IDENTIFIKASI BAKTERIKurniawan Santoso, dr

IDENTIFIKASI BAKTERIALAT YANG DIPERLUKANCARA PEWARNAANCARA PENILAIANMENENTUKAN JENIS BAKTERI DARI HASIL PEMERIKSAAN

PEWARNAAN (STAINING)Pewarna bereaksi secara kimiawi dg protoplas bakteri; jika sel belum mati, maka proses pewarnaan akan membunuhnyaPewarna yg umum dipakai adalah garam. Pewarna dasar tdd kation berwarna dan anion tak berwarna (misal : methylene biru+ chloride-)Pewarna asam merupakan kebalikannya (sodim+ eosinate-)Sel bakteri kaya asam amino dan mengandung muatan negatif seperti klmpk fosfat akan bereksi dg zat warna yg bermuatan positif

PEWARNAAN (STAINING)Pewarna asam tidak mewarnai sel bakteri o.k digunakan u/ mewarnai latar belakang sebagai pewarna kontrasPewarna basa mewarnai sel bakteri secara merata, kecuali sitoplasma RNA dirusak terlebih dahulu. Teknik pewarnaan khusus bisa digunakan u/ membedakan flagella, kapsul, dinding sel, membran sel, granula, nukleoid dan spora

Pewarnaan GramKarakteristik taksonomi bakteri reaksi terhadap pewarnaan gram. Reaksi pewarnaan gram berhubungan dengan sifat morfologi bakteriOrganisme yg berpotensi gram (+) mungkin hanya dapat dlihat dengan pewarnaan gram pd kondisi lingkungan yg sesuai dan pada biakan muda

Pewarnaan GramBAHAN YANG DIPERLUKAN :Obyek glassLampu spiritusOse bulatBak pewarnaanRak pengeringReagent cat gram (gentian violet, lugol, alkohol 70 %, safranin)

Pewarnaan GramCARA PEWARNAAN :Siapkan obyek glass yang bersih , kering dan bebas lemakAmbil sediaan dengan menggunakan ose bulat yang sebelumnya ose telah disterilkanSediaan difiksasi dengan melewatkan di atas nyala api lampu spiritusSediaan dituangi dengan gram 1 (gentian violet) selama 3-5 menit)Cat dibuang dan dicuci dengan air kran atau air mengalir Sediaan digenangi dengan gram 2 (lugol) selama 10-15 detikCuci dengan air kran atau air mengalirSediaan dituangi dengan safranin selama 3-5 menitCat dibuang cuci dengan air kranKeringkan

Pewarnaan GramCARA PENILAIANSel gram (+) akan mengikat senyawa gentian (kristal) violet iodine tetap berwarna biru keunguan; sel gram (-) warnanya akan hilang o/ alkoholLangkah terakhir, counterstain (ex: safranin yg berwarna merah) ditambahkan sel gram (-) yg tidak berwarna akan mengambil warna kontras; sedangkan sel gram (+) akan terlihat warna biru keunguanDasar perbedaan reaksi gram adalah struktur dinding sel

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)Digunakan u/ pengecatan bakteri tahan asamBakteri tahan asam bakteri yg mengikat karbolfuksin meskipun didekolorisasi dg asam HCl dlm alkoholContoh : Mycobacterium, beberapa Actinomycetes

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)BAHAN YANG DIPERLUKAN:Obyek glassKarbolfuksinAcid alkoholLampu spiritusCounter stain (warna biru atau hijau)

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)CARA PEWARNAAN :Heat fix cells on glass microscope slide. Flood the slide with carbol fuchsin stain. Heat the slide gently until it steams (5 min). Pour off the carbol fuchsin. Wash slide thoroughly with water. Decolourize with acid-alcohol (5 min). Wash slide thoroughly with water. Flood slide with methylene blue counterstain for 1 min. Wash with water. Blot excess water and dry in hand over bunsen flame

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)CARA PENILAIAN:Bakteri tahan asam tampak berwarna merahSelain bakteri tahan asam sesuai warna counter stain

Pewarnaan Negatif (Negative Staining)Prosedur ini meliputi pewarnaan latar belakang dg pewarnaan asam, dan membiarkan sel tidak berwarnaPewarna hitam negrosin merupakan yg paling umum digunakanMetode ini digunakan pd sel atau struktur sel yg sulit diwarnai secara langsung

Pewarnaan Flagella (Flagella Staining)Flagella terlalu halus (diameter 12-30 nm) u/ dapat dilihat dg mikroskop cahayaKeberadaan dan susunannya dpt didemonstrasikan dg memberi sel suspensi koloid tak stabil dari tannic acid salt (yg cepat mengendap pd dinding sel flagella) diameter flagella terlihat >> diwarnai dg fuchsin basa daat dilihat dg mikroskop cahayaPada bakteri peritrikh, flagella membentuk bundel selama bergerak bundel dpt dilihat pd sel hidup d menggunakan mikroskop lapangan gelap (darkfield microscop)

Pewarnaan Kapsul (Capsul Staining)Kapsul biasanya diperlihatkan dg prosedur pewarnaan negatif atau modifikasinyaSuatu pewarnaan kapsul (metode Welch) meliputi penggunaan larutan kristal violet panas yg diikuti pencucian dg larutan copper sulfat u/ menghilangkan kelebihan pewarna karena pencucian konvensional menggunakan air akan merusak kapsulCopper salt memberikan warna pd latar belakang dg hasil sel dan latar belakangnya berwarna biru gelap dan kapsulnya berwarna biru pucat

Pewarnaan Nukleoid dan Pewarnaan SporaPewarnaan Nukleoid dpt diwarnai dg pewarnaan Feulgen yg spesifik bg DNASpora secara sederhana dpt dilihat sbg badan intraseluler (intracellular refractile bodies) pd suspensi sel yg tidak diwarnai atau sbg area tak berwarna dlm sel yg diwarnai dg metode konvensionalDinding spora relatif impermeabel menghambat dekolorisasi spora pd tahap pemberian alkohol yg biasanya cukup u/ dekolorisasi sel vegetatifSpora umumnya diwarnai dg Malachite Green atau karbolfuksin