115 82 33 0.838 3:1
NT S18.4 125 102 23 2.904 3:1
NT S20.3 130 92 38 1.241 3:1
Simpulan
Vektor untuk rekayasa ekspresi berlebih gen MmCuZn-SOD berhasil
dikonstruksi dan disisipkan ke genom tanaman N. benthamiana dan N. tabacum.
Pola segeregasi gen hpt yang difusikan dengan gen MmCuZn-SOD pada
tanaman transgenik generasi T1 mengikuti pola pewarisan Mendel monohibrid
yaitu 3:1.
BAB VI KONSTRUKSI VEKTOR RNAi DARI FRAGMEN 3’UTR GEN
PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE DARI Melastoma malabathricum, L.
Abstrak
Tehnik RNA silencing adalah sebuah cara yang efektif untuk menguji
fungsi biologi mRNA target pada tanaman. Perkembangan terkini mengenai
teknologi pengklonan GATEWAYTM memudahkan untuk mengkonstruksi vector
RNAi yang mempunyai sekuen pemicu dan untuk menganalisis fungsi gen target.
Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi RNAi dari fragmen 3’UTR gen
penyandi CuZn-SOD dari Melastoma malabathricum L. (MmCuZn-SOD). Vektor
RNAi telah berhasil dikonstruksi menggunakan teknologi pengklonan
GATEWAYTM dimana fragmen 3’UTRMmCuZn-SOD digunakan sebagai sekuen
pemicu RNA utas ganda (dsRNA), pENTRTM/D-TOPO® sebagai entry vector dan
vektor pANDA sebagai destination vector. RNAi telah diintroduksikan ke
tanaman M. malabathricum L. melalui Agrobacterium tumefaciens LBA4404
untuk mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD dalam detoksifikasi cekaman Al.
Uji toleransi tanaman transgenik terhadap cekaman Al menunjukkan bahwa
pada media MS yang mengandung 1 mM Al (AlCl3.6H2O), tanaman transgenik
mengalami hambatan pertumbuhan sampai mati, sementara non-transgenik tidak
mengalami hambatan. Hal ini menunjukkan bahwa penghambatan ekspresi gen
MmCuZn-SOD dengan RNAi pada tanaman M. malabathricum L. menyebabkan
tanaman menjadi sensitif terhadap Al.
Abstract
The RNA silencing technique is an effective tool to examine the biological
function of the target mRNAs in plants. The recent development of regarding GATEWAYTM cloning technology makes it easy to construct the RNAi vectors with trigger sequences and to analyze the function of a target gene. The objective of this study is to construct RNAi including the 3'UTR fragment of the gene coding CuZn-SOD from Melastoma malabathricum L. (MmCuZn-SOD). RNAi vector had been successfully constructed using Gateway cloning technology with the 3'UTR MmCuZn-SOD was used as double stranded RNA (dsRNA) trigger sequence, pENTRTM/D-TOPO® as entry vector, and pANDA as destination vector. RNAi had been successfully introduced into M. malabathricum L. mediated by Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 to analyze the function of MmCuZn-SOD gene in the detoxifying Al stress. Transgenic plants tolerance analyzes to Al stress showed that in the MS medium containing 1 mM Al (AlCl3.6H2O), the transgenic plants underwent growth suppression, whereas non-transgenic plants underwent growth normally. These results suggested that suppression of MmCuZn-SOD gene expression by RNAi to M. malabathricum L. caused the plant became sensitive to Al.
Keywords: RNAi, CuZn-SOD, Melastoma malabathricum
66
Pendahuluan
Perkembangan teknologi rekayasa genetika yang sangat pesat
memberikan harapan baru dalam memanipulasi tanaman agar dihasilkan
varietas-varietas baru dengan sifat-sifat unggul termasuk tanaman yang tahan
terhadap cekaman lingkungan. Langkah awal dalam rekayasa genetik adalah
mempelajari peranan gen tertentu. Peranan suatu gen dalam tanaman dapat
dipelajari minimal dengan pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi
gen dengan mengkonstruksi vektor over expression serta menghentikan
dan/atau menurunkan ekspresi gen antara lain dengan mengkonstruksi RNAi
(RNA interference).
RNAi merupakan potongan kecil RNA yang dapat menginduksi
penghancuran mRNA tertentu sebelum proses transkripsi di dalam sitoplasma.
Prinsip dasarnya adalah bahwa masuknya RNA utas ganda (dsRNA) ke dalam
sitoplasma akan membungkam ekspresi suatu gen di tingkat post-transkripsi
(Fire et al. 1998; Kalantidis et al. 2008). Adanya RNAi menyebabkan RNA yang
ada di dalam sel dapat diikat oleh RNAi untuk membentuk RNA utas ganda
(dsRNA). RNA utas ganda dipotong oleh enzim Dicer di sitoplasma menjadi
fragmen dsRNA pendek berukuran 21-26 nukleotida dengan ujung 3’ overhangs
dua nukleotida (Fire et al. 1998; Waterhouse et al. 2001; Hannon 2002; Pickford
& Cogoni 2003). Salah satu dari kedua utas dari masing-masing fragmen, yang
diketahui sebagai utas pemandu (guide strand), bergabung dengan RISC (RNA-
induced silencing complex) dan berasosiasi dengan mRNA target (Hammond et
al. 2000), dan kemudian mengaktivasi fungsi RISC untuk mendegradasi mRNA
target dan menekan ekspresi gen pada berbagai level (Fire et al. 1998; Meister &
Tuschl 2004).
Berdasarkan mekanisme selulernya, pembentukan dsRNA dapat terjadi
melalui dua cara, yaitu secara eksogenous dan endogenous (Bagasra & Priliman
2004). Secara eksogenous, dsRNA yang berasal dari infeksi virus dengan
sebuah genom RNA atau dari manipulasi laboratorium yang secara langsung
masuk dalam sitoplasma dan dipotong menjadi fragmen kecil oleh enzim Dicer.
Secara endogenous, dsRNA berasal dari dalam sel sebagai pre-microRNA yang
diekspresikan dari gen penyandi RNA dalam genom. Transkrip dari gen tersebut
membentukstruktur jepit rambut (stem-loop) yang kemudian dikeluarkan ke
sitoplasma untuk dipotong oleh Dicer.
67 Teknik RNAi ini merupakan cara yang efektif untuk menguji fungsi biologi
mRNA target pada tanaman. Perkembangan terkini mengenai vektor RNAi, yang
menggunakan promotor kostitutif dan teknologi teknik pengklonan Gateway,
memudahkan untuk mengkonstruksi vektor RNAi yang mempunyai sekuen
pemicu dsRNA dan memudahkan pula untuk menganalisis fungsi gen target.
Salah satu vektor RNAi yang dapat digunakan untuk mempelajari fungsi gen
target adalah vektor pANDA yang dikembangkan oleh Miki & Shimamoto (2004).
Vektor ini menggunakan promoter ubiquitin1 dari jagung yang mengontrol
ekspresi mRNA berulang terbalik dari sekuen gen target. Orientasi mRNA
berulang terbalik merupakan pemicu pembentukan siRNA. Aplikasi vektor ini
dengan gen penyandi green fluorescent protein (GFP) dan phytoene desaturase
(PDS) dapat menekan ekspresi kedua gen tersebut pada tanaman padi (Miki et
al. 2005).
Miki et al. (2005) juga menggabungkan sekuen unik berulang terbalik dari
3’UTR (untranslated region) yang diperoleh dari family gen OsRac padi dengan
promotor kuat dan stabil lalu diintroduksikan ke dalam padi. Masing-masing dari
sembilan anggota family gen OsRac eksperesinya ditekan oleh kontruksi
berulang terbalik tersebut. Ekspresi mutan berulang terbalik menggunakan
gabungan dari beberapa 3’UTR membungkam ekspresi tiga anggota family gen
OsRac. Selanjutnya, dengan menggunakan daerah yang terkonservasi tinggi
dari family gen OsRac, Miki et al. (2005) juga berhasil menekan ekspresi semua
anggota family gen OsRac dengan efesiansi yang berbeda-beda. Hasil tersebut
menunjukkan bahwa RNAi merupakan metoda yang bermanfaat untuk
menganalisis fungsi famili gen pada padi dan tanaman lain.
Teknologi RNAi ini telah digunakan untuk mempelajari fungsi suatu gen
pada tanaman (Wesley et al. 2001; DeBoer et al. 2011; Muzuni 2011), menapis
gen fungsional untuk mengidentifikasi target terapi pada hewan (Soutchek et al.
2004; Shen et al. 2005; Raoul et al; 2005), pengobatan infeksi virus berbahaya
pada manusia (Leonard & Schaffer 2006; Ma et al. 2007), dan pengobatan terapi
kanker (Yin et al. 2003; Abdelrahim et al. 2006; Pai et al. 2006).
Salah satu gen yang diduga terlibat dalam toleransi tanaman terhadap
cekaman lingkungan termasuk cekaman aluminium adalah gen penyandi
superoxide dismutase (SOD) (Darko et al. 2004; Du et al. 2010). Superoxide
dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang mampu menetralkan
radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal superoksida menjadi
68 molekul O2 dan H2O2 (Tseng et al. 2008). Salah satu tipenya adalah copper/zinc
superoksida dismutase (CuZn-SOD) yang memiliki kofactor logam copper/zinc.
Pada tanaman CuZn-SOD pada umumnya ditemukan di sitosol dan kloroplast.
cDNA utuh dari gen CuZn-SOD dari Melastoma malabathricum L. telah
berhasil diisolasi dari penelitian sebelumnya. Pada percobaan ini, kami menguji
peranan gen penyandi MmCuZn-SOD dalam toleransinya terhadap cekaman Al.
Pada pengujian ini, kostruksi RNAi menggunakan vektor pANDA dan dua sekuen
3’UTR dari gen MmCuZn-SOD yang ekspresinya berlawanan sebagai sekuen
berulang terbalik. Vektor hasil konstruksi diintroduksikan ke dalam tanaman M.
malabathricum L. melalui perantara A. tumefaciens LBA 4404. Tanaman
transgenik selanjutnya diuji pada media yang mengandung Al. Tanaman M.
malabathricum adalah tanaman yang sangat toleran Al, bilamana MmCuZn-SOD
berperan dalam toleransi M.malabathricum L. terhadap cekaman Al, maka
gangguan ekspresi gen ini melalui RNAi menyebabkan tanaman transgenik yang
diperoleh adalah sensitif terhadap cekaman Al.
Bahan dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Plasmid pGEM-MmCuZn-SOD digunakan sebagai sumber fragmen
3’UTR MmCuZn-SOD. Plasmid biner pANDA (koleksi Prof. Ko Shimamoto,
NAIST, Japan) digunakan sebagai vektor RNAi, plasmid pENTR (Invitrogen,
USA) sebagai entry clone ke plasmid biner pANDA, A. tumefaciens LBA 4404
digunakan untuk mentransfer gen ke genom tanaman, E. coli HB 101 yang
membawa helper pRK 2013 sebagai plasmid konyugasi untuk memindahkan
plasmid biner rekombinan yang mengandung fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD dari
bakteri E.coli ke A. tumefaciens. E.coli DH5α digunakan untuk memperbanyak
plasmid RNAi rekombinan yang telah mengandung fragmen 3’UTR MmCuZn-
SOD, dan kultur invitro M.malabathricum digunakan sebagai bahan tanaman.
Metode Penelitian
Perbanyakan Fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD. Fragmen 3’UTR
MmCuZn-SOD diamplifikasi menggunakan enzim DNA polimerase proofreading
untuk menghasilkan produk PCR ujung tumpul (blunt end) dengan primer
spesifik (SOD3UTR-F1 : 5’-CAC CAG GGT TAA GCT ACC TCT G -3’ &
69 SOD3UTR-R1 : CCC AAG ATC AGT AAC ACC CGG TT) dengan penambahan
nukleotida CACC pada primer forward agar dapat disisipkan pada situs
pengklonan plasmid pENTR-D/TOPO (Gambar 2) dan pGEM-MmCuZn-SOD
(Gambar 13) sebagai cetakan. Komposisi PCR yang digunakan adalah 10 ng
pGEM-MmCuZn-SOD, 0.5 µM primer SOD3UTR-F, 0.5 µM primer SOD3UTR-R,
1x buffer Tag, 0.2 mM dNTP mix, 1.25 U Platinum Taq (invitrogen) DNA
polymerase dan ddH2O hingga volume reaksi 20 µM. PCR dilakukan sebanyak
30 siklus dengan kondisi pra-PCR pada 95oC selama 5 menit, denaturasi pada
94oC selama 1 menit, penempelan primer pada 58oC selama 30 detik,
pemanjangan 72oC selama 1 menit, dan pasca-PCR pada 72oC selama 5 menit.
Produk PCR selanjutnya dielektroforesis menggunakan gel agarose 1 % untuk
mengetahui integritas dan kuantitasnya.
Penyisipan Fragmen 3’UTRMmCuZn-SOD ke dalam Entry Vector.
Metode penyisipan fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD ke dalam entry vector
pENTRTM/D-TOPO® sesuai protokol Invitrogen.
Pengklonan ke dalam Vektor pANDA. Vektor pENTR-D/TOPO
rekombinan (entry clone) yang telah mengandung 3’UTR MmCuZn-SOD
direkombinasikan dengan vektor pANDA menggunakan enzim LR clonase.
Campuran reaksinya adalah sebagai berikut: 2 µl buffer reaksi LR (5x), 300 ng
entry clone, 300 ng vektor pANDA, dan buffer TE hingga volume 8 µl.
Selanjutnya 2 µl enzim LR clonase ditambahkan ke dalam campuran dan
diinkubasi pada suhu 25oC selama semalam. Reaksi pada campuran dihentikan
dengan menambahkan 1 µl proteinase K (2 µg/ µl) dan diinkubasi pada suhu
37oC selama 10 menit. Hasil rekombinasi diintroduksikan ke dalam E.coli DH5α
dengan mencampur 10 µl larutan rekombinasi dengan 100 µl E.coli DH5α
kompeten. Tahapan transformasi dilakukan sama dengan sebelumnya. Hasil
proses transformasi disebar pada media LB padat yang mengandung 50 mg/L
kanamisin dan 50 mg/L higromisin. Bakteri yang tumbuh diverifikasi dengan
PCR koloni menggunakan primer spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R.
Transformasi A. tumefaciens LBA 4404 dengan Vektor RNAi. Vektor
pANDA yang telah mengandung fragmen 3’UTRMmCuZn-SOD (pAND-MmCuZn-
SOD) diintroduksikan ke dalam bakteri A.tumefaciens melalui metode triparental
mating (TPM) seperti pada BAB V. Bakteri A. tumefaciens yang tumbuh pada
media seleksi yang mengandung 50 mg/L kanamisin, 50 mg/L higromisin, dan
70 streptomisin 50 mg/L diverifikasi dengan PCR koloni menggunakan primer
spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R.
Transformasi M.malabathricum dengan Vektor RNAi. Transformasi
dilakukan dengan menggunakan A.tumefaciens dan eksplan daun menurut
prosedur Akashi et al. (2005) yang telah dimodifikasi oleh Darojat (2010).
Eksplan daun dari tanaman M. malabathricum hasil perbanyakan in vitro berumur
empat minggu dipotong dengan ukuran 1-2 cm. Ko-kultivasi dilakukan dengan
merendam eksplan dalam suspensi A. tumefaciens OD600 0,5-0,8 selama 60
menit, digoyang 100 rpm pada suhu ruang. Selanjutnya eksplan dikeringkan
dengan kertas tissue steril dan diletakkan dalam media MS0 dengan
penambahan 0,1 mg/L NAA, 1 mg/L BAP dan 40 mg/L asetosiringon selama 3
hari di ruang gelap. Setelah ko-kultivasi, eksplan dicuci dengan air steril
sebanyak tiga kali dan dilanjutkan dengan larutan 500 mg/L carbenicillin dan 200
mg/L cefotaxime. Eksplan dikeringkan dan dipindahkan ke dalam media MS0
yang mengandung 1 mg/L NAA, 1 mg/L BAP, 100 mg/L kanamisin, 10 mg/L
higromisin, 200 mg/L carbenicillin dan 100 mg/L cefotaxime, dan kultur tanaman
disimpan dalam ruang dengan suhu 26º-27ºC. Setelah 4 minggu, eksplan yang
berkalus dipindahkan ke dalam media MS0 yang mengandung 1 mg/L NAA, 1
mg/L BAP, 100 mg/L kanamisin dan 20 mg/L higromisin. Setiap 4 minggu sekali
kalus yang masih hidup disubkultur (regenerasi) ke media yang sama sampai
bertunas. Tunas-tunas yang muncul disubkultur ke media seleksi MS0 yang
mengandung 100 mg/L kanamisin dan 30 mg/L higromisin sampai tunas menjadi
besar.
Identifikasi Tanaman Transgenik. Tanaman transgenik diidentifikasi
menggunakan PCR dengan primer higromisin-F 5’-AAG GAA TCG GTC AAT
ACA CTA C-3’ dan higromisin-R 5’-ACT ATC GGC GAG TAC TTC TAC A-3’.
Isolasi DNA mengikuti metode CTAB. Daun sebanyak 0.1 g digerus dengan
bantuan nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan
dimasukkan ke ependorf yang telah berisi 500 µl buffer ekstraksi (2 % CTAB, 2%
PVP 40000, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl dan 1% β-
mercapto ethanol), kemudian divortex dan diinkubasikan pada suhu 65oC selama
10 menit. Sebelum ditambahkan 1 x volume kloroform:isoamil alkohol (24:1),
suspensi didinginkan terlebih dahulu. Campuran kemudian divortex dan
disentrifus pada kecepatan 18000 x g (TOMY MX-205) pada suhu 4oC selama 10
menit. Cairan bagian atas yang mengandung DNA total diambil, dimasukkan ke
71 dalam tabung 1.5 ml dan diekstraksi kembali dengan 1 x volume
phenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), divortek dan disentrifus pada
kecepatan 18000 x g suhu 4oC selama 10 menit. Cairan bagian atas
dipindahkan ke ependof baru, ditambahkan 2 x volume etanol absolut dan
diinkubasi pada suhu -30oC selama 2 jam. Campuran disentrifus pada 18000 x g
pada suhu 4oC selama 15 menit. Cairan dibuang, dan endapan DNA
disuspensikan dalam 500 µl TE (10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA) dan
ditambahkan 1 x volume phenol pH 8, divortek dan disentrifus pada 18000 x g
pada suhu 20oC selama 10 menit. Cairan bagian atas yang mengandung DNA
diambil, dimasukkan ke dalam tabung baru 1.5 ml dan ditambahkan 2 x volume
etanol absolut dan diinkubasi pada -30oC selama 3 jam. Cairan disentrifus pada
kecepatan 18000 x g, suhu 4oC selama 15 menit. Endapan DNA dibilas dengan
500 µl alkohol 70% dan disentrifus pada 18000 x g suhu 4oC selama 5 menit.
Endapan DNA dikeringkan dengan vaccum dryer, dan disuspensikan di dalam
dH2O. Untuk menghilangkan RNA ditambahkan RNAse . Kualitas dan kuantitas
DNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm. Keutuhan DNA dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose 1% di
dalam larutan penyangga TAE 1x. Visualisasi DNA dilakukan di atas UV
transiluminator GelDoc (Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr (0.5 µg/ml)
selama 15 menit dan dibilas dengan air.
Komposisi PCR untuk mendeteksi tanaman transgenik adalah 10 ng
DNA total, 0.5 µM primer higromisin-F, 0.5 µM primer higromisin-R, 1x buffer
Tag, 0.2 mM dNTP mix, 1.25 U DNA Polymerase (Fermentas) dan ddH2O
hingga volume reaksi 20 µM. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi
pra-PCR 95oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 1 menit; penempelan primer 58oC, 1
detik; pemanjangan 72oC, 1 menit; dan pasca-PCR 72oC, 5 menit.
Uji Toleransi Tanaman Transgenik Terhadap Cekaman Al. Tanaman
transgenik yang telah berumur 6 bulan setelah transformasi dipotong bagian
atasnya hingga 3-4 buku dari pucuk lalu ditumbuhkan di dalam media MS0 yang
mengandung Al 1 mM AlCl3.6H2O pH 4.5. Kemudian diamati penghambatan
pertumbuhannya pada tanaman transgenik.
72
Hasil dan Pembahasan
Konstruksi Vektor RNAi
Fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD yang berukuran 200 pb telah berhasil
diisolasi dari plasmid pGEM-MmCuZn-SOD (Gambar 31). PCR dilakukan
dengan menggunakan enzim Taq polymerase yang menghasilkan ujung yang
tumpul (blunt end) yang tidak mengandung nukleotida A. Hal ini dimaksudkan
agar ujung 5’ fragmen hasil PCR adalah CACC supaya dapat tersisipi ke vektor
pENTRTM/D-TOPO®.
Gambar 31. Hasil isolasi 3’UTR MmCuZn-SOD melalui PCR pGEM-MmCuZn-
SOD sebagai cetakan dan primer SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R.
Produk PCR yang berukuran 200 pb ini telah berhasil diligasikan dengan
pENTR-D/TOPO. Keberhasilan ini ditunjukkan oleh koloni bakteri E.coli yang
tumbuh dalam media seleksi LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin
50 mg/L setelah ditransformasikan dengan hasil ligasi tersebut. Hasil PCR koloni
dengan primer SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R menunjukkan bahwa koloni yang
tumbuh pada media seleksi tersebut membawa fragmen 3’UTR gen MmCuZn-
SOD (Gambar 32). Hal ini menunjukkan bahwa fragmen 3’UTR gen MmCu/Zn-
SOD telah berhasil tersisipi ke vektor pENTR-D/TOPO yang selanjutnya disebut
plasmid pENTR-3UTRMmCuZn-SOD. cDNA yang tersisipi ke dalam pENTR
dapat dipastikan memiliki arah yang tepat karena kesepesifikan pada ujung
5’nya.
Gambar 32. Hasil PCR dengan primer spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R terhadap lima koloni bakteri E.coli hasil transformasi membawa plasmid pENTR-D/TOPO rekombinan (pENTR-3UTRMmCuZn-SOD). (M=Marka, 1-4 = koloni E.coli transforman: 5 = pGEM-MmCuZn-SOD sebagai kontrol positif).
73
Fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD yang dibawa vektor pENTRTM/D-TOPO®
telah berhasil disisipkan ke dalam vektor RNAi pANDA dengan enzim LR
clonase (Invitrogen, USA). Hasil ini ditunjukkan dengan koloni E.coli yang tumbuh
pada media seleksi higromisin 50 mg/L dan kanamisin 50 mg/L. Hasil PCR
koloni dengan primer SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R menunjukkan bahwa koloni
yang tumbuh pada media seleksi tersebut membawa fragmen 3’UTR gen
MmCuZn-SOD (Gambar 34). Hal ini menunjukkan bahwa fragmen 3’UTR gen
MmCuZn-SOD telah berhasil tersisipi ke vektor pANDA yang selanjutnya disebut
plasmid pANDA-3UTRMmCuZn-SOD. Penyisipan fragmen 3’UTR MmCuZn-
SOD ke dalam vektor RNAi pANDA pada dua daerah yang orientasinya terbalik
(inverted) adalah hasil rekombinasi antara attR1 dan attR2 dari vektor pANDA
dan attL1 dan attL2 dari vektor pENTR-3UTRMmCuZn-SOD.
Gambar 33. Hasil PCR pANDA-MmCuZn-SOD sebagai cetakan dengan primer spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R. ( M = marka; 1-2 = koloni E.coli transforman; 3 = pGEM-MmCuzn-SOD sebagai kontrol positif).
Di dalam sel, fragmen 3’UTRMmSOD yang ada pada dua daerah yang
orientasinya terbalik (inverted) ini ditranskripsikan (Gambar 34) di bawah kendali
promotor konstitutif ubiquitin 1 jagung. mRNA yang dihasilkan membentuk utas
ganda (dsRNA).
Gambar 34. Konstruksi vektor RNAi pANDA yang membawa fragmen 3’UTR gen penyandi MmCuZn-SOD.
74
Double strand RNA yang dihasilkan oleh suatu organisme akan dikenali
oleh enzim dicer dan dipotong menjadi dsRNA yang berukuran kecil dan
selanjutnya salah satu utasnya (antisense) berasosiasi dengan RISC (RNA-
induced silencing complex) untuk mendegradasi mRNA target sehingga ekspresi
gen dapat ditekan dalam berbagai level (Hannon 2002; Meister & Tuschl 2004).
Transformasi A. tumefaciens dengan Plasmid pAND-3’UTRMmCuZn-SOD Plasmid pAND-3’UTRMmCuZn-SOD telah berhasil diintroduksikan ke
dalam A.tumefaciens LBA 4044 dengan menggunakan metode triparental mating
(TPM). Plasmid pAND-3’UTRMmCuZn-SOD yang terdapat pada E.coli DH5α
hasil transformasi (sebagai donor) dipindahkan ke dalam A.tumefaciens LBA
4044 (sebagai resipien) melalui proses konyugasi dengan bantuan E.coli HB 101
(pRK 2013) yang resisten terhadap antibiotik kanamisin. Bakteri yang mampu
hidup pada media seleksi yang mengandung 50 mg/L kanamisin +50 mg/L
higromisin + 50 mg/L streptomisin hanya A. tumefaciens LBA 4404 yang
mengandung plasmid pAND-3’UTRMmCuZn-SOD.
Koloni hasil TPM yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya telah
dianalisis dengan PCR untuk membuktikan adanya plasmid pAND-
3’UTRMmCuZn-SOD di dalam A.tumefaciens. PCR dengan primer spesifik
SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R terhadap koloni A. tumefaciens menghasilkan
produk PCR berukuran 200 pb (Gambar 35). Hasil ini menunjukkan bahwa
proses TPM telah berhasil dan menghasilkan A.tumefaciens yang mengandung
plasmid RNAi pAND-3’UTRMmCuZn-SOD. A.tumefaciens tersebut siap
diintroduksikan ke dalam tanaman target M. malabathricum.
Gambar 35. Hasil PCR dengan primer spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R terhadap 2 koloni bakteri A. tumefaciens LBA 4404 hasil triparental mating. (M=Marka, 1-2 = koloni A. tumefaciens transforman pAND-3UTRMmCuZn-SOD; 3 = plasmid pAND-3UTRMmCuZn-SOD).
75 Transformasi Tanaman M. malabathricum dengan A. tumefaciens
Vektor ekspresi RNAi telah berhasil diintroduksikan ke dalam tanaman M.
malabathricum L. sehingga tanaman M. malabathricum transgenik yang
mengandung dua fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD dengan orientasi terbalik yang
dikontrol oleh promotor kuat ubiqutin1 telah diperoleh. Pengujian dengan PCR
menggunakan primer higromisin-F dan higromisin-R menghasilkan pita DNA
berukuran sekitar 580 pb, sedangkan PCR menggunakan ActF dan ActR sebagai
kontrol menghasilkan pita berukuran sekitar 200 pb (Gambar 36). Pita berukuran
580 pb berasal dari amplifikasi gen HPT sebagai gen reporter dan berada di hilir
gen target (Gambar 34). Hal ini menunjukkan bahwa konstruksi RNAi yang
membawa fragmen 3UTRMmCuZn-SOD telah terintegrasi ke dalam genom
tanaman M. malabathricum. Hal ini juga dibuktikan dengan kemampuan tanaman
transgenik hidup di media seleksi 30 mg/L higromisin (Gambar 37). Fungsi dari
penggunaan primer aktin adalah untuk memastikan bahwa DNA yang digunakan
sebagai cetakan adalah baik.
Gambar 36. Hasil PCR menggunakan primer higromisin-F dan higromisin-R (pita
berukuran 580 pb) dan primer ActF dan ActR (pita berukuran 200 pb) terhadap DNA dari 6 tanaman transgenik. (M= marker; 1-6 = DNA tanaman transgenik; 7 = tanaman non transgenik; 8 = plasmid pAND-3UTRMmCuZn-SOD).
Gambar 37. Tanaman M.malabathricum transgenik umur 16 minggu setelah transformasi pada media seleksi 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L kanamisin.
76 Uji Toleransi Tanaman Transgenik Terhadap Cekaman Al
Tanaman M.malabathricum L. transgenik yang telah ditumbuhkan pada
MS yang mengandung 1 mM AlCl3.6H2O mulai minggu ke 3 perlakuan Al
menampakkan gejala daun menguning dan terus mengalami perubahan ke
coklat dan mengalami kematian 7 minggu kemudian. Sementara kontrol tetap
menunjukkan pertumbuhan yang baik yang diindikasikan dengan warna daun
yang tetap hijau. Pada penelitian ini pertumbuhan tanaman transgenik terhambat
oleh perlakuan 1 mM Al (Gambar 38). Hal tersebut menunjukkan bahwa
konstruksi RNAi dari 3’UTRMmCuZn-SOD diduga dapat menghentikan dan/atau
menurunkan ekspresi gen penyandi MmCuZn-SOD pada M. malabathricum L.
Kondisi ini juga dapat memberikan dugaan bahwa gen penyandi MmCuZn-SOD
pada M. malabathricum merupakan salah satu gen yang terlibat dalam toleransi
tanaman dari cekaman Al. Hal ini sejalan dengan pernyataan bahwa konstruksi
RNAi dapat digunakan untuk mempelajari peranan suatu gen pada tanaman
(Miki et al. 2005; Moritoh et al. 2005; DeBoer et al. 2010; Muzuni 2011).
Gambar 38. Tanaman M.malabathricum transgenik dan non transgenik yang diperlakukan dengan 1mM AlCl3.6H2O. dan pH 4.5 pada media MS selama 7 minggu. A. Tanaman non trangenik, B. Tanaman transgenik, C. Tanaman transgenik pada media MS tanpa cekaman pH dan Al.
Simpulan
Vektor RNAi yang membawa fragmen 3’UTRMmCuZn-SOD berhasil
dikonstruksi dan disisipkan ke genom tanaman Melastoma malabathricum L.
melalui Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Pada media MS yang
mengandung cekaman Al (1 mM AlCl3.6H2O), tanaman transgenik mengalami
hambatan pertumbuhan, sedangkan non trasngenik tidak mengalami hambatan.
Hal ini menunjukkan bahwa CuZn-SOD berperan dalam toleransi Al pada
tanaman M. malabathricum.
BAB VII PEMBAHASAN UMUM
Tumbuhan yang hidup di tanah asam umumnya adalah tumbuh-
tumbuhan yang dapat beradaptasi dengan lingkungan tersebut. Salah satu jenis
tumbuhan yang banyak dijumpai pada Tanah Podsolik Merah Kuning yang
bersifat asam adalah Melastoma. Tanaman ini tersebar di seluruh Indonesia.
Salah satu spesiesnya adalah Melastoma malabathricum L. Tanaman M.
malabathricum L. ini sangat tolereran terhadap tanah asam dengan kelarutan Al
tinggi sehingga tanaman ini biasa disebut sebagai tanaman indikator tanah asam
dan tanaman akumulator Al. Pertumbuhan akar tanaman M. malabathricum L.
pada pH 4.0 tidak mengalami gangguan (Muhaemin 2008). Selain itu, telah
dibuktikan pula bahwa M. affine D. Don. (sinonim M. malabathricum L.) yang
mendapat cekaman 3.2 mM Al pada pH 4 dalam media cair menunjukkan
akumulasi Al sebesar 8.82 mg Al/g daun tua setelah 2 bulan perlakuan (Mutiasari
2008). Karena tumbuh baik pada kondisi asam dan Al tinggi, maka tanaman ini
dapat digunakan sebagai sumber gen ketahanan terhadap tanah asam dan Al
tinggi. Untuk memanfaatkan sifat toleransi M. malabathricum L. terhadap pH
rendah dan Al, beberapa gen telah berhasil diisolasi dari tanaman ini yang
diduga terlibat dalam sistem toleransi tanaman terhadap cekaman pH rendah
dan Al. Gen-gen tersebut adalah gen multidrug resistance associated protein
(Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009),
dan H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010). Isolasi gen-gen tersebut
sangat penting dilakukan agar perakitan tanaman transgenik yang toleran
terhadap cekaman Al dan pH rendah dapat dilakukan. Tanaman ini diharapkan
dapat dikembangkan di lahan marginal sehingga produksi tanaman pangan di
lahan tersebut dapat ditingkatkan.
Secara umum, penelitian ini dibagi menjadi 4 percobaan. Percobaan
pertama dalam penelitian ini adalah isolasi gen aktin dari M. malabathricum L.
Percobaan ini sangat penting dilakukan karena belum ada informasi sekuen DNA
yang menyandi aktin dari M.malabathricum di GenBank. cDNA aktin digunakan
sebagai kontrol internal pada percobaan ke 2. Hasil percobaan 1 ini adalah
empat fragmen MmACT yang telah didaftarkan di bank data
GenBank/EMBL/DDBJ, masing-masing dengan nomor aksesi AB500686,
AB500687, AB500688, dan AB500689. Keempat fragmen gen aktin ini adalah
gen aktin yang pertama diisolasi dari M. malabathricum L. Informasi urutan
78 nukleotida gen aktin ini sangat diperlukan untuk mendesain primer yang
diinginkan untuk kontrol internal dalam menganalisis ekspresi gen-gen yang telah
diisolasi dari tanaman M. malabathricum, khususnya analisis ekspresi gen secara
kuantitatif. Informasi ini juga penting sebagai kontrol kontaminasi DNA ketika
mengisolasi RNA dari tanaman M. malabathricum, karena posisi fragmen
MmACT yang telah diisolasi berada pada posisi ekson 2 dan ekson 3.
Informasi fragmen gen aktin yang telah diperoleh, telah dijadikan sebagai
sumber informasi untuk mendesain primer aktin. Primer ini telah digunakan
untuk kontrol internal dalam analisis gen CuZn-SOD yang telah diisolasi dari M.
malabathricum pada percobaan kedua.
Percobaan kedua adalah mengisolasi gen CuZn-SOD dari
M.malabathricum L. Desain primer dilakukan terlebih dahulu untuk mengisolasi
gen ini. Primer spesifik CuZn-SOD didesain dari daerah terkonservasi sekuen
CuZn-SOD dari beberapa tanaman tingkat tinggi yang ada di GenBank. Hasil
PCR dengan primer spesifik ini menghasilkan produk PCR berukuran 457 pb.
Setelah memastikan bahwa fragmen tersebut adalah fragmen cDNA yang
menyandi gen CuZn-SOD yaitu dengan sekuensing dan analisis kesejajaran,
maka didesain lagi primer dari fragmen ini untuk memperoleh gen utuh (full
length) dengan metode RACE (Rapid Amplification cDNA Ends) dari ujung 5’ dan
3’. Analisis kesejajaran (alignment) urutan nukleotida dari fragmen 5’RACE,
fragmen 3’RACE, dan fragmen CuZn-SOD diperoleh full length CuZn-SOD
M.malabathricum (MmCuZn-SOD) berukuran 824 pb. Fullength MmCuZn-SOD
ini terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino,
114 pb daerah 5’UTR (untranslated regiaon), dan 251 pb daerah 3’UTR.
CuZnSOD adalah superoksida dismutase (SOD) yang memiliki kofaktor
copper/zinc (CuZn) pada sisi aktif enzimnya. Protein gen ini umumnya ditemukan
di sitosol dan kloroplas. Lokasi protein yang disandikan oleh gen CuZn-SOD
yang telah diisolasi dari M. malabathricum (MmCuZN-SOD) adalah di sitosol.
Hal ini berdasarkan pada analisis daerah 5’UTR MmCuZn-SOD yang
mempunyai urutan kodon akhir (TAA) di depan kodon awal metionin, yang
merupakan indikasi bahwa MmCuZn-SOD tidak mempunyai peptida transit untuk
target kloroplast. Dugaan ini juga diperkuat dengan analisis filogenetik
berdasarkan urutan asam amino, yang menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD
memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol tanaman tingkat tinggi
lainnya, dibandingkan CuZn-SOD kloroplast.
79
Ekspresi MmCuZn-SOD pada M. malabathricum diuji dengan
semikuantitatif RT-PCR. Aktin digunakan sebagai kontrol internal pada
pengujian ini. Pada percobaan ini diketahui bahwa gen MmCuZn-SOD
tereksperesi pada daun, batang, dan akar. Menurut Ezaki et al. (2000) gen SOD
adalah salah satu gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al. Hasil percobaan kami
dengan menguji ekspresi MmCuZn-SOD pada tanaman M.malabathricum L.
yang diberi cekaman Al, menunjukkan bahwa tingkat ekspresi MmCuZn-SOD
meningkat dengan perlakuan cekaman Al baik pada daun maupun akar. Hasil ini
menunjukkan bahwa ekspresi MmCuZn-SOD diinduksi oleh Al pada tanaman
M.malabathricum L.
Peranan gen pada tanaman dapat dipelajari dengan pendekatan dua
arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen antara lain dengan mengkonstruksi vektor
over ekspression dan diekspresikan ke tanaman sensitif Al, serta menghentikan
dan/atau menurunkan ekspressi gen antara lain dengan mengkonstruksi RNAi.
Pendekatan pertama yaitu untuk meningkatkan ekspresi gen telah kami lakukan
pada percobaan 3. Gen MmCuZn-SOD telah disisipkan ke vektor ekspresi
pMSH1 dan pGWB5 yang mempunyai promotor CaMV dan gen penanda seleksi
nptII dan hpt pada daerah T-DNAnya. MmCuZn-SOD dimasukkan ke dalam
genom tanaman model Nicotian bentamiana dan N. tabacum melalui
Agrobacterium tumefaciens. Hasil analisis tanaman transgenik dengan PCR
menunjukkan bahwa tanaman yang tahan kanamisin dan higromisin
mengandung DNA sisipan yaitu MmCuZn-SOD. Tanaman transgenik generasi
T1 yang diuji dengan media seleksi 50 mg /L higromisin menunjukkan pola
segregasi 3:1. Hal ini menunjukkan bahwa gen MmCuZn-SOD yang dimasukkan
ke tanaman transgenik dapat diturunkan ke generasi berikutnya mengikuti hukum
Mendel monohibrid.
Pendekatan kedua yaitu untuk menurunkan dan/atau menghentikan
ekspresi gen dengan RNAi telah dilakukan pada percobaan 4. Bagian 3’UTR
gen penyandi MmCuZn-SOD digunakan sebagai fragmen spesifik gen dalam
konstruksi vektor RNAi. Fragmen ini telah disisipkan ke pENTRTM/D-TOPO®
sebagai entry clone dan selanjutnya disisipkan ke pANDA sebagai vektor RNAi
dengan enzim LR (enzim rekombinase). pANDA merupakan plasmid biner yang
mempunyai promotor kuat ubiquitin dan gen penanda seleksi nptII dan hpt (Miki
& Shimamoto 2004). Vektor RNAi dimasukkan ke A. tumefaciens LBA 4404
melalui triparental mating (TPM), dan selanjutnya bakteri inilah yang digunakan
80 untuk mengintroduksikan fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD ke dalam genom
tanaman M.malabathricum L. dan menghasilkan M.malabathricum L. transgenik.
Analisis PCR terhadap tanaman M.malabathricum L. transgenik
menunjukkan bahwa tanaman mengandung gen hpt . Hasil ini mengindikasikan
bahwa tanaman transgenik juga mengandung DNA sisipan 3’UTR MmCuZn-SOD
yang telah difusikan pada daerah hulunya (Gambar 34). Uji tantang terhadap
tanaman transgenik dengan cekaman 1 mM Al pada media MS menunjukkan
hambatan pertumbuhan sampai pada kematian setelah 7 minggu perlakuan,
sementara tanaman kontrol (non transgenik) masih tumbuh dengan baik
(Gambar 38). Hal ini diduga karena pembungkaman gen penyandi CuZn-SOD
pada tanaman transgenik, dan ini menunjukkan bahwa gen MmCuZn-SOD pada
M. malabathricum berperan dalam toleransi terhadap Al. Menurut Cakmak dan
Horst (1991) interaksi Al3+ dengan protein dan lipid membran dapat
meningkatkan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) seperti superoksida (O2-),
H2O2, dan peroksidasi lipid. Superoksida berasal dari beberapa proses metabolik
seperti respirasi pada membran plasma, sedangkan H2O2 diproduksi oleh
dismutase enzimatik. dan dismutase spontan dari superoksida. Kombinasi O2-
dan H2O2 membentuk radikal hidroksi reaktif tinggi yang menginisiasi rantai
reaksi radikal bebas yang menghasilkan peroksidasi lipid dan menyebabkan
kerusakan membran. Sehingga ketika ekspresi gen CuZn-SOD pada M.
malabathricum dibungkam, maka diduga terjadi peningkatan superoksida yang
dapat menyebabkan peroksidasi lipid, karena aktivitas dismutase superoksida
dikatalisis oleh enzim superoxide dismutase (SOD) (Bowler et al. 1992;
Scandalios 1993). Hal yang sama juga dikemukakan oleh Yamamoto et al.
(2001) bahwa cekaman Al pada tanaman Pisum sativum menyebabkan
peroksidasi lipid.
Analisis ekspresi MmCuZn-SOD pada percobaan 2 dan uji tantang
pembungkaman gen MmCuZn-SOD pada percobaan 4 telah membuktikan
bahwa ekspresi gen CuZn-SOD diinduksi oleh Al pada tanaman M. malabthricum
dan gen ini berperan dalam toleransi Al. Hasil ini berpotensi untuk menguji gen
MmCuZn-SOD pada tanaman yang sensitive Al yang diberi cekaman Al,
sehingga diharapkan dapat merakit tanaman-tanaman yang toleran Al. Vektor
ekspresi berlebih gen MmCuZn-SOD yang telah diintroduksikan ke dalam bakteri
A.tumefaciens pada percobaan 2 dapat dimasukkan ke berbagai tanaman yang
diiinginkan.
81
SOD merupakan enzim antioksidan yang berada pada garis depan
sebagai pertahanan terhadap radikal superoksida (Fridovich 1995). Enzim ini
sangat berperan sebagai pertahanan ketika tanaman mendapat cekaman biotik
dan abiotik. Ekspresi gen SOD juga telah dilaporkan meningkat dengan
cekaman abiotik lainnya seperti cahaya tinggi (Allen et al. 1997) sulfur dioksida
(Tseng et al. 2007; Tseng et al. 2008), ozon (Pitcher and Zilinskas 1996),
kekeringan (Mittler & Zilinskas 1994; Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), suhu
rendah (Hernandez-Nistal et al. 2002; Lee & Lee 2000; Gao et al. 2009), dan
garam ( Sreenivasulu et al. 2000). Peranan SOD ini memberi peluang untuk
menganalisis gen MmCuZn-SOD terhadap berbagai cekaman biotik dan abiotik,
sehingga gen ini juga berpotensi untuk merakit tanaman toleran terhadap
cekaman oksidatif.
Sampai saat ini belum ada laporan mengenai isolasi gen penyandi CuZn-
SOD dari tanaman M. malabathricum L, dan ekspresinya terhadap cekaman Al.
Oleh karena itu gen MmCuZn-SOD yang diisolasi dari M. malabathricum L. dan
diduga berperan dalam toleransi Al tanaman M. malabathricum L. merupakan
kebaruan dari penelitian ini (novelty). Hasil ini diharapkan dapat menunjang
program pemuliaan tanaman pangan untuk memperoleh tanaman toleran Al
dengan mengintroduksikan gen MmCuZn-SOD ke tanaman lain dengan teknik
rekayasa genetika.
BAB VIII SIMPULAN DAN SARAN UMUM
Simpulan Umum
Empat fragmen cDNA aktin dari M. malabthricum telah berhasil diisolasi,
yaitu berukuran 617 pb (MmACT1, MmACT2) dan 735 pb (MmACT3, MmACT4).
Antar keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar
78%-99% , dan kemiripan asam amino sekitar 98% - 100%. Fragmen MmACT
terletak diantara ekson 2 dan ekson 3 pada struktur umum gen aktin A.thaliana.
Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data
GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688,
dan AB500689.
Gen utuh CuZn-SOD dari M. malabathricun (MmCuZn-SOD) juga telah
berhasil diisolasi berukuran 840 pb yang terdiri dari 459 pb ORF yang menyandi
152 asam amino. MmCuZn-SOD adalah CuZn-SOD sitosol. MmCuZn-SOD
terekspresi pada jaringan daun, akar dan batang. Perlakuan cekaman Al
meningkatkan ekspresi MmCuZn-SOD pada daun dan akar M.malabathricum.
Gen MmCuZn-SOD berhasil diintroduksi ke dalam vektor ekspresi dan
telah dimasukkan ke dalam genom tanaman N. benthamiana dan N. tabacum.
Pola segeregasi gen hpt yang difusikan dengan gen MmCuZn-SOD pada
tanaman transgenik generasi T1 mengikuti pola pewarisan Mendel monohibrid
yaitu 3:1.
Vektor RNAi yang membawa fragmen 3’UTRMmCuZn-SOD berhasil
dikonstruksi dan dimasukkan ke genom tanaman Melastoma malabathricum L.
melalui Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Pada media MS yang
mengandung cekaman Al (1 mM AlCl3.6H2O), tanaman transgenik mengalami
hambatan pertumbuhan, sedangkan non trasngenik tidak mengalami hambatan.
Hal ini menunjukkan bahwa CuZn-SOD berperan dalam toleransi Al pada
tanaman M. malabathricum.
Saran Umum
Pengujian tanaman model transgenik dengan cekaman Al perlu dilakukan
untuk mengetahui tingkat toleransinya terhadap cekaman Al setelah
mengandung gen MmCuZn-SOD. Gen MmCuZn-SOD berpotensi dimasukkan
ke tanaman komoditas lainnya, selanjutnya diuji ekspresinya terhadap cekaman
Al dan cekaman abiotik lainnya.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ……………………………………………………….............
xv
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………………...
xvi
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………………….
xix
1 PENDAHULUAN Latar Belakang …………………………………………………………... 1 Tujuan Penelitian ………………………………………………………... 4 Strategi Penelitian ……………………………………………………….. 4 2 TINJAUAN PUSTAKA Melastoma malabathricum L. …………………………………………... 7 Toksisitas Aluminium ………………………………………………….… 8 Pengaruh Aluminium Pada Tanaman ……………………………….… 9 Toleransi Tanaman Terhadap Cekaman Aluminium ………………... 11 Gen-Gen Yang Berhubungan Dengan Toleransi Aluminium ……….. 12 Superoxide Dismutase (SOD) ………………………………………….. 13 Pengklonan DNA Dengan Rekombinasi Situs Spesifik………………. 15 RNA interference (RNAi).................................................................... 17 Teknik Transformasi ………………………………………………......... 20 Aktin ………………………………………………………………………. 22 3 ISOLASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI AKTIN DARI
Melastoma malabathricum L
Abstrak…………………………………………………………………….. 25 Abstract …………………………………………………………………… 25 Pendahuluan …………………………………………………………….. 26 Bahan Dan Metode ……………………………………………………… 26 Hasil Dan Pembahasan ………………………………………………… 29 Simpulan …………………………………………………………………. 34
4 ISOLASI, PENGKLONAN DAN EKSPRESI GEN PENYANDI
COPPER/ZINC-SUPEROXIDE DISMUTASE PADA Melastoma malabathricum L.
Abstrak…………………………………………………………………….. 35 Abstract …………………………………………………………………... 35 Pendahuluan …………………………………………………………….. 35 Bahan dan Metode penelitian..…………………………………………. 37 Hasil dan Pembahasan ……………………………………………….... 39 Simpulan …………………………………………………………………. 46
5 KONSTRUKSI VEKTOR DAN REKAYASA EKSPRESI BERLEBIH GEN MmCuZn-SOD PADA Nicotiana benthamiana DAN Nicotiana tabacum
Abstrak……………………………………………………………………. 47 Abstract …………………………………………………………………... 47
xiv
Pendahuluan …………………………………………………………….. 47 Bahan dan Metode …………………………………………………….... 49 Hasil dan Pembahasan ……………………………………………….... 54 Simpulan …………………………………………………………………. 63
6 KONSTRUKSI RNAi DARI FRAGMEN 3’UTR DARI GEN PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak……………………………………………………….……………. 65 Abstract……………………………………………………….…………... 65 Pendahuluan ……………………………………………….……………. 66 Bahan dan Metode Penelitian…………………………………………... 68 Hasil dan Pembahasan …………………………………….…………… 72 Simpulan …………………………………………………………………. 76
7 PEMBAHASAN UMUM ………………………………………………........... 77
8 SIMPULAN DAN SARAN UMUM …………..………………………………. 83
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………………..
85
LAMPIRAN………………………………………………………………… 101
xv
DAFTAR TABEL
Halaman 1 Persentase kemiripan nukleotida antar cDNA MmACT…………………..
32
2 Analisis kesejajaran fragmen nukleotida MmCuZn-SOD dengan program BLASTn………………………………………………………………
41
3 Persentase keberhasilan transformasi genetik N. tabacum dan N.
benthamiana dengan menggunakan eksplan daun.………………………
59
4 Hasil pengujian resistensi tembakau transgenik generasi T1 terhadap higromisin………………………………………………………………………
63
xvi
xvii
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, analisis ekspresi, analisis
ekspresi berlebih pada tanaman model dan pembungkaman pada M.malabathricum L. gen penyandi CuZn-SOD dari M.malabathricum L.
5 2 Vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen 2006) ........................................ 16 3 Model umum tahapan-tahapan dalam mekanisme RNAi........................ 19 4 RNA total dari daun M. malabathricum L. ............................................... 29 5 Fragmen MmACT hasil PCR menggunakan primer PlAc46S dan
PlAc245N (1), dan primer PlAc46S dan PlAc284N (2)…………………...
30 6 PCR koloni dari fragmen target 750 pb (1 & 2) dan 600 pb (3 & 4)......... 30 7 Verifikasi DNA plasmid rekombinan target 600 pb (1 & 2) dan 750 pb (3
& 4) dengan enzim restriksi EcoR1..........................................................
31 8 Hubungan filogenetik antara aktin Melastoma malabathricum (Mm),
Populus trichocarpa (Pt), Gossypium hirsutum (Gh), Arabidopsis thaliana (At), Oryza sativa (Os), Zea mays (Zm) dan Musa acuminate AAA Group (Ma). Angka menunjukkan ketidakmiripan………………….
33 9 Posisi fragmen MmACT dalam struktur umum gen aktin A. thaliana....... 34 10 RNA total dari daun (1), batang (2), pucuk (3) dan akar (4)…………… 39 11 Urutan basa fragmen MmCuZn-SOD . ……………………………………. 40 12 Urutan nukleotida gen utuh MmCuZn-SOD dan deduksi asam
aminonya, dengan ORF (open reading frame) dari nukleotida ke-115 sampai dengan 573. Huruf tertulis miring adalah kodon akhir pada 5’UTR MmCuZn-SOD. Huruf dalam kotak menunjukkan kodon awal dan kodon akhir. Nukleotida yang digaris bawahi adalah sinyal poliadenilasi putatif……………………...……………………………………
42
13 Peta plasmid pGEM-MmCuZn-SOD (3839 pb) yang terdiri dari vektor
pGEM-T Easy (3015 pb) dan cDNA MmCuZn-SOD (824pb)……………
42 14 Kesejajaran urutan asam amino MmCuZn-SOD dengan asam amino
CuZn-SOD sitosol dan kloroplas dari Gossypium hirsutum dan Arabidopsis thaliana. Residu asam amino yang terkonservasi berada dalam kotak. Residu domain Cu ditandai dengan segitiga tertutup, residu domain Zn ditandai dengan segitiga terbuka, dan residu sistein dengan lingkaran tertutup........................................................................
43
xviii
15 Profil hidrofobisitas MmCuZn-SOD dan CuZn-SOD sitosol Gossypium
hirsutum menggunakan skala Kyte & Doolittle.........................................
44 16 Hubungan filogenetik MmCuZn-SOD dengan CuZn-SOD sitosol dan
kloroplas dari R. communis (EEF49740), M. xiaojinensis (AT66935), G.hirsutum (ABA00453), P. trichocarpa (ABK93317), M. truncatula (ACJ83988), A. thaliana (NP172360), A.thaliana-chl (AAD10208), G. hirsutum-chl (ACC93637), S. lycopersicum-chl (P14831), dan B. gymnorhiza-chl (CAM98444)………………………………………………..
44 17 Pola ekspresi MmCuZn-SOD pada daun (L), akar (R), dan batang (S).. 45 18 Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD dengan cekaman aluminium pada M.
malabathricum. A. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD pada daun, B. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD pada akar. Gen actin M. malabathricum digunakan sebagai kontrol internal untuk menstandarkan jumlah RNA yang digunakan…………………………….
46 19 Hasil pemotongan fragmen PCR MmCuZn-SOD dan pMSH1 dengan
dengan enzim restriksi Xba1 dan Spe1 (M= Marka. 1= fragmen MmCuZn-SOD, 2= pMSH1).....................................................................
55 20 Hasil PCR dengan primer spesifik MmCuZn-SOD dari koloni bakteri
E.coli hasil transformasi dengan plasmid pMSH1 rekombinan. (M=Marka, 1-8 = koloni E.coli transforman).............................................
55 21 Konstruksi plasmid biner pMSH1 yang membawa gen MmCuZn-SOD
(pMSH-MmCuZn-SOD)………………………………………………………
56 22 Hasil PCR dengan primer spesifik MmCuZn-SOD dari koloni bakteri
E.coli hasil transformasi dengan plasmid pENTR™/D-TOPO® rekombinan (M=Marka,1-4=koloni E.coli transforman)............................
57 23 Hasil PCR dengan primer spesifik MmCu/Zn-SOD dari koloni bakteri
E.coli hasil transformasi dengan plasmid pGWB5 rekombinan (M=Marka; 1-6 = koloni E.coli transforman).............................................
57 24 Konstruksi plasmid biner pGWB5 yang membawa gen MmCuZn-SOD
(pGWB-MmCuZn-SOD)……………………………………………………
58 25 Hasil PCR dengan primer spesifik terhadap koloni bakteri A.
tumefaciens LBA 4404 hasil triparental mating........................................\
59
26 Tanaman transgenik umur 8 minggu setelah transformasi pada media
seleksi yang mengandung 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L kanamisin …………………………………………………………………...
60
xix
27 PCR DNA genom N. benthamiana hasil transformasi dengan primer spesifik MmSOD-F1 dan MmSOD-R2, (M = marker 1 Kb; 1-5 = tanaman transgenik; 6 = tanaman non transgenik; 7 = kontrol plasmid pMSH-MmCuZn-SOD)……………………………………………………….
60 28 PCR DNA genom N. tabacum hasil transformasi dengan primer spesifik
35S-F dan MmSOD-R2, (M = marker 1 Kb; 1-5 = tanaman transgenik; 6 = tanaman non transgenik; 7 = kontrol plasmid pGWB-MmCuZn-SOD)……………………………………………………………………………
61 29 Tanaman transgenik N.benthamiana (atas) dan N. tabacum (bawah)… 62 30 Hasil seleksi biji tanaman transgenik generasi T1 umur 4 minggu
menggunakan 50 mg/L higromisin…………………………………………
62 31 Hasil isolasi 3’UTR MmCuZn-SOD melalui PCR pGEM-MmCuZn-SOD
sebagai cetakan dan primer SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R……………
72 32 Hasil PCR dengan primer spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R
terhadap lima koloni bakteri E.coli hasil transformasi membawa plasmid pENTR-D/TOPO rekombinan (pENTR-3UTRMmCuZn-SOD)………………………………………………..
72 33 Hasil PCR pANDA-MmCuZn-SOD sebagai cetakan dengan primer
spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R. …………………………………
73 34 Konstruksi vektor RNAi pANDA yang membawa fragmen 3’UTR gen
penyandi MmCuZn-SOD…………………………………………………...
73 35 Hasil PCR dengan primer spesifik SOD3UTR-F dan SOD3UTR-R
terhadap 2 koloni bakteri A. tumefaciens LBA 4404 hasil triparental mating......................................................................................................
74 36 Hasil PCR menggunakan primer higromisin-F dan higromisin-R (pita
berukuran 580 pb) dan primer ActF dan ActR (pita berukuran 200 pb) terhadap DNA dari 6 tanaman transgenik.. ………………………………..
75 37 Tanaman M.malabathricum transgenik umur 16 minggu setelah
transformasi pada media seleksi 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L kanamisin……………………………………………………………………...
75 38 Tanaman M. malabathricum transgenik dan non transgenik yang
diperlakukan dengan 1mM AlCl36H2O dan pH 4.5 pada media MS0 selama 7 minggu……………………………………………………………
76
xx
xxi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Urutan nukleotida fragmen gen actin Melastoma malabathricum L…….. 103 2 Kompisi Media Lurria Bertani (LB) Agar…………………………………… 105 3 Komposisi Media Murashige & Skoog (MS)………………………………. 106
DAFTAR PUSTAKA
Abdelrahim M, Safe S, Baker C, Abudayyeh A. 2006. RNAi and cancer: Implications and applications. J RNAi Gene Silencing 2(1): 136-145.
Akashi K, Morikawa K, Yokota A. 2005. Agrobacterium-mediated transformation
system for the drought and excess light stress-tolerant wild watermelon (Citrullus lanatus). Plant Biotechnol 22: 13-18.
Allen RD, Webb RP, Schake SA. 1997. Use of Transgenic Plants to Study
Antioxidant Defenses. Free Radic Biol Med. 23(3):473-479. Alscher RG, Erturk N, Heath LS. 2002. Role of superoxide dismutase (SODs) in
controlling oxidative stress in plants. J Exp Bot 53 (372):1331-1341. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W. 1997. Gapped BLAST
and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs Nucleic Acids Res 25:3389-3402.
Ambavaram MM, Pereira A. 2011. Setting up reverse transcription quantitative-
PCR experiments. Meth Mol Biol 678: 45-54. Aniol A. 1995. Physiological aspects of aluminium tolerance associated with the
long arm of chromocome 2D of wheat (Triticum aestivum L.). Theor Appl Genet 91: 510-516.
Anwar S, Jusuf M, Suharsono, Sopandie D. 2000. Pengklonan gen yang
diinduksi oleh aluminium pada kedelai. J Bioteknol Indones 5(1): 7-16. Apel K, Hirt H. 2004. Reactive oxygen species: Metabolism, Oxidative Stress,
and Signal Transduction. Annu Rev Plant Biol 55:373–399. Bagasra O, Prilliman KR. 2004. RNA interference: the molecular immune
syatem. J Mol Histol 35(6):545-553. Bannister JV, Bannister WH, Rotilio G. 1987. Aspects of the structure, function,
and applications of superoxide dismutase. CRC Crit Rev Biochem 22(2):111–180.
Bartlett JG, Alves SC, Smedley M, Snape JW, Harwood WA. 2008. High-
throughput Agrobacterium-mediated barley transformation. Plant Methods 4(22): 1-12.
Bas A, Forsberg G, Hammarstrom S, Hammarstrom ML. 2004. Utility of the
housekeeping genes 18S RNA, β-actin, and glyceraldehydes-3-phosphate-dehydrogenase for normalization in real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis of gene expression in human T lymphocytes. Scand J Immunol 59: 566-573.
Basu A, Basu U, Taylor CJ. 1994. lnduction of microsomal membrane proteins
in roots of an aluminum-resistant cultivar of Triticum aestivum L. under conditions of aluminum stress. Plant Physiol 104: 1007-1013.
86 Basu U, Good AG, Taylor GJ. 2001. Transgenic Brassica napus plants
overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide dismutase cDNA are resistant to aluminium. Plant Cell Environ 24:1269-1278.
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. 2001 . Role for a bidentate
ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409(6818):363-6.
Bezier A, Lambert B, Baillieul F. 2002. Study of defense-related gene expression
in grapevine leaves and berries infected with Botrytis cinerea. Eur J Plant Pathol 108:111–120.
Bhattacharjee B, Mohan M, Nair S. 2010. Transformation of chickpea: effect of
genotype, explant, Agrobacterium-strain and composition of culture medium. Biol Planta 54(1): 21-32.
Bian S, Jiang Y. 2009. Reactive oxygen species, antioxidant enzyme activities
and gene expression patterns in leaves and roots of Kentucky bluegrass in response to drought stress and recovery. Sci Hort 120: 264–270.
Blessing CA, Ugrinova GT, Goodson HV. 2004. Actin and ARPs: action in the
nucleus. Trends Cell Biol 14:435-442. Boscolo PRS, Menossi M, Jorge RA. 2003. Aluminium-induced oxidative stress in
maize. Phytochemistry 62:181-189. Bot AJ, Nachtergaele FO, Young A, editor. 2000. Land Resource Potential and
Constraints at Regional and Country Levels. Rome: Food and Agricultural Organization of the United Nations.
Bowler C, Montagu MV, Inze D. 1992. Superoxide dismutase and stress
tolerance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43:83-116. Brand L et al. 2006. A versatile and reliable two component system for tissue-
specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol 141: 1194–12. Bueno P, Varela J, Ciménez-Gallego C, del Rio LA. 1995. Peroxisomal
copper,zinc superoxide dismutase. Plant Physiol 108: 1151-1160. Cakmak I, Horst WJ. 1991. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide
dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max). Physiol Plant 83:463-468.
Cannon RE, White JA, Scandalios JG. 1987. Cloning of cDNA for maize
superoxide dismutase 2 (SOD2). Genetics 84:179-183. Carzoli FG, Michelotti V, Fambrini M, Salvini M, Pugliesi C. 2008. Molecular
cloning and organ-specific expression of two gibberellin 20-oxidase genes of Helianthus annuus. Plant Mol Biol Rep 27(2): 144-152.
87 Chau BL, Lee KAW. 2007. Function and anatomy of plant siRNA pools derived
from hairpin transgenes. Plant Methods 3 (13):1-14. Chen CY et al. 2002. The regulation of actin organization by
actindepolymerizingfactor in elongating pollen tubes. Plant Cell 14: 2175–2190.
Chen R, Gyokusen M, Nakazawa Y, Gyokusen K. 2010. Selection of
housekeeping genes for transgene expression analysis in Eucommia ulmoides Oliver Using Real-Time RT-PCR. J Bot 2010: 1-7
[CSAR] Center for Soil and Agroclimate Research. 1997. Statistik sumberdaya
lahan/tanah Indonesia dan agroklimat. Jakarta: Badan Litbang Departemen Pertanian.
Curtis MD, Grossniklaus U. 2003. A gateway cloning vector set for high-
throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol 133: 462–469.
Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W, Chen S, Beachy RN, Fauquet C.
2001. Comparative analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particles bombardment. Mol Breed 7:25-33.
Darko E, Ambrusa H, Stefanovist-Banyai E, Fodor J, Bakos F, Barnabas B. 2004.
Aluminium toxicity, Al tolerance and oxidative stress in an Al-sensitive wheat genotype and in-tolerant lines developed by in vitro microscopore selection. Plant Sci 166:583-591.
Darojat MR. 2010. Perakitan Melastoma malabathricum transgenik [skripsi].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
DeBoer KD, Dalton HL, Edward FJ, Hamill JD. 2011. RNAi-mediated down-
regulation of ornithine decarboxylase (ODC) leads to reduced nicotine and increased anatabine levels in transgenic Nicotiana tabacum L. Phytochemistry 72:344–355.
Delhaize E, Craig S, Beaton CD, Bennet RJ, Jagadish VC, Randall PJ. 1993.
Aluminium tolerance in wheat (Triticum aestivum L.). 1. Uptake and distribution of aluminium in root apices. Plant Physiol 103:685-693.
Delhaize E, Ryan PR. 1995. Aluminium toxicity and tolerance in plants. Plant
Physiol 107:315-321. Delhaize E, Ryan PR, Hebb DM, Yamamoto Y, Sasaki T, Matsumoto H. 2004.
Engineering high-level aluminum tolerance in barley with the ALMT 1 gene. Proc Natl Acad Sci USA 101:15249-54.
De Schutter K et al. 2007. Arabidopsis WEE1 kinase controls cell cycle arrest in
response to activation of the DNA integrity checkpoint. Plant Cell 19: 211–225.
88 Dong C et al. 2009. Molecular cloning and expression analysis of an Mn-SOD
gene from Nelumbo nucifera. Appl Biochem Biotechnol 158(3):605-14. Du B, Nian H, Zhang Z, Yang C. 2010. Effects of aluminum on superoxide
dismutase and peroxidase activities, and lipid peroxidation in the roots and calluses of soybeans differing in aluminum tolerance. Acta Physiol Planta 32 (5):883-890.
Earley KW et al. 2006. Gateway-compatible vectors for plant functional
genomics and proteomics. Plant J 45: 616–629. Ezaki B, Yamamoto Y, Matsumoto H. 1995. Cloning and sequencing of cDNA
induced by aluminium treatment and Pi starvation in cultured tobacco cells. Physiol Planta 93:11-18.
Ezaki B, Gardner RC, Ezaki Y, Matsumoto H. 2000. Expression of aluminium-
induced genes in transgenic Arabidopsis plants can ameliorate aluminium stress and/or oxidative stress. Plant Physiol 122:657-665.
Feng Y, Liu Q, Xue Q. 2006. Comparative study of rice and Arabidopsis actin-
depolymerizing factors gene families. J Plant Physiol 163:67-79. Fernando CL, Miguel GT. 2000. Rice tolerance to excess Mn: Implications in the
chloroplast lamellae and synthesis of a novel Mn protein. Plant Physiol Biochem 38: 969-978.
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. 1998. Potent
and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806–11.
Foy CD. 1988. Plant adaptation to acid, aluminum toxic soils. Commun Soil Sci
Plant Anal 19: 959-987. Foyer CH, Noctor G. 2005. Redox homeostasis and antioxidant signaling: a
metabolic interface between strees perception and physiological responses. Plant Cell 17: 1866-1875.
Freuler F, Stettler T, Meyerhofer M, Leder L, Mayr LM. 2008. Development of a
novel Gateway-based vector system for efficient, multiparallel protein expression in Escherichia coli. Protein Expr Purif 59(2):232-41.
Fridovich I. 1975. Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 44:147-159. Fridovich I. 1995. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev
Biochem 64:97-112. Fu J, Huang B. 2001. Involvement of antioxidants and lipid peroxidant in the
adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress. Environ Exp Bot 45: 105–114.
89 Gao C, Long D, Lenk I, Nielsen KK. 2008. Comparative analysis of transgenic
tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.) plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment. Plant Cell Rep 27(10):1601-1609.
Gao J, Li T, Yu X. 2009. Gene expression and activities of SOD in cucumber
seedlings were related with concentrations of Mn2+, Cu2+, or Zn2+ under low temperature stress. Agric Sci Chin 8(6): 678-684.
Gelvin SB. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and
integration. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51: 223-256. Gelvin SB. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology
behind the ''Gene-Jockeying'' tool. Microbiol Mol Biol Rev 67(1):16-37. Gilliland LU, Pawloski L, Kandasamy MK, Meagher RB. 2003. The Arabidopsis
actin gene ACT7 plays an essential role in germination and root growth. Plant J 33:319-328.
Gonzalez-Santana IH, Marquez-Guzman J, Cram-Heydrich S, Cruz-Ortega R.
2011. Conostegia xalapensis (Melastomataceae): an aluminum accumulator plant. Physiol Plant in press. http://onlinelibrary.wiley.com/ doi/ 10.1111/j.1399-3054.2011.01527.x/full [12 November 2011].
Gutteridge JMC, Quinlan GJ, Clark I, Halliwell B. 1985. Aluminium salts
accelerate peroxidation of membrane lipids stimulated by iron salts. Biochim Biophys Acta 835: 441–447.
Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. 2000. An RNA-directed
nuclease mediates post transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404: 293-296.
Hannon GJ. 2002. RNA interference. Nature 418: 244-251. Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. 2000. DNA cloning using in vitro site-specific
recombination. Genome Res 10(11): 1788-95. Hernandez-Nistal J, Dopico B, Labrador E. 2002. Cold and salt stress regulates
the expression and activity of a chickpea cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase. Plant Sci 163: 507-514.
Hiei Y, Komari T. 2008. Agrobacterium-mediated transformation of rice using
immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols 3(5): 824-834.
Hodson MJ, Evans DE. 1995. Aluminium/silicon interaction in higher plants. J
Exp Bot 46:161-171. Invitrogen. 2003. Benchtopich™ in Gateway™ technology.
www.invitrogen.com/.../Benchtopics_Gateway_Volume_2_Number_1.pdf [8 Mei 2011].
90 Invitrogen. 2006. pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits.
http://www.invitrogen.com [ 8 Mei 2011]. Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. 1987. GUS fusions: beta-
glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6(13): 3901–3907.
Jian B et al. 2008. Validation of internal control for gene expression study in
soybean by quantitative real-time PCR. BMC Mol Biol 9(59):1-14. Jones DL, Kochian LV, Gilroy S. 1998. Aluminum induces a decrease in cytosolic
calcium concentration in BY-3 tobacco cell cultures. Plant Physiol 116:81–89.
Joube`s J, De Schutter K, Verkest A, Inze´ D, De Veylder L. 2004. Conditional,
recombinase-mediated expression of genes in plant cell cultures. Plant J 37: 889–896.
Kai G, Lu Y, Qian Z, Luo Y, Zhou G, Tang K. 2006. Molecular characterization
and expression analysis of a gene encoding mannose-binding lectin from bulb of Zephyranthes grandiflora. Biologia 61(6): 671-677.
Kalantidis K, Schumacher HT, Alexiadis T, Helm JM. 2008. RNA silencing
movement in plants. Biol Cell 100: 13–26. Kandasamy MK, McKinney EC, Meagher RB. 1999. The late pollen-specific
actins in angiosperms. Plant J 18: 681–691. Kandasamy MK, McKinney EC, Meagher RB. 2002. Functional nonequivalency
of actin isovariants in Arabidopsis. Mol Bio Cell 13: 251-261. Kano S. Kurita T, Kanematsu S, Morinaga S. 2010. Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of the violet root-rot fungus, Helicobasidium mompa, and the effect of activated carbon. Mycoscience (2010): 1-7.
Karami O, Esna-Ashari M, Kurdistani GK, Aghavaisi B. 2009. Agrobacterium-
mediated genetic transformation of plants: the role of host. Biol Plant 53 (2): 201-212.
Karimi M, Inze D, Depicker A. 2002. GATEWAY vectors for Agrobacterium
mediated plant transformation. Trends Plant Sci 7: 193–195. Karimi M, De Meyer B, Hilson P. 2005. Modular cloning in plant cells.Trends
Plant Sci 10: 103–105 Karimi M, Depicker A, Hilson P. 2007. Recombinational cloning with plant
gateway vectors. Plant Physiol 145:1144–1154. Katzen F. 2007. Gateway recombinational cloning: a biological operating system.
Expert Opin Drug Discov 2(4):571-589.
91 Kidd PS, Liugany M, Poschenrieder C, Gunse B, Barcelo J. 2001. The role of
root exudates in aluminium resistance and silicon-induced amelioration af aluminium toxicity in three varieties of maize (Zea mays L.). J Exp Bot 52: 1339-1352.
Kikkert JR, Vidal JR, Reisch BI. 2004. Stable transformation of plant cells by particle bombardment/biolistics. Meth Mol Biol 286:61-78.
Kinraide TB, Parker DR. 1990. Apparent phytotoxicity of mononuclear hydroxyl
aluminium to four dicotyledenous species. Physiol Plant 79: 283-288. Kinraide TB, Ryan PR, Kochian LV. 1994. AI3+-Ca2+ interactions in aluminum
rhizotoxicity; II. Evaluating the Ca2+-displacement hypothesis. Planta 192:104-109.
Klein TM, Arentzen R, Lewis PA, Fitzpatrick-McElligott S. 1992. Transformation
of microbes, plants and animals by particle bombardment. Nature Biotechnol 10: 286 – 291.
Kliebenstein DJ, Monde RA, Last RL. 1998. Superoxide dismutase in
Arabidopsis: an electic enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiol 118:637-650.
Kochian LV, Hoekenga OA, Piñeros MA. 2004. How do crop plants tolerate acid
soils? Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annu Rev Plant Biol 55: 459–493.
Kochian LV, Piñeros MA , Hoekenga OA. 2005. The physiology, genetics and
molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity. Plant Soil 274:175–195.
Konishi S, Niyamoto S. 1983. Alleviation of aluminum stress and stimulation of
the pollen tube growth by fluorine. Plant Physiol 24:857-862. Kumar V, Sharma A, Prasad BCN, Gururaj HB, Ravishankar GA. 2006.
Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electron J Biotechno 9 (4): 349-357.
Larsen PB, Geister MJ, Jones CA, Williams KM, Cancel JD. 2005. ALS3
encodes a phloem-localized ABC transporter-like protein that is required for aluminum tolerance in Arabidopsis. Plant J 41: 353-363.
Lee DH, Lee CB. 2000. Chilling stress-induced changes of antioxidant enzymes
in the leaves of cucumber: in gel activity. Plant Sci 159: 75-85. Leonard JN, Schaffer DV. 2006. Antiviral RNAi therapy: emerging approaches
for hitting a moving target. Gene Ther 13(6): 532–540. Li XB, Pan XP, Wang XL, Cai L, Yang WC. 2005. The cotton ACTIN1 gene Is
functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation. Plant Cell 17:859-875
92 Liang Y, Yang C, Shi H. 2001. Effects of silicon on growth and mineral
composition of barley grown under toxic levels of aluminum. J Plant Nutr 24: 229-243
Liberty, Herman M, Wattimena GA. 2008. Konstruksi plasmid biner pembawa
gen Cry1Ab dan transformasi plasmid biner dengan metode tri parental mating. Zuriat 19(2): 130-139.
Lim S et al. 2007. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that
express both CuZn-SOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediated oxidative stress and chilling. Mol Breed 19:227–239.
Liu J, Megalhaes JV, Shalf J, Kochian LV. 2009. Aluminum-activated citrate and
malate transporters from the MATE and ALMTfamilies function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance. Plant J 57: 389-399.
Liu JJ, Goh Cj, Loh CS, Tay BH, Pua EC. 1998. Cloning of two cDNAs encoding
Cu/Zn-superoxide dismutase (accession Nos.X95726 and X95728) of mustard (Brassica juncea [L.]). Plant Physiol 116: 867-872.
Ma JF, Hiradate S. 2000. Form of Aluminium for uptake and translocation in
buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). Planta 211:355-360 Ma JF, Hiradate S, Nomoto K, Iwoshita T, Matsumoto H. 1997. Internal
detoxification mechanism of Al in hydrangea: identification of Al forms in the root apices. Plant Physiol 113: 1033-1039.
Ma JF, Hiradate S, Matsumoto H. 1998. High aluminium resistant in buckwheat.
II. Oxalic acid detoxifies aluminium internally. Plant Physiol 117:753-759. Ma Z, Miyasaka SC. 1998. Oxalate exudation by taro in response to Al. Plant
Physiol 118:861-865. Ma Y, Chan C-Y, He M-L. 2007. RNA interference and antiviral therapy. World
J Gastroenterol 13(39): 5169-5179. Magalhaes JV, et al. 2007. A gene in the multidrug and toxic compound
extrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum. Nat Genet 39: 1156-1161.
Magnani E, Bartling L, Hake S. 2006. From gateway to multi site gateway in one
recombination event. BMC Mol Biol 7(46):1-7. Maria D, Ewa SP, Zbigniew K. 2007. The redox state and activity of superoxide
dismutase classes in Arabidopsis thaliana under cadmium or copper stress. Chemosphere 67: 188-193.
Marienfeld S, Schmohl N, Klein M, Schoeder WH, Kuhn AJ, Horst W. 2000.
Localisation of aluminium in root tips of Zea mays and Vicia faba. J Plant Physiol 156: 666-671.
93 Maroufi A, Bockstaele EV, Loose MD, 2010. Validation of reference genes for
gene expression analysis in chicory (Cichorium intybus) using quantitative real-time PCR. BMC Mol Biol 11(15): 1-12.
Marschner H. 1995. Mineral nutrition in higher plants. London: Academic Press
Inc. Matsumoto H. 1991. Biochemical Mechanism of Toxicity of Aluminium and The
Squestration of Aluminium in Plant Cells. Di dalam: Wright RJ, editor. Plant soil interaction at low pH. Netherlands: Kluwer Academic Publisher. hlm 825-838.
Matsumoto H. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and toleransce in higher
plants. Int Rev Cytol 200: 1-46. Matsumoto H, Yamaya T. 1988. Inhibition of potassium uptake an regulation of
membran associated Mg-ATPase activity of pea roots by aluminium. Soil Sci Plant Nutr 32:179-188.
Matsumoto H, Hirasawa E, Torikai H, Takahashi E. 1976. Localization of
absorbed aluminum in pea root and its binding to nucleic acid. Plant Cell Physiol 17: 127-137.
McDowell JM, Huang S, McKinney EC, An YQ, Meagher RB. 1996. Structure
and evolution of the actin gene family in Arabidopsis thaliana. Genetics 142:587-602.
McKinney EC, Meagher RB. 1996. Members of the arabidopsis actin gene
family are widely dispersed in the genome. Genetics 149: 663–675. McLean BG, Eubanks S, Meagher RB. 1990. Tissue specific expression of
divergent actins in soybean root. Plant Cell 2:335–344. Meister G, Tuschl T. 2004. Mechanism of gene silencing by doublestranded
RNA. Nature 431: 343-349. Meriga B, Attitalla IH, Ramgopal M, Ediga A, Kavikishor PB. 2010. Differential
tolerance to aluminium toxicity in rice cultivars: Involvement of antioxidative enzymes and possible role of aluminium resistant locus. Acad J Plant Sci 3(2): 53-63.
Meyer K. 2001. Revision of the southeast asian genus Melastoma
(Melastomataceae). Blumea (46): 351-398. Miki D, Shimamoto K. 2004. Simple RNAi vectors for stable and transient
suppression of gene function in rice. Plant Cell Physiol 45: 1706-1716. Miki D, Itoh R, Shimamoto K. 2005. RNA silencing of single and multiple
members in a gene family of rice. Plant Physiol 138: 1903-1913.
94 Miller MB, Bassler BL. 2001. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol
55: 165-199. Mittler R, Zilinskas BA. 1994. Regulation of pea cytosolic ascorbate peroxidase
and other antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery from drought. Plant J 5: 397–405.
Miyasaka SC, Buta JG, Howell RK, Foy CD. 1991. Mechanisms of aluminum
tolerance in snapbeans. Root exudation of citric acid. Plant Physiol 96:737–743.
Montgomery MK, Fire A. 1998. Double-stranded RNA as a mediator in
sequence-specific genetic silencing and co-suppression. Trends Genet 14 (7): 255-258.
Morito A, Yanagisawa O, Takatsu S, Maeda S, Hiradate S. 2008. Mechanism
for the detoxification of aluminum in roots of tea plant (Camellia sinensis (L.) Kuntze). Phytochemistry 69: 147–153.
Moritoh M, Miki D, Akiyama M, Kawahara M, Izawa T, Maki H, Shimamoto K.
2005. RNAi-mediated silencing of OsGEN-L (OsGEN-like), a new member of the RAD2/XPG nuclease family, causes male sterility by defect of microspore development in rice. Plant Cell Physiol 46(5): 699–715.
Muhaemin. 2008. Analisis pertumbuhan Melastoma (Melastoma malabathricum
auct. Non L. dan M. affine D. Don.) yang mendapat cekaman pH rendah dan aluminum [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Mushofa U. 2011. Isolasi dan karakterisasi fragmen cDNA dari gen penyandi
sitrat sintase pada Melastoma malabathricum [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Mutiasari A. 2008. Akumulasi aluminium pada Melastoma affine dan Melastoma
malabathricum [tesis].Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Muzuni, Sopandie D, Suharsono UW, Suharsono. 2010. Isolasi dan pengklonan
fragmen cDNA gen penyandi H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. J Agron Indones 38: 67-74.
Muzuni. 2011. Isolasi, pengklonan, dan konstruksi RNAi gen penyandi H+-
ATPase membrane plasma dari Melastoma malabathricum L. [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Nakagawa T et al. 2007. Improved gateway binary vector: high-performance
vectors for creation and fusion constructs intransgenic analysis of plants. Bioschi Biotechnol Biochem 71(8):2095-2100.
95 Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. 1990. Introduction of a chimeric chalcone
synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-289.
Nicot N, Hausman JF, Hoffmann L, Evers D. 2005. Housekeeping gene
selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. J Exp Bot 56:2907–2914.
Olbrich M et al. 2008. Quantification of mRNAs and housekeeping gene
selection for quantitative real-time RT-PCR normalization in European beech (Fagus sylvatica L.) during abiotic and biotic stress. Z Naturforsch C 63(7-8):574-582.
Osaki M, Watanabe T, Tadano T. 1997. Benefecial effect of aluminum on growth
of plants adapted to low pH soils. Soil Sci Plant Nutr 43: 551-563. Pai SI, Lin Y-Y, Macaes B, Meneshian A, Hung C-F, Wu T-C. 2006. Prospects of
RNA interference therapy for cancer. Gene Therapy 13: 464–477. Panda SK, Sinha LB, Khan MH. 2003. Does aluminium phytotoxicity induce
oxidative stress in greengram (Vigna radiate)?. Bulg J Plant Physiol 29: 77-86.
Paolacci AR, Tanzarella OA, Porceddu E, Ciaffi M. 2009. Identification and
validation of reference genes for quantitative RT-PCR normalization in wheat. BMC Mol Biol 10 (11): 1-27.
Patton AJ. 2000. Gateway cloning technology: faster, easier, more accurate
cloning. www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring2000/ patton/gateway.htm. [2 Juli 2011].
Peixoto PHP, Cambrain J, Anna RS, Mosquim PR, Moreira MA. 1999.
Aluminium effects on lipid peroxidation and on the activities of enzymes of oxidative metabolism in sorghum. R Bras Fisiol Veg 11(3): 137–145.
Perl-Trevers R, Nacmias B, Aviv D, Zeelon EP, Galun E. 1988. Isolation of two
cDNA clones from tomato containing two different superoxide dismutase sequences. Plant Mol Biol 11:609-623.
Pickford AS, Cogoni C. 2003. RNA-mediated gene silencing. Cell Mol. Life Sci
60:871-882 Pitcher LH, Zilinskas BA. 1996. Overexpression of copper/zinc superoxide
dismutase in the cytosol of transgenic tobacco confers partial resistance to ozone-induced foliar necrosis. Plant Physiol 110: 583–588.
Purnamaningsih R. 2006. Introduksi gen DefH9-iaaM dan DefH9-Ri-iaaM melalui
vector Agrobacterium tumefaciens untuk meningkatkan potensi produksi tanaman tomat [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
96 Quartin VI, Azinheira HG, Nunes MA. 2001. Phosphorus deficiency is
responsible for biomass reduction of Triticale in nutrient solution with aluminum. J Plant Nutr 24:1901–1911.
Raj SK, Singh R, Pandey SK, Singh BP. 2005. Agrobacterium-mediated tomato
transformation and regeneration of transgenic lines expressing Tomato leaf curl virus coat protein gene for resistance against TLCV infection. Curr Sci 88(10):1674-1679.
Ramulu KS. 1984. Origin and nature of somaclonal variation in potato. Di dalam:
Semal J, editor. Somaclonal Variation in Crop Improvement . Dordrecht: Martinus Nijhoff. hlm 188-201.
Raoul C et al. 2005. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA
interference retards disease onset and proression in a mouse model of ALS. Nat Med 4(11):423-428.
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, Hinata K. 1996. Transgenic plant production
mediated by Agrobacteriumin Indica rice. Plant Cell Re 15:727-730. Richards KD, Gardner RG. 1998. Alumunium induced oxidative stress genes in
Arabidopsis taliana. Plant Physiol 116:409-418. Richards KD, Schott EJ, Sharma YK, Davis KR, Gardner, RC. 1998. Aluminum
induces oxidative stress genes in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 116:409-418.
Rincon M, Gonzales RA. 1992. Aluminum partitioning in intact roots of aluminum-
tolerant and aluminum-sensitive wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Plant Physiol 99: 1021-1028.
Rout GR, Samantaray S, Das P. 2001. Aluminium toxicity in plants: a review.
Agronomie 21: 3-21. Ryan PR, Delhaize E, Jones DL. 2001. Function and mechanism of organic
anion exudation from plant roots. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52:527–560.
Ryan PR, Delhaize E, Randal PJ. 1995. Malate efflux from root apies and
tolerance to aluminium are highly correlated in wheat. Aust J Plant Physiol 22:531-536.
Ryan PR, Skerrett M, Findlay GP, Delhaize E, Tyerman SD. 1997. Aluminum
activates an anion channel in the apical cells of wheat roots. Proc Natl Acad Sci USA 94: 6547–6552.
Santoso D, Cugito FI, Minarsih H. 2000. Development of tobacco plant cells in
the presence of kanamycin at various levels for transgenesis. Menara Perkebuan 68:21-28.
97 Sarangi S, Ghosh J, Bora A, Das S, Mandal AB. 2011. Agrobacterium-mediated
genetic transformation of indica rice varieties involving Am-SOD gene. Indian J Biotechnol 10: 9-11.
Sasaki T et al. 2004. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate
transporter. Plant J 37: 645–653. Scandalios JG. 1993. Oxygen stress and superoxide dismutase. Plant Physiol
101: 7-12. Schmohl N, Horst WJ. 2000. Cell wall pectin content modulates aluminium
sensitivity of Zea mays (L.) cells grown in suspension culture. Plant Cell Environ 23:735-742.
Schmohl N, Pilling J, Fisahn J, Horst WJ. 2000. Pectin methylesterase
modulates aluminium sensitivity in Zea mays and Solanum tuberosum. Physiol Plant 109:419-427.
Shen J et al. 2005. Suppression of ocular neovascularization with siRNA
targeting VEGF receptor 1. Gene Ther Sep 29:1-10. Shen R, Ma JF, Kyo M, Iwashita T. 2002. Compartmentation of aluminium in
leaves of an Al-accumulator, Fagophyrum esculentum Moench. Planta 215:349-398.
Sheng J, Citovsky V. 1996. Agrobacterium - plant cell DNA transport : have
virulence proteins will travel. Plant Cell 8 : 1699-1710 Shi QH, Zhu ZJ, Li J, Qian QQ. 2005. Combined effects of high level of Mn and
low pH on oxidative stress and antioxidant enzymes in cucumber roots. Sci Agric Sinica 38: 999-1004.
Shin JH, London J, Le Pecheur M, Weitzdoerfer R, Hoeger H, Lubec G. 2005.
Proteome analysis in hippocampus of mice overexpressing human Cu/Zn-superoxide dismutase. Neu Int 46 (8): 585-653.
Silva IR et al. 2000. Aluminum accumulation at nuclei of cells in the root tip.
Fluorescence detection using lumogallion and confocal laser scanning microscopy. Plant Physiol 123: 543-552.
Simonovicova M, Tamas L, Huttova J, Mistrik I. 2004. Effect of aluminium on
oxidative stress related enzymes activities in barley roots. Biol Plant 48(2):261-266.
Slamet-Loedin IH. 1994. Transformasi genetik pada tanaman: Beberapa teknik
dan aspek penting. Hayati 1(2):66-67. Soliman MH, Omar HS, El-Awady MA, Al-Assal S, El-Din AAYG. 2009.
transformation and expression of Na+/H+antiporter vacuolar (AtNHX1) gene in tobacco plants under salt stress. Arab J Biotech 12(1):99-108.
98 Sopandie D, Chozin MA, Sastrosumarjo S, Juhaeti T, Sahardi. 2003. Shading
tolerance in upland rice. Hayati 10(2):71-75. Soutchek J et al. 2004. Therapeutic silencing of an endogenous gene by
systemic administration of modified siRNAs. Nature 432(7014):173-178. Sreenivasulu N, Grimn B, Wobus U, Weschke W. 2000. Diffrential response of
antioxidant components to salinity stress in salt-tolerant and salt-sensitive seedlings of foxtail millet (Setaria italica). Physiol Plant 109: 435-442.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati
9:67-70. Suharsono, Firdaus S, Suharsono UW. 2008. Isolasi dan pengklonan fragmen
cDNA dari gen penyandi multidrug resistance associated protein dari Melastoma affine. Makara Sains 12 (2):102-107.
Suharsono, Trisnaningrum N, Sulistyaningsih LD, Widyastuti U. 2009. Isolation
and cloning of cDNA of gene encoding for metallothionein type 2 from Melastoma affine. Biotropia 16 (1):28-37.
Sun HF et al. 2009. Selection of housekeeping genes for gene expression
studies on the development of fruit bearing shoots in Chinese jujube (Ziziphus jujube Mill.). Mol Biol Rep 36(8):2183-2190.
Suzuki T, Higgins PJ, Crawford DR. 2000. Control selection for RNA
quantitation. Biotechniques 29: 332-337. Syarifuddin A, Abdurachman A. 1993. Optimasi pemanfaatan sumberdaya lahan
berwawasan lingkungan. Di dalam: Prosiding Simposium Penelitian Tanaman Pangan III. Jakarta/Bogor 23-25 Agustus 1993. Jakarta. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan dan Badan Litbang DEPTAN.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary
genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24:1596-1599.
Tang L et al. 2006. Enhanced tolerance of transgenic potato plants expressing
both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against oxidative stress and high temperature. Plant Cell Rep 25: 1380-1386.
Taylor GJ. 1991. Current views of the aluminium stress response; the
physiological basis of tolerance. Curr Topics Plant Biochem Physiol. 10:57-93.
Thomas C et al. 2003. Molecular characterization and spatial expression of the
sunflower ABP1 gene. Plant Mol Biol 52:1025–1036. Tinland B. 1996. The integration of T-DNA into plant genomes. Trends Plant Sci
1: 178-184.
99 Tjitrosoedirdjo SS. 1991. Melastoma malabathricum Linn. Weed info sheet 6.
Bogor: SEAWIC, SEAMEO BIOTROP. Travella S et al. 2005. A comparison of transgenic barley lines produced by
particle bombardment and Agrobacterium-mediated techniques. Plant Cell Rep 23:780-789.
Triasnaningrum N. 2009. Analisis ekspresi gen penyandi metallothionein tipe II
pada Melastoma affine L. yang mendapat cekaman pH rendah dan aluminium [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Tseng MJ, Liu CW, Yiu JC. 2007. Enhanced tolerance to sulfur dioxide and salt
stress of transgenic Chinese cabbage plants expressing both superoxide dismutase and catalase in chloroplasts. Plant Physiol Biochem 45: 822–833.
Tseng MJ, Liu CW, Yiu JC. 2008. Tolerance to sulfur dioxide in transgenic
Chinese cabbage transformed with both the superoxide dismutase containing manganese and catalase genes of Escherichia coli. Sci Hort 115:101-110.
Tu LL et al. 2007. Suitable internal control genes for qRT-PCR normalization in
cotton fiber development and somatic embryogenesis. Chin Sci Bulletin 52:3110-3117.
Valentine JS, Doucette PA, Potter S.Z. 2005. Copper-Zinc superoxide
dismutase and amyotrophic lateral sclerosis. Annu Rev Biochem 74:563–93.
Vance V, Vaucheret H. 2001. RNA silencing in plants-defense and
counterdefense. Science 292: 2277-2280. Vantard M, Blanchoin L. 2002. Actin polymerization processes in plant cells.
Curr Opinion Plant Biol 5:502-506. Watanabe T, Osaki M. 2001. Influence of aluminum and phosphorus on growth
and xylem sap composition in Melastoma malabathricum L. Plant Soil 237: 63–70
Watanabe T, Osaki M. 2002. Role of organic acids in aluminum accumulation
and plant growth in Melastoma malabathricum. Tree Physiol 22:785-792. Watanabe T, Misawa S, Osaki M. 2005. Aluminium accumulation in the roots of
Melastoma malabathricum, an aluminium-accumulating plant. Can J Bot 83:1518-1522.
Watanabe T, Osaki M, Tadano T. 1997. Aluminum-induced growth stimulation
and relation to calcium, magnesium, and silicate nutrition in Melastoma malabathricum L. Soil Sci Plant Nutr 43: 827-837.
100 Watanabe T, Osaki M, Tadano T. 2001. Al uptake kinetics in roots of Melastoma
malabathricum L. – an Al accumulator plant. Plant Soil 231: 283-291. Watanabe T, Osaki M, Yoshihara T, Tadano T. 1998. Distribution and chemical
speciation of aluminum in the Al accumulator plant, Melastoma malabathricum L. Plant Soil 201:165-173.
Waterhouse PM, Wang M-B, Lough T. 2001. Gene silencing as an adaptive
defense against viruses. Nature 411: 834-842. Wesley SV et al. 2001. Construct design for efficient, effective and high-
throughput gene silencing in plants. Plant J 27:581-590. Wise AA, Liu Z, Binns AW. 2006. Three methods for introduction of foreign DNA
into Agrobacterium. Meth Mol Biol 343(1):43-54 Yamamoto Y, Kobayashi Y, Matsumoto H. 2001. Lipid peroxidation is an early
symptom triggered by aluminum, but is not the primary cause of elongation inhibition in pea roots. Plant Physiol 125:199–208.
Yang ZM, Sivaguru M, Horst WJ, Matsumoto H. 2000. Aluminium tolerance is
achieved by exudation of citric acid from roots of soybean (Glycine max). Physiol Plant 110:72-77.
Yin JQ, Gao J, Shao R, Tian WN, Wang J, Wan Y. 2003. siRNA agents inhibit
oncogene expression and attenuate human tumor cell growth. J Exp Ther Oncol 3: 194–204.
Zambryski P, Joost H, Genetellol C, Leemans J. Montagu MV, Schell J. 1983. Ti
plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J 2(12): 2143-2150.
Zhang JL, Liu DH, Wang ZH, Yu C, Cao JH, Wang CT, Jin DM. 2009. Asian J
Plant Sci 8:285-292. Zheng SJ, Ma JF, Matsumoto H. 1998. High aluminum resistance in buckwheat:
I. Al-induced specific secretion of oxalic acid from root tips. Plant Physiol 117: 745–751.
Zupan JR, Zambryski P. 1995. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the
Plant Cell. Plant Physiol 107: 1041-1047.
101
LAMPIRAN
102
103
Lampiran 1. Urutan nukleotida fragmen gen actin Melastoma malabathricum L.
>embl|AB500686|AB500686 Melastoma malabathricum Mm-Actin1 mRNA for actin, partial cds.
agacgcgtacgtcggcgatgaggcccaatctaagagaggtatattgaccctaaagtatcc
gattgagcatggtattgtcagcaactgggatgatatggagaagatttggcatcacacttt
ctacaacgagctccgtgtcgcgcccgaggaacaccctgttcttctgacagaagctcctct
taaccccaaggcgaatcgtgagaagatgacccagatcatgtttgagacctttaacacccc
tgcaatgtatgtcgccatccaggccgtgctttccttgtacgcgagcggtcgtaccacggg
tattgtgttggattctggtgatggtgtcagccacacggtgcccatctatgagggttatgc
cctcccacatgctatcctccgtctcgaccctgccggacgtgaccttactgacaacttgat
gaagatcctcaccgagcgtggctactcttttaccaccacggcggagcgtgaaatcgtgag
agacatgaaggagaagctcgcttacatcgcgctcgattatgagcaggaactggagacctc
gaagaccagctccgcggttgagaagacctacgagctc
>embl|AB500687|AB500687 Melastoma malabathricum Mm-Actin2 mRNA for actin, partial cds. agacgcgtacgtcggcgatgaggcccaatctaagagaggtatattgaccctaaagtatcc
gattgagcatggtattgtcagcaactgggatgatatggagaagatttggcatcacacttt
ctacaacgagctccgtgtcgcgcccgaggaacaccctgttcttctgacagaagctcctct
taaccccaaggcgaatcgtgagaagatgacccagatcatgtttgagacctttaacacccc
tgcaatgtatgtcgccatccaggccgtgctttccttgtacgcgagcggtcgtaccacggg
tattgtgttggattctggtgatggtgtcagccacacggtgcccatctatgagggttatgc
cctcccacatgctatcctccgtctcgaccctgccggacgtgaccttactgacaacttgat
gaagatcctcaccgagcgtggctactcttttaccaccacggcggagcgtgaaatcgtgag
agacatgaaggagaagctcgcttacatcgcgctcgattatgagcaggaactggagacctc
gaagaccagctccgcggttgagaagacctacgagctc
>embl|AB500688|AB500688 Melastoma malabathricum Mm-Actin3 mRNA for actin, partial cds. agacgcatatgttggtgatgaggctcaatccaagagaggtatcttgaccctgaagtatcc
cattgagcacggtatcgtcagcaactgggacgacatggagaagatctggcatcacacttt
ctacaatgagcttcgagttgcccccgaggaacacccggttcttctgactgaggctcctct
caaccccaaggccaatcgtgagaagatgacacagatcatgttcgagaccttcaacacccc
tgccatgtatgtcgctatccaggccgtgctttccttgtacgctagcggccgtaccacggg
tatcgtgttggattccggtgatggtgtcagtcacaccgtgcccatttacgagggctacgc
acttccccatgccatccttcgtctcgatcttgccggacgtgaccttaccgacaacttgat
gaagatcctcactgagcgtggctactctttcaccaccacagcagagcgcgaaatcgtgag
agacatgaaggaaaagctcgcctacatcgcgctcgactacgagcaggaactcgagacctc
taagacaagctctgcggtcgagaagacatacgagcttcccgacgggcaggtgatcaccat
cggtgcagagaggttcaggtgcccagaggtgctcttccagccatcgatgattgggatgga
agctgcgggcatccacgagacaacctacgactcc
104
>embl|AB500689|AB500689 Melastoma malabathricum Mm-Actin4 mRNA for actin, partial cds. ggatgcctacgttggtgacgaggctcagtccaaaagaggtatccttaccttgaaataccc
gattgaacacggtattgtgagcaactgggatgacatggagaagatctggcatcacacctt
ctacaatgagcttcgtgttgccccagaggagcacccggttctccttactgaggcaccact
caaccccaaggccaacagagaaaaaatgacccaaattatgtttgagactttcaatgtgcc
cgccatgtatgttgctatccaggctgtcctctcactttatgccagtggtcgtacaacagg
tattgtgcttgactctggtgatggtgtcagtcacactgtgcccatctacgagggatatgc
acttccccatgccatcttgcgtcttgatctcgccggccgtgatctcacggatgctctcat
gaagatcctcactgaaaggggttacatgttcaccaccactgccgaacgggaaattgtccg
tgacatgaaagagaagcttgcttatgtggcccttgactatgagcaggagctggagactgc
gaagagcagctcttcggtagagaagaactacgagttgcctgatggtcaggtgatcacgat
tggtgctgagagattccgctgtcctgaggtcctcttccagccatcattgatcggaatgga
agctgctggaattcatgagactacctacaattcc
105
Lampiran 2. Kompisi Media Lurria Bertani (LB) Agar.
No. Bahan Kimia g/l
1 Bacto Trypton 10
2 Bacto Yeast 5
3
4
NaCl
Agar
10
25
106
Lampiran 3. Komposisi Media Murashige & Skoog (MS).
No. Bahan Kimia mg/l 1. KNO3 1900 2. NH4NO3 1650 3. MgSO4.7H2O 370 4. CaCl.2H2O 440 5. KH2PO4 170 6. MnSO4.4H2O 22,3 7. ZnSO4.7H2O 8,6 8. H3BO3 6,2 9. Kl 0,83 10. Na2MoO4.2H2O 0,25 11. CuSO4.5H2O 0,025 12. CoCl2.6H2O 0,025 13. Na2.EDTA 37,3 14. FeSO4.7H2O 27,8 15. Meso-Inositol 100 16. Pyridoxine-HCl 0,5 17. Nocotinic-acid 0,05 18. Thiamine-HCl 0,1 19. Glycine 2 20. Sucrose 30 g/l 21. Gelrite 2,5 g/l 22. pH 5,9