IDENTIFIKASI BAKTERI MENGGUNAKAN 16S rDNA

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER

OLEH:

RIZFI FARIZ PARI

P051140031/BTK

BIOTEKNOLOGI

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang tergolong sebagai biomolekul utama penyusun setiap

organisme, termasuk bakteri. Organisme memiliki DNA kromosomal dan ekstrakromosomal.

DNA kromosomal adalah DNA yang terletak didalam inti sel atau nucleus, berbentuk linier

dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon.. DNA ekstrakromosomal adalah DNA yang

terletak di mitokondria dan kloroplas, berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein

histon. DNA pada organisme prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,

sedangkan DNA pada organisme eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon.

(Lewin, 2004)

Isolasi DNA bakteri dari daging yang busuk diawali dengan perusakan dinding sel yang

bisa dilakukan dengan cara mekanis, kimia, atau enzimatis. DNA pada bakteri terletak di

nucleus, mitokondria dan kloroplas, sehingga proses dilanjutkan dengan melisis sel. Bahan-

bahan sel yang relative lunak dapat dilisis dengan menggunakan enzim didalam medium

buffer nonosomatik, sedangkan bahan sel yang lebih kasar dilisis dengan detergen yang kuat

seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Sel yang telah dilisis

dibersihkan dari hasil lisisnya dengan sentrifugasi. Hasil sentrifugasi belum diyakini bersih

dari pengotor protein dan RNA. Oleh karena itu, protein yang tersisa di presipitasi dengan

menggunakan fenol atau pelarut organic seperti kloroform dan dihancurkan secara enzimatis

dengan proteinase. RNA dibersihkan dengan menggunakan RNAse. DNA kemudian

dibersihkan dari sisa-sisa pengotor dengan menggunakan ammonium asetat dan alcohol atau

dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl. (Albert, et al., 2002)

DNA yang sudah diisolasi diidentifikasi dengan metode polymerase chain reaction

(PCR). PCR adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida

diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik.  PCR melibatkan banyak siklus yang

masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA

templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan

(extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase. Setelah

amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel agarose dengan

buffer tris-asetat-EDTA (TAE) dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan

dengan bromida etidium. (Meltzer, 2006)

Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan

(templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan

molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan

1

sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan

berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen

DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada

karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase

mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang

komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan

ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang

ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA

polimerase ini berlangsung dengan arah 5’ ke 3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA

polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang

terdapat pada rantai DNA templat. (Meltzer, 2006)

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mempelajari proses isolasi DNA genom bakteri

dan identifikasi DNA bakteri dari daging ayam busuk dan daging kambing busuk.

2. METODOLOGI

2.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar Universitas Institut

Pertanian Bogor

2.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum identifikasi bakteri adalah mortar, spatula,

pisau, tabung sentrifuge, sentrifuge kecepatan tinggi berpendingin, tabung mikro, neraca

analitik, pipet mikro, penangas air, spektrofotometer UV-VIS, cetakan gel, sisir, erlenmeyer,

sudip, gelas piala, gelas ukur, tube PCR, microwave, parafilm, power supply, perangkat

elektroforesis, UV Transilluminator dan kamera, mesin thermocycler /PCR, dan mesin DNA

speed vac.

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi bakteri dalam praktikum ini adalah daging

ayam busuk, daging kambing busuk, nitrogen cair, buffer lisis yang mengandung proteinase

K, es, NaCl 5N, RNAse, isopropanol, EtOH 70%, ddH2O, agarose 1%, buffer TAE, loading

2

dye, marker λ, ethidium bromide (EtBr), ddH2O, Taq DNA polymerase, buffer taq 10X,

dNTPs, primer 16S dengan 63 F dan 1387 R

2.3 Cara Kerja

2.3.1 Isolasi Genom Bakteri dari Ayam busuk dan Kambing busuk

Sampel bakteri yang diambil dari daging ayam busuk dan daging kambing busuk

sebanyak 0,05 gram digerus dalam nitrogen cair dengan menggunakan mortar sampai

berbentuk serbuk berwarna putih. Sampel dimasukkan kedalam tube yang berisi buffer lisis

yang mengandung proteinase K sebanyak 350 µl. Sampel kemudian diinkubasi selama 15

menit pada suhu 550C dan dibolak-balik (invert) setiap 5 menit. Setelah itu, sampel

didinginkan di dalam es selama 10 menit, kemudian ditambahkan NaCl sebanyak 150 µl dan

dibolak-balik. Sampel dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit. Sampel kemudian

dimasukkan kedalam unit sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan putaran 10.000

rpm. Supernatant dari hasil sentrifugasi diambil dan ditambahkan 4 µl RNAse. Sampel

diinkubasi selama 15 menit pada suhu 370C. Sampel kemudian ditambahkam dengan

isopropanol sebanyak 350 µl dan dibolak-balik sebanyak 6 sampai 8 kali. Sampel

dimasukkan kedalam sentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.

Supernatant hasil sentrifugasi dibuang, kemudian dimasukkan 500 µl EtOH 70% kedalam

tube. Sampel dimasukkan kedalam unit sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 10.000

rpm. Supernatant hasil sentrifugasi dibuang, sedangkan tube yang berisi endapan dikeringkan

dengan unit vacuum drying selama 15 sampai 20 menit. Tube kemudian ditambahkan dengan

20 µl ddH2O. Hasil isolasi didapatkan, kemudian diuji kondisi sampelnya dengan

elektroforesis.

2.3.2 Elekroforesis

Elektroforesis menggunakan agar yang dibuat dari campuran agarose dan 1% buffer

TAE dengan perbandingan 1:100, kemudian dipanaskan dengan microwave sampai

beningselama 2-3 menit. Gel agarose dimasukkan kedalam cetakan bersisir dan didinginkan.

Setelah gel agarose mengeras, gel dikeluarkan dari cetakan dan sisir. Sisir pada cetakan akan

membentuk sumur, tempat diinjeksikannya sampel. Gel yang sudah beku kemudian

dimasukkan dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 0.5x. Proses

elektroforesis gel agarose diawali dengan disiapkan seperangkat bak elektroforesis yang telah

berisi larutan TAE 0.5x. Selanjutnya gel agarosa yang telah memadat dimasukkan ke dalam

bak hingga gel terendam penuh.

3

Sampel yang akan di elektroforesis dicampur dengan loading buffer dengan

perbandingan 1:5 pada parafilm. Sampel sebanyak 5 µl dicampurkan dengan loading dye

sebanyak 1,5 µl. Setelah diresuspensi, sampel dimasukkan kedalam sumur elektroforesis.

Marker yang digunakan adalah 1 kb plus DNA ladder sebanyak 5 µL. Setelah semua sampel

selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan pada power supply dan voltase diatur

pada 100 volt. Elektroforesis dihubungkan dengan sumber daya dan dinyalakan pada

tegangan 90 volt selama 30 menit. Setelah proses running selesai, gel dikeluarkan dari alat

elektroforesis kemudian direndam dalam larutan EtBr selama 20 menit, setelah itu dibilas

dengan akuades. Kemudian direndam lagi dengan larutan EtBr delama 5 menit dan dibilas

dengan menggunakan akuades. Selanjutnya gel di masukkan kedalam transluminator dan

DNA dilihat dengan bantuan sinar Ultra Violet (UV).

2.3.3 Spektrofotomoter

Sampel DNA sebanyak 5 µl diencerkan dengan ddH2O sebanyak 695 µl, sehingga

total larutannya menjadi 700 µl. Blanko untuk pengukuran spektrofotometer menggunakan

ddH2O. Larutan sampel hasil pengenceran dan blanko dimasukkan kedalam kuvet, kemudian

diukur dalam spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

2.3.4 PCR

Sampel ditambahkan dengan larutan untuk PCR yang berisi taq DNA polymerase, buffer taq

polymerase, dNTP 0,2 mM, primer 16 S dengan 63 F dan 1387 R, dan ddH2O. Amplifikasi

DNA dilakukan dengan menggunakan Perkin Thermocycler ABI-Biosystem. Program PCR

terdiri dari 1 siklus pada 94°C selama 5 menit (PreDenaturasi); 40 siklus pada: 94°C selama 1

menit (Denaturasi), 32°C selama 3 menit (Annealing), 72°C selama 2 menit (Ekstension); 1

siklus pada 72°C selama 7 menit (Postekstension); diakhiri dengan inkubasi pada 25°C.

Produk PCR kemudian dielektoforesis dengan agarose 1% (Promega) dan divisualisasikan di

atas UV transilumimator kemudian didokumetasikan dengan alat Geldoc.

2.3.5 Analisis

Polimorfisme dari pola pita yang terbentuk diukur kemiripan genetiknya berdasarkan ada

tidaknya pita. Rumus kemiripan genetik yang digunakan adalah kemiripan genetik Dice.

Klasterisasi dilakukan dengan Unweighted Pair Group With Arithmatic Mean (UPGMA)

yang dihitung melalui SHAN pada program NTSYSpc version 2.0.

4

3. HASIL

3.1 Hasil Spektrofotometer

Sampel Bakteri λ260 λ280

Kelompok no. 1 0,045 0,035

Kelompok no. 2 0,035 0,030

Kelompok no. 3 0,026 0,023

Kelompok no. 4 0,024 0,021

Kelompok no. 5 0,031 0,025

Kelompok no. 8 0,019 0,016

3.2 Hasil Elektroforesis Genom

Gambar 3.1. Hasil elektroforesis genom bakteri. Sampel kelompok 1, 2, dan 3 adalah bakteri

dari kambing. Sampel kelompok 4, 5, dan 8 adalah bakteri dari ayam.

5

3.3 Hasil PCR

Gambar 3.2. Hasil elektroforesis kiri ke kanan kelompok 1 kambing, 2 kambing, 3 kambing,

4 ayam, 5 ayam, 8 ayam

4. PEMBAHASAN

4.1 Analisis Kemurnian

Kemurnian sampel DNA dapat diukur dengan spektrofotometer dan dapat

divisualisasikan dengan elektrofotometer. Pengukuran spektrofotometer menghasilkan nilai

absorbansi pada panjang gelombang tertentu. Hasil pengukuran pada panjang gelombang 260

nm menghasilkan absorbansi keberadaan materi genetik, sedangkan panjang gelombang 280

nm menghasilkan absorbansi keberadaan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang

260 nm berbanding dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 280 nm menghasilkan

nilai tingkat kemurnian DNA pada sampel. Berikut rumusannya:

Kemurnian DNA = Absorbansi pada λ260

Absorbansi pada λ280

6

10.000

6.000

3.000

1.000

M + - 1 2 3 4 5 8

Berdasarkan kemurniannya, hasil spetrofotometer dengan sampel yang angka

kemurnian antara 1,8 – 2,0 merupakan sampel yang bisa dikategorikan baik. (Linacero,

Rueda, & Vazquez, 1998). Tabel 4.1 menunjukkan hasil perhitungan kemurnian pada sampel

yang diteliti. Hasil kemurnian menunjukkan tidak ada sampel yang masuk kategori baik

kemurniannya. Kurang murninya sampel dapat disebabkan oleh kurang teliti dan kurang

bersihnya proses isolasi genom. Tingkat kemurnian ini dapat divisualisasikan lebih lanjut

dengan elektroforesis genom.

Tabel 4.1. Nilai kemurnian sampel

Sampel Bakteri Kemurnian

Kelompok no. 1 1,286

Kelompok no. 2 1,167

Kelompok no. 3 1,130

Kelompok no. 4 1,143

Kelompok no. 5 1,240

Kelompok no. 8 1,188

Prinsip dari teknik elektroforesis adalah migrasi pratikel yang bermuatan dengan

pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. DNA bermuatan negatif, sehingga

pada elektroforesis, DNA diinjeksikan pada sumur gel dan diletakkan pada kutub negatif.

DNA akan bergerak ke kutub positif pada elektroforesis. Semakin besar berat molekul DNA,

maka semakin lambat geraknya. Sebaliknya, semakin kecil berat molekul DNA maka akan

semakin cepat perpindahannya ke kutub positif dari elektroforesis. Oleh karena itu, pada hasil

elektroforesis, pita yang paling dekat dengan sumur menggambarkan DNA yang berat

molekulnya besar. Semakin jauh pita, maka semakin kecil berat molekul DNA.

Pada penelitian ini, dilakukan elektroforesis gel dengan gel agarosa. Elektroforesis gel

agarosa dapat digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus

hingga 20.000 pasang basa (bp).

Hasil elektroforesis genom (Gambar 3.1) menunjukkan smear pada setiap sampel.

Smear terjadi karena DNA yang terdegradasi, masih ada RNA pada sampel, dan kesalahan

pada elektroforesis. DNA yang terdegradasi dan keberadaan RNA pada sampel dapat terjadi

karena proses isolasi DNA yang kurang baik. Kesalahan pada elektroforesis juga dapat

7

menimbulkan smear, seperti jika melakukan kesalahan pada saat pembuatan gel agarose, dan

terlalu banyak sampel yang dimasukkan kedalam sumur. (Kurien & Scofield, 2012)

Bila hasil elektroforesis genom ini disejajarkan dengan kemurnian dari hasil

spektrofotometer, maka dapat disimpulkan sampel terkontaminasi dengan protein sehingga

menimbulkan smear. Selain itu juga terjadi kesalahan elektroforesis, karena smear terjadi

tidak hanya pada sampel tetapi juga terjadi pada marker.

4.2 Analisis Konsentrasi

Konsentrasi sampel dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:

Konsentrasi DNA = Absorbansi pada λ260 × 50 ngμl

× 700

5

Hasil perhitungan konsentrasi DNA yang didapat dari isolasi ini ditunjukkan pada Tabel 4.2.

Konsentrasi tertinggi diperoleh pada sampel kelompok no 1, yaitu bakteri dari daging

kambing yang telah busuk. Konsentrasi terendah diperoleh pada sampel kelompok no 8, yaitu

bakteri dari daging ayam yang telah busuk. Konsentrasi dibutuhkan untuk menentukan

pengenceran pada sampel untuk proses PCR.

Tabel 4.2. Konsentrasi Sampel Bakteri

Sampel Bakteri Konsentrasi ( ngμl )

Kelompok no. 1 315

Kelompok no. 2 245

Kelompok no. 3 182

Kelompok no. 4 168

Kelompok no. 5 217

Kelompok no. 8 133

4.3 Analisis Hasil PCR

PCR dilakukan dengan primer spesifik 63F (5’ CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC

3’) dan 138R (5’GGG CGG WGT GTA CAA GGC 3’). (Marchesi, 1998). Primer ini spesifik

untuk identifikasi organisme prokariot berdasarkan gen penyandi 16s rRNA. Penyandi ini

dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena bersifat universal dengan fungsi yang

identik pada seluruh organisme. 16s RNA memiliki daerah urutan basa yang relative

8

konserfatif dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Analisis dengan menggunakan

16s RNA dilakukan sebagai pendekatan untuk menunjukkan kekerabatan pada spesies

prokariot, tetapi tidak dapat menggambarkan keanekaragaman prokariot di alam. (Gomes,

2002)

Hasil elektroforesis PCR (Gambar 3.2) menunjukkan pita pada sampel kelompok 3 dan

kelompok 4. Letak pita sejajar dengan pita pada control positif. Bila disejajarkan dengan

marker, pita menunjukkan bahwa DNA pada sampel memiliki antara 1000-2000 pasang basa.

Pita yang muncul menunjukkan bahwa DNA template pada sampel sama dengan DNA

template primer, artinya terdapat kemiripin antar template DNA tersebut. Sampel yang tidak

menghasilkan pita terjadi karena kurang atau tidak miripnya DNA template pada sampel

dengan DNA template pada primer.

5. KESIMPULAN

Isolasi bakteri dari daging kambing dan daging ayam busuk berhasil dilakukan. Hal

ini ditunjukkan pada hasil elektroforesis genom. Hasil PCR menunjukkan sampel DNA

kelompok 3 dan kelompok 4 memiliki kemiripan dengan template DNA primer yang

ditunjukkan dengan munculnya pita pada hasil elektroforesis.

6. DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molecullar

Biology of the Cell Edisi ke-4. New York: Graland Science.

Gomes, E. (2002). Polymorphism in the internal transcribed spacer (ITS) of the ribosomal

DNA of 26 isolates of ectomycorrhizal fungi. Genet Mol Biol , 25(4) : 477-483.

Kurien, B., & Scofield, R. (2012). Common artifacts and mistakes made in electrophoresis.

PubMed - indexed for MEDLINE, 869:633-40.

Lewin, B. (2004). Genes VIII. New Jersey: Pearson Education Inc.

Linacero, R., Rueda, J., & Vazquez, A. (1998). Quantification of DNA. London: Chapman

and Hall.

Marchesi, J. (1998). Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers. Appl.

Environm. Microbiol, 64: 795-799.

Meltzer, S. (2006). PCR in Bioanalysis. New York: Springer Science & Business Media.

9