Universidad de Costa Rica

Escuela de Biología

Guía para el trabajo de laboratorio

Introducción a la Fisiología Vegetal (B0442)

I ciclo 2019

Encargados del Curso

Elmer G. García

Andrea Camacho

Jordán Villegas

Mónica Alfaro

Diego Aguilar

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INTRODUCCIÓN

La fisiología vegetal es una disciplina amplia y variada, por lo que no es posible ofrecer

en un solo semestre todos los aspectos que contempla, sobre todo a nivel de laboratorio. Es por

eso que en el curso se abarcará el estudio de algunos de los principales procesos fisiológicos que

hacen posible la vida de las plantas y las respuestas de ellas ante las alteraciones ambientales,

teniendo en cuenta una perspectiva contemporánea, metodológica y didáctica; con el objetivo

de que el estudiante pueda realizar experimentos sobre algunos procesos fisiológicos y expresar

científicamente sus hallazgos.

Este documento es una guía para desarrollar el trabajo en el laboratorio, no un manual.

La idea es que sirva de base a la experimentación y que el estudiante pueda por sí solo ampliarla,

siempre y cuando las condiciones lo permitan.

Aparte del conocimiento como tal en fisiología, interesa la formación científica. Se parte

del principio de que quienes están en el curso son estudiantes avanzados y con curiosidad

científica. El alumno tiene la libertad de ir más allá de lo que aquí se menciona, pues interesa

que despierte su espíritu de observación y análisis. Se debe tener presente que las prácticas

incluidas aquí son para comprender mejor o ampliar lo estudiado en las clases teóricas, y que

por ende, no son algo aislado. También, es importante tener claro que las hipótesis planteadas

en cada experimento no siempre se cumplen y que, además, durante la ejecución de cada

práctica se presentan muchos problemas y cambios. Los procesos fisiológicos no son rígidos y

los resultados no siempre son los esperados. Cada resultado tiene una razón de ser y cualquier

factor lo puede alterar, razón por la cual el análisis, la discusión y la búsqueda de las causas son

aspectos prioritarios. Se proporciona una pequeña introducción a cada práctica, así como los

aspectos básicos de la metodología a seguir.

Se procura que los estudiantes realicen las prácticas de laboratorio a manera de

investigación, siguiendo los principios del método científico y que para ello tengan inspiración y

no se dediquen a copiar el trabajo de otros, ni a realizar las prácticas sin conocer sus

fundamentos. El trabajo se hace en grupos precisamente para promover la discusión y el análisis.

Es por eso también que se requiere que los alumnos lleven estudiadas las prácticas el día que se

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inician. No se puede trabajar sin conocer lo que se hará en el laboratorio. Tampoco se debe

esperar a que los instructores del laboratorio proporcionen toda la información necesaria.

Como se indicó anteriormente, interesa que el estudiante despierte su curiosidad científica.

DETERMINACIÓN DE POTENCIALES HÍDRICO Y OSMÓTICO

A) Potencial Hídrico

Para medir el potencial hídrico de un tejido existen métodos directos e indirectos. Los

primeros consisten en hacer uso de equipos como la Bomba de Scholander. Entre los indirectos,

está el Método de cambios de peso de un tejido cuando se sumerge en soluciones de potencial

osmótico conocido (e.g. soluciones de sacarosa). Si se sumergen fragmentos de un tejido en una

solución, estos variarán su peso después de un tiempo, ya que absorben o pierden agua según

la concentración osmótica de la solución. Si no hay cambios de peso es porque el potencial

osmótico de la solución es igual al del tejido. Por lo tanto, si se conoce el potencial osmótico de

la solución externa se puede calcular indirectamente el potencial hídrico del tejido.

Materiales

- Tubérculos o raíces tuberosas de varias especies.

- Sacabocados o instrumento para cortar fragmentos de los tubérculos.

- Navajillas

- Papel toalla

- Pinzas

- Termómetro

- Balanza

- Agua destilada

- Soluciones de sacarosa de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1.0 Molar

- Frascos para guardar las soluciones

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Procedimiento

1) Obtenga tubérculos (o raíces tuberosas) de las especies que se le indican

2) Mida la temperatura del laboratorio.

3) Corte fragmentos de tubérculos (o raíces tuberosas) de 2.0 x 1.0 cm, lo más

homogéneos posibles. Debe hacerlo por separado según la especie.

4) Pese 5 fragmentos de la misma especie y juntos sumérjalos inmediatamente en las

soluciones de sacarosa y de agua destilada (5 fragmentos por cada una de las diez

soluciones de sacarosa, más el agua destilada). Debe cortar y pesar los fragmentos

inmediatamente para que no pierdan agua.

5) Mantenga los fragmentos sumergidos por 3 horas. Calcule el tiempo de pesada y

asegúrese de que todos estarán el mismo tiempo sumergidos.

6) Extraiga con cuidado los fragmentos y con la ayuda de papel toalla elimine el exceso

de agua o de la solución.

7) Pese nuevamente los fragmentos, procurando hacerlo lo más rápido posible después

de sacarlos de la solución.

8) Calcule el porcentaje de cambio de peso de cada grupo de tejidos una vez que estos

se sacaron de la solución correspondiente.

9) Para cada una de las soluciones de sacarosa determine el potencial osmótico de la

siguiente manera:

Potencial osmótico = miRT

m = molaridad de la solución

i = Constante de ionización (1 para la sacarosa)

R = constante de los gases (0,08205746 atm L/mol K)

T= temperatura en kelvin

10) Determine el valor del potencial hídrico, en megapascales (MPa), de cada uno de los

tubérculos utilizados. El valor del potencial hídrico es aquel potencial osmótico de la

solución de sacarosa que no cambia el peso del tejido; para obtenerlo puede hacer

una interpolación (o extrapolación) de los datos.

4

B) Potencial Osmótico

El potencial osmótico es uno de los componentes del potencial hídrico de las células, y

puede ser medido por métodos directos o indirectos. Uno de estos últimos está basado en la

plasmólisis que ocurre cuando una célula ha perdido agua, contrario a la turgencia que ocurre

cuando la célula se llena de agua. Cuando una célula vegetal está plasmolizada, su plasmalema

se separa de la pared celular (Fig. 1). A una condición especial de plasmólisis, que es normal

encontrar en las plantas, se le conoce como plasmólisis incipiente o limitante, la cual es cuando

el 50 % de las células de un tejido muestran el plasmalema separado de la pared. En este caso,

se asume que el potencial osmótico de las células es igual al del medio en el que están

sumergidas. Por lo tanto, si se encuentra una solución de potencial osmótico conocido que

plasmolice el 50 % de las células, el potencial osmótico del tejido es igual al de esa solución. El

objetivo de esta práctica es determinar el potencial osmótico de un tejido siguiendo el método

de la plasmólisis incipiente.

Materiales

- Bulbos de cebolla morada

- Soluciones de sacarosa de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1.0 M

- Cajas de Petri

- Portaobjetos, cubreobjetos y microscopio

Procedimiento

1) Realice un corte paradermal de secciones superficiales y delgadas de epidermis de

cebolla, de tal modo que quede una capa intacta de muy pocas células de grosor.

Debe practicar varios cortes hasta que obtenga uno que le permita hacer las

observaciones en forma aceptable. Un criterio a seguir para considerar un corte

bueno e intacto es la presencia de antocianinas en la vacuola.

2) Enjuague todos los cortes con solución de sacarosa 0.2 M.

3) Distribuya al menos tres pares de cortes en cajas de Petri que contengan cada uno

5

diferentes soluciones de sacarosa de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1 M,

más agua destilada (o sea 10 soluciones de sacarosa más el agua destilada).

4) Después de 45 min, monte los cortes en un portaobjetos con las mismas soluciones

en las que estaban y coloque el cubreobjetos. Evite burbujas o espacios secos en el

tejido.

5) Observe al microscopio, preferiblemente en alto poder, sectores relativamente

homogéneos y cuente 20 células, anotando las que tienen plasmólisis y las que no la

tienen. Anote el porcentaje de células con plasmólisis. Puede repetir esto en varios

campos ópticos y obtener un promedio. Tenga cuidado de que el tejido no se seque

cuando lo coloca en el portaobjetos, por lo que es conveniente adicionar al

portaobjetos gotas de la misma solución en la que estuvo sumergido el tejido. Se le

recomienda, para reconocer mejor las células plasmolizadas, observar primero

aquellas que están sumergidas en soluciones de sacarosa de mayor concentración

(0.9 y 1.0 M).

6) Calcule el potencial osmótico de cada solución de sacarosa como se indica en el

punto A, para lo cual necesita medir la temperatura del laboratorio.

Al hacer lo anterior con los tejidos sumergidos en las distintas soluciones de sacarosa, usted

podrá determinar, mediante extrapolación, el potencial osmótico en megapascales (MPa), de

aquella solución de sacarosa que provoque el 50 % de plasmólisis en cada tejido. Es

recomendable que grafique sus resultados y basado en eso estimar el potencial osmótico del

tejido.

Figura 1. Células vegetales turgentes (1 y 2), el plasmalema se encuentra adherido a la pared celular. Células vegetales plasmolizadas (3 y 4), el plasmalema está separado de la pared celular.

6

EFECTO DEL ESTRÉS HÍDRICO Y SALINO SOBRE EL DESARROLLO DE PLANTAS DE FRIJOL

El desarrollo y crecimiento de las plantas está determinado por su información genética

y por las condiciones ambientales, entre estas últimas, una de las más críticas es la

disponibilidad de agua, la cual es indispensable para todos los procesos metabólicos, lo que

afecta el crecimiento y la producción de los diferentes cultivos y ecosistemas. El agua limita la

distribución de las especies y las características de los ecosistemas.

Tanto el exceso como el déficit hídrico son factores que causan estrés en las plantas y,

por consiguiente, afectan su desarrollo. Otro aspecto causante de estrés, al cual muchas

especies están adaptadas, es la alta concentración salina del medio donde crecen. Esa

adaptación puede expresarse en distintos procesos, por ejemplo, en la germinación, en la

fenología, en la fotosíntesis, en la transpiración, en el crecimiento y en la producción de frutos y

semillas. Por esto, en esta práctica se tiene como objetivos evaluar el crecimiento bajo distintos

niveles de estrés hídrico y salino.

Materiales

- Semillas de frijol

- Cajas de cartón de un litro de capacidad

- Balanza, secadora, medidor de área foliar, tijeras, navajillas, regla milimétrica, lápiz, papel toalla

- Bolsas de papel o papel periódico

- Solución de NaCl de 0.1 M

Procedimiento

1) Obtenga al menos 128 cajas de cartón de 1 L de volumen, lo más homogéneas posible

(como las de leche o jugo). A 96 de ellas proceda a hacerles cuatro huecos en el fondo de

no más 0.5 cm de diámetro, a las 32 cajas restantes no se les hace hueco.

7

2) Posteriormente llene todas las cajas con tierra libre de piedras o contaminantes. Llénelas

hasta el borde superior evitando la compactación de la tierra. Humedezca bien la tierra.

3) Entierre tres semillas de frijol a aprox. 1.5 cm de profundidad, y que queden lo más cerca

posible del centro de la caja. Las semillas deben quedar tapadas y teniendo el cuidado

que con el riego no se salgan.

4) Mantenga la tierra húmeda, pero sin exceso de agua. Tener cuidado con las cajas que no

tienen hueco. Debe regar con cuidado para que el golpe del chorro de agua no escarbe

el suelo.

5) Deje pasar unos días hasta que las semillas germinen.

6) Una vez que las plántulas expanden sus primeras hojas proceda a cortar dos plantas y a

mantener una en la caja. Y aplique los 4 tratamientos que se indican a continuación:

i) Plantas con riego a capacidad de campo permanente y sin exceso de agua.

ii) Plantas con exceso de agua, para lo que se usan las cajas que no tienen hueco en el

fondo. Se riegan de modo que siempre se mantengan en inundación.

iii) Plantas a las que se les adicionan 75 mL de agua una vez a la semana el mismo día (el

martes). Cuando se le avise se aumentará el volumen de agua que se le indique, si es

necesario.

iv) Plantas a las que se le adicionan 100 mL de una solución de NaCl de 0.1 M el primer

día. Se mantienen a capacidad de campo y tres semanas después de iniciado el

tratamiento se les vuelve a adicionar 100 mL de NaCl. Luego se riegan con agua a

capacidad de campo. Si es del caso, cuando su instructor se lo indique se agregará

nuevamente la solución salina.

Debe garantizar que tenga al menos 32 cajas por cada tratamiento, para que de esa

manera pueda usar 4 cajas por semana (para mediciones), durante 8 semanas.

7) El propio día que inicie la aplicación de los tratamientos y, semanalmente a partir de ese

día, tome las siguientes mediciones a las plantas de 4 cajas por tratamiento:

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A) Longitud del eje central de la planta, desde la inserción de los cotiledones hasta

la base de la última hoja expandida y que se reconozca bien que es trifoliada.

B) Número de hojas simples y compuestas presentes. En las compuestas se cuenta

el número de hojas que ya se pueden distinguir con claridad, es decir, hojas que

están extendidas (abiertas) y que tienen foliolos mayores de 1.0 cm de longitud.

C) Peso fresco y Peso seco de todo el sistema radical. Para ello se extrae y se lava

con cuidado las raíces, se seca con papel toalla, se pesa inmediatamente y se

coloca en bolsas de papel o en papel periódico. Debe sacar con cuidado las

plantas de suelo para no perder parte del sistema radical. Una vez pesada la raíz

(Peso fresco) se colocan en el papel y se introducen en una secadora a 60 - 70 °C

hasta obtener peso constante (que será el Peso seco), lo que se logra una semana

después.

D) Peso fresco y Peso seco del tallo (incluyendo pecíolos). Pese rápidamente toda la

parte considerada como tallo y luego colóquelo en la secadora por una semana

para obtener el peso seco.

E) Área foliar total de cada planta. Se consideran los foliolos extendidos y de 1.0 cm

o más de longitud.

F) Peso fresco y Peso seco de todas las hojas de la planta. Aquí se incluyen los

foliolos de menos de 1.0 cm longitud.

G) Potencial hídrico medido con la Bomba de Scholander, para el cual se usan hojas

antes de obtener su peso fresco. Se le indicará la forma en que lo hará.

H) Número de flores y frutos.

I) Anote todos los datos u observaciones que considere convenientes,

estableciendo comparaciones entre los distintos tratamientos. Por ejemplo,

coloración, deformaciones, presencia de enfermedades, etc.

J) Anote el día que aparecen los primeros botones florales y los frutos y cuente el

número de estos órganos que aparecen semanalmente.

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8) Con base en los datos obtenidos semanalmente debe determinar, al menos, lo siguiente

para cada tratamiento (consultar Lambers et al., 2008, pág. 323):

A) Relación Área foliar/Biomasa total

B) Relación Biomasa foliar/Biomasa total

C) Relación Biomasa raíz/Biomasa total

D) Tasa de crecimiento relativo (TCR)

E) Tasa de asimilación neta (TAN)

F) Relación Área foliar/Alargamiento del tallo

G) Área foliar específica (AFE)

H) Tasa de alargamiento del tallo por semana

Haga los análisis que considere apropiados. Discuta y analice comparativamente todos los

resultados. Debe ser puntual, sistemático y cuidadoso en la aplicación y mantenimiento de

todos los tratamientos y anotar todos aquellos aspectos que considere convenientes para que

de esa manera pueda interpretar y discutir mejor los resultados.

Debe revisar permanentemente que las plantas inundadas o en capacidad de campo

siempre mantengan su condición. Además, procure regar al inicio de la mañana o final del día,

no cuando las plantas están expuestas a “mucho” sol.

Va a obtener mucha información, por lo que será su responsabilidad hacer el análisis de la

mejor manera posible para comparar e interpretar por su propia cuenta las posibles diferencias

entre todos los tratamientos aplicados. No espere que se le diga con detalle todo lo que debe

hacer respecto al análisis. Lo importante es que analice las diferencias entre tratamientos y el

efecto de cualquier factor que influya en los resultados.

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EFECTO DE LA INTENSIDAD LUMÍNICA SOBRE EL DESARROLLO DE LAS PLANTAS

La luz es uno de los factores que más afecta el desarrollo de las plantas, no solo porque

se necesita para el proceso de fotosíntesis, sino porque altera muchos aspectos metabólicos y

morfológicos. Cuando una planta que está adaptada a ambientes sombreados es sometida a

alta intensidad lumínica, sufre trastornos que le pueden provocar daños irreversibles. Por otro

lado, si una planta es sometida a oscuridad, sufre el fenómeno de etiolación, que se manifiesta

como una pérdida de coloración, la cual se puede recuperar si se vuelve a iluminar.

Los cambios en la intensidad lumínica afectan varios procesos fisiológicos que finalmente

alteran el desarrollo. El objetivo de esta práctica es evaluar el efecto de las variaciones de la

intensidad lumínica sobre el desarrollo de algunas especies de plantas.

Materiales

- Semillas de varias especies forestales nativas de Costa Rica

- Bolsas de almácigo llenas con tierra

- Sarán

- Bolsas negras

- Balanza, secadora, tijeras, navajillas, regla milimétrica, papel toalla, Bolsas de papel

- Medidor de área foliar

Procedimiento

1) Prepare almácigos con turba (de semillas de las especies a estudiar) y colóquelos en una

cámara de germinación.

2) Llene al menos 50 bolsas con tierra lo más limpia posible y cuando las plántulas del

almácigo adquieran el tamaño adecuado, según se lo indique su instructor, proceda a

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trasplantar una plántula a cada bolsa. Deje pasar unos días para que la plántula se

recupere y estabilice. Si se daña o muere coloque otra. Riegue a capacidad de campo.

3) Cuando se le indique proceda a aplicar los siguientes tratamientos:

i) Sol pleno: Colocar 20 plantas a la luz plena del invernadero.

ii) Sombra parcial: Cubrir 20 plantas con tela de sarán.

iii) Oscuridad total: Colocar al menos 10 plantas en condiciones de oscuridad

total para ver qué sucede con ellas.

4) Mida la intensidad lumínica.

5) Mantenga las plantas siempre a capacidad de campo y evite la manipulación excesiva.

6) Completadas cinco semanas después de aplicados los tratamientos, a 10 plantas del

tratamiento “Sol pleno” y a 10 plantas del tratamiento “Sombra parcial”, realíceles las

siguientes mediciones:

A) Longitud del eje central de la planta, desde la inserción de los cotiledones, hasta

la base de la última hoja extendida.

B) Número de hojas y de cotiledones presentes.

C) Peso fresco y Peso seco de todo el sistema radical. Para ello se extrae y lava con

cuidado todas las raíces, se seca con papel toalla, se pesa inmediatamente y se

coloca en bolsas de papel o papel periódico. Debe sacar con cuidado las plantas

del suelo para no perder parte del sistema radical. Una vez pesada la raíz (Peso

fresco) se colocan en el papel y se introducen en una secadora a 60-70 °C hasta

obtener peso constante (Peso seco), lo que se logra una semana después.

D) Peso fresco y Peso seco del tallo (incluyendo pecíolo). Pese lo más rápido que

pueda toda la parte considerada como tallo y luego colóquelo en la secadora por

una semana para obtener el Peso seco.

E) Área foliar total de cada planta, para lo cual se usa solo la lámina de la hoja.

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F) Peso fresco y Peso seco de todas las hojas de la planta

G) Potencial hídrico medido con Bomba de Scholander antes de obtener peso fresco

de hojas.

7) Diez semanas después proceda a tomar los mismos datos indicados anteriormente a las

plantas restantes.

8) Haga todas las observaciones que considere conveniente y analícelas comparativamente,

pero también proceda a realizar y analizar lo siguiente (consultar Lambers et al., 2008, pág.

323):

A) Relación Área foliar/Biomasa total

B) Relación Biomasa foliar/Biomasa total

C) Relación Biomasa raíz/Biomasa total

D) Área foliar específica (AFE)

E) Relación Área foliar/Alargamiento del tallo

F) Tasa de asimilación neta (TAN)

G) Tasa de crecimiento relativo (TCR)

H) Tasa de alargamiento del tallo semanal

Va a obtener mucha información, por lo que será su responsabilidad hacer el análisis de la

mejor manera posible para comparar e interpretar por su propia cuenta las posibles diferencias

entre todos los tratamientos aplicados. No espere que se le diga con detalle todo lo que debe

hacer respecto al análisis. Lo importante es que analice las diferencias entre tratamientos y el

efecto de cualquier factor que influya en los resultados.

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EVALUACIÓN DE LA TENSIÓN HÍDRICA GENERADA SOBRE EL XILEMA Y EL POTENCIAL HÍDRICO DE LOS PECIOLOS EN TOMATE

La transpiración genera la fuerza que provoca el ascenso del agua y minerales a las

partes altas de la planta. Según la Teoría de tensión y cohesión para que el agua ascienda debe

generarse una fuerza negativa sobre el xilema, la cual es posible medir directa o indirectamente.

El movimiento del agua obedece entonces a una continuidad suelo-planta-atmósfera, por lo que

son muchos los factores que pueden afectar y ofrecer resistencia a ello, entre ellos está el

déficit hídrico del suelo.

El déficit hídrico del suelo genera estrés en las plantas de forma que los potenciales

hídricos de los tejidos se ven afectados. Una forma para medir directamente el potencial hídrico

de los tejidos es utilizando la Bomba de Scholander.

Esta práctica tiene como objetivos estimar la tensión hídrica que se genera sobre el

xilema y el potencial hídrico de plantas de tomate sometidas a estrés hídrico.

Materiales

- Plantas de tomate

- Bolsas de almácigo con tierra u otro sustrato

- Azul de metileno al 1 %

- Navajillas, regla graduada y marcador indeleble.

- Guantes de látex o de nitrilo

- Gabacha de laboratorio

- Bolsas plásticas

- Bomba de Scholander

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Procedimiento

A) Tensión hídrica sobre el xilema

1) Prepare un almácigo de tomate según se lo indique su instructor de laboratorio.

2) Mantenga las plántulas en buena condición y posteriormente trasplántelas a bolsas con

tierra.

3) Mantenga 9 plantas con riego a capacidad de campo por 22 días, pero después de ese

tiempo reduzca el riego a la mitad a 3 de las plantas y a una cuarta parte de agua a

otras 3 plantas para generar déficit hídrico. Las otras 3 plantas se mantienen a capacidad

de campo. Es decir, tendrá dos tratamientos con déficit hídrico y uno a capacidad de

campo. Lo ideal es que las plantas a capacidad de campo las riegue todos los días. Es

importante, y necesario, que durante los 22 días mencionados anteriormente, mida el

volumen de agua adicionado para alcanzar la condición de capacidad de campo, pues de

esa manera sabrá cuánta agua debe aplicar en la inducción del déficit.

4) Una semana después de que indujo el déficit hídrico, vierta en un recipiente 20 mL de la

solución de Azul de metileno y extraiga con mucho cuidado las plantas de la bolsa, sin

dañar el sistema radical.

5) Inmediatamente después de extraída la planta de la bolsa, sumérjala en la solución de

Azul de metileno que ha vertido sobre el recipiente y, bajo esta condición corte el tallo al

nivel de la base. Este corte debe ser lo más recto posible y hecho de la mejor manera,

evitando que el sector donde hará el corte quede fuera de la solución. Si queda fuera

entrará aire y éste bloqueará el flujo xilemático. No debe dejar pasar mucho tiempo

entre la extracción de la planta y la sumergida en el colorante.

6) Mantenga la base del tallo, en el sitio de corte, sumergida por un minuto y medio en el

Azul de metileno. No debe sacar el tallo de la solución antes del tiempo indicado, pues

corre el riesgo de la cavitación y si ello ocurre habrá que repetir el experimento.

7) Después de remover el tallo de la solución, mida su longitud total desde la base hasta el

ápice y realice cortes sucesivos cada 1-2 cm, a partir del ápice, hasta que observe el

colorante.

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8) Mida la distancia que recorrió el Azul de metileno en el tallo.

9) Exprese los valores en porcentaje de distancia recorrida y compárelos para las distintas

plantas y tratamientos.

10) Repita el procedimiento para todas las otras plantas del mismo y distinto tratamiento.

11) Analice, compare y discuta los resultados.

B) Potencial hídrico de los peciolos

1) Prepare la Bomba de Scholander.

2) Utilice al menos tres hojas de una planta de tomate de cada tratamiento (ver punto A).

2) Coloque cada hoja dentro de una bolsa plástica.

3) Corte los peciolos de las hojas (las hojas deben estar dentro de las bolsas).

4) Inmediatamente después de cortar los peciolos selle la bolsa plástica.

5) En un movimiento rápido, saque el peciolo de la bolsa e introdúzcalo en la Bomba de

Scholander según se lo mostrará su asistente (durante todo el proceso la hoja debe estar

dentro de la bolsa plástica).

6) Encienda la Bomba de Scholander.

7) Observe detenidamente la subida de presión.

8) Detenga la Bomba cuando se forme el menisco de agua en tejido expuesto del peciolo.

9) Anote el valor de presión que indica la bomba.

10) Repita el procedimiento con las demás hojas (haga esto para una planta de cada

tratamiento).

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NUTRICIÓN MINERAL, SÍNTOMAS DE DEFICIENCIA Y DE EXCESO

Existe una serie de elementos que son requeridos por las plantas para completar su

desarrollo, estos se conocen como elementos esenciales. Aquellos que se requieren en mayores

concentraciones se les denomina macroelementos o macronutrimentos (C, H, O, N, K, Ca, Mg, P

y S). Los elementos que las plantas ocupan en menores concentraciones, pero que son

igualmente importantes, son llamados microelementos o micronutrimentos (Cl, Fe, Mn, B, Cu, Zn,

Mb y Ni).

Cuando un elemento esencial está ausente, o en concentraciones muy bajas, las plantas

muestran síntomas de deficiencia. Mientras que si algún elemento se encuentra en altas

concentraciones (mayores a las mínimas requeridas), se pueden presentar síntomas de exceso.

Sin embargo, resulta difícil separar mediante características visibles el efecto de un

exceso o de una deficiencia de un elemento en específico. Por eso, una manera de logarlo es

utilizando la técnica de hidroponía y hacer crecer a las plantas en medios con soluciones

nutritivas conocidas.

Con este fin, se han desarrollado soluciones nutritivas completas, es decir, que incluyen

todos los nutrimentos necesarios para el desarrollo de una planta y en las proporciones

adecuadas. Con estas es posible estudiar los síntomas de deficiencia o de exceso de un

elemento determinado, al eliminarlo de la solución o al agregarlo en exceso.

El objetivo de esta práctica es estudiar los principales síntomas de deficiencia y de

exceso de los elementos esenciales en las plantas.

Materiales

- Semillas y plántulas de tomate

- Baldes plásticos de aprox. 4.0 L

- Soluciones de Macro- y Microelementos

- Sistema que permita airear las soluciones nutritivas

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Procedimiento

A) Siembra y trasplante de plantas

1) Prepare en el invernadero un sistema que permita tener baldes con soluciones nutritivas

que reciban aireación constante.

2) Usando sustrato para germinación prepare almácigos de tomate.

3) Cuando las plántulas tengan el tamaño apropiado proceda a trasplantarlas en los

recipientes que contienen la solución nutritiva completa (Parte B). Debe ser muy

cuidadoso en el trasplante para evitar daños a las plántulas. Puede usar algodón o

alguna espuma para evitar que el tallo roce el borde de la tapa del balde.

4) Deje todas las plantas en solución nutritiva completa durante una semana.

B) Preparación de soluciones nutritivas de cada tratamiento

1) En baldes plásticos agregue los reactivos en las cantidades y en el orden

especificados para cada tratamiento (Cuadro 1). La solución con microelementos

será preparada previamente por los asistentes del curso (Cuadro 2).

2) A continuación debe verter en cada balde el volumen del nutriente sustituto según el

tratamiento del que se trate (Cuadro 3). Esto debido a que debe sustituir el volumen

del nutriente eliminado (según sea el tratamiento) con un volumen igual de un

nutriente sustituto. Preste especial atención en este paso, ya que hay soluciones

sustitutas que se utilizan para más de un tratamiento.

3) Adicione el volumen de agua destilada necesario para llegar al volumen final (1.0 L).

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4) Tome en cuenta que estas cantidades están pensadas para soluciones finales de 1.0 L,

y que los baldes tienen un volumen aprox. de 4.0 L (el balde debe quedar lleno).

5) Una vez preparada cada solución proceda a medir el pH y repita esto semanalmente.

6) Asegúrese de agregar el fosfato de último y en forma diluida para evitar precipitación.

C) Cuidados posteriores de las plantas

1) Periódicamente debe agregar las soluciones nutritivas y asegurarse de que las raíces

de las plantas estén siempre en contacto con la solución, y que el sistema tenga

aireación.

2) Describa los cambios de color observados en las plantas, utilizando la escala de

colores de la Figura 2.

3) Semanalmente mida la longitud del tallo principal y cuente el número de hojas en

cada planta. Observe y anote el estado y condición de cada planta y trate de

detectar posibles síntomas visuales de deficiencia o toxicidad y compárelos con los

descritos en la literatura. Si aparecen flores o frutos debe llevar su contabilidad.

4) Cuando el experimento finalice, determine el Peso fresco y el Peso seco del sistema

radical, de los tallos y de las hojas. Además, determine el Área foliar.

5) Anote cualquier aspecto que observe en las plantas y que puedan mostrar

diferencias entre los tratamientos.

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CUADRO 1

Composición de las soluciones nutritivas por tratamiento

Volumen por agregar de cada reactivo según el tratamiento*

Solución Madre (1.0 M)

Concentración (g/L)

Compl (mL)

-Ca (mL)

-N (mL)

-K (mL)

-Mg (mL)

-S (mL)

-P (mL)

-Fe (mL)

- microE (mL)

Exceso (mL)

Sin Nutr (mL)

Ca(NO3 )2

236 10 - - 10 10 10 10 10 10 10 -

KNO3

101 10 10 - - 10 10 10 10 10 10 -

MgSO4•7H2O

246.5 5 5 5 5 - - 5 5 5 5 -

K H2PO4

136 2.5 2.5 2.5 - 2.5 2.5 - 2.5 2.5 2.5 -

FeEDTA

5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 - 2.5 2.5 -

Microelementos

Ver Cuadro 3 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 - 10 -

H2O destilada - - - - - - - - - - - 30

*Tratamientos y sus abreviaturas

i. Solución completa (Compl)

ii. Solución sin Calcio (-Ca)

iii. Solución sin Nitrógeno (-N)

iv. Solución sin Potasio (-K)

v. Solución sin Magnesio (-Mg)

vi. Solución sin Azufre (-S)

vii. Solución sin Fósforo (-P)

viii. Solución sin Hierro (-Fe)

ix. Solución sin Microelementos (-microE)

x. Solución con exceso de Microelementos (Exceso)

xi. Solución sin nutrientes (Sin Nutr), solo agua destIlada.

20

CUADRO 2

Concentraciones de microelementos

Microelementos por utilizar y sus concentraciones (g/L) respectivas

Solución de micronutrientes

Concentración (g/L)

H3BO3 2.860

ZnSO4•7H2O 0.220

CuSO4•5H2O 0.079

MnSO4 1.015

H2MoO4•H2O 0.090

CUADRO 3

Soluciones de nutrientes sustitutos a ser agregadas según

el nutriente eliminado por tratamiento

Se observa la concentración (g/L) y volumen (mL) por agregar en cada tratamientos

Sol. Sustitutas (1.0 M)

Concentración (g/L)

Tratamientos

Compl (mL)

-Ca (mL)

-N (mL)

-K (mL)

-Mg (mL)

-S (mL)

-P (mL)

NaNO3 85.01 - 10 - 10 - - -

MgCl2 95.23 - - - - - 5 -

Na2SO4 142.06 - - - - 5 - -

CaCl2 111.99 - - 10 - - - -

KCl 74.55 - - 10 - - - 2.5

NaH2PO4 138.01 - - - 2.5 - - -

21

Figura 2. Escala de colores para describir los cambios observados en la coloración de las plantas. A. Círculo cromático estándar; B. Escala de verde-amarillos: El tomo de verde-amarillo se puede describir según el número que tiene asociado.

A

B

22

EFECTO DE LOS REGULADORES DEL CRECIMIENTO

En las plantas existen muchos reguladores del crecimiento, llamados también hormonas,

pero este nombre no es el más adecuado, ya que los mecanismos de acción de estas sustancias

difieren considerablemente de los de las hormonas de los animales. Los procesos que pueden

controlar son muchos y la presencia en sí de una de estas sustancias no necesariamente

provoca el mismo efecto. También, muchas veces el efecto varía dependiendo del equilibrio de

concentraciones entre una y otra sustancia.

Los reguladores del crecimiento más comunes en las plantas son: las auxinas, las

giberelinas, las citocininas, el etileno, el ácido abscísico y el ácido salicílico. Las auxinas, las

giberelinas y las citocininas son estimulantes del crecimiento, mientras que el ácido abscísico y

el etileno son inhibidores de muchos procesos metabólicos. El ácido salicílico se ha asociado con

la resistencia a patógenos.

En estas prácticas se tratará de demostrar algunos de los efectos de estas sustancias

hormonales en las plantas.

A) Efecto de las sustancias hormonales sobre el crecimiento de frijol

Materiales

- Ácido giberélico (AG)

- Ácido naftaleno acético (ANA)

- Helmtrel 48 SL (con 39,5 % de Ácido cloroetil fosfónico)

- Ácido abscísico (ABA)

- Aspirinas

- Semillas de frijol, bolsas de almácigo

- Gotero, Balanza, Secadora, tijeras, navajillas, regla milimétrica, lápiz, papel toalla

- Medidor de Área foliar

23

Procedimiento

1) Siembre tres semillas de frijol en 40 bolsas de almácigo llenas con tierra limpia.

2) Cuando las plántulas tengan las dos primeras hojas simples extendidas corte dos plantas

y conserve una. Y proceda a aplicar los siguientes tratamientos:

i) Agregue 5 gotas de AG 10 ppm en el haz de cada hoja simple de 5 plantas.

ii) Agregue 5 gotas de AG 20 ppm en el haz de cada hoja simple de 5 plantas.

iii) Agregue 5 gotas de ANA 20 ppm en el haz de cada hoja simple de 5 plantas.

iv) Agregue 5 gotas de ANA 40 ppm en el haz de cada hoja simple de 5 plantas.

v) Agregue 5 gotas de Helmtrel en el haz de cada hoja simple de 5 plantas. Repita

esto una semana después.

vi) Agregue 5 gotas de ABA 100 ppm en el haz de cada hoja simple de 5 plantas.

vii) Disuelva 10 pastillas de aspirina en 50 mL de agua destilada y agregue 5 gotas de

esta solución en el haz de cada hoja simple de 5 plantas.

viii) Agregue 5 gotas de agua destilada en el haz de cada hoja simple de 5 plantas

(tratamiento testigo).

Nota: Distribuya uniformemente las gotas en la superficie del haz. Use un gotero distinto

para cada hormona.

3) A partir del momento de la aplicación de los tratamientos, mida semanalmente la

longitud del eje central de las plantas, desde la inserción de los cotiledones hasta la base

del pecíolo de la última hoja extendida.

4) Cuente el número de hojas compuestas (recuerde, hojas que tengan foliolos extendidos

de 1.0 cm o más de longitud).

5) Determine el tiempo que tardan en aparecer las flores y los frutos y cuéntelos

diariamente, a partir del momento en que los observa.

24

6) Cuando las plantas estén con fruto, o en el momento en que se le indique, proceda a

determinar lo siguiente:

A) Peso fresco, por separado, del tallo (incluyendo pecíolo), del sistema radical y del

follaje de cada planta. Pese lo más rápido que pueda para evitar pérdida de agua.

B) Área foliar total de cada planta y Área foliar específica, para lo cual se usa

únicamente los foliolos (todos los foliolos de la planta).

C) Peso seco, por separado, de tallos, de raíces y de hojas, para lo cual se debe

colocar el material en una secadora por una semana a 60-70 °C por una semana.

D) Todos los otros datos y observaciones que considere convenientes,

estableciendo comparaciones entre los distintos tratamientos. Por ejemplo

coloración, deformaciones, presencia de enfermedades, entre otras.

7) Al final del experimento, al menos, debe determinar lo siguiente para cada tratamiento

(consultar Lambers et al. 2008, página 323):

A) Relación Área foliar/Biomasa total

B) Relación Biomasa foliar/Biomasa total

C) Relación Biomasa raíz/Biomasa total

D) Área foliar específica (AFE)

E) Relación Área foliar/Alargamiento del tallo

F) Tasa de asimilación neta (TAN)

G) Tasa de crecimiento relativo (TCR)

H) Tasa de alargamiento del tallo

8) Compare, analice y discuta todos los resultados obtenidos y haga los cálculos,

observaciones y análisis que considere necesarios o convenientes.

25

B) Dominancia apical y curvatura de peciolos

Materiales

- Plantas de chirrite (Coleus sp.) y tomate

- Lanolina

- Ácido Indol acético (AIA) o Ácido naftaleno acético (ANA)

- Kinetina

- Transportador

Procedimiento

1) Escoja 8 plantas de chirrite de tamaño similar sembradas en macetas individuales, y que

tengan al menos 5 hojas completamente desarrolladas. Escoja también 8 plantas de

tomate que tengan al menos 5 hojas desarrolladas.

2) Corte la zona apical de 6 plantas de cada especie. Conserve la zona apical de 2 plantas.

3) Tratamiento 1. Cubra la zona del corte de 2 plantas de cada especie con una capa gruesa

de Lanolina que contenga 0.1 % de la Auxina.

4) Tratamiento 2. Cubra la zona del corte de 2 plantas de cada especie con una capa gruesa

de Lanolina que contenga 0.1 % de Kinetina.

5) Tratamiento 3. Cubra la zona del corte de 2 plantas de cada especie con Lanolina pura

(i.e., sin fitohormonas).

6) Tratamiento 4 (testigo). Dejar como testigo las 2 plantas por especie a las que no se les

cortó la zona apical.

7) Observe periódicamente las plantas.

8) Evalué si los pecíolos se curvan midiendo con un transportador el ángulo de inserción del

pecíolo en el tallo y determine si se desarrollan yemas axilares.

9) Observe el estado general de cada planta y todas aquellas diferencias que detecte según

el tratamiento aplicado.

26

SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES

La fotosíntesis es el proceso mediante el cual la planta sintetiza moléculas orgánicas a

partir de agua y CO2. En este proceso intervienen diferentes tipos de pigmentos fotosintéticos

que capturan la energía lumínica. La fotosíntesis se realiza en los cloroplastos de las células del

parénquima. En dichas organelas existen membranas internas llamadas tilacoides, dentro de las

cuales se encuentran los pigmentos, los más comunes en las plantas superiores son clorofila a,

clorofila b, carotenos y xantofilas.

El objetivo de esta práctica es extraer y separar dichos pigmentos, mediante el uso de

solventes orgánicos y obtener sus espectros de absorción lumínica.

Materiales

- Hojas de diferentes especies

- Embudos separadores, beakers, erlenmeyers, pisetas

- Éter de petróleo

- Éter etílico

- Metanol

- KOH

- Agua destilada

- Tubos de ensayo

- Licuadora

- Espectrofotómetro

Procedimiento

1) En una licuadora mezcle 25 g de hojas con agua destilada hasta obtener una pulpa.

2) Posteriormente filtre a través de un algodón y recoja el filtrado en un embudo separador.

3) Añada 40 mL de éter de petróleo en el embudo separador, agite el embudo suavemente

y agregue pequeñas cantidades de agua destilada hasta obtener dos capas.

27

4) Descarte la capa de acetona con agua destilada. Lave con agua la capa de éter de

petróleo varias veces y luego transfiérala a un erlenmeyer.

5) A la disolución de pigmentos en éter de petróleo añádale 50 mL de metanol que

contenga 8% de agua. Agite suavemente y deje que las capas se separen lo más

claramente. Transfiera la capa inferior (que contiene el metanol) y la superior a beakers

diferentes. Observe la coloración de cada capa y deduzca cuáles pigmentos contiene

cada una.

6) Transfiera la solución que contiene el metanol a un embudo separador y añádale una

cantidad igual de éter etílico. Agite suavemente y procure separar las capas con adición

de agua destilada por las paredes del embudo. Separadas las capas descarte la de

metanol.

7) Una vez que tiene las dos fracciones, una en éter de petróleo y otra en éter etílico,

proceda a colocar un volumen de 30 mL de cada una en un tubo de ensayo y adicione a

cada una 15 mL de una solución de KOH preparada en metanol. Luego a cada tubo

adiciónele de agua destilada, mezcle y espere que las capas se separen. Transfiera las

dos capas a tubos de ensayo. Si los pigmentos amarillos se observan contaminados con

los verdes, adicione el éter de petróleo o el etílico, según sea el caso y agite hasta que el

color amarillo se observe nítido y brillante. Hecho esto, proceda a separar las capas.

Cada capa corresponde a un pigmento, a saber, clorofila a, clorofila b, carotenos y

xantofilas.

8) Una vez separados los cuatro pigmentos, diluya en una cubeta del espectrofotómetro

una alícuota de cada uno de los pigmentos en su respectivo solvente y proceda a

determinar el espectro de absorción lumínica de cada pigmento.

9) Discuta y analice sus resultados.

28

FOTOSÍNTESIS EN PLANTAS ACUÁTICAS

La fotosíntesis es un proceso complejo, que además de la producción de moléculas

orgánicas, libera oxígeno a la atmósfera. Un resumen de sus reacciones es:

CO2 + H2O → Carbohidratos + O2

Existen muchos métodos para medir la fotosíntesis. Una forma de hacerlo es

determinando la cantidad de CO2 consumido o de carbohidratos y oxígeno producidos.

Cuando el oxígeno se libera en una solución acuosa se producen burbujas, de modo que

se puede contar la cantidad de burbujas producidas y usar este parámetro para evaluar

actividad fotosintética. Esto es fácil de hacer en plantas acuáticas sometidas a tratamientos con

distintas concentración de CO2. El desarrollo de la fotosíntesis induce también cambios en el pH

de la solución acuosa donde están las plantas, los cuales se pueden determinar.

Los objetivos de esta práctica son: 1) estimar la actividad fotosintética en plantas

acuáticas a partir de la producción de burbujas de oxígeno, y 2) evaluar las variaciones del pH de

una disolución que contiene una planta acuática.

Materiales

- Plantas de elodea (Elodea sp.)

- Tubos de ensayo, gradillas

- Solución de NaHCO3 al 0.1 %, 0.5 % y 2.0 %

- Lámparas, Navajillas, Marcador indeleble, regla

- Erlenmeyer de 500 mL,

- Papel aluminio

- pHmetro

- Cámaras metabólicas

- Sensores de CO2 u O2 disuelto

- Interfaz de medición

29

Procedimiento

A) Producción de burbujas de oxígeno

1) Llene tres tubos de ensayo con el agua donde se encuentran las plantas de elodea.

2) Corte con una navajilla, de la mejor manera posible, tres segmentos terminales de

elodea de 6-10 cm de longitud.

3) Introduzca en cada tubo de ensayo un segmento de elodea, con la zona del corte

hacia arriba y coloque el tubo en la gradilla.

4) Situé la gradilla a 30 cm de distancia de la fuente de luz y deje pasar unos minutos

hasta que las condiciones se estabilicen y salgan burbujas del tallo y hojas.

5) Durante un minuto cuente el número de burbujas que se producen. Haga esto cada

minuto hasta completar cinco minutos.

En otro experimento, pero siguiendo los mismos principios anteriores, proceda a evaluar la

cantidad de burbujas producidas por minuto, pero con plantas de elodea sumergidas en tubos

de ensayo con las siguientes tratamientos.

i) Tres tubos de ensayo llenos con agua destilada.

ii) Tres tubos de ensayo llenos en dos terceras partes con agua destilada y 1 mL de

solución de NaHCO3 al 0.1 %

iii) Tres tubos de ensayo llenos en dos terceras partes con agua destilada y 1 mL de

solución de NaHCO3 al 0.5 %

iv) Tres tubos de ensayo llenos en dos terceras partes con agua destilada y 1 mL de

solución de NaHCO3 al 2.0 %

30

B) Medición cuantitativa de la producción de oxígeno

1) Llene dos cámaras metabólicas con el agua en el que se encuentran las plantas de

elodea y añada seis ramas terminales.

2) Coloque los sensores que tenga a su disposición (CO2 u O2 disuelto).

3) Con la interfaz, inicie la medición sin incluir las plantas hasta tener una línea base estable

(aprox. 2-3 minutos).

4) Selle las cámara metabólicas y sométalas a los tratamientos de luz (encienda una

lámpara a una distancia aproximada de 30 cm), y oscuridad (envuelva la cámara

metabólica con papel aluminio).

5) Registre durante una hora los niveles de gases disueltos en el agua.

6) Evalúe las diferencias entre los niveles de gases al inicio y al final de aplicar los

tratamientos.

C) Variaciones del pH

1) Llene dos erlenmeyers de 500 mL con cantidades iguales de disolución de KHCO3 al 0.1 %

2) Coloque 12 ramas terminales de elodea en cada erlenmeyer. Mida el pH inicial.

3) Cubra un erlenmeyer con papel aluminio (condiciones de oscuridad) y exponga el otro a

condiciones de iluminación. Pero, ambos a la misma temperatura.

4) Cada 15 min durante 3 horas, obtenga una alícuota de 25 mL de cada erlenmeyer,

transfiérala a un beaker y mida el pH. Devuelva la alícuota al erlenmeyer una vez que ha

medido el pH.

5) Compare y analice sus resultados.

31

DETECCION DE AZÚCARES Y ALMIDÓN EN HOJAS

La translocación es el proceso de transporte de los productos fotosintéticos de los sitios

de síntesis (fuente) a los sitios de almacenamiento (sumideros) y ocurre a través del floema.

Los carbohidratos son transportados por el floema en forma de sacarosa. El almidón es la

principal forma de almacenamiento de carbohidratos en las plantas.

Los carbohidratos producidos en las hojas durante la fotosíntesis pueden ser

translocados a otros órganos de la planta, pero también es posible que permanezcan

almacenados en las hojas.

El objetivo de esta práctica es detectar la presencia natural de almidón en las hojas, así

como en relación a las condiciones lumínicas a las que las hojas están expuestas.

Materiales

- Plantas de geranio y chirrite

- Alcohol etílico de 95 grados

- Solución de lugol al 10 %

- Agua hirviendo, Baño maría

- Beakers de 500 mL

- Prensas para papel (clips)

- Papel aluminio

- Papel celofán rojo, azul y verde

32

Procedimiento

A) Detección de almidón almacenado en hojas

1) Verter alcohol etílico de 95 grados en beakers de 500 mL.

2) Colocar los beakers en un baño maría con agua hirviendo.

3) Sumergir tres hojas de geranio y tres de chirrite en los beakers durante 20 min, o hasta

que las hojas se decoloren.

4) Lavar las hojas con agua caliente.

5) Colocar lugol en cajas de Petri o en bandejas.

6) Sumergir las hojas decolorados en la solución de lugol.

7) Observar las hojas decoloradas y la formación de ciertas manchas.

8) Analizar y discutir lo observado.

B) Detección de azúcares en hojas según la luz recibida

1) Corte fragmentos de papel aluminio y de papel celofán de los diferentes colores, de

manera que alcancen para cubrir una cuarta parte de la lámina foliar de la planta a usar.

2) Cubra al menos tres hojas (por el haz y por el envés) de una planta viva con los

fragmentos de papel (use para esto clips).

3) Señale claramente con cuál tipo de papel está cubriendo cada sector de la hoja.

4) Tenga al menos tres repeticiones.

5) Coloque la planta por una semana en un lugar soleado y riéguela.

6) Transcurrido este tiempo, corte las hojas de la planta, rotúlelas y remueva los

fragmentos de papel.

7) Repita el procedimiento de la parte A para identificar los sitios donde con almidón.

8) Compare la acumulación de almidón en los distintos sectores cubiertos y no cubiertos

por cada tipo de papel.

33

ESCARIFICACION Y GERMINACION DE SEMILLAS DE LEGUMINOSAS FORESTALES CON LETARGO

Para que una semilla germine, el primer requisito que debe cumplirse es que el agua

penetre a través de la testa, fenómeno conocido como imbibición. Una vez que esto ocurre y si

no hay ningún otro factor que afecte, se activan todos los procesos metabólicos, que van a

conducir finalmente a la aparición de la radícula y al desarrollo de la plántula.

Muchas especies presentan letargo y, en consecuencia, la semilla no germina, ya que

existe algún factor ajeno a la presencia de agua que lo impide. Por ejemplo, algún requisito

específico de luz, temperatura, factor biótico o bien por impermeabilidad de la cubierta seminal

o testa. Esto último es común que se presente en algunas especies forestales, las cuales se

caracterizan por tener una testa que no permite el ingreso del agua. Por lo tanto, es necesario

debilitarla o romperla para que el agua ingrese y se active la germinación. La ruptura de la testa,

por algún método físico o químico, se conoce como escarificación.

Materiales

- Semillas de cenízaro (Samanea saman)

- Semillas de guanacaste (Enterolobium cyclocarpum)

- Agua caliente (75-80 °C)

- Ácido sulfúrico concentrado

- Papel de lija o algún otro material para raspar la testa de las semillas

- Bandejas de germinación

- Sustrato para germinación (turba)

34

Procedimiento

1) Utilice semillas de cenízaro y guanacaste, tanto de un año de colectadas como recientes.

2) Aplique los siguientes tratamientos (tanto para semillas de un año de colectadas como

para semillas recientes):

i) Inmersión en Ácido sulfúrico concentrado por 5 min.

ii) Raspado de la testa por el extremo de la semilla donde brotará la radícula,

pero sin que se haga contacto con el embrión (Utilizar Papel de lija o similar).

iii) Inmersión por 3 min en agua caliente (aprox. 75-80 °C).

iv) Testigo, sin aplicar ningún tipo de escarificación.

3) Utilice una bandeja de germinación por cada tratamiento para cada especie, llénela con

sustrato para germinación (turba) y coloque una semilla en cada hueco.

4) Cubra las semillas con una capa delgada de turba, riéguelas, y asegurándose de que la

humedad se mantenga siempre y que las semillas no queden descubiertas.

5) Obsérvelas periódicamente y evalué lo siguiente por el tiempo que sea necesario:

A) Tiempo de aparición de los primeros síntomas visuales de germinación (brote).

B) Porcentaje de semillas que van germinando diariamente por cada tratamiento.

C) Principales aspectos del desarrollo de cada plántula como: Longitud del tallo (medido

desde los cotiledónes hasta la base de la última hoja extendida); Apertura y Caída de

cotiledones; Color; Forma y Tamaño de cotiledones; Tiempo de caída de la testa;

Tiempo de aparición de hojas y forma de éstas; Condición particular o estado de las

plántulas y cualquier otro tipo de información que considere de interés.

6) Realice comparaciones entre tratamientos y discuta las diferencias encontradas y todo

aquello que considere importante.

35

DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD DE SEMILLAS MEDIANTE LA PRUEBA DE TETRAZOLIO

El principal requisito para que ocurra la germinación de una semilla, si no existe letargo,

es la entrada de agua en la semilla (imbibición). Esto desencadena una serie de procesos que

llevarán posteriormente a la aparición de la radícula. Entre estos está el incremento de la

respiración celular, en la que participan enzimas del grupo de las deshidrogenasas.

Si la semilla es viable existe actividad de estas enzimas, las cuales reducen otras

sustancias. El Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio es una sustancia incolora que al reducirse

adquiere una coloración rosada y se transforma en un compuesto llamado formazán.

El formazán tiñe los tejidos, por lo que, según la intensidad de la coloración y su patrón

mostrado en las semillas, se puede determinar la viabilidad de estas. El objetivo de esta práctica

es evaluar la viabilidad de semillas mediante la prueba de tetrazolio.

Materiales

- Semillas de maíz, de frijol y de arroz.

- Cajas de Petri, Papel aluminio

- Solución al 1.0 % (5.0 g en 500 mL de agua) de Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio

- Navajillas, Gabacha, Guantes

Procedimiento

1) El día anterior a la realización de la práctica ponga a imbibir semillas de cada especie.

2) Una vez que están hinchadas, proceda a cortarlas justo por la mitad del embrión, de esta

manera obtendrá dos partes iguales. Descarte una de las partes.

3) Agregue la solución de tetrazolio en una caja de Petri.

4) Coloque al menos 20 semillas de cada especie en la solución de tetrazolio de manera

que la superficie del lado del corte quede en contacto con la solución.

5) Haga 5 repeticiones por cada especie, variedad o condición de semilla.

36

6) Posteriormente, cubra las cajas de Petri con papel aluminio (para producir oscuridad).

7) Transcurridas 2 horas evalué la viabilidad con base en las figuras 3, 4 y 5.

8) Calcule el porcentaje de viabilidad.

9) Hecho lo anterior, coloque semillas de los mismos lotes en bandejas de germinación con

sustrato para germinación húmedo. Utilice cinco repeticiones.

10) Calcule el porcentaje de germinación.

11) Compare el porcentaje de germinación con los resultados obtenidos en la prueba de

tetrazolio (porcentaje de viabilidad).

Figura 3. Viabilidad en semillas de maíz según la Prueba de Tetrazolio. Del 1 al 3 viable: embrión completamente teñido; Del 4 al 5 viable: plúmula teñida, radícula sin teñir; las áreas teñidas son las mínimas necesarias para la germinación. Del 7 al 12 no viable: radícula sin teñir, mayor parte del embrión sin teñir.

37

Figura 4. Viabilidad de semillas de frijol según la Prueba de Tetrazolio. Del 1 al 6 viable, del 7 a 13 no viable. Lo que se aprecia en negro está en realidad teñido de rosado, no así lo que está blanco.

Figura 5. Viabilidad de semillas de arroz según la Prueba de Tetrazolio. Del 1 al 8 viable, del 9 a 16 no viable.

38

EFECTO DE LA LUZ SOBRE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS

La luz es un factor importante en el proceso de germinación. Algunas semillas requieren

de oscuridad para germinar (fotoblastismo negativo) y otras, por el contrario, necesitan la

presencia de luz (fotoblastismo positivo). El objetivo de esta práctica es evaluar la germinación

según distintas condiciones lumínicas.

Materiales

- Semillas de lechuga (Lactuca sativa) o de otras especies.

- Cajas de Petri, Pinzas y pisetas

- Papel celofán rojo, verde, amarillo, azul y transparente

- Papel aluminio

- Agua destilada, Papel filtro

Procedimiento

1) Utilice 5 cajas de Petri por tratamiento (i.e. cinco réplicas por tratamiento).

2) Coloque en el fondo de la caja de Petri un trozo de papel filtro humedecido con agua

destilada. Remueva el exceso de agua.

3) Coloque ordenadamente 50 semillas de lechuga o de otra especie disponible.

4) Cubra las caja de Petri con tres capas de papel (celofán y de aluminio) según el

tratamiento (uno por cada tipo de papel).

5) Diariamente asegúrese de que las cajas de Petri estén húmedas.

6) Evalué el porcentaje de germinación diariamente (a partir del día en que inició el

experimento y durante una semana).

7) Compare los resultados entre de los distintos tratamientos.

39

ESPECIFICACIONES COMUNES PARA

INFORMES CORTOS Y PARA INFORMES LARGOS

Los informes serán confeccionados en Word (Microsoft) o en Writer (Open Office), con

letra Times New Roman, tamaño 12 y a espacio sencillo. Texto justificado. Subtítulos centrados.

Con sangría en cada párrafo nuevo. Sin espaciado antes de cada párrafo y automático después

de cada párrafo. Los márgenes inferior y superior a 2.5 cm, y márgenes laterales a 3.0 cm.

Existen aspectos que se evalúan en todo el cuerpo de texto. Estos incluyen ortografía,

uso adecuado del idioma español, claridad en la redacción y coherencia del texto en general.

La puntualidad es un aspecto a importante, ya que, por cada día de retraso se rebajaran

20 puntos del total obtenido en la revisión por parte de su asistente.

Los informes deben entregarse de manera digital al correo electrónico del asistente que

se le indique en la fecha y hora en que se le indique. Además del documento de texto

(.docx, .odt), puede enviar un archivo en PDF como respaldo.

Las direcciones de correo electrónico de los asistentes son:

Mónica Alfaro: mar.bucr@gmail.com Diego Aguilar: dd.10306@gmail.com Jordan Villegas: jvillegasmurillo@gmail.com Andrea Camacho: anndre.3@gmail.com

40

FORMATO DE LOS INFORMES LARGOS

Los informes largos seguirán el formato de los artículos científicos publicados por la

Revista de Biología Tropical (RBT). Exceptuando el resumen en inglés, el total de palabras, y la

sección de agradecimientos. Los informes largos deben incluir las siguientes partes:

Título (2 %)

Autores, correo electrónico, afiliación (1 %)

Resumen en español (6 %)

Palabras clave (1 %)

Introducción (sin indicarlo con este subtítulo) (20 %)

Materiales y Métodos (15 %)

Resultados (incluye cuadros y figuras) (25 %)

Discusión (25 %)

Referencias (5 %)

En este enlace se presenta un ejemplo del formato de los artículos de la RBT

https://revistas.ucr.ac.cr/docs/RBT/English-format-example.pdf

En este enlace se presenta la Guía de figuras de la RBT

https://revistas.ucr.ac.cr/docs/RBT/FIGURES-GUIDE.pdf

Para los cuadros sígase el siguiente formato

CUADRO #

Título

41

GUIA PARA LA ELABORACIÓN DE INFORMES CORTOS

Los informes cortos tienen un formato intermedio entre un artículo científico y un

reporte de laboratorio. A continuación se presenta el desglose de los rubros a evaluar en los

informes cortos y las especificaciones de cada sección. Esta guía es únicamente para informes

cortos del curso B0442, los informes largos obedecen a otros criterios de evaluación.

Título y encabezado (5%): esta sección no varía mucho con respecto a los informes

largos. Se evalúa la coherencia del título con respecto a la práctica realizada, autores en orden

alfabético, correos electrónicos sin hipervínculos y afiliación (unidad académica). Recuerde que

el título va centrado, en negrita (exceptuando nombres científicos y otros taxones

contemplados en el formato de la Revista de Biología Tropical) y en mínuscula luego de la

primera letra.

Introducción (25%): esta sección debe contar con un máximo de dos párrafos. Un

primer párrafo que contenga los aspectos teóricos más importantes de la práctica que se realizó

(no puede ser idéntica a las descripciones de la guía de laboratorio). El segundo párrafo debe

contener los objetivos que se abordaron, las hipótesis planteadas y las predicciones

debidamente justificadas. Recuerde que aunque sea solo un párrafo teórico, debe procurar que

siga manteniendo la forma de ‘pirámide invertida’ que se busca en la escritura científica.

Materiales y Métodos: esta sección se omite completamente en los informes cortos, ya

que al requerir menos espacio, se mantiene el entendido que se siguió la metodología de la guía

de laboratorio con los cambios acordados en clase.

Resultados y Discusión (40%): La sección de resultados y la de discusión se reportan

como una sola. Se evalúa que se reporten los resultados generales de manera descriptiva y

detallada. Además, los resultados deben ser coherentes con las hipótesis planteadas y se debe

evitar la omisión de resultados obtenidos. Recuerde que se deben reportar los resultados desde

42

la perspectiva biológica y en el mismo orden en el que se plantearon las hipótesis y predicciones.

Además, se evalúa la interpretación de todos los resultados obtenidos, apoyados en la

literatura que se cite. Recuerde utilizar citas en toda esta sección. Se debe incluir un párrafo con

las conclusiones principales, que respondan a las hipótesis iniciales, además de

recomendaciones y limitaciones de los experimentos.

Referencias (15%): en esta sección se evalúan las fuentes bibliográficas utilizadas en el

informe. Se toman en cuenta aspectos de formato uniforme (APA 6ta ed.) tanto en las citas en

el texto como el formato de presentación al final del escrito. Además, se evalúa que las

referencias sean de fuentes confiables y que tengan el formato específico para cada tipo de

fuente (artículo, tesis, capítulo de libro y demás). Debe colocar las fuentes orden alfabético y

con sangría francesa.

Cuadros y Figuras (10%): en esta sección se evalúa la información adjunta que apoye la

sección de resultados y discusión. Se evalúan aspectos de claridad en los títulos de cuadros y

figuras, que tengan el formato correcto y que estén completos. Además, se toma en cuenta la

calidad de la información contenida en los cuadros y figuras. En caso de que el informe no tenga

la necesidad de adjuntar cuadros y/o figuras, el porcentaje de esta sección se traslada a los

resultados y discusión.

Formato (5%): Aquí se evalúa que el formato del documento corresponda al indicado en

esta guía. Toma en cuenta aspectos como extensión, tipo y tamaño de letra, márgenes, sangrías,

texto justificado y uniformidad. El informe final debe constar de tres páginas como máximo sin

contar las referencias y los anexos.

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ASPECTOS A TOMAR EN CUENTA EN LA EVALUACION DEL DESEMPEÑO

(5% de la nota del curso)

Puntualidad y asistencia (1%)

- El estudiante asiste a las sesiones de laboratorio de manera puntual.

- El estudiante permanece en el espacio de trabajo hasta que finalicen las prácticas

correspondientes a ese día.

Orden y aseo (1%)

- El estudiante mantiene su ambiente de trabajo ordenado y limpio.

- El estudiante lava, limpia y guarda organizadamente el equipo que utiliza.

- El estudiante coloca los desechos en el lugar adecuado.

Disposición (1%)

- El estudiante muestra una buena relación con sus compañeros.

- El estudiante mantiene una relación respetuosa con sus asistentes y profesor.

- El estudiante tiene una buena disposición para realizar las prácticas de laboratorio.

Cooperación (1%)

- El estudiante trabaja de manera asertiva con su grupo de laboratorio.

- El estudiante muestra una buena organización con su grupo de trabajo.

- El estudiante coopera con sus compañeros para terminar dentro del tiempo asignado.

Responsabilidad (1%)

- El estudiante es responsable del mantenimiento y control de las prácticas en desarrollo

tanto dentro como fuera del horario de clase.

- El estudiante presenta una buena capacidad de resolución de problemas que se

presenten en el desarrollo del laboratorio.

- El estudiante asimila los conocimientos adquiridos en las prácticas durante el semestre.