DWI WINARNIDepartemen Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga Surabaya

A. Definisi

visualisasi bagian jaringan atau sel melalui deteksi interaksi antibodi-antigen spesifik, dimana antibodi dilabel dengan

label atau marker

- Pewarna fluorensens

- koloid logam

- hapten

- marker radioaktif

- enzim

Beragam mulai wujud sel atau irisan beku hingga sel atau jaringan dalam blok parafin atau resin

dalam immunostaining, antibodi digunakan untuk membentuk link antigen yang ada pada sel atau jaringan secara spesifik pada pewarna (reaksi yang menghasilkan warna) sehingga keberadaan antigen tersebut teramati di bawah mikroskop

immunohistochemistry immunocytochemistry

antigen dalam jaringan Antigen dalam kultur sel

Cryostat section

Memerlukan fiksasi

paraffin section resin section

Tanpa fiksasi

History of immunohistochemistry

1942 Coons, Creech, Jones, Berliner

Developed indirect immunofluorescence method

1959 Singer Developed electron-dense molecular conjugate (ferritin)

1965 Sternberger Developed electron-opaque heavy metal technique (uranium)

1966 Graham & Karnovsky

Developed enzyme tagging method (horseradish peroxidase

1967 Nakane & Pierce Developed enzyme-labelled antibody technique (immunoperoxidase)

1970 Sternberger Developed unlabelled antibody method (PAP method)

1971 Faulk & Taylor Developed another electron-opaque heavy metal technique (colloidal gold)

1974 Heitzman & Richards

Developed another unlabelled antibody method (ABC technique)

Prinsip imunohistokimia

• Reaksi antigen-antibodi untuk lokalisasi antigen

• Labeling dengan agen pewarna/fluoresens atau electron-opaque substance (ultrastructural tags) untuk memvisualisasi reaksi Ag-Ab

B. TAHAP-TAHAP DALAM IMUNOHISTOKIMIA

B.1. ANTIGEN RETRIEVAL

Antigen retrieval/unmasking dengan melakukan pretreatment spesimen

Meningkatkan reaktivitas antigen dalam jaringan

Mutlak dilakukan untuk jaringan yang difiksasi formalin karena fiksatif mengadakan cross link inter dan intramolekular dengan protein struktural tertentu yang dapat mengakibatkan masking antigen

Pretreatment : digesti menggunakan enzim proteolitik, pemanasan, iradiasi microwave, autoclaving atau pressure cooking

B.1. 1. Digesti menggunakan enzim proteolitik

B.1. ANTIGEN RETRIEVAL

Pronase 0,05% w/vProteinase-Ktrypsin 0,05% w/vpepsin 0,05%

!!!!!!!! Tidak semua antigen memerlukan digesti proteolitik karena enzim proteolitik dapat menghilangkan reaktivitas antigen tertentu, menimbulkan antigenic sites palsu , atau mengubah sifat serta merusak antigen

B.2. IMMUNOLABELING

Visualized antigen-antibody reaction by adding SUBSTRATE & CHROMOGENS

Sampel : pankreas rat (fiksatif formalin/PFA)Antigen retrieval : -Blocking : BSA 2%, 2 jam 25oCPrimary antibody : mouse-anti –rat insulinSecondary Ab : goat-anti-mouse HRP conjugationChromogen : DAB

  .substance P merupakan primary afferent derived neuropeptide .jumlah reseptor dan kadar substance P meningkat

pada kondisi pain persistent (ex: inflamasi kronis)

CGRP (Calcitonin gene related peptide ) is one of the most abundant peptides produced in both peripheral and central neurons. It is the most potent peptide vasodilator and can function in the transmission of pain. In the trigeminal vascular system the cell bodies on the trigeminal ganglion are the main source of CGRP. CGRP is thought to play a role in cardiovascular homeostasis andnociception.

APOPTOTIC CELLS DETECTION