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GUÍA PARA EL ANÁLISIS BROMATOLÓGICO DE MUESTRAS DE FORRAJES

Facultad de Ciencias

Agropecuarias Universidad de

Panamá

Autor: Manuel De Gracia, Ph.D.

Apoyo en Revisión: Albis Gallardo

Cosita

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Guía para el Análisis Bromatológico de Muestras de Forrajes

Laboratorio de Nutrición Animal

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Universidad de Panamá

Autor: Manuel S. De Gracia, Ph.D.

Apoyo en revisión: Albis Gallardo

2015

TABLA DE CONTENIDO

Página No.

I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................................... 1

II. TOMA DE MUESTRAS ............................................................................................................................... 2

A. PASTURAS ..................................................................................................................................... 2

B. HENOS ............................................................................................................................................ 3

C. ENSILAJE Y SUBPRODUCTOS DE FERMENTACIÓN ................................................................ 3

D. GRANOS O MEZCLAS DE CONCENTRADOS ............................................................................. 4

III. MEZCLA DE LAS MUESTRAS E IDENTIFICACIÓN ............................................................................... 4

IV. PRESECADO Y MOLIENDA ..................................................................................................................... 6

V. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS ............................................................................................................ 7

VI. DETERMINACIÓN DE LA MATERIA SECA .......................................................................................... 11

A. MATERIA SECA PARCIAL O A 60 °C ......................................................................................... 11

B. MATERIA SECA TOTAL O A 105 °C ........................................................................................... 12

C. MATERIA SECA TOTAL A 135 °C ............................................................................................... 13

D. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR DESTILACIÓN CON TOLUENO ................................. 14

E. MÉTODOS ADICIONALES PARA DETERMINAR HUMEDAD ................................................... 15

F. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD EN DOS PASOS ................................................................... 16

VII. DETERMINACIÓN DE CENIZAS ........................................................................................................... 17

VIII. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO .................................................................................................... 18

IX. DETERMINACIÓN DEL EXTRACTO ETÉREO ...................................................................................... 24

X. DETERMINACIÓN DE FIBRA .................................................................................................................. 26

A. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA CRUDA ................................................................................... 26

B. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO (FDN) O CONSTITUYENTES DE LA PARED CELULAR. ................................................................................................................. 29

C. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE ÁCIDO (FDA). .............................................. 32

D. DETERMINACIÓN DE FIBRA POR ANÁLISIS ENZIMÁTICO .................................................... 35

XI. DETERMINACIÓN DE LIGNINA ............................................................................................................. 39

XII. DETERMINACIÓN DE MINERALES ..................................................................................................... 42

A. DETERMINACIÓN DE CALCIO .................................................................................................... 43

B. DETERMINACIÓN DE FÓSFORO ................................................................................................ 46

C. DETERMINACIÓN DE POTASIO ................................................................................................. 48

XIII. LITERATURA CONSULTADA .............................................................................................................. 52

Guía para el Análisis Bromatológico de Muestras de Forrajes Manuel S. De Gracia, Ph.D.

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I. INTRODUCCIÓN La nutrición como ciencia basa su aplicación en el conocimiento de las demandas nutricionales de los animales en cada uno de sus estados fisiológicos y en la oferta de los nutrimentos para satisfacer estas necesidades en las cantidades y calidad adecuadas. Resulta imposible poder formular una ración para el consumo animal que maximice la respuesta de un grupo diverso de animales. De acuerdo con la distribución normal de una determinada población, habrá animales con mayores o menores demandas nutricionales en comparación con el promedio general del grupo, por lo que la ración que se formule deberá cubrir los requerimientos nutricionales de un alto porcentaje de los animales, y solo en el caso de aquellos animales más exigentes, se formularán raciones especiales si el valor económico de los animales lo amerita. El formular raciones con un exceso de nutrimentos para cubrir las necesidades de todos los animales puede acarrear una sobrealimentación de algunos o de muchos según sea el caso, y por consiguiente disminuir los beneficios económicos, así como la competitividad de la actividad. Para lograr formular una ración que se adecue a satisfacer los requerimientos nutricionales de la mayoría de los animales en un lote tenemos que utilizar como punto de partida la composición química de los diferentes alimentos o ingredientes que serán utilizados en la formulación de la ración. Debe quedar claro que el solo conocimiento de la composición química de los ingredientes no puede predecir la respuesta animal, pues se dan otros factores como lo son la genética de los animales, condiciones ambientales, estado de salud de los animales, nivel de consumo de la ración, digestibilidad de la ración o de los diversos ingredientes de la misma, entre otros. No obstante, se han desarrollado diversas ecuaciones matemáticas que pretenden predecir el valor nutritivo de los alimentos en función de su composición y de esta manera, indirectamente, predecir parcialmente la respuesta animal. Con la composición química de los alimentos se puede establecer una clasificación relativa del valor de cada uno de ellos, ya sea como fuente de nitrógeno o de energía, dos de los principales componentes en cualquier ración que se desee formular. El aporte de minerales, vitaminas, así como el de fibra cruda, Fibra Detergente Neutro, Fibra Ácido Detergente y de ácidos grasos esenciales, entre otros, también resulta importante, pero dependen de la especie animal y del estado fisiológico. Igual resulta importante en especies como porcinas y aves el aporte de amino ácidos esenciales en la ración. Adicionalmente, dependiendo del lugar, la forma de producción y el procesamiento, entre otros, de los ingredientes podemos obtener variaciones en la composición química, lo que implicaría realizar periódicamente análisis de los alimentos cada vez que tengamos sospecha de que se puedan dar variaciones significativas que pudieran alterar la composición final de la ración, y por consiguiente obtener resultados diversos en la respuesta animal. Con lo anterior podemos indicar que un análisis exhaustivo de la composición química de un alimento sería lo mejor y tendría muchas ventajas al momento de formular una ración, sin embargo, esto sería muy costoso, por lo que, en forma práctica, resulta más económico realizar ciertos análisis específicos y utilizar valores de referencia de la literatura para ciertos componentes, cuyo análisis demanda cierto tipo de equipo y son más costosos y difíciles de realizar. En el caso que se detecten variaciones significativas con los valores de referencia, pudiera procederse a verificar la composición de forma periódica. Finalmente, a lo largo de los años, se han desarrollado diversas técnicas de análisis, así como equipo más sensible, que han permitido determinar con mayor exactitud la composición química de los alimentos. Se han estandarizado procedimientos, entre los cuales se pueden indicar los de la AOAC International, National Forage Testing Association, Japan Livestock Technology Association, o los de la USDA. Igualmente, se proceden a certificar laboratorios donde se comprueba la veracidad de los resultados de los análisis contra patrones establecidos y se comparan y validan total o parcialmente la composición de ciertos alimentos. En el curso Principios de Nutrición Animal el estudiante podrá conocer y realizar algunos de los procedimientos analíticos más comunes que se aplican a los alimentos o forrajes utilizados en la nutrición animal de las especies domésticas de interés económico en el país. Esperamos que este documento sirva de apoyo para la realización de estas actividades y sirva de material de referencia al estudiante durante sus prácticas de laboratorio. En el documento se ha respetado el derecho de autor de la información presentada, y este documento no pretende sustituir la fuente original utilizada para la elaboración del mismo.


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II. TOMA DE MUESTRAS La toma de muestra tiene como objetivo principal proveer de material para determinar algún aspecto de interés de una población o universo. Para la realización de la mayoría de los análisis de laboratorio se utilizan entre uno a dos gramos de muestra. Si comparamos esta cantidad de material con el total del material de donde proviene, en muchos casos parece insignificante, por lo que se deduce la importancia de poder contar para los análisis de laboratorio con una muestra que sea representativa del material que queremos analizar. Por lo anterior podemos indicar que la toma de muestra es un paso importante, pues del mismo dependerá nuestra inferencia sobre el resto de material que será utilizado para la formulación de raciones para los animales. Se considera que la toma de muestra es una de las mayores fuentes de variación durante los procesos de análisis, por lo que se debe tener un gran cuidado en esta etapa. Si la muestra no representa fielmente el material a utilizar podemos sub o sobreestimar la oferta de nutrimentos a los animales en la ración, y por consiguiente pudiéramos no encontrar las respuestas deseadas en términos de producción y productividad biológica, así como en términos económicos. Por lo tanto, es importante conocer que las mediciones que se van a obtener en la muestra son correspondientes a una distribución que posee una media o promedio determinado, y que el valor estimado desde la muestra no posee ningún sesgo y sea preciso. No obstante, toda medición posee un grado de error, conocido como error estándar, y entre menor es este error mayor es la precisión. Esta última puede aumentarse o disminuirse en función del número de muestras que se tomen, o cambiando el tamaño de la muestra, lo que está limitado por los recursos que se poseen. La forma como obtengamos la muestra del campo va a depender del tipo de material que queremos analizar. Así podemos tener materiales desde gramíneas de piso, decumbentes, erectas, de corte, como también leguminosas de tipo arbustivo, rastreras, trepadoras, entre otras. Adicionalmente, en muchas oportunidades nos encontramos con cultivos donde se desea utilizar parte del mismo o en su totalidad como el caso del maíz y el sorgo para ensilaje, o en su defecto los rastrojos y subproductos de la cosecha del grano. Para el caso de alimentos semi o totalmente procesados nos encontramos con diversidades de formas de almacenamiento, ya sea a granel, en sacos, tanques u otro tipo de envase, así como en forma líquida o semilíquida, o con altos niveles de humedad, como el caso de la melaza, subproductos de destilería, pulpas, entre otros. En muchos casos, existe la posibilidad que el material provenga de un solo lote o fecha de siembra, sin embargo, se dan casos donde el material a utilizar es elaborado en diferentes fechas, por lo que se deben tomar muestras de cada lote de elaboración si se desea mantener un control sobre los alimentos utilizados en la formulación de las raciones. Finalmente, la cantidad preliminar de muestra que debe enviarse al laboratorio deberá tomar en consideración la cantidad original de material. Así tenemos que, para el caso de pasturas, la cantidad y puntos donde se tome la muestra estará influenciada por la cantidad de hectáreas que comprende el área a utilizar por los animales, que a su vez estará influenciada por la uniformidad de las características del suelo, tanto en composición físico-química como de topografía. Para muestras envasadas, tal como se mencionara anteriormente, no solo influirá el lote de fabricación o procesamiento, sino también la cantidad de material producido, y la forma del envase. Algo muy importante en lo que se refiere al tratamiento de las muestras para análisis, es que se debe minimizar el tiempo entre la toma de la muestra y su acondicionamiento para análisis en el laboratorio. No se deben guardar las muestras bajo condiciones que pueden alterar su composición, tales como alta humedad, elevadas temperaturas, luz solar, entre otras. Si la muestra no va a ser acondicionada dentro de las siguientes 24 horas de su recolección, es aconsejable colocarla en refrigeración hasta que llegue al laboratorio. A continuación, algunas sugerencias sobre la toma de muestras de algunos alimentos utilizados en la nutrición animal.

A. PASTURAS La obtención de muestra de pasturas debe realizarse con mucho cuidado y hay que tomar en consideración varios factores, por lo que se podrán encontrar en la literatura diversas metodologías y métodos para la recolección de muestras de acuerdo a cada situación. Lo importante es asegurarse que se está tomando una muestra representativa del área utilizada. Por lo general la muestra debe ser cortada a la altura con que


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frecuentemente los animales la consumen, en caso de que sean utilizadas en pastoreo directo, que por lo general está entre los 10 a 15 cm de altura. Uno de los métodos más comunes es el uso de cuadrantes o marcos de metal o madera que cubren 0.5 m2 de área. Los cuadrantes se arrojan dentro del área al azar y se corta todo el material que se encuentra dentro del cuadrante. En caso de parcelas experimentales pequeñas se deben evitar los bordes y tomar la muestra en el centro de la misma. Cuando estamos frente a mayores extensiones se puede aplicar una sectorización del área de acuerdo a las características de la parcela, y dentro de cada sector determinar visualmente cuadrantes y de los cuales, de forma aleatoria, se tomarán muestras de algunos para obtener una muestra representativa de la pastura. Por hectárea el rango de muestras varía desde 10 hasta 25 muestras. Cuando son pasturas de crecimiento erecto, por lo general la altura de corte se puede incrementar hasta unos 25 cm, ya que este tipo de pasturas por lo general es más susceptible a la defoliación severa, además de que por lo general los animales no las consumen extensamente. En el caso de especies para corte se seleccionan plantas consecutivas dentro de varias hileras del material sembrado, que muestren un crecimiento promedio del campo, y se cortan a alturas inferiores a los 10 cm o a ras del suelo, para permitir el crecimiento de nuevo material. Para especies arbustivas la selección de la muestra dependerá de lo que se ofertará a los animales, ya sea hojas u hojas más tallos jóvenes entre diversas plantas de la parcela. En todos los casos anteriores, todo el material cortado es pesado individualmente, de forma que pueda estimarse posteriormente la cantidad de material producido por hectárea. Dependiendo del número de muestras tomadas en campo, se pueden tomar submuestras del material cortado en cada localidad para conformar una, dos o tres muestras finales del campo, o bien tomar todo el material cortado para preparar la muestra que será enviada al laboratorio.

B. HENOS Existen diversos dispositivos para tomar muestras de heno, el más común consiste en una especie de tubo de acero inoxidable de aproximadamente 45 cm de largo y 3 cm de diámetro con un extremo con bordes cortantes. La toma de muestra dependerá de la forma de henificación y de la cantidad de material henificado. Si es un heno de montón se deberán tomar muestras tanto de la parte externa como de la parte interna. De la parte externa se deben tomar a una profundidad de aproximadamente 10 cm. Para el caso de pacas se toman también muestras del interior, o en algunos casos se abren las pacas y se toman sectores o franjas interiores en su totalidad. Se puede asumir que cada muestra representará el total de la paca y tomando un número suficiente de muestras de diversas pacas se obtiene una representatividad del heno. No se debe tratar de separar las hojas de los tallos cuando se toma este tipo de muestra. El número de pacas utilizadas para obtener la muestra dependerá del volumen de pacas obtenidas en campo y en algunos casos de la uniformidad del material recolectado. De cada paca seleccionada se podrán tomar hasta cinco submuestras, que luego se mezclan para seleccionar la muestra a enviar al laboratorio para análisis. Se dan procesos donde el heno se oferta en forma de pequeños cubos. En estos casos su comercialización se hace en bolsas o sacos y hasta en tanques, por lo que la toma de muestra de este tipo de material debe hacerse de forma muy similar a la que se aplica para granos y otros productos que se envasan en el mismo sistema.

C. ENSILAJE Y SUBPRODUCTOS DE FERMENTACIÓN Una vez se procede a abrir el silo, se deben tomar muestras de las áreas expuestas, que estén libres de daños visibles (color oscuro, hongos o mohos). Se pueden tomar muestras del material cuando este es transportado hacia los comederos, y se debe evitar tomar muestras muy cerca de los bordes superior, inferior o los lados de la estructura. Para silos en bolsa, se pueden tomar muestras de cada bolsa según se estén utilizando, y en el caso de “silopress” tomar muestras a medida que se avance en su abertura. En el caso de ensilaje se recomienda tomar muestras del silo por varios días consecutivos, las cuales se congelan hasta que se mezclen todas y se vayan a enviar al laboratorio las submuestras. Si las submuestras no serán procesadas inmediatamente, las mismas deberán ser envasadas en recipientes que permiten excluir la mayor cantidad de aire posible y congelarlas. Al igual que con los otros materiales utilizados en la alimentación animal se deberán tomar tantas muestras como se considere necesario de acuerdo con el


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tamaño del silo y las características del material ensilado, tales como estado de madurez, diferencias de crecimiento en campo, entre otros. Para el caso de otros materiales con alto contenido de humedad y subproductos de procesos fermentativos, como los residuos de cervecería, se deben tomar muestras de acuerdo a como se van utilizando, de igual manera que con los ensilajes. Para la conservación de las submuestras, aunque no se requiere la exclusión de aire, se debe proceder a su congelamiento si no van a ser procesadas de inmediato. En estos materiales no se debe tratar de extraer los líquidos por presión, puesto que muchas veces estos son consumidos por el animal cuando se ofrecen frescos, y solo se pierde líquido por almacenamiento o transporte de forma normal, pero no por presión externa.

D. GRANOS O MEZCLAS DE CONCENTRADOS Las muestras de granos o mezclas de alimentos que están envasados en bolsas se pueden tomar con un dispositivo o probador adecuado para tal propósito. Se deben tomar de cada saco un par de muestras del centro del saco, o hay quienes prefieren tomar muestras de la parte superior, inferior y del medio del saco, pues se da la tendencia que material más fino, así como el más denso, si los sacos han sido manipulados, se segreguen hacia el fondo o costados, si están estibados. No obstante, en el mejor de los casos es mejor tomar la muestra en el momento en que el material se está vaciando. La AOAC1 indica que para lotes de una a diez bolsas deberán tomarse muestras de todas las bolsas, para lotes mayores a 11 bolsas tomar muestras de al menos diez bolsas al azar. Las bolsas se colocan horizontalmente y se toman muestras diagonalmente, una de cada bolsa, y para menos de 4 bolsas tomar de cinco a mas muestras diagonalmente. En caso de que el material este a granel, se pueden tomar muestras de diferentes lugares, incluyendo el centro del mismo, lo que puede resultar en la toma de más de 10 muestras, o en su defecto tomar muestras a medida que el material está siendo utilizado. De igual forma, estas muestras deben ser mezcladas totalmente y luego tomar las submuestras para el laboratorio. III. MEZCLA DE LAS MUESTRAS E IDENTIFICACIÓN En todos los casos anteriores si la muestra será utilizada para análisis de minerales se recomienda el uso de tijeras u otro material de acero inoxidable, tanto para su recolección como para su conservación. Para facilitar la mezcla del material cortado, este se corta a 3 cm de longitud aproximadamente y se mezcla completamente. Posteriormente se puede utilizar el método del fraccionamiento en cuartos. Esto consiste en distribuir la muestra total sobre una superficie limpia y dividirla en cuartos, los cuartos opuestos diagonalmente se desechan y los restantes se mezclan, y se vuelven a dividir. Se repite la operación hasta que se obtiene una muestra de aproximadamente 1.5 kg para material fresco y ensilajes, y de 300 g para henos, concentrados, y otros. Otro método utilizado, recomendado por la AOAC consiste en colocar todo el material en un solo montón y con una pala u otro instrumento ir tomando alternadamente muestras, es decir, tomar una muestra y rechazar la siguiente. El nuevo montón que queda se somete al mismo procedimiento, y así sucesivamente, hasta llegar a la cantidad que será enviada al laboratorio. Durante el proceso de mezclado y selección de la submuestra se debe tener especial cuidado que el material no se contamine o sufra algún tipo de degradación que altere los resultados De cada muestra de campo se pueden enviar dos o tres submuestras para análisis al laboratorio. Esto no invalida el uso de repeticiones en el laboratorio, pues a cada una de las submuestras en cada corrida o análisis se deberán incluir repeticiones. Cada muestra deberá ser identificada adecuadamente, de manera que se puedan conocer las condiciones bajo las cuales se obtuvo el material y asociar su composición con estas. Para identificar las muestras se puede incluir en el detalle parte de lo que se conoce como el “Nombre Internacional” utilizado por el National Research Council y basado en la propuesta de Harris y col.2, que permite estandarizar la identificación de los distintos alimentos utilizados en la alimentación animal. Igualmente deberá indicarse la fecha de recolección, la localidad y si se desea el nombre de la persona que recolectó el material.

1 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000. 2 Harris, L., J. Malcon A. y E.W. Crampton. An International Feed nomenclature and methods for summarizing and using feed

data to calculate diets. Utah. Agr. Expt. Sta. Bul. 479. 1968


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El nombre internacional de la NRC de los alimentos se compone de los siguientes componentes:

Nombre científico: esto incluye el género y especie del alimento (Zea mays, Digitaria decumbens, Gossypium spp., como ejemplo)

Variedad o clase: esto incluye las diversas líneas o variedades que se obtienen por lo general con la manipulación genética (var identata, var Marandú, var Libertad, como ejemplo)

Nombre común del alimento: esto corresponde al nombre vulgar conocido ampliamente en la región o a nivel internacional (maíz, pasto pangola, algodón, como ejemplo)

Parte de la planta, animal o subproducto: En este caso se identifica la porción de la planta o el animal, y en todo caso el subproducto que es utilizado en la formulación de la ración (parte área, tallos, semilla con cáscara, como ejemplo)

Proceso(s) y tratamiento(s) que sufrió antes de consumirlo el animal: aquí se señala si el alimento ha sido previamente procesado para ser incluido en la ración o consumido por el animal (ensilado, fresco, fertilizado, extraído por prensa solvente, horneado a 110 °C, como ejemplo)

Estado de madurez: Es importante señalar que muchas veces utilizamos edad de corte por edad fisiológica de la planta, aunque son dos fenómenos diferentes. En este componente se debe identificar el estado de madurez fisiológico de la planta (floración, antes de la floración, recién germinado, como ejemplo)

Corte o cosecha: Bajo este componente es que se indica la edad al momento del corte o cosecha. En muchos cultivos, para los cuales se dan los rebrotes se puede indicar si es primero, segundo u otro corte. Igualmente, en otras latitudes se indica si el corte pertenece a determinada estación del año.

Grado o designación de calidad: Para ciertos granos o materiales se pueden dar indicaciones más exactas sobre el grado o contenido de ciertos nutrientes importantes, para los cuales el alimento es utilizado. Así tenemos que se puede indicar el nivel de proteína, fibra ácido detergente, entre otros.

Clasificación: Para la clasificación se utiliza un agrupamiento de los alimentos en función de ciertas características muy particulares, las cuales no son rígidas en extremo. Hay circunstancias donde un alimento bien pudiera ser clasificado o excluido de cierto grupo dada ciertas condiciones al momento de su uso. Las clasificaciones utilizadas son: ► Forrajes secos y alimentos toscos (1): Esta clasificación incluye los henos, tanto de

gramíneas como leguminosas, algunos henos de cultivos de cereales, las pajas y residuos de cosecha, rastrojos, y otros productos que tienen como característica principal poseer un contenido de fibra cruda mayor al 18%. Este nivel de fibra es el que se utiliza para clasificar en esta categoría todos los productos cuyo contenido en base seca exceda dicho nivel. También forman parte de este grupo las cáscaras y vainas, el bagazo de la caña, las cascarillas y la tuza del maíz

► Forrajes de fibra utilizados verdes (2): Se incluye en esta categoría todos los forrajes que son utilizados frescos, aun cuando hayan sido cortados, ya que algunos autores incluyen en la misma los pastos de corte. También se incluyen algunos residuos de cultivos alimenticios. Sin embargo, se mantiene como parámetro para clasificarlos como forrajes el hecho de que en base seca poseen más de 18% de fibra cruda. Tal como se mencionara anteriormente, hay productos que son difíciles de clasificar, tal es el caso del ensilaje de maíz, el cual con un contenido de fibra mayor al 18% posee un contenido de Nutrientes Digeribles Totales (NDT) cerca de 70% lo que lo hace bastante digerible, a diferencia de los alimentos incluidos en esta categoría. En el caso de las leguminosas, estas poseen un contenido de proteína cruda superior en muchos casos al 20% y se clasifican en esta categoría.

► Ensilajes (3): Como su nombre lo indica, aquí se incluyen todos los materiales que han sido preservados mediante la técnica del ensilaje o fermentación anaeróbica. Existen ensilajes de gramíneas, cereales como el maíz, sorgo y otros alimentos.

► Concentrados energéticos (4): a esta clasificación pertenecen todos los alimentos que contienen menos de 20% de proteína cruda y menos de 18% de fibra cruda. Aquí se incluyen los granos de cereales, subproductos de la molienda de los cereales, melazas, pulpas y subproductos de cítricos, lípidos de origen animal y vegetal, suero, subproductos de cervecería, desechos de algunas plantas de alimentos, frutas, vegetales, nueces, raíces y tallos reservantes, desechos de panadería, banano de desecho, entre otros.


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► Concentrados proteicos (5): Aquí pertenecen todos los alimentos con más de 20% de proteína cruda. Existen dentro de esta categoría productos de origen animal como los son las harinas de carne, de sangre y de carne y hueso, harinas de pescado, así como los subproductos de animales como la gallinaza y la cerdaza. Entre los de origen vegetal tenemos las harinas de las oleaginosas como la semilla de algodón, de soya, maní, entre otros. Se incluyen las harinas de algas, algunos subproductos de la molienda de cereales, granos desecados de la destilería y cervecerías, leguminosas deshidratadas, fuentes unicelulares por bacterias, levaduras, así como los nitrogenados no proteicos como la urea.

► Suplementos minerales (6): Como su nombre lo indica a este grupo pertenecen todos los productos que contienen los minerales necesarios en la alimentación animal, en sus diferentes formas. Aquí se incluye la harina de hueso, de concha, entre otros.

► Suplementos vitamínicos (7): Al igual que en la clasificación anterior se incluyen todas las formulaciones o productos que poseen un alto contenido, casi puro, de las diversas vitaminas que se utilizan en la alimentación animal.

► Aditivos (8): Aquí corresponden la diversidad de productos, que aun cuando no aportan ningún nutrimento a la alimentación animal, ayudan a ser más eficientes algunos aspectos del metabolismo animal, aumentar el nivel de ingesta o prevenir ciertas enfermedades.

Número Internacional: Este se compone de 6 dígitos, X-XX-XXX, donde el primero corresponde a su clasificación, y los demás son asignados de acuerdo a su inclusión dentro de la tabla de composición de alimentos que norma la NRC, también se le conoce como el “Nombre Numérico”. Este número es utilizado cuando se trabaja con sistemas de cómputo.

IV. PRE SECADO Y MOLIENDA Dependiendo del nivel de humedad del material colectado para muestra se deberá tener el cuidado de poder disminuir el contenido de agua hasta niveles donde se pueda conservar en el laboratorio sin que el material se deteriore hasta el momento de su análisis o para conservarlo para determinaciones futuras adicionales. En el caso de materiales como heno, rastrojos, concentrados, granos cosechados y secados previo almacenamiento, entre otros, que en su mayoría llegan al laboratorio con un 90 a 95% de materia seca, pueden ser molidos directamente y el material puede ser conservado en frascos con tapa o en bolsas plásticas con cierre hermético bajo condiciones normales de laboratorio o bodegas refrigeradas. Estos recipientes deberán contar con una adecuada identificación y llevar un registro de las mismas en un banco de datos. En la figura 1 se muestra un esquema del tratamiento de las muestras de acuerdo a su nivel inicial de humedad. Para los forrajes verdes, cosechados frescos, no se acostumbra guardarlos en su forma natural, por lo que se someten a un pre secado a temperaturas de 60 °C por aproximadamente 18 a 24 horas en hornos de aire forzado caliente. Para el caso de muestras con altos niveles de humedad, tales como ensilajes, subproductos de fermentación, pulpas, alimentos líquidos, inclusive aceites y grasas, entre otros, si no se desea disminuir el nivel original de humedad deberán conservarse a temperaturas de congelamiento, donde se eviten fermentaciones u oxidaciones adicionales por la presencia de bacterias, hongos, mohos y oxígeno. Estos materiales por lo general poseen menos de 85% de materia seca. La reducción del contenido de humedad de las muestras permite que se elimine el medio más general de reacción, el agua. Una vez se disminuye la cantidad de agua libre es muy difícil que las reacciones ocurran, y si adicionalmente se le reduce la temperatura ambiental, se reducen mucho más las posibilidades de que el material sufra cambios mientras permanezca almacenado. Durante el pre secado, se debe tener en cuenta que no se ha eliminado totalmente el contenido de agua del material, lo que se elimina en gran parte es lo que se conoce como agua libre. Esta pérdida de agua en el pre secado deberá tomarse en cuenta cuando se determine la humedad total, que se realiza a temperaturas cercanas a los 100 °C.


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De manera general, todas las muestras que serán sometidas a análisis deben ser molidas. Los materiales colectados en campo, en especial los forrajes, poseen partículas de gran tamaño, por lo que se debe reducir su tamaño para realizar los análisis correspondientes. La reducción en el tamaño de las partículas permite que la submuestra utilizada para el análisis sea representativa de todo el material colectado. En muchos casos, existe la posibilidad de que el material pueda sufrir un calentamiento adicional en el molino, por lo que se debe ser muy cuidadoso en el tamaño de partícula que se desea obtener y el tiempo que tome la muestra en el molino. En este procedimiento se puede perder una cantidad adicional de humedad. Para proceder a moler la muestra esta debe tener no más de un 12% de humedad, aproximadamente. Las partículas grandes se reducen para que puedan colocarse en el molino, esto se puede realizar con algún instrumento de acero inoxidable para no contaminar las muestras. Cuando las partículas de la muestra son muy grandes, se aconseja molerlas inicialmente utilizando mallas que permitan obtener un tamaño de partícula entre 4 a 6 mm. Por lo general, para la molienda final, se utilizan mallas en el molino que permitan reducir el tamaño de las partículas entre 0.75 hasta 1 mm. En muestras que tengan tendencia a perder humedad, la AOAC recomienda que se utilicen mallas de 2 mm, para minimizar el tiempo en el proceso. El tipo de molino a utilizar dependerá del tipo de muestra y su nivel de humedad. El molino de cuchillas o martillo trabaja bien para muestras con 80 a 85% de materia seca, sin embargo, el de bolas o tipo ciclón requiere que las muestras tengan entre 90 a 95% de materia seca para poder ser molidas sin problemas. Una vez molida las muestras se procede a guardarlas en envase de vidrios o bolsas plásticas a temperatura de laboratorio, donde se minimice su exposición al aire, calor y luz, y se evite su deterioro. Finalmente se procede a la identificación apropiada de la muestra. V. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS La determinación de la composición química de los alimentos utilizados en la alimentación animal se basa en diversos procesos químicos que tienen como finalidad determinar cuantitativamente la presencia de determinado elemento, compuesto o fracción de la estructura del material. En base a la composición, es decir la presencia cuantitativa de un elemento, compuesto o fracción determinada, se realizan inferencias sobre los beneficios que tiene determinado alimento sobre la nutrición animal. Hay otros tipos de análisis que permiten estimar la calidad del alimento, pero esto se considera como una evaluación un tanto subjetiva y en muchos casos sus valores son relativos y no absolutos, pues solo permiten comparar el valor de un

Figura 1. Esquema para la preparación de la muestra para análisis.


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alimento con respecto a otro o un grupo de alimentos. Adicionalmente, la composición cuantitativa no refleja la eficiencia o el nivel de aprovechamiento con la cual el alimento es utilizado por determinada especie. Factores como la digestibilidad, absorción y el uso a nivel tisular de cada nutrimento de determinado alimento, consumido solo o combinado, varían entre las especies, y aún dentro de ellas, para los diferentes estados fisiológicos de los animales. Por tal motivo, se han diseñado ensayos biológicos que permiten medir la biodisponibilidad, o sea la cantidad de un nutrimento que el animal realmente aprovecha. Estos métodos son generalmente más complicados y costosos. A pesar de todo lo anterior, el análisis del alimento nos sirve de guía para determinar el nivel de incorporación de un alimento en la formulación de raciones para cada especie, y conocer cuáles son los aportes en términos de nutrimentos y como poder complementarlos con otra fuente, ya sea natural o artificial. La disponibilidad de nutrimentos en un alimento es esencialmente determinada por la composición química del alimento: primero con respecto a la concentración de los componentes disponibles y no disponibles y segundo a través de las estructuras orgánicas e inhibidores que pueden limitar la disponibilidad de sus componentes con los cuales están asociados. Los análisis de laboratorio son requeridos como un medio rápido y económico para el control de calidad de alimentos y predecir la respuesta animal en diferentes situaciones de alimentación. Existen los análisis químicos y los de la digestión in vivo e in vitro utilizando bacterias ruminales o enzimas. Esta última provee de estimaciones más directas de digestibilidad, pero es más larga, cara y se indica que es menos reproducible. El análisis proximal de la materia seca en uso por más de 100 años, se atribuye su desarrollo en Alemania a Henneberg y Stohmann3, y es conocido como el método Weende. El mismo consiste de los siguientes pasos:

• Materia seca a los 100° C: Calentamiento de la muestra hasta un peso constante a temperaturas por encima del punto de ebullición del agua (100 °C). Esto remueve el agua, por consiguiente, la pérdida de peso equivale al contenido de agua. Fuentes de error son el hecho de que cualquier material que se volatiliza a esta temperatura se pierde (ensilajes u otros productos fermentados). Algunos líquidos se oxidan cuando se calientan y por consiguiente aumentan de peso. Se utiliza la determinación con tolueno, secado al vacío y secado en congelamiento, como métodos alternos.

• Lípidos: Extracción con éter del residuo para estimación de lípidos por 4 h. La pérdida de peso luego del secado corresponde a los lípidos.

• Fibra Cruda: Reflujo del residuo del extracto etéreo por 30 m con ácido sulfúrico al 1.25% seguido por 30 m con hidróxido de sodio al 1.25%. El residuo insoluble se seca, pesa e incinera, y la materia orgánica insoluble se denomina fibra cruda, que está constituida por hemicelulosa, celulosa y lignina insoluble.

• Determinación de nitrógeno: método del Kjeldhal. Pequeñas muestras son digeridas en ácido sulfúrico concentrado y toda la materia orgánica es destruida. El nitrógeno en forma de sulfato de amonio, luego es neutralizado con hidróxido de sodio, destilado y el amonio es llevado a una solución ácida estándar y titulado.

• Cenizas: incineración por dos horas a 600° C. Las altas temperaturas pueden alterar la forma de algunos minerales y pueden volatilizar algunos como el cloro, zinc, selenio y yodo.

• Extracto Libre de Nitrógeno: El cálculo de esta fracción se considera como la materia seca no determinada por la suma del extracto etéreo, fibra cruda, cenizas y proteína (N x 6.25). compuesto principalmente de carbohidratos altamente disponibles, tales como azúcares y almidón, pero también puede contener hemicelulosa y lignina, especialmente en forrajes.

Este sistema es la base para los cálculos del NDT (Nutrientes Digeribles Totales) asumiendo lo siguiente:

• El extracto etéreo recolecta los lípidos y grasas que contienen 2.25 veces el contenido energético de los carbohidratos

• Todo el nitrógeno está en forma de proteína que contiene 16% de nitrógeno • La fibra cruda recolecta la porción fibrosa y material estructural menos digerible del alimento • El extracto libre de nitrógeno representa carbohidratos altamente digeribles.

Ninguna de las anteriores asunciones es cierta y el grado de error varía considerablemente, sin embargo, es uno de los métodos más utilizados. El extracto etéreo incluye ceras, aceites volátiles, clorofila y pigmentos

3 Maynard, L. A. y J. K. Loosli. Animal Nutrition. 6ta. Edición. McGraw Hill, 1973, McDonald, P., R. A. Edwards y J. F. Greenhalg.

Animal Nutrition. 2da. Edición. Longman, 1977 y Van Soest, P. J. Nutritional Ecology of the Ruminant. O & B Books, 1982.


9

con poco valor y no recupera los jabones en las heces que son la forma en la cual ácidos grasos indigeribles son excretados. Los forrajes no poseen triglicéridos y los galactolípidos de las hojas contienen menos energía que lo que implica el factor 2.25. Puede ser ignorado en el análisis de muchos forrajes y alimentos para rumiantes. Los constituyentes nitrogenados incluyen: proteínas, ácidos nucleicos, nitrógeno no proteico soluble en agua y fracciones muy insolubles asociadas con la lignina. El contenido de nitrógeno de las plantas varía de 15 a 16%. La proteína verdadera solo representa el 70% del nitrógeno del forraje y poco o nada del nitrógeno fecal. El nitrato no es convertido a sales de amonio por este procedimiento. Muchos análisis de heces indican cantidades considerables de extracto libre de nitrógeno, pero ordinariamente no contienen carbohidratos hidrosolubles. Almidón insoluble es el único carbohidrato no estructural que aparece en las heces y solo en grandes ingestas aparece con cantidades sustanciales. El extracto libre de nitrógeno contiene los errores acumulados de todas las otras determinaciones. Mayormente debido a la solubilidad y pérdida de lignina y hemicelulosa en la preparación de la fibra cruda. Aún la celulosa no es totalmente recobrada y el comportamiento de diferentes materiales es variable. Posteriormente, durante 1930 surge nuevamente el interés por el análisis de la fibra. Bajo el auspicio de L.A. Moore se desarrolla el método de Van Soest que corrige un tanto las deficiencias en las determinaciones de fibra cruda y el extracto libre de nitrógeno. Predecir el valor nutritivo a partir del proximal es un problema, en especial con aquellos alimentos fibrosos. En este análisis se dividen los nutrimentos que se encuentran en los tejidos vegetales en dos grandes compartimentos basado en su disponibilidad nutricional, el contenido celular que es fácilmente disponible para todos los animales, y un segundo compartimiento constituido por las paredes celulares las cuales son menos disponibles y cuya digestibilidad es controlada por la concentración de lignina y celulosa. Este método puede repetirse con mayor facilidad que el método de la fibra cruda, además aísla una fracción del alimento que generalmente los animales utilizan en forma muy ineficiente. Existen otros métodos específicos y sofisticados para determinar cada uno de los componentes químicos, pero obviamente requieren de equipo sofisticado y son más tediosos. Estos análisis sirven para complementar los análisis obtenidos por el método de Weende o de Van Soest. El mismo autor indica “el carácter dual nutritivo de la materia seca de la planta (contenido celular y constituyentes de la pared celular) contraindican el uso de un único factor para predecir la totalidad de la digestibilidad de la materia seca”. Estos componentes son denominados “entidades nutritivas” por Lucas (1961)4 debido a que estos dos componentes físicos tienen su propia disponibilidad nutritiva característica. En la figura 2 se muestra una comparación de cómo se distribuyen los constituyentes del tejido vegetal en las diferentes fracciones según el análisis utilizado. Se debe indicar, que de acuerdo con el método de Van Soest, es posible determinar el contenido de nitrógeno en cada una de las fracciones, y en cierta forma determinar su biodisponibilidad. Métodos enzimáticos también han sido evaluados para analizar la composición de los forrajes, en especial su componente fibroso. Uno de los métodos que está siendo

ampliamente aceptado es el desarrollado por el Dr. Abe5, en el cual se utiliza -amilasa y una proteasa para separar la fracción soluble o contenido celular (CC) de la fracción insoluble o pared celular (PC). Posteriormente, se trata la fracción insoluble con una celulasa lo que separa una fracción de fibra altamente digerible de una fibra de baja digestibilidad. En ambas fracciones se puede determinar la fracción orgánica si ambas son incineradas y la diferencia de las cenizas se considera materia orgánica de la fibra altamente digerible (Oa) y materia orgánica de fibra de baja digestibilidad (Ob), cuyas fracciones sumadas nos proveen del contenido orgánico de la pared celular6.

4 Mott, G.O. y J.E. Moore. Forage Evaluation Techniques in Perspective. Proceedings of the National Conference on forage Quality

Evaluation and Utilization, September 3-4, 1969, L-1-l-10. 5 Abe, T. The studying data of the Livestock Experiment Station. Vol. 2. 1988 6 Japan Livestock Technology Association. Technical Manual for Feed analysis. S. Tanabe, Ed., March, 2000.

Guía para Análisis de Muestras de Forrajes Manuel S. De Gracia, Ph.D.

10

Figura 2. Comparación entre Dos sistemas de Análisis de los Componentes de la Materia Orgánica del Forraje7

Van Soest

Componentes del Forraje

Weende Nitrogenado No nitrogenado

Contenido Celular8 (Solubles en Detergente

Neutro)

Lípidos Extracto Etéreo

Nitrógeno No Proteico Solubles en Agua

Extracto Libre de Nitrógeno

Proteína soluble

Pectina, Almidón

Constituyentes de la Pared Celular9 (Fibra Detergente Neutro)

Soluble en Ácido Detergente

Proteína Insoluble

Hemicelulosa

Lignocelulosa (Fibra Detergente Ácido)

Nitrógeno Lignificado Lignina Soluble en Álcali

Lignina insoluble10 Fibra Cruda

Celulosa11

7 Adaptado de Maynard, L. A. y J. K. Loosli. Animal Nutrition. 6ta. Edición. McGraw Hill, 1973 y Jurgens, M. H. Animal Feeding and Nutrition. Kendall/Hunt Publishing Company, 4ta. Ed.,

1978. 8 Incluyen azúcares, almidón, carbohidratos solubles, pectina, proteína, nitrógeno no proteico, lípidos, vitaminas y otros. 9 Incluye celulosa, hemicelulosa, lignina, sílice, proteína dañada por el calor 10 Determinada por incineración a 500° C 11 Soluble en H2SO4 al 72%


11

VI. DETERMINACIÓN DE LA MATERIA SECA Es muy común que la gran mayoría de los alimentos utilizados en la alimentación animal cuando son utilizados para la formulación de raciones posean cierto nivel de humedad. Este nivel de humedad varía aún dentro de un mismo tipo de material debido a las condiciones donde se obtuvo. Así tenemos que, en los forrajes, de acuerdo a su madurez fisiológica van perdiendo humedad y se encuentra pastos con contenidos elevados de humedad cuando jóvenes y con muy poca humedad cuando viejos. En los subproductos agroindustriales, de acuerdo al procesamiento al cual son sometidos los materiales, la pérdida de agua varía de acuerdo al método de extracción o secado. Igual sucede con el almacenamiento de granos, que, aunque se estandarizan, no todo el tiempo poseen el mismo grado de humedad. Al tomar una muestra para analizar su composición es importante que la muestra no sufra deterioro o alteraciones durante el tiempo que permanece en laboratorio para su análisis o mientras se guarde para futuros análisis. Tal como se mencionara con anterioridad, la remoción de la humedad libre en el material recién recolectado restringe la actividad enzimática y previene la actividad biológica de cualquier bacteria, hongo u otro microorganismo presente en el material. Esto es quizás uno de los puntos más importantes al momento de acondicionar la muestra para su análisis. Por otra parte, la variabilidad en el contenido de humedad dificulta un tanto la comparación que se pueda realizar entre los distintos materiales que se utilizan en la alimentación animal. Por lo que resulta muy conveniente, expresar el contenido de nutrimentos como porcentaje de la materia seca, o lo que se conoce como “Composición en Base Seca”. Cuando se conoce el contenido original de humedad del material la composición se expresa como “Composición Tal como Ofrecido” o “Composición en Base Fresca”.

A. MATERIA SECA PARCIAL O A 60 – 65 °C Para la molienda de ciertos materiales y obtener el tamaño de partícula ideal para los análisis de laboratorio, algunas muestras deben ser pre secadas, así como también reducir su humedad para su conservación. Para estos efectos se acostumbra secar la muestra en un horno de convección de aire caliente a una temperatura de 60 -65 °C por 18 a 24 horas. Todas las muestras deberán ser procesadas por duplicado. A continuación, los pasos a seguir:

PROCEDIMIENTO

Todo el proceso debe realizarse en duplicado.

Use una bandeja de aluminio limpia.

Pese la bandeja de aluminio vacía con exactitud. P1

Agregue el material de muestra hasta que llene la bandeja y registre el peso de la bandeja más la muestra húmeda. P2

Coloque la bandeja con la muestra húmeda en el horno de convección de aire forzado con temperatura de 60 - 65 °C por un periodo no menor a las 18 horas.

Luego del periodo indicado con anterioridad, retire la bandeja con la muestra parcialmente seca del horno y colóquela sobre la mesa dejando que se equilibre con la humedad del aire del laboratorio por lo menos durante 30 minutos.

Pese la bandeja con la muestra parcialmente seca y registre este valor. P3

Peso (gramos)

Duplicado 1 Duplicado 2

P1. Peso de la bandeja vacía

P2. Peso de la bandeja más la muestra fresca

P3. Peso de la bandeja más la muestra parcialmente seca

P4. Peso de la muestra fresca (P2 – P1)

El contenido de humedad del material se determina por la diferencia de peso entre el material fresco y el material parcialmente seco. Para obtener el contenido parcial de materia seca a 60 – 65 °C, utilice la siguiente ecuación:


12

El contenido parcial de humedad se obtiene por diferencia:

Con los pesos de los duplicados se obtiene un promedio, y ambos no deben variar más de 1.5% de la diferencia de ambos valores. Esta muestra parcialmente seca es molida y se conserva, debidamente identificada, en envases de vidrio con tapa o en bolsas de plástico con cierres herméticos, para los futuros análisis. Las muestras no son secadas a 105 °C para extraer totalmente la humedad desde su inicio debido a que a dicha temperatura se pueden provocar reacciones indeseables, tales como la Reacción de Maillard o de

empardecimiento12, donde los grupos aminos de los aminoácidos, proteínas y aminas, tal como el -amino de la lisina pueden llegar a reaccionar con carbohidratos, aldehídos y cetonas ligándose, y alterando los resultados posteriores. Las reacciones subsecuentes como los rearreglos de Amadori y la formación de los pigmentos de melanoidinas dan como producto final el empardecimiento de los alimentos.

B. MATERIA SECA TOTAL O A 105 °C La remoción parcial de la humedad libre del material permite la conservación del mismo disminuyendo su deterioro o alteraciones químicas. No obstante, el material aún conserva cierto nivel de humedad que está ligada a ciertas estructuras y compuestos, la cual debe ser removida para determinar con exactitud el contenido total de agua del material. En el caso de materiales que no han sido pre secados a 60 – 65 °C y que han sido molidos, se puede realizar la determinación de la humedad total directamente. Para determinar el contenido total de humedad proceda con los siguientes pasos:

PROCEDIMIENTO


Coloque un crisol de porcelana con tapa con capacidad de 50 ml en un horno de convección de aire forzado a 105 °C por 16 horas por lo menos. Si las muestras no serán utilizadas para la determinación de cenizas, se pueden utilizar pequeños envases de aluminio no muy profundos con tapa, de aproximadamente 50 mm de diámetro y 40 mm de profundidad.

Remueva el crisol de porcelana del horno, utilizando pinzas de metal, y lo coloca en un desecador, el cual debe poseer un agente secante en el fondo. Coloque la tapa del desecador sin cerrarlo completamente. Si lo cierra completamente provocara un vacío dificultando la remoción posterior de la tapa. Espere por lo menos dos minutos y proceda a colocar la tapa de manera que cierre herméticamente el desecador. Espere cinco minutos para que se enfríe el crisol.

Remueva el crisol y su tapa del desecador con unas pinzas de metal y proceda a registrar su peso. El peso debe registrarse en una balanza analítica hasta cerca del 0.0001 g. P1

Sin remover el crisol de la balanza, agregue con cuidado 2 g de muestra y registre el peso con la mayor exactitud hasta 0.0001 g. P2

Retire el crisol de la balanza y lo coloca en un horno de convección de aire forzado a 105 °C durante 24 horas. Algunos procedimientos indican un término de 3 horas solamente.13

Al final del periodo de secado, remueva el crisol del horno y lo coloca cerrado con su tapa en un desecador, con las mismas precauciones indicadas con anterioridad. Déjelo enfriar.

Registre el peso del crisol más la muestra seca con exactitud hasta 0.0001 g. P3

12 Eskin, N.A.M., H.M. Henderson y R.J. Townsend. Biochemistry of Foods. Academic Press, New York. 1971 13 Undersander, D., D.R. Mertens and N. Thiex. Forage Analyses Procedures. National Forage Testing Association, 2001.

www.foragetesting.org

x100

4P

1P -

3P

SECA TEPARCIALMEN o C0

60ASECAMATERIA DE %

C60SECA A MATERIA DE % - 100 C60 A PARCIAL HUMEDAD DE % OO


13

El contenido de humedad del material se determina por la diferencia de peso entre el material fresco y el material seco. Para obtener el contenido de materia seca a 105 °C, utilice la siguiente ecuación:

Peso (gramos)


P1. Peso del crisol vacío

P2. Peso del crisol más la muestra fresca

P3. Peso del crisol más la muestra seca


El contenido de humedad se obtiene por diferencia:

Tal como en el caso anterior, la diferencia de los valores de los pesos de los duplicados no debe superar más del 1.5% de las diferencias de ambos con el promedio. Estas muestras secas se conservan en los crisoles para la determinación del contenido de cenizas. No obstante, estas muestras no deben utilizarse para la determinación de la fibra, lignina o nitrógeno insoluble en la fibra ácido detergente. Igualmente, en este procedimiento se pierden compuestos volátiles, en especial de los ensilajes.

C. MATERIA SECA TOTAL A 135 °C En algunos casos un procedimiento más rápido para la determinación de la materia seca total es aceptado por la AOAC14. En este caso las muestras son colocadas en hornos de convección de aire caliente a temperatura de 135 °C. Este procedimiento no se recomienda para muestras donde se desea realizar análisis de lípidos, o en materiales con urea, alto contenido de azúcares, materiales ensilados, productos lácteos con contenido de azúcar mayor al 4% o productos que contengan algunos de estos compuestos, debido a que pueden ocurrir reacciones que alteren la muestra y además puedan provocar la pérdida de material dada la elevada temperatura utilizada durante el análisis. Para determinar la humedad por este procedimiento siga los siguientes pasos:

PROCEDIMIENTO


Coloque un pequeño envase de aluminio no muy profundo con su respectiva tapa en un horno de convección de aire forzado a 135 ° C por 2 horas por lo menos.

Remueva el envase de aluminio y su tapa, utilizando pinzas de metal, y lo coloca en un desecador, el cual debe poseer un agente secante en el fondo. Coloque la tapa del desecador sin cerrarlo completamente. Si lo cierra completamente provocara un vacío dificultando la remoción posterior de la tapa. Espere por lo menos dos minutos y proceda a colocar la tapa de manera que cierre herméticamente el desecador. Espere cinco minutos para que se enfríe el envase de aluminio.

Remueva el envase de aluminio y su tapa del desecador con unas pinzas de metal y proceda a registrar su peso. El peso debe registrarse en una balanza analítica hasta cerca del 0.0001 g. P1

Sin remover el envase de aluminio de la balanza, agregue con cuidado 2 g de muestra y registre el peso con la mayor exactitud hasta 0.0001 g. Remueva la muestra hasta que se distribuya uniformemente en el fondo del envase. P2

Retire el envase de aluminio de la balanza y lo coloca en un horno de convección de aire forzado a 135 °C durante 2 horas, sin colocarle la tapa.

14 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000.

x100P

P -PC105ASECAMATERIA DE PORCENTAJE

4

130

C105SECA A MATERIA DE % - 100 C105 A HUMEDAD DE % OO


14

Al final del periodo de secado, remueva el envase de aluminio del horno, le coloca la tapa y lo coloca en un desecador, con las mismas precauciones indicadas con anterioridad. Déjelo enfriar.

Registre el peso del envase de aluminio con tapa más la muestra seca con exactitud hasta 0.0001 g. P3

El contenido de humedad del material se determina por la diferencia de peso que se da entre el material fresco y el material seco luego del secado en el horno. Para obtener el contenido de materia seca a 135 °C, utilice la siguiente ecuación:

Peso (gramos)


P1. Peso del envase de aluminio vacío

P2. Peso del envase de aluminio más la muestra fresca

P3. Peso del envase de aluminio más la muestra seca


Al igual que en casos anteriores el contenido de humedad se obtiene por diferencia:

D. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR DESTILACIÓN CON TOLUENO Algunas muestras poseen una cantidad variable de compuestos volátiles, los cuales pueden eliminarse si la muestra se calienta a las temperaturas utilizadas para determinar materia seca en hornos de convección de aire forzado. En muchos casos estas pérdidas pueden ser insignificantes, mientras que para otras puede resultar elevada, y se puede sobreestimar el contenido de humedad. Este es el caso de los ensilajes, donde sí se coloca el material en un horno convencional se pueden perder los ácidos acético, propiónico y butírico, así como el amonia. Igualmente, algunos carbohidratos se pueden descomponer y las proteínas pueden ligarse y formar compuestos insolubles en otros materiales. Para evitar este tipo de errores en la determinación de humedad se utiliza el método de destilación por tolueno o método de Dean y Stark. En este caso, se toma en consideración que el solvente y el agua son inmiscibles, que el solvente posea un punto de ebullición mayor que el agua, sea menos denso que el agua y seguro de utilizar. Durante la destilación, el tolueno y el agua del material se evaporan y condensan en conjunto, y los ácidos grasos volátiles u otro material volátil permanece en la muestra, disueltos en el solvente orgánico, lo que permite que no se sobreestime el contenido de humedad del material. Algunos autores indican que la humedad remanente, cerca de 3 a 5%, son el equivalente de la pérdida de ácidos grasos volátiles durante el secado convencional 15 . Para el procedimiento se indica lo siguiente:

15 Undersander, D., D.R. Mertens and N. Thiex. Forage Analyses Procedures. National Forage Testing Association, 2001.

www.foragetesting.org

Figura 3 Esquema del sistema para determinación de humedad por destilación con tolueno.

x100

4P

1P -

3P

C0135ASECAMATERIA DE PORCENTAJE

C135SECA A MATERIA DE % - 100 C135 A HUMEDAD DE % OO


15

PROCEDIMIENTO


Conecte un balón de fondo redondo con capacidad de 250 ml y un destilador Leibig de 500 mm de altura a un recibidor de humedad tipo Bidwell-Sterling con un recibidor de 5 ml de capacidad. Ver figura 3.

Destile una cantidad conocida de agua para determinar la exactitud de la columna hasta 0.01 ml.

Se limpia el tubo receptor y el condensador con una mezcla de ácido crómico, luego con suficiente agua, luego alcohol y finalmente lo seca al horno para eliminar todo vestigio de agua.

Pese suficiente cantidad de muestra que le permita extraer por lo menos de dos a cinco mililitros de agua de la muestra. El peso debe ser exacto con una exactitud de 0.0001 g.

Introduzca la muestra en el balón y agregue suficiente tolueno grado analítico hasta cubrir completamente la muestra.

Llene el tubo recibidor con tolueno, agregándolo por la parte superior del condensador.

Caliente hasta el punto de ebullición y destile lentamente, aproximadamente dos gotas por segundo, hasta que toda el agua haya sido extraída, y luego eleve la tasa de destilación hasta cuatro gotas por segundo.

Cuando toda el agua haya sido aparentemente extraída, lo que puede tomar cerca de una hora, lave el condensador adicionando tolueno desde la parte superior y continúe la destilación para ver si se destila alguna cantidad adicional de agua. Si ocurre, repite la operación.

Si permanecen algunas gotas de agua en el condensador, remuévalas cepillando el interior del condensador con un cepillo saturado con tolueno, lavando igualmente con tolueno.

Deje que el contenido se enfríe a temperatura ambiente. Fuerce cualquier gota de agua hacia el recibidor utilizando un alambre de cobre cubierto con una banda de hule al final

Mide el volumen de agua con exactitud de 0.1 ml, y realice los cálculos para obtener el porcentaje de humedad.

El porcentaje de humedad se obtiene por diferencia.

E. MÉTODOS ADICIONALES PARA DETERMINAR HUMEDAD

A lo largo de los años se han desarrollado nuevos métodos para determinar el contenido de humedad de los alimentos. El uso de cada uno de los métodos dependerá del tipo de material y de las facilidades con que se cuente en el laboratorio. Lo importante es mantener un procedimiento confiable y que sea reproducible para poder obtener resultados exactos y precisos. Entre los métodos aprobados por la AOAC está el Espectroscopia utilizando la reflexión de ondas del Infrarrojo cercano (NIRS)16. Otro método es el de Karl Fischer, en el cual el agua se extrae de la muestra con metanol y se titula con el reactivo de Karl Fischer. El método se basa en la siguiente reacción:

2H2O + SO2 + I2 H2SO4 + 2HI Debido a que el HI es incoloro y el I2 es de color rojizo, este cambio en coloración permite determinar la reacción del agua con los reactivos. Para evitar la pérdida de SO2 y I2 de la solución, se le agrega piridina. Se han propuesto métodos donde se utilizan microondas. Este método igualmente no es adecuado para muestras que se desean analizar para fibra, lignina y análisis insoluble de nitrógeno en fibra o para NIRS. Para este caso se requiere que el microondas posea un mínimo de 600 watts, con bandeja giratoria preferiblemente. Las muestras son colocadas una y otra vez por espacio de tres minutos, aproximadamente,

16 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000.

)x100(g) Muestra la dePeso

(ml) agua de Volumen1(SECA MATERIA DE PORCENTAJE

SECA MATERIA DE % - 100 HUMEDAD DE %


16

hasta que no se registre cambio de peso. Existen algunos microondas que tienen integrado una balanza de manera que se pueda monitorear el cambio de peso de las muestras. Existe el método donde se coloca la muestra debajo de una lámpara infrarroja. En este caso, como la luz puede penetrar el material, el agua al absorber la energía se evapora y el cambio de peso se registra como pérdida de humedad. No obstante, en este procedimiento se debe estandarizar hasta la distancia de la lámpara a la muestra, así como el tamaño de la muestra para obtener resultados reproducibles. Es un método relativamente rápido, donde se puede tardar entre 10 a 25 minutos para determinar el contenido de humedad. Para el caso de muestras con alto contenido de humedad se utilizan hornos de convección de aire forzado caliente, pero con reducción en la presión interna, por lo general debajo de 50 mm de Hg. Esto tiene la ventaja de poder reducir la temperatura del aire hasta 70 °C, minimizando reacciones indeseables entre los componentes de los alimentos. Igualmente existe el procedimiento de “Secado en congelamiento” o liofilización. En este procedimiento el agua se sublima en cámaras donde se controla la temperatura, un condensador donde se atrapa el agua que se remueve del producto, un sistema de refrigeración y un sistema de vacío para reducir la presión dentro de la cámara. En el procedimiento es importante inicialmente congelar el agua libre del producto, la manera lenta o rápida de congelamiento afecta el tiempo inicial de secado. Luego al material se le reduce la presión en la cámara y se calienta para que el agua se sublime. Esto se debe realizar lentamente para que no se pierda material por el movimiento del vapor de agua, y si se calienta muy rápido el material puede fundirse o colapsar. Luego que el agua libre se ha evaporado se eleva la temperatura para evaporar el agua ligada y se realiza a la máxima capacidad de vacío del equipo. También hay sondas térmicas, hay sondas que utilizan la conductancia eléctrica, y otras, de las cuales algunas están aún en prueba y no han sido aprobadas oficialmente. No obstante, en algunas industrias las utilizan por su versatilidad y rapidez.

F. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD EN DOS PASOS

Este procedimiento es cuando se utiliza el pre secado de la muestra, a temperaturas 60 °C, que se denomina materia seca parcial, y luego se somete la muestra u otra porción de la muestra a la extracción total de agua por otro método, en particular los de horno de convección forzada con aire caliente a

temperaturas 105 °C durante periodos de más de 16 horas o a 135 °C por menos tiempo, por lo general no más de dos horas. En este caso, la cantidad total de humedad de la muestra bajo análisis se obtiene multiplicando el porcentaje de humedad obtenido durante el pre secado por el contenido de humedad obtenido en el segundo paso o secado total. Como ejemplo, utilizamos la materia seca parcial a 60 °C y la obtenida a 105 °C.

El contenido de humedad se obtiene por diferencia:

SECAMATERIA DE TOTAL PORCENTAJE - 100HUMEDAD DE PORCENTAJE

C105SECA A MATERIA DE % x C60SECA A MATERIA DE %SECAMATERIA DE TOTAL % OO


17

VII. DETERMINACIÓN DE CENIZAS Los minerales que están presentes en los alimentos, de muy diversas formas, constituyen la materia denominada inorgánica, la cual se obtiene como residuo de la incineración del material o cenizas. El residuo de la incineración puede variar de acuerdo con el grado de contaminación de la muestra, una muestra altamente contaminada con suelo u otro material mineral nos da como resultado un alto contenido de cenizas. Dado que la cantidad de cenizas formará parte del total de la materia seca, una alteración en su porcentaje afectará la composición estimada de los demás nutrimentos que conforman el alimento. El procedimiento para determinar las cenizas requiere que el material se incinere a temperaturas entre los 500 y 600 °C, temperatura a la cual algunos minerales se volatilizan, tales como el yodo y el selenio. Igualmente se recomienda que no se utilice este procedimiento para materiales con alto contenido de azúcares o líquidos. Siga el siguiente procedimiento para la determinación de cenizas:

PROCEDIMIENTO


El crisol y la muestra seca utilizada para la determinación de humedad a 105 o 135 °C se coloca en un incinerador frío, donde se ha preestablecido como temperatura máxima los 600 °C.

Si no se ha realizado la determinación de humedad de la muestra y se hará directamente la determinación de cenizas, realice lo siguiente: Coloque un crisol de porcelana en un incinerador a 600 °C por espacio de dos horas. Retire el crisol del incinerador y déjelo enfriar por aproximadamente 60 m en un desecador y

determine con exactitud su peso hasta 0.0001 g. P1 Coloque el crisol en una balanza analítica y agregue aproximadamente 2 g de muestra con

exactitud de 0.0001 g. P2

Coloque el crisol con la muestra en el incinerador17, cierre la puerta y encienda el incinerador.

Cuando la temperatura alcance los 600 °C deje las muestras por espacio de dos horas.

Apague el incinerador y deje que la temperatura descienda por debajo de los 200 °C.

Con mucho cuidado abra la puerta del incinerador para no crear corrientes de aire y remueva los crisoles hacia un desecador, utilizando pinzas y guantes de asbesto, para que se enfríen. Esto puede durar cerca de una hora.

Pese los crisoles más las cenizas con exactitud hasta 0.0001 g y realice los cálculos para obtener el porcentaje de cenizas. P3

Peso (gramos)


P1. Peso del crisol vacío

P2. Peso del crisol más la muestra fresca o parcialmente seca

P3. Peso del crisol más las cenizas

P4. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca (P2 – P1)

Si la muestra no ha sido pre secada, el cálculo anterior nos brinda el Porcentaje de Cenizas Tal como Ofrecido o en Base Fresca, para obtener el Porcentaje de cenizas en base seca cuando utilizamos una muestra que ha sido pre secada o parcialmente seca a 60 °C, se deberán realizar los correctivos para ajustar el contenido y se debe realizar la siguiente operación:

17 En algunos casos se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente hasta que deje de

emanar humo y luego se transfiere al incinerador. Esto aumenta la manipulación de la muestra y puede aumentar el grado de error.

x100P

P -PCENIZAS DE PORCENTAJE

4

13

100 xCo105SECA A MATERIA DE %

SECA TEPARCIALMEN CENIZAS DE %SECA BASE EN CENIZAS DE %


18

VIII. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO En muchas partes este análisis es conocido como el de determinación de proteína cruda, debido a que, por convención, el porcentaje de nitrógeno determinado en el análisis se multiplica por el factor 6.25 para obtener el porcentaje de proteína cruda. Este factor está relacionado con el hecho de que la proteína, en términos generales, contiene un 16% de nitrógeno, por lo que el factor se obtiene de la relación 100/16. Sin embargo, es conocido que esto no es tan cierto, puesto que se conoce que el porcentaje de nitrógeno en las proteínas varía desde un 15.5 hasta un 18%, por lo que habría que aplicar un factor diferente para cada tipo de proteína. Como ejemplo tenemos que el complejo de proteínas de la leche da 15.7% en promedio, por lo que el factor debe ser 6.38, en cambio en la harina de trigo es de 17.5% por lo que el factor debe ser 5.7118, para otros granos es 6.25, para arroz es 5.95,19 y un valor de 3.44 para la cafeína. Adicionalmente, en el procedimiento conocido como Método Kjeldhal20, todo el nitrógeno presente en la muestra, exceptuando los nitratos y nitritos, se convierten en amonio que a su vez es liberado del medio de reacción en forma gaseosa y atrapado con un ácido débil para su titulación. Esto implica que el nitrógeno determinado de esta manera, y expresado como proteína cruda, estaría disponible para los animales, sin embargo, los animales de estómago simple o monogástricos no pueden hacer un uso eficiente de todas las formas de nitrógeno, y requieren específicamente de ciertos aminoácidos presentes en la proteína verdadera, estos son los denominados aminoácidos esenciales. Para el caso de los animales de estómagos compuestos o rumiantes, esta determinación se relaciona mucho mejor con la capacidad que tienen estos animales de utilizar la gran diversidad de fuentes de nitrógeno gracias al fenómeno de fermentación ruminal que realizan las bacterias y otros organismos que habitan el retículo-rumen. Entre los compuestos nitrogenados de tipo no proteico que se incluyen en esta determinación están las amidas, sales de amonio y la urea, entre otros. El método de análisis para la determinación del nitrógeno involucra básicamente tres pasos. El primero implica la digestión de la muestra donde el nitrógeno de la materia orgánica se descompone por la acción de una solución concentrada de ácido. Esto se logra por el calentamiento de la muestra en ácido sulfúrico, obteniéndose una solución de sulfato de amonio. En el segundo paso ocurre la destilación donde al agregar un exceso de una base, el amonia iónico se convierte en amonia gaseoso el cual se libera del medio por ebullición y el gas se condensa y atrapa en una solución con un ácido débil. Finalmente, el tercer paso implica la titulación donde se cuantifica la cantidad de amonio presente en la solución resultante. En el caso de la titulación esta la determinación directa y la indirecta, en esta última se utiliza, por lo general, ácido bórico. La serie de reacciones que toman lugar durante la determinación de nitrógeno en los alimentos son:

El equipo diseñado para este análisis ha variado en los últimos años, no obstante, el método convencional utiliza los balones tipo Kjeldhal, hornillas para calentar durante la digestión y destilación, el sistema de condensación y recolección de amonia y los erlenmeyer, llevándose a cabo el proceso de digestión y destilación bajo una cámara de gases.

18 Maynard, L.A., J.K. Loosli, H.F. Hintz y R.G. Warner. Nutrición Animal. 7ª. Ed. 4ta. En Español. McGraw-Hill.1998. 19 Labconco Corporation. Guide to Kjeldahl Nitrogen Determination Methods and Apparatus. 2-41-9/98-JCON-5M-R3. Kansas City,

Missouri. 1998 20 El científico danés Johan Kjeldahl introdujo este análisis en 1883.

ClNHBOH HCl BO)H(NH

(exceso)BOHBO)H(NH BOH NH

O2H NH OHNH

SONa OH2NH 2NaOH SO)(NH

OSSUBPRODUCT OTROSCOOHSO)(NH SOH N CONORGÁNICA MATERIA

4 33324

33324333

23Calor

4

424424

2242442


19

En la Figura 4 se muestra un sistema integrado para análisis de nitrógeno utilizando el método de Kjeldhal21. Como se observa en la figura 4, en la parte inferior están los calentadores eléctricos (6) sobre los cuales se colocan los balones con la muestra, el H2SO4, la mezcla de catalizadores y las perlas de ebullición u otro material utilizado para evitar el sobrecalentamiento y saltos durante la ebullición de la mezcla. Los balones se apoyan inclinados sobre un sistema de extracción de gases (3, 5). Esta parte constituye el complejo de digestión de la muestra. En la parte superior del sistema se encuentra otra serie de calentadores eléctricos (6) sobre los cuales se colocan los balones con la muestra digerida. Estos balones se unen al sistema de condensación (2), en cuyo extremo posterior e inferior, tal

como se muestra en el esquema sobre una plataforma (4) reposan los erlenmeyer que contienen el ácido bórico con los indicadores que recibirán el destilado con el amonia. En la parte superior de los balones Kjeldhal se encuentran unos bulbos conectores (8) que permiten la separación de los gases que se condensaran y el líquido que se pueda formar antes de la condensación. En este esquema integrado se indica la cabina o cámara (7) donde se encuentra el sistema, así como parte del sistema de ventilación y extracción de gases (3, 4). También existe un procedimiento similar pero denominado MicroKjeldhal, donde se utilizan menores cantidades de muestra, pero el procedimiento implica los mismos pasos que cuando se utilizan mayores cantidades de muestra. El uso de menores cantidades de muestra en el análisis implica que esta debe representar con bastante exactitud toda la cantidad de alimento que se va a utilizar. Se indica que para este tipo de análisis es crítico el tamaño y la uniformidad de la muestra que se va a analizar, puesto que se puede alterar los resultados significativamente. En la figura 5 se muestra el aparato utilizado para la destilación con este método. Igualmente, para este proceso los balones de digestión son

21 Adaptado de: Labconco Corporation. Guide to Kjeldahl Nitrogen Determination Methods and Apparatus. 2-41-9/98-JCON-5M-

R3. Kansas City, Missouri. 1998

Figura 4. Esquema de sistema integrado para análisis de nitrógeno por el método de Kjeldhal.

1. Termostato o controlador de temperatura

2. Sistema de condensación

3. Abanico del sistema de extracción de gases

4. Plataforma para sostener erlenmeyer receptores de destilado

5. Sistema de extracción de gases

6. Calentadores eléctricos

7. Cámara externa del sistema

8. Bulbo conector separador de gases y líquidos

1

2

3

4

5 6

6

7

8

Figura 5. Sistema para destilación por método

MicroKjeldhal.


20

de menor capacidad, de aproximadamente 30 a 100 ml, capacidad menor a la de los utilizados en el sistema macro. Igualmente, se han diseñado nuevos sistemas para la digestión de la muestra. En estos sistemas, en lugar de utilizar los balones Kjeldhal se utilizan tubos que son colocados en bloques que alcanzan altas temperaturas permitiendo la descomposición de la muestra en

el medio ácido. Estos son denominados digestores rápidos debido a que el tiempo de digestión varía entre 25 a 45 minutos dependiendo del tipo de muestra y el tipo de catalizador. En la figura 6 se muestra uno de estos sistemas. En la figura se aprecian los tubos utilizados y algunos elementos adicionales del sistema de control de calor. Con este sistema se ha automatizado igualmente el sistema de destilación. En este sistema en un circuito cerrado, donde se mantienen reservorios con las soluciones, se agrega el agua, el NaOH, y se genera el vapor para la destilación, y se recoge el destilado en un erlenmeyer, donde por ajuste gravimétrico, se suspende la destilación cuando se alcanza determinado volumen. En la figura 7 se muestra uno de estos sistemas automatizados donde la destilación puede tomar de cinco a diez minutos por muestra, solamente. A continuación, se indican los reactivos que se utilizan en el análisis de nitrógeno por el método Kjeldhal, donde se

utiliza el CuSO4 como catalizador y el ácido bórico al 4% como solución para “atrapar” el amonia producto del proceso de digestión y destilación.

REACTIVOS:

Ácido Sulfúrico: Se utiliza ácido sulfúrico concentrado con pureza de 96 a 98%, grado analítico, d = 1.84.

Hidróxido de sodio al 40%: Disuelva lentamente cerca de 400 g de NaOH bajo en N en agua, deje enfriar y diluya hasta completar un litro de solución. También puede utilizar una solución de NaOH con

d 1.36

Ácido Bórico al 4%: Disuelva cerca de 400 g de ácido bórico en agua destilada y adicionar 170 ml de la mezcla de solución indicadora y lleve todo hasta diez litros de solución.

Solución indicadora: Disuelva 0.1 g de verde de bromocresol en 100 ml de etanol y 0.1 g de rojo de metilo en 100 ml de etanol. Mezcle 70 ml de la solución de rojo de metilo con 100 ml de la solución de verde de bromocresol. Esta mezcla final se agrega y a diez litros de ácido bórico.

Figura 6. Bloques para calentamiento de tubos utilizado para la digestión de muestras para análisis por el

método Kjeldhal.

Figura 7. Destilador automatizado para el análisis

Kjeldhal.


21

Ácido Clorhídrico 0.1 N: Disuelva lentamente cerca de 86.0 ml de ácido clorhídrico 36.5 a 38.0% en un litro de agua, luego diluya todo hasta 10 litros de solución. Estandarice esta solución de la siguiente manera: Tome 40 ml de la solución ácida a estandarizar con una pipeta volumétrica de 40 ml y descártela.

Esto es para lavar la pipeta. Tome una alícuota de 40 ml de la solución ácida a estandarizar y transfiérala a un erlenmeyer de

250 a 300 ml que ha sido lavado con agua libre de CO2. Haga esto en triplicado. Lave una bureta con NaOH estandarizado con aproximadamente la misma concentración del ácido

que se va a estandarizar. Llene la bureta con la solución de NaOH y espere, por lo menos un minuto, hasta que repose el líquido de las paredes y tome la lectura inicial. Recuerde siempre leer la bureta al nivel del ojo y en el borde inferior del menisco.

Utilice el indicador que se utilizara en el método de Kjeldhal para titular en la solución ácida. Agregue gota a gota la solución de NaOH, siempre con agitación.

Titule hasta el cambio de coloración de rojo a naranja a amarillo. Cuando ha logrado el punto final, remueva cualquier gota de la punta de la bureta y lave los lados

del erlenmeyer con agua libre de CO2 y observe si la coloración persiste. Si no persiste agregue otra gota de NaOH y verifique el color.

Calcule la normalidad y ajuste con HCl o agua si fuese necesario. Mezcle y verifique la estandarización según lo indicado con anterioridad.

Solución de NaOH 0.1 N: Diluya cerca de 54 ml de una solución 1:1 p/p de NaOH en agua destilada libre de CO2 para obtener 10 litros de solución. Estandarice esta solución de la siguiente manera: Pese con la mayor exactitud cerca de 0.4 g de Ftalato ácido de potasio seco y transfiéralo a un

erlenmeyer de 300 ml. Añada 50 ml de agua destilada libre de CO2 y disuelva completamente. Titule hasta pH 8.6 con la solución a ser estandarizada utilizando ya sea electrodos de vidrio o

fenolftaleína. Para el caso de utilizar fenolftaleína, añada tres gotas a un recipiente que contenga 50 ml de solución amortiguadora con pH 8.6 y tápela. Este recipiente se utilizará como referencia del punto final para un pH de 8.6 en la titulación.

Determine el volumen requerido para lograr el punto final en una solución blanco que contenga 50 ml de agua libre de CO2 y tres gotas de fenolftaleína.

Reste el volumen necesario para titular el blanco del volumen utilizado para titular el Ftalato ácido de potasio y calcule la normalidad. Esta normalidad debe estar un poquito elevada.

Ajuste a la concentración deseada, mezcle adecuadamente y verifique la estandarización de la forma mencionada anteriormente.

Catalizador: Se mezcla sulfato de potasio (K2SO4) y sulfato de cobre (CuSO45H2O) en una relación de 9:1. También se puede mezclar 15 g de K2SO4 con 0.04 g de CuSO4 anhidro. En el caso de que se utilice TiO2 como parte del catalizador, se mezclan 0.01 g de este reactivo con 16.7 g de K2SO4 y 0.01 g de CuSO4 anhidro.2223 Esta mezcla permite elevar la temperatura de ebullición del H2SO4, de 330 a 390 °C aproximadamente, y acelerar la reacción de descomposición.

Perlas de ebullición

Piedra pómez

Para verificar la normalidad de las soluciones de NaOH y del HCl se deben realizar las siguientes operaciones:

22 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000. 23 En el mercado se pueden obtener mezclas de catalizadores en tabletas. Dependiendo de las indicaciones del vendedor se pueden

utilizar de una hasta tres tabletas por muestra.

erlenmeyer en HCl de ml

adaestandariz NaOH de Normalidad x adaestandariz NaOH de ml HCl de Normalidad

204.229 x NaOH de ml

1000 x OHKHC de g NaOH de Normalidad 448


22

A continuación, el procedimiento que se debe seguir para la determinación de nitrógeno utilizando ácido bórico al 4% en la captura del amonia.

PROCEDIMIENTO


En un papel filtro o encerado libre de Nitrógeno pese aproximadamente de 0.25 a 1.0 g de muestra con exactitud de 0.0001 g.24

Coloque la muestra con el papel dentro del balón tipo Kjeldhal, evitando que se pierda algo de muestra.

Añada los catalizadores o la mezcla de ambos al balón. Se añade el equivalente de aproximadamente 15.0 g de K2SO4 con 0.04 g de CuSO4 anhidro, u otra proporción seleccionada.

Añada con mucho cuidado 20 ml de H2SO4 concentrado al balón y rote levemente el mismo para que humedezca completamente el papel con la muestra.25.

Coloque las perlas de ebullición y piedra pómez. Esto es para evitar saltos bruscos del balón y recalentamiento del mismo.

Encienda el calentador de manera que la solución entre en ebullición en cinco minutos. Esta temperatura es aquella que puede llevar 250 ml de H2O de 25 °C a ebullición en cinco minutos.

Durante este periodo se observará un humo blanco dentro del balón, se pierde CO2, y la mezcla del balón pasa de un color oscuro hasta quedar completamente clara o ligeramente verdosa, y se dejan de emitir vapores.

Continúe calentando por espacio de 90 minutos, dándole giros ocasionales al balón. Se podrá observar la condensación de H2SO4 en el cuello del balón.

Terminado el periodo, apague el calentador y deje enfriar los balones. Coloque los balones sobre soportes adecuados y déjelos enfriar un poco mas.

Aún tibios, agregue lentamente al balón aproximadamente 250 ml de H2O tratando de lavar las paredes, y deje enfriar a temperatura ambiente. Asegúrese de que no se le han formado cristales en el balón. Esto puede reducir la recuperación de nitrógeno, así como provocar bolsones de ácido que reaccionan violentamente al agregarse el NaOH.

Añada al balón lentamente, sin agitar, aproximadamente 20 ml de NaOH al 40%. No permita que se caliente bruscamente la solución.

Coloque el balón sobre el calentador del sistema de destilación y en el extremo opuesto del sistema de condensación coloque un erlenmeyer con aproximadamente 25 ml de la solución de ácido bórico e indicadores correspondientes, de manera que el extremo del tubo recolector quede inmerso en la solución.

Gire el balón de manera que la solución de NaOH se mezcle completamente con el contenido del balón.

Encienda el calentador y destile a una temperatura donde se logre el punto de ebullición en aproximadamente 7.5 minutos.

Destile hasta haber recolectado cerca de 150 ml de destilado. Retire el erlenmeyer de manera que la punta del tubo recolector quede fuera de la solución, pero no fuera del erlenmeyer. La solución debe haber cambiado de un color rojo a verde.

Apague el calentador, y siga recogiendo destilado por cerca de un minuto adicional hasta que cese completamente. Si no retira el tubo recolector de la solución en el erlenmeyer, al enfriarse el balón se dará un reflujo de solución del erlenmeyer hacia el balón y se perderá la muestra.

Retire el erlenmeyer y titule el destilado con la solución estandarizada de HCl y calcule el porcentaje de Nitrógeno en la muestra. Durante la titulación el color cambiara de color verde a un gris casi transparente. Registre el volumen utilizado de ácido.

Se debe correr blancos en duplicado donde se coloca igual cantidad de reactivos, inclusive hasta un trozo del papel utilizado para pesar las muestras. En algunos casos se recomienda utilizar como muestra lisina hidroclórica como patrón para realizar ajustes en los cálculos y verificar la confiabilidad del proceso.

Al volumen utilizado para titular la muestra se resta el volumen utilizado en el blanco y calcule el contenido porcentual de nitrógeno en la muestra.

24 En algunos casos se recomienda utilizar de 0.3 a 0.7 g para alimentos, 0.2 a 0.5 para suplementos y 10 ml para orina. 25 Se recomienda añadir 1.0 ml adicional de H2SO4 por cada 0.1 g de grasa o cada 0.2 g de material si la muestra es mayor a 1.0 g.


23

Para el cálculo de proteína cruda se multiplica el contenido de nitrógeno por el factor 6.25 o en su defecto el factor que más se adecua al tipo de material analizado, según se indicó con anterioridad.

Para el cálculo del contenido de nitrógeno o proteína cruda en base seca se debe realizar el siguiente ajuste: En el caso de utilizar muestras que no han sido secadas parcialmente, solo se debe utilizar en lugar de % de proteína parcialmente seca el valor obtenido directamente en el análisis y corregirlo por el contenido de materia seca a 105 °C.

(g) muestra la de Peso

HCl] de N x blanco) de HCl de ml - muestra de HCl de [(ml x 0.014 NITRÓGENO DE %

6.25 x NITRÓGENO DE %CRUDA PROTEÍNA DE %


SECA TEPARCIALMENPROTEÍNA DE %SECA BASE ENPROTEÍNA DE %


24

IX. DETERMINACIÓN DEL EXTRACTO ETÉREO Al utilizar algún tipo de solvente orgánico se espera que los compuestos grasos o lípidos se disuelvan y puedan ser removidos del material. No obstante, se conoce que otros compuestos, tales como ceras, aceites volátiles, clorofila y pigmentos, que no aportan mucha energía a la nutrición de los animales, también pueden ser extraídos con este procedimiento, por lo que de acuerdo a la cantidad presente de estos compuestos se puede sobreestimar el aporte energético de la fracción de lípidos del alimento evaluado. El método para la determinación de la fracción de lípidos se basa en la evaporación continua de un solvente orgánico, en muchos casos éter etílico, que luego de condensarse pasa por la muestra extrayendo los materiales solubles. El extracto se recoge en un recipiente y el éter se destila y recoge, dejando como residuo el extracto etéreo al cual se seca y se le determina el peso. Para el caso de algunas muestras que poseen grandes cantidades de compuestos solubles en agua, tales como carbohidratos, urea, ácido láctico, glicerol entre otros, se recomienda extraer cinco veces 2 g de la muestra con 20 ml de agua en un pequeño papel filtro y secarla, antes de la extracción.26 El método anterior es conocido como método directo, mientras que en el método indirecto el residuo se seca y se pesa, determinando el porcentaje de extracto etéreo como el peso perdido en la muestra. El análisis de extracto etéreo, dado el tipo de solvente que se utiliza, debe ser realizado en cámara extractora de gases y tener mucho cuidado con el uso de cualquier material o equipo que pueda provocar una combustión de manera accidental. A continuación, se indican los pasos que se deben seguir para la determinación del extracto etéreo por el método directo en la muestra:

PROCEDIMIENTO


Un vaso químico, de aproximadamente 100 ml, diseñado para el aparato Goldfisch que se muestra en la figura 8, se coloca en un horno a 105°C por espacio de dos horas como mínimo. Se deja enfriar en un desecador y se obtiene su peso con exactitud de 0.0001 g. P1

En el vaso químico se coloca de 30 a 40 ml del solvente orgánico que se va a utilizar. Se recomienda no utilizar solventes cuyo punto de ebullición exceda los 85 °C.

Para el caso del éter etílico este debe ser anhidro y libre de peróxidos27 o éter de petróleo.28

Se pesan cerca de 2.0 g de muestra con exactitud de 0.0001 g y se colocan en los dedales de extracción a base de celulosa. P3

Se puede colocar el dedal con la muestra en el horno a 105 °C por dos horas o secar una porción de la muestra a esta temperatura previa al análisis.

Coloque el dedal con la muestra dentro del extractor del sistema Goldfisch.

Conecte el vaso al sistema, y active el sistema de enfriamiento para la condensación del éter, eleve y encienda las hornillas. Las hornillas no necesariamente tienen que hacer contacto con el vaso químico.

Si se establece una tasa de condensación de cinco a seis gotas por segundo, el proceso puede tomar cerca de cuatro horas. Durante este periodo verifique constantemente el volumen de éter y si observa alguna disminución significativa por escape puede añadir, con mucho cuidado, una porción adicional de éter al vaso químico.

Luego de las cuatro horas, retire el calentador y permita que se seque el dedal. Deje que se enfríe.

Remueva la muestra con el dedal de celulosa y coloque el tubo de recolección de éter bajo el condensador. Coloque nuevamente el vaso químico y caliente nuevamente hasta que casi todo el éter se haya evaporado del vaso y recogido en el tubo colector.

26 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000. 27 Si no se posee éter anhidro, proceda de la siguiente manera: Lave el éter con dos o tres porciones de agua, y añada NaOH o KOH sólido. Deje reposar hasta que la mayor cantidad de agua sea removida del éter. Decante el éter a un envase totalmente seco y añada pequeñas piezas de Na metálico y deje en reposo hasta que cese la

liberación de hidrógeno. CUIDADO CON LA MANIPULACIÓN DEL SODIO METÁLICO. Guarde el éter de esta forma en botellas con las tapas ligeramente cerradas.

28 Se recomienda éter de petróleo con punto inicial de ebullición de 35 a 38 °C, gravedad específica a 15.5 °C de 0.630 – 0.660, residuo

luego de evaporación 0.002% y 95% destila a 54 °C.


25

Justo cuando todo el éter se ha casi evaporado, retire los calentadores y permita que se enfríen los vasos. Recoja el éter para un uso futuro.

Complete la evaporación del éter en la cámara extractora de gases a temperatura ambiente hasta que no se sientan los vapores de éter.

Una vez no se tengan residuos de éter en los vasos, coloque los vasos químicos con los residuos del extracto etéreo en el horno de aire caliente de convección forzada a 105 °C por 30 minutos, retírelos y colóquelos en un desecador. Déjelos enfriar y obtenga el peso del vaso más el residuo con una exactitud de 0.0001 g. P2

Estime el contenido de extracto etéreo.

Para el método indirecto, coloque el dedal con la muestra a secar y determine la pérdida de peso.

Peso (gramos)


P1. Peso del vaso químico vacío

P2. Peso del vaso químico mas el extracto etéreo

P3. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca

Para el cálculo del contenido de extracto etéreo en base seca se debe ajustar el valor obtenido con la muestra parcialmente seca con el siguiente ajuste:

En la figura 8 se muestra un esquema del instrumento utilizado para el análisis de extracto etéreo del tipo Goldfisch. En la parte inferior se observan las hornillas o calentadores que poseen los controles de temperatura, así como un sistema que permite ajustarlos verticalmente para ajustar el vaso que contiene el solvente utilizado para la extracción. En la parte superior se encuentra el sistema de enfriamiento de agua, que luego del ajuste del vaso permite la condensación continua del solvente que pasa a través de la muestra para el proceso de extracción de los lípidos u otro compuesto soluble en el solvente utilizado.

Figura 8. Instrumento para determinación de

extracto etéreo tipo Goldfisch.

Calentadores Vaso químico

Sistema de condensación


SECO TEPARCIALMEN ETÉREO EXTRACTO DE %SECA BASE EN ETÉREO EXTRACTO DE %

x100P

P -PETÉREO EXTRACTO DE PORCENTAJE

3

12


26

X. DETERMINACIÓN DE FIBRA Tal como se mencionara al inicio, la fibra ha sido uno de los componentes del tejido vegetal, en especial de los forrajes, que ha causado gran controversia tanto en su definición como en su determinación. Para la clasificación de los forrajes se utiliza un nivel de 18% de fibra para separar los forrajes de los concentrados o suplementos proteicos y los energéticos. No obstante, se conoce que alimentos con valores superiores de fibra, como el caso del ensilaje, son alimentos de alto valor energético, donde la fibra no es una limitante para su consumo y digestibilidad. Si se utiliza el método de análisis proximal o de Weende la fracción resultante identificada como fibra cruda no está constituida de manera uniforme por compuestos específicos, y se dan casos donde pueden retenerse o perderse compuestos que no son propiamente parte de la fibra del alimento. En términos generales se consideraba que la fibra formaba la mayor parte del material indigerible de los alimentos. Gran parte de esta fracción pasaba a través del tracto digestivo con muy pocas alteraciones químicas y su aporte a la nutrición del animal era mínimo o casi nulo. En muchos casos esto resultaba cierto para animales de estómago simple. No obstante, para animales de estómago compuesto o rumiantes, este principio no es valedero, puesto que las bacterias y otros organismos que están presentes en el retículo rumen de estos animales poseen enzimas capaces de degradar parte de los compuestos que conforman la fibra, tales como la celulosa y la hemicelulosa. En algunos casos, de animales herbívoros no rumiantes parte de la fibra puede ser digerida a nivel del ciego y colon, obteniéndose alguna utilidad de la misma. Dada esta discrepancia se desarrolló el método de análisis de fibra o de las paredes celulares de Van Soest. En este método, con el uso de soluciones detergentes, el forraje se divide en dos fracciones principales, el contenido celular (CC) y la pared celular (PC). De acuerdo con los científicos estas son unidades uniformes, donde el contenido celular, indistintamente del tipo de animal, es totalmente digerible y disponible para su digestión y absorción. En cambio, la pared celular se puede dividir en fracciones donde se pueden aislar e identificar de manera uniforme las fracciones digeribles y las indigeribles, tal como la lignocelulosa. El Dr. Abe ha diseñado un sistema de análisis donde por métodos enzimáticos, se separa la fracción digerible (Oa) y la no digerible (Ob). Para el caso de los humanos, la fracción fibrosa de los alimentos, determinada por el método de análisis proximal, conlleva otra serie de implicaciones, puesto que, como tal, la fibra ayuda a la eliminación de ciertos compuestos y elementos nocivos para la salud humana, y a la vez estimula los movimientos peristálticos facilitando el avance del material indigerible en la porción inferior del sistema digestivo. De esta manera, aunque no aporta beneficios nutritivos al organismo ayuda en la nutrición al eliminar sustancias no deseables. Un método que ha sido aprobado por la AOAC y que ha tenido aceptación en el análisis de la fibra, una vez se cuente con el equipo adecuado, es la determinación utilizando la Espectroscopia utilizando la reflexión de ondas del Infrarrojo cercano (NIRS)29. Con este método, además de poder determinar el contenido de humedad de la muestra, se pueden determinar una serie de componentes de los alimentos. Se ha considerado que para el caso de la fibra se obtienen valores con alta precisión y alta correlación con los métodos de análisis químicos30. A continuación, se indicarán tres de los procedimientos que se utilizan para la determinación de la fibra y parte de sus componentes en los forrajes.

A. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA CRUDA Este análisis corresponde al método proximal o de Weende. Se basa en la digestión de la muestra en soluciones ácidas y básicas, donde el peso perdido de la muestra luego de la incineración del residuo se considera la fibra cruda. Este método también ha sufrido una serie de modificaciones con el tiempo, en especial lo que respecta al instrumental utilizado. Muchos lo consideran muy inexacto por la manipulación de la muestra y además su poca uniformidad en los resultados. La muestra a utilizar debe ser una muestra libre o con muy poco contenido de lípidos. Tal como se indicó con anterioridad, el proceso trata de simular el proceso digestivo de los forrajes en el tracto de los animales. En este procedimiento no deben utilizarse

muestras que han sido secadas en horno a temperatura 60 °C.

29 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000. 30 Japan Livestock Technology Association. Technical Manual for Feed analysis. S. Tanabe, Ed., March, 2000.


27

REACTIVOS:

Ácido Sulfúrico al 1.25%: Se utiliza una solución de ácido sulfúrico 0.128 ± 0.003 M. Esto se logra disolviendo 1.25 g de H2SO4 concentrado en 100 ml de agua. La concentración debe verificarse por titulación.

Hidróxido de sodio al 1.25%: Se utiliza una solución de hidróxido de sodio 0.313 ± 0.005 M. Esto se logra disolviendo 1.25 g de NaOH en 100 ml de agua. Se debe verificar la concentración por titulación.

Alcohol: Se utiliza alcohol etílico al 95% grado reactivo, así como metanol o propanol.

Solución limpiadora31: Cuando se utilizan crisoles porosos para la filtración es conveniente que periódicamente sean sometidos a una limpieza, dado que partículas de la muestra pueden obstruir parcialmente los poros. La solución se prepara mezclando: Solución ácida: Disolver volúmenes iguales de ácido clorhídrico concentrado y agua. Solución alcalina: Disolver 5 g de Na2H2EDTA, 50 g de Na2HPO4 y 200 g de KOH en agua hasta

completar un litro. Mantenga las soluciones en recipientes de boca ancha con capacidad para dos a tres litros donde

puedan sumergirse y mantener los crisoles.

Agente antiespumante: Se puede utilizar alcohol amílico u otra solución comercial con esta propiedad.

PROCEDIMIENTO


Se puede utilizar para este procedimiento la muestra proveniente de la determinación del extracto etéreo, según procedimiento detallado con anterioridad, o la muestra parcialmente seca.

Coloque en el horno de convección forzada de aire caliente a 105 °C por espacio de cuatro horas un crisol de porcelana tipo Gooch con fondo poroso de 40 a 50 ml de capacidad32. Retire del horno y deje enfriar en un desecador.

En un sistema de filtración por succión coloque un embudo tipo Büchner33 con una malla de 200 mesh que selle completamente el área de filtración.34

Coloque en el vaso químico tipo Berzelius con capacidad de 600 ml aproximadamente 2.0 g de muestra pesada con exactitud de 0.0001 g. P3

Caliente la solución de H2SO4 al 1.25% hasta punto de ebullición y transfiera, con la ayuda de guantes de asbesto y mucho cuidado, 200 ml al vaso químico Berzelius que contiene la muestra, asegurándose que toda la muestra quede humedecida y no se adhiera a las paredes.

Mantenga en punto de ebullición aproximadamente un litro de agua destilada.

Se puede añadir al vaso químico una solución antiespumante, como ejemplo una a dos gotas de alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes.

Proceda a colocar el vaso sobre las hornillas, encienda el sistema de condensación y enfriamiento de agua, y encienda las hornillas. La temperatura debe ser ajustada de manera que se pueda llevar desde 25 °C hasta punto de ebullición 200 ml de agua en 15 ± 2 minutos. Luego mantenga la temperatura de manera que se logre una ebullición estable, pero leve sin formación de mucha espuma

Para el caso de varias muestras, se recomienda colocar los vasos a intervalos de cinco minutos. Permita que la solución se mantenga en ebullición durante 30 minutos. Periódicamente rote los vasos de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso de que

31 Para el lavado de los crisoles, se sumergen inicialmente por espacio de 5 minutos en la solución alcalina, lavar con agua caliente,

a continuación, sumerja los crisoles en la solución ácida por espacio de 5 minutos, lave con agua caliente y finalmente con agua destilada caliente. Luego de haber utilizado los crisoles en tres a cuatro determinaciones, lávelos invertidos con agua cerca del punto de ebullición.

32 Una de las alternativas utilizadas para filtrar es utilizar paños de tela, tipo manta sucia. En este caso, luego de la filtración con ayuda de una espátula se “raspa” el material y se transfiere nuevamente al vaso químico Berzelius para la segunda digestión con la solución de NaOH.

33 La AOAC ha propuesto el uso de un embudo tipo Büchner tipo California de plástico de dos piezas, al cual se le coloca una malla de 200 mesh que selle totalmente el área de filtración.

34 Para el caso de materiales extremadamente finos se sugiere que se selle la malla utilizando una mezcla de 60 a 75 ml de HsSO4 al 1.25% con 1.5 g de fibra de cerámica, la cual ha sido previamente mezclada con agua (mezcla de 60 g de fibra con 800 ml de agua licuada por un minuto a baja revolución)


28

parte de la muestra se adhiera a las paredes, con una botella lavadora que contiene solución de H2SO4 al 1.25 % caliente, lave con cuidado las paredes hasta que toda la muestra permanezca en solución.

Cuando se está terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el embudo Büchner, encienda el sistema de succión de manera que se alcance una presión de succión de 25 mm aproximadamente.

Retire el vaso de la hornilla, con cuidado utilizando guantes de asbesto, decante el líquido sobrenadante sobre el embudo y lave el residuo del vaso utilizando el mínimo de agua caliente, con ayuda de una botella lavadora. Filtre hasta que este seco, y luego proceda a lavar el residuo de cuatro a cinco veces con aproximadamente 40 a 50 ml de agua caliente, cercana al punto de ebullición. Al adicionar el agua de lavado no aplique succión. Este proceso deberá eliminar la mayor cantidad de residuo ácido de la muestra.

Trasvase el residuo del filtro hacia el vaso químico Berzelius utilizando solución a punto de ebullición de NaOH al 1.25%. Luego de lavar el filtro, añada suficiente solución de NaOH al 1.25% para completar aproximadamente 200 ml. Coloque los vasos a intervalos de cinco minutos y proceda a mantener la solución en ebullición por espacio de 30 minutos.

Se puede añadir al vaso químico una solución antiespumante, como ejemplo una a dos gotas de alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes. También se pueden utilizar las denominadas perlas de ebullición para evitar el sobrecalentamiento y ebullición brusca de la solución.

Periódicamente rote los vasos de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso de que parte de la muestra se adhiera a las paredes, con una botella lavadora que contiene solución de NaOH al 1.25 % caliente, lave con cuidado las paredes hasta que toda la muestra permanezca en solución.

Cuando se está terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el crisol tipo Gooch, encienda el sistema de succión de manera que se alcance una presión de succión de 25 mm aproximadamente.

Retire el vaso de la hornilla, con cuidado utilizando guantes de asbesto, decante el líquido sobrenadante sobre el crisol tipo Gooch y lave el residuo del vaso utilizando el mínimo de agua caliente, con ayuda de una botella lavadora.

Eleve el nivel de vacío y proceda a lavar el residuo una sola vez con aproximadamente 25 a 30 ml de la solución de H2SO4 al 1.25% cercana al punto de ebullición, y posteriormente dos veces con aproximadamente 25 a 30 ml de agua caliente, cercana al punto de ebullición. Al adicionar el agua de lavado no aplique succión. Filtre hasta sequedad. En algunos casos se recomienda lavar una vez con alcohol y luego proceder a secar la muestra.

Coloque el crisol con el residuo en un horno de convección forzada de aire caliente a una temperatura de 110° C durante la noche. Luego de este periodo colóquelos en un desecador para enfriarlos y pese con exactitud de 0.0001 g. P2

Posteriormente coloque el crisol en un incinerador, cuya temperatura máxima sea de 550 °C ± 10 °C, por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo y posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. P1

Se recomienda procesar al menos dos blancos por cada 24 muestras analizadas.

Determine el contenido de fibra cruda.

Peso (gramos)


P1. Peso del crisol tipo Gooch mas cenizas

P2. Peso del crisol tipo Gooch mas residuo

P3. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca

Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste la pérdida promedio de peso (B) obtenida luego del secado e incinerado de los crisoles con los blancos a la pérdida de peso de la muestra analizada.

x100P

B)P -(PCRUDAFIBRA DE PORCENTAJE

3

12


29

Para el cálculo del contenido de fibra cruda en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

En la figura 9 se muestra el diagrama del instrumento utilizado, de manera general, para la determinación de fibra cruda. Se basa en el mismo principio del instrumento utilizado para el análisis de extracto etéreo, con la diferencia que la muestra se encuentra en constante contacto con la solución del detergente que se encuentra en ebullición. Este equipo se utiliza igualmente para la determinación de la fibra neutro (FDN) y detergente ácido (FDA) del método de análisis de fibra según Van Soest, así como para cualquier otro tipo de determinación en la que se requiera mantener una solución en ebullición y reflujo, minimizando la pérdida de la solución. En la actualidad se han ideado otros sistemas para la digestión donde se minimiza la manipulación de la muestra. En un esquema cerrado, luego de colocar la muestra, la adición sucesiva de la

solución ácida y la alcalina, así como los lavados intermedios y finales con agua ocurren de manera automatizada. B. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO (FDN) O CONSTITUYENTES DE LA PARED CELULAR. Según el método de análisis de la fibra propuesto por Van Soest, el tratamiento del forraje o material vegetal con una solución neutro detergente, permite que todo el contenido celular del material se extraiga y el residuo de la digestión lo constituya la pared celular. En este contexto, el residuo lo componen la celulosa, la hemicelulosa, la lignina, así como otros compuestos que se

encuentran ligados a la pared celular, entre los que se incluye parte de los compuestos nitrogenados, que en algunos casos son proteínas y algunos minerales. La fracción orgánica es conocida como fibra detergente neutro. El procedimiento se puede utilizar en la mayoría de los forrajes, no obstante, cuando la muestra tiene alto contenido de almidón, tales como concentrados, ensilaje de maíz y heces, se recomienda modificar el proceso utilizando una amilasa para facilitar la filtración durante el análisis. El almidón puede quedarse como parte del residuo por lo que se puede sobreestimar el contenido de fibra. A continuación, se indicarán los reactivos y procedimientos para el método simple y en el que utiliza amilasa. En este procedimiento no

deben utilizarse muestras que han sido secadas en horno a temperatura 60 °C.

REACTIVOS:

Solución Detergente Neutro: Mezcle 540 g de sulfato sódico de lauril35, 335 g de EDTA disódico, 123

g de borato sódico (Na2B4O710H2O) hasta un volumen de 10 litros de agua destilada. Asegúrese que todo se ha disuelto. En un litro de agua destilada disuelva 82 g de fosfato sódico dibásico (Na2HPO4) y mezcle las soluciones. Luego añada a esta solución 180 ml de éter monoetil etilen glicol y lleve hasta un volumen final de 18 litros con agua destilada. El sulfato sódico de lauril se precipita a bajas

35 Se puede reemplazar por detergente Orvus. Utilice 100 ml de la solución de Orvus por cada litro de solución detergente neutro. Para

los 18 litros se deben utilizar 1800 ml de Orvus. Esta solución debe calentarse hasta que este clara y luego la añade al resto de la solución. Al momento de utilizar la solución detergente neutro se hace necesario mantenerla tibia para que todos los ingredientes se mantengan en solución. No utilice la solución neutro detergente si esta turbia.


SECA TEPARCIALMENCRUDA FIBRA DE %SECA BASE ENCRUDA FIBRA DE %

Vaso químico tipo Berzelius Hornillas eléctricas

Sistema de enfriamiento de agua

Figura 9. Instrumento para determinación de fibra cruda.


30

temperaturas por lo que la solución debe calentarse con agitación hasta que esté todo disuelto y totalmente transparente.

Solución de amilasa: (a) Disuelva 2 g de la enzima en 90 ml de agua y filtre la solución resultante a través de un filtro

#541 y añada a la solución 10 ml de éter monoetil etilen glicol. Guarde la solución en refrigeración a 5 °C. La enzima es obtenida del Bacillus subtilis, es de tipo III y con actividad óptima a pH 6.9 y 80 °C.

(b) Prepare una solución amortiguadora de ácido fosfórico disolviendo 60.4 g de KH2PO4 y 19.9 g

de Na2HPO412H2O en agua destilada hasta cinco litros de solución. Ajuste el pH a 5.8. Disuelva 1

mg de -amilasa en 20 ml de solución amortiguadora de ácido fosfórico inmediatamente antes de ser utilizada.

Agente antiespumante: Se puede utilizar alcohol amílico u otra solución comercial con esta propiedad. Un agente conocido es Decalin o decahidronaftaleno.




Acetona: Utilice acetona grado reactivo.

Papel filtro #410

PROCEDIMIENTO


Coloque en el horno de convección forzada de aire caliente a 105 °C por espacio mayor de cuatro horas un crisol de porcelana tipo Gooch con fondo poroso de 40 a 50 ml de capacidad. Retire del horno, deje enfriar en un desecador y pese con exactitud de 0.0001 g. Esto es necesario si el residuo será utilizado para la determinación de fibra ácido detergente. Si solo es para fibra detergente neutro se puede utilizar papel filtro #410 y un sistema de filtración con embudos unidos a un sistema de succión El papel filtro debe ser colocado igualmente en un horno a 105 °C por espacio de cuatro horas. Terminado el periodo de secado colóquelo en un desecador para enfriarlo y péselo con exactitud de 0.0001 g. Para este procedimiento se deberá igualmente secar un crisol y pesarlo con exactitud de 0.0001 g. P3

Coloque en el vaso químico tipo Berzelius con capacidad de 600 ml aproximadamente 1.0 g de muestra pesada con exactitud de 0.0001 g. P6

Transfiera 100 ml de la solución detergente neutro al vaso químico Berzelius que contiene la muestra, asegurándose que toda la muestra quede humedecida y no se adhiera a las paredes.


Se puede añadir al vaso químico una solución antiespumante, como ejemplo una a dos gotas de alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes como el Decalin.

Proceda a colocar el vaso sobre las hornillas, encienda el sistema de condensación y enfriamiento de agua, y encienda las hornillas. La temperatura debe ser ajustada de manera que se pueda llegar al punto de ebullición rápidamente, esto es elevar de 25 °C a ebullición 100 ml de agua en 4 a 5 minutos. Luego mantenga la temperatura de manera que se logre una ebullición estable, pero leve. Esto debe permitir el movimiento significativo de las partículas en el vaso sin formación de mucha espuma.

Para el caso de varias muestras, se recomienda colocar los vasos a intervalos de cinco minutos. Permita que la solución se mantenga en ebullición durante una hora. Periódicamente rote los vasos de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso de que parte de la muestra se adhiera a las paredes o al bulbo de condensación, con una botella lavadora

36 Para el lavado de los crisoles, se sumergen inicialmente por espacio de 5 minutos en la solución alcalina, lavar con agua caliente,



31

que contiene solución neutro detergente, lave con cuidado hasta que toda la muestra permanezca en solución. Con muestras con alto contenido de almidón, agregue inicialmente 50 ml de la solución detergente

neutro al vaso con la muestra y lleve a ebullición. Luego de 30 minutos, desde el comienzo de la ebullición, agregue otros 50 ml de la solución detergente neutro y 2 ml de la solución enzimática (a). Coloque nuevamente el vaso sobre la hornilla y lleve a ebullición por espacio de 30 minutos adicionales. No puede utilizar el sistema de papel de filtro en este procedimiento.

Una modificación a este procedimiento implica lo siguiente: en un erlenmeyer con capacidad para 100 ml agregue 20 ml de agua junto con un gramo de muestra pesada con exactitud de 0.0001 g. Caliente la mezcla de manera que el almidón se gelatinice, la cual debe completarse una vez la

solución alcanza el punto de ebullición. Luego de enfriar, añada los 20 ml de la solución de -amilasa (b) y mantenga en agitación por 16 horas a temperatura de 40 °C. Finalizada la hidrólisis filtre en papel N°5 y lave completamente con agua destilada de tres a cuatro veces. Transfiera el residuo al vaso químico Berzelius utilizando el mínimo de solución detergente neutro.

Cuando se está terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el crisol o embudo con el papel filtro, encienda el sistema de succión con una presión leve.

Al término del tiempo de reflujo, lave toda la muestra que pueda estar adherida al bulbo de reflujo y toda aquella que se encuentra en las paredes del vaso. Retire el vaso de la hornilla, con cuidado utilizando guantes de asbesto, decante el líquido sobrenadante sobre el embudo y lave el residuo del vaso utilizando el mínimo de agua caliente, con ayuda de una botella lavadora. Maximice la presión de succión, y luego proceda a lavar el residuo de cuatro a cinco veces con aproximadamente 40 a 50 ml de agua caliente, cercana al punto de ebullición, esto debe remover los residuos de la solución detergente neutro.37 Si se dan problemas en la filtración con las muestras de alto contenido de almidón, añada de uno

a dos mililitros adicionales de solución enzimática al residuo, así como 30 ml de agua caliente, con temperatura aproximada de 80 °C. Deje reposar por 10 a 15 minutos. Encienda la succión nuevamente. Proceda a lavar con agua caliente dos a tres veces.

Proceda a lavar tres o cuatro veces con acetona y filtre hasta a secar la muestra. Asegúrese que en la muestra no se sientan vapores de acetona.

Coloque el crisol o el papel filtro con el residuo en un horno de convección forzada de aire caliente a una temperatura de 105° C durante la noche. Luego de este periodo colóquelos en un desecador para enfriarlos y pese con exactitud de 0.0001 g. P1

Posteriormente coloque el crisol o el papel de filtro en un crisol de porcelana, en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 550 °C ± 10 °C, por espacio de dos horas.38 Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo y posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. P2

Determine el contenido de fibra detergente neutro por la pérdida de peso.

Se recomienda procesar al menos dos blancos por cada 24 muestras analizadas, en especial cuando se utiliza el método con la solución enzimática y con papel filtro.

Peso (gramos)


P1. Peso del crisol o papel filtro mas residuo

P2. Peso del crisol mas cenizas

P3 Peso del crisol o papel solo.

P4 Peso del residuo (P1 – P3)

P5 Peso de las cenizas (P2 – P3)*

P6. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca * Para el caso del procedimiento donde se utilizó papel filtro, el peso del crisol corresponde al peso del crisol utilizado para la

incineración.

37 En algunos casos es recomendable cerrar el vacío y permitir que repose por tres a cinco minutos el agua caliente en el crisol, y con

ayuda de una varilla de vidrio agite y rompa la capa de material del fondo del crisol, y vuelva a aplicar succión. 38 Para el caso de utilizar papel de filtro se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente

hasta que deje de emanar humo y luego se transfiere al incinerador. Esto aumenta la manipulación de la muestra y puede aumentar el grado de error.


32

Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste el promedio de peso (B) obtenido luego del secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de los residuos y cenizas de la muestra analizada.

Para el cálculo del contenido de fibra detergente neutro en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

En la figura 9 se muestra el diagrama del instrumento utilizado, de manera general, para la determinación de la fibra detergente neutro (FDN), como se observa es similar o es el mismo utilizado para la determinación de fibra cruda y fibra detergente ácido (FDA) del método de análisis de fibra según Van Soest, así como para cualquier otro tipo de determinación en la que se requiera mantener una solución en ebullición y reflujo, minimizando la pérdida de la solución.

C. DETERMINACIÓN DE LA FIBRA DETERGENTE ÁCIDO (FDA). Por este procedimiento, la fracción menos digerible de la pared celular, la cual está compuesta principalmente de celulosa, hemicelulosa, lignina, parte de las proteínas ligadas a la pared celular y la sílice, se separa del contenido celular, que se estima es alta y completamente disponible a los animales. Este procedimiento utiliza un detergente catiónico en una solución de H2SO4 que disuelve o remueve los carbohidratos lábiles, proteína que no está ligada por la reacción de Maillard y lípidos. Se da una limitación en la acción de la solución detergente ácido cuando la muestra posee un contenido de lípidos superior al 5%, por lo que se recomienda la extracción de la muestra cuando se excede este porcentaje. Este procedimiento puede repetirse con mayor facilidad que el método de fibra cruda, además que aísla una fracción que básicamente es utilizada con poca eficiencia por los animales. Con este procedimiento, casi toda la hemicelulosa es hidrolizada, aunque la fracción cristalina de la celulosa no lo es. Adicionalmente, la lignina, presente en esta fracción, no es digerida, por lo que la fracción la constituye lo que se conoce como lignocelulosa. En esta fracción queda retenida igualmente proteína ligada y sílice. La proteína ligada es aquella que en el caso de productos vegetales y de origen animal se ha dañado por efecto del calor al cual fue sometido el producto durante su procesamiento. De esta manera la fracción orgánica es identificada como la fibra detergente ácido. Esta fracción puede posteriormente ser digerida para identificar el contenido de cada uno de sus componentes, a saber, celulosa, lignina y sílice. En este

procedimiento no deben utilizarse muestras que han sido secadas en horno a temperatura 60 °C.

REACTIVOS:

Solución Detergente Ácido: Mezcle 504 ml de H2SO439 en 10 litros de agua destilada y añada

posteriormente 360 g de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). Finalmente lleve la solución hasta 18 litros.

Agente antiespumante: Se puede utilizar alcohol amílico u otra solución comercial con esta propiedad. Un agente conocido es Decalin o decahidronaftaleno.

Solución limpiadora40: Cuando se utilizan crisoles porosos para la filtración es conveniente que periódicamente sean sometidos a una limpieza, dado que partículas de la muestra pueden obstruir parcialmente los poros. La solución se prepara mezclando:

39 H2SO4 con gravedad específica 1.634 a 20 °C o 12.0 M. 40 Para el lavado de los crisoles, se sumergen inicialmente por espacio de 5 minutos en la solución alcalina, lavar con agua caliente,



SECA TEPARCIALMEN FDN DE %SECA BASE EN FDN DE %

x100P

)B -(P- )B -(PNEUTRO DETERGENTEFIBRA DE PORCENTAJE

6

cenizas5residuo4


33

Solución ácida: Disolver volúmenes iguales de ácido clorhídrico concentrado y agua. Solución alcalina: Disolver 5 g de Na2H2EDTA, 50 g de Na2HPO4 y 200 g de KOH en agua hasta




Papel filtro #410 o #54141

PROCEDIMIENTO


Coloque en el horno de convección forzada de aire caliente a 105 °C por espacio mayor de cuatro horas un crisol de porcelana tipo Gooch con fondo poroso de 40 a 50 ml de capacidad.42 Retire del horno, deje enfriar en un desecador y registre su peso con exactitud de 0.0001 g. Se puede utilizar papel filtro #410 o #541 y un sistema de filtración con embudos unidos a un sistema de succión. El papel filtro debe ser colocado igualmente en un horno a 105 °C por espacio de cuatro horas. Terminado el periodo de secado colóquelo en un desecador para enfriarlo y péselo con exactitud de 0.0001 g. Para este procedimiento se deberá igualmente secar un crisol y pesarlo con exactitud de 0.0001 g. P3

Coloque en el vaso químico tipo Berzelius con capacidad de 600 ml aproximadamente 1.0 g de muestra pesada con exactitud de 0.0001 g.43P6

Transfiera 100 ml de la solución detergente ácido al vaso químico Berzelius que contiene la muestra, asegurándose que toda la muestra quede humedecida y no se adhiera a las paredes.


Se puede añadir al vaso químico una solución antiespumante, como ejemplo una a dos gotas de alcohol amílico o cualquier otro producto comercial con propiedades antiespumantes como el Decalin.

Proceda a colocar el vaso sobre las hornillas, encienda el sistema de condensación y enfriamiento de agua, y encienda las hornillas. La temperatura debe ser ajustada de manera que se pueda llegar al punto de ebullición rápidamente, esto es elevar de 25 °C a ebullición 100 ml de agua en 4 a 5 minutos. Luego mantenga la temperatura de manera que se logre una ebullición estable, pero leve. Esto debe permitir el movimiento significativo de las partículas en el vaso sin formación de mucha espuma.

Para el caso de varias muestras, se recomienda colocar los vasos a intervalos de cinco minutos. Permita que la solución se mantenga en ebullición durante una hora. Periódicamente rote los vasos de manera que la muestra no se adhiera a las paredes, y se mantenga en solución. En caso de que parte de la muestra se adhiera a las paredes o al bulbo de condensación, con una botella lavadora que contiene solución ácido detergente, lave con cuidado hasta que toda la muestra permanezca en solución.

Cuando se está terminando el periodo de reflujo, pase agua caliente por el embudo, encienda el sistema de succión con una presión leve.

Al término del tiempo de reflujo, lave toda la muestra que pueda estar adherida al bulbo de reflujo y toda aquella que se encuentra en las paredes del vaso. Retire el vaso de la hornilla, con cuidado utilizando guantes de asbesto, decante el líquido sobrenadante sobre el embudo y lave el residuo del vaso utilizando agua caliente, con ayuda de una botella lavadora. Maximice la presión de succión, y luego proceda a lavar el residuo de cuatro a cinco veces con aproximadamente 40 a 50 ml de agua caliente, cercana al punto de ebullición, esto debe remover los residuos de la solución detergente ácido.

Proceda a lavar tres o cuatro veces con 30 a 40 ml de acetona y filtre hasta a secar la muestra. Durante los lavados con acetona deje reposar de tres a cinco minutos antes de aplicar la succión, en los últimos lavados el filtrado debe ser incoloro. Asegúrese que en la muestra no se sientan vapores de acetona luego del último filtrado.

41 Papel filtro #541 debe ser utilizado si se desea determinar contenido de nitrógeno en la fibra detergente ácido. 42 El crisol con filtro poroso se utiliza si se desea determinar el contenido de lignina en la fibra detergente ácido. 43 Muestras con un contenido de lípidos > 5% deben ser procesadas con acetona, éter etílico o éter de petróleo. En este procedimiento

puede colocarse la muestra pesada con exactitud de 0.0001 g en el crisol de fondo poroso que será utilizado para la determinación de fibra detergente ácido. Agregue cuatro veces cerca de 30 a 40 ml de acetona, dejando reposar por cerca de tres a cinco minutos cada vez y filtrando por succión. Seque al aire por 10 a 15 minutos y transfiera el residuo al vaso químico Berzelius para proceder al análisis.


34

Coloque el crisol o el papel filtro con el residuo en un horno de convección forzada de aire caliente a una temperatura de 105° C durante la noche. Luego de este periodo colóquelos en un desecador para enfriarlos y pese con exactitud de 0.0001 g. P1

Determine el contenido de fibra detergente ácido. Como alternativa se puede llevar el residuo a incineración y se estima el contenido de fibra detergente neutro por la pérdida de peso como se detalla a continuación.

Coloque el crisol o el papel de filtro en un crisol de porcelana, en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 550 °C ± 10 °C, por espacio de dos horas.44 Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo y posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. P2

Determine el contenido de fibra detergente ácido por la pérdida de peso.

Se recomienda procesar al menos dos blancos por cada 24 muestras analizadas, en especial cuando se utiliza el método con papel filtro.

Peso (gramos)


P1. Peso del crisol o papel filtro mas residuo


P3 Peso del crisol o papel solo.

P4 Peso del residuo (P1 – P3)


P6. Peso de la muestra fresca o parcialmente seca * Para el caso del procedimiento donde se utilizó papel filtro, el peso del crisol corresponde al peso del crisol utilizado para la

incineración. Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste el promedio de peso (B) obtenido luego del secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de los residuos y cenizas de la muestra analizada.

Para el cálculo del contenido de fibra detergente ácido en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

En la figura 9 se muestra el diagrama del instrumento utilizado, de manera general, para la determinación de la fibra detergente ácido (FDA), como se observa es similar o es el mismo utilizado para la determinación de fibra cruda y fibra detergente neutro (FDN) del método de análisis de fibra según Van Soest, así como para cualquier otro tipo de determinación en la que se requiera mantener una solución en ebullición y reflujo, minimizando la pérdida de la solución. En este procedimiento se asume que, luego de la incineración del residuo, las cenizas corresponden al contenido de sílice, por lo que se puede aplicar el siguiente procedimiento y ecuaciones para determinar el contenido de sílice de la muestra. Esta determinación no se puede realizar si se desea obtener el contenido de lignina de la muestra, puesto que, para este caso, el residuo del análisis de la Fibra Detergente Ácido se tratará posteriormente, con una solución de H2SO4 o KMnO4 para eliminar la lignina, quedando como residuo la celulosa.

44 Para el caso de utilizar papel de filtro se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente


x100P

)B -(P- )B -(P ÁCIDODETERGENTEFIBRA DE PORCENTAJE

6

cenizas5residuo4


SECA TEPARCIALMENFDA DE %SECA BASE ENFDA DE %


35

Peso (gramos)



P3. Peso del crisol solo.


P6 Peso de la muestra fresca o parcialmente seca * Para el caso del procedimiento donde se utilizó papel filtro, el peso del crisol corresponde al peso del crisol utilizado para la

incineración. Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste el promedio de peso (B) obtenido luego del secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de las cenizas de la muestra analizada.

Para el cálculo del contenido de sílice en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

D. DETERMINACIÓN DE FIBRA POR ANÁLISIS ENZIMÁTICO45 La utilización de enzimas ha sido propuesta como método analítico para tratar de simular el tipo de reacción que ocurre en el tracto digestivo de los animales. Existen una diversidad de métodos y enzimas que han sido utilizadas para este propósito, no obstante, son muy pocos los análisis que han logrado una estandarización, no solo dentro de un laboratorio, sino entre distintos laboratorios. Es un método complejo que requiere de mucho cuidado en la manipulación de las enzimas y la determinación del grado de actividad de la misma, si se desea lograr una buena exactitud y repetibilidad en el análisis. Como se mencionara anteriormente, recientemente se ha propuesto un método enzimático, que está siendo aceptado por diversos laboratorios y presenta cierto grado de facilidad y repetibilidad entre muestras. En este procedimiento la muestra es sometida a una digestión enzimática donde se separa el contenido celular (CC) de la pared celular (PC). Adicionalmente, la fracción determinada como pared celular se somete a una segunda digestión enzimática donde se obtienen dos fracciones: fibra altamente digerible (Oa) y la fibra de baja digestibilidad (Ob).

REACTIVOS:

Solución de -amilasa en amortiguador de ácido fosfórico: Prepare una solución amortiguadora

de ácido fosfórico disolviendo 60.4 g de KH2PO4 y 19.9 g de Na2HPO412H2O en agua destilada hasta

cinco litros de solución. Ajuste el pH a 5.8. Disuelva 1 mg de -amilasa en 20 ml de solución amortiguadora de ácido fosfórico y finalmente añada 5 ml de la solución de acetato de calcio por cada litro de solución inmediatamente antes de ser utilizada.

Solución de acetato de calcio: Disuelva 7.0 g de Ca(CH3COO)23H2O en agua destilada hasta un litro de solución.

Solución de proteasa: Prepare una solución amortiguadora de fosfato mezclando 9.0 g de KH2PO4 y

95.4 g de Na2HPO412H2O en agua destilada hasta cinco litros de solución. Ajuste el pH a 7.4. Añada posteriormente proteasa46 en una relación de 0.02% (peso/peso) a la solución amortiguadora que se le ha agregado solución de acetato de calcio en una relación de 5 ml por litro de solución.

Solución de celulasa: Prepare una solución amortiguadora de acetato disolviendo 12.9 g de

Ca(CH3COO)23H2O en agua destilada a la cual se ha añadido con anterioridad 24.3 g de ácido acético

45 Adaptado de Japan Livestock Technology Association, Technical Manual for Feed Analysis. S. Tanabe, Ed., March, 2000. 46 Proteasa conocida comercialmente como Actinasa E.

x100

6P

)cenizasB -4(PSÍLICE DE PORCENTAJE

100 xC

o105SECA A MATERIA DE %

SECA TEPARCIALMEN SÍLICE DE %SECA BASE EN SÍLICE DE %


36

(CH3COOH) y se lleva la solución hasta cinco litros. Ajuste el pH a 4.0. Disuelva celulasa47 a razón de 1% peso por peso.

Solución de -amilasa en amortiguador de acetato: Prepare una solución amortiguadora de acetato

disolviendo 63.2 g de Ca(CH3COO)23H2O en agua destilada a la cual se ha añadido con anterioridad 2.1 g de ácido acético (CH3COOH) y se lleva la solución hasta cinco litros. Ajuste el pH a 5.8.

Solución de -amilasa/celulasa: Disuelva 1 mg de -amilasa y 8 mg de celulasa en 20 ml de la solución amortiguadora de acetato, añadiendo solución de acetato de calcio a razón de 5 ml por litro de solución.





Papel filtro N°5A

PROCEDIMIENTO

1. Determinación del contenido orgánico de la pared celular (OCW)


Coloque 0.5 g de muestra con exactitud de 0.0001 g en un vial con capacidad de 50 ml con tapa de rosca junto con 20 ml de agua destilada. P7

Caliente el vial junto con la mezcla en una hornilla de manera que se gelatinice el almidón presente en la muestra. Esto se completa cuando la solución llega al punto de ebullición.

Deje reposar y enfriar. Añada 20 ml de la solución de -amilasa en solución amortiguadora de fosfato. Cierre el vial y verifique que no se pueda derramar la solución.

Coloque el vial en agitación a 40 °C por espacio de 16 horas para que ocurra la hidrólisis del almidón.

Luego de terminado el periodo, lave el contenido del vial con agua destilada en un vaso químico con capacidad para 300 ml y lleve el volumen hasta los 300 ml con agua destilada y deje reposar

por un periodo de tres horas.

Decante el filtrado sobre un embudo con papel filtro N°5 y proceda a filtrar la solución bajo succión. Lave de tres a cuatro veces el residuo con agua destilada.

Pase el residuo del papel filtro hacia el vial utilizado con anterioridad, lavando el papel filtro con el mínimo de la solución de proteasa, para lo que puede utilizar una botella lavadora. Llene el vial con la solución de proteasa. Cierre el vial y verifique que no se pueda derramar la solución.

Coloque el vial en agitación a 40 °C por espacio de 16 horas para que ocurra la digestión de la proteína.

Decante el filtrado sobre un embudo con papel filtro N°5, que ha sido previamente secado y pesado con exactitud de 0.0001 g (P4), y proceda a filtrar la solución bajo succión. Lave de tres a cuatro veces el residuo con agua destilada. Finalmente lave con porciones de acetona por lo menos tres veces y deje secar el residuo a temperatura ambiente.

Cuando no se sientan vapores de acetona en la muestra, lleve el papel filtro a un horno de convección de aire forzado a temperatura de 135 °C por espacio de dos horas. Retire y deje enfriar en un desecador por espacio de 30 minutos y pese con exactitud de 0.0001 g. P3

Coloque el papel de filtro en un crisol de porcelana, que ha sido previamente secado y pesado con exactitud de 0.0001 g, (P2) en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 600 °C ± 10 °C, por

47 Celulasa conocida comercialmente como Celulasa P1500 para análisis de alimentos. 48 Para el lavado de los crisoles, se sumergen inicialmente por espacio de 5 minutos en la solución alcalina, lavar con agua caliente,



37

espacio de dos horas.49 Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo, por espacio de 60 minutos, y posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. Determine el contenido orgánico de la pared celular (OCW) por la pérdida de peso.

Peso (gramos)




P3. Peso del papel filtro más residuo.

P4. Peso del papel filtro solo.

P5. Peso del residuo (P3 – P4).


P7 Peso de la muestra fresca o parcialmente seca

Para el cálculo del contenido del contenido de pared celular orgánica en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

Para la determinación de la fracción orgánica de baja digestibilidad identificada como Ob, se procede a utilizar el residuo proveniente de la determinación de la fracción orgánica de la pared celular u OCW. Este procedimiento se aplica a aquellas muestras donde el residuo de contenido de pared celular es de aproximadamente 0.3 g. De esta manera, antes de que se proceda a lavar con acetona el residuo luego de la digestión con la solución de proteasa se procesa el residuo con la solución de celulasa.

PROCEDIMIENTO

2. Determinación de la fracción orgánica de baja digestibilidad de la pared celular (Ob).


Si requiere determinar la fracción Ob con una nueva muestra, calcule la cantidad de muestra a utilizar mediante la siguiente relación [0.3/(Peso del residuo/Peso de la muestra)]. Pese la cantidad a utilizar con exactitud de 0.0001 g (P7). Si va a utilizar el residuo de la determinación de OCW, utilizando una botella lavadora que contenga la solución de celulasa en amortiguador de acetato, transfiera el residuo luego de la digestión con proteasa a un vial con capacidad de 50 ml y con tapa de rosca.50

Llene el vial con la solución de celulasa, cierre el vial y verifique que no se pueda derramar la solución.

Coloque el vial en agitación a 40 °C por espacio de 16 horas para que ocurra la digestión de la celulosa y hemicelulosa.

Luego que, terminado el periodo de digestión, coloque los viales sobre una hornilla y caliente la

solución hasta una temperatura 80° C, temperatura a la cual se inactiva la celulasa. No deje que la solución en el vial entre en ebullición.

Decante el filtrado sobre un embudo con papel filtro N°5, que ha sido previamente secado y pesado con exactitud de 0.0001 g (P4), y proceda a filtrar la solución bajo succión. Lave de tres a cuatro



50 Si requiere determinar la fracción Ob con una nueva muestra, calcule la cantidad de muestra a utilizar mediante la siguiente relación 0.3/(Peso del residuo/Peso de la muestra). Pese la cantidad a utilizar con

x100P

)P- (P(OCW)ORGÁNICA CELULAR PARED DE PORCENTAJE

7

65


SECA TEPARCIALMENOCW DE %SECA BASE EN (OCW)ORGÁNICA CELULAR PARED DE %


38

veces el residuo con agua destilada. Finalmente lave con porciones de acetona por lo menos tres veces y deje secar el residuo a temperatura ambiente.

Cuando no se sientan vapores de acetona en la muestra, lleve el papel filtro a un horno de convección de aire forzado a temperatura de 135 °C por espacio de dos horas. Retire y deje enfriar en un desecador por espacio de 30 minutos y pese con exactitud de 0.0001 g. P3

Coloque el papel de filtro en un crisol de porcelana, que ha sido previamente secado y pesado con exactitud de 0.0001 g (P2), en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 600 °C ± 10 °C, por espacio de dos horas.51 Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol en un desecador para enfriarlo, por espacio de 60 minutos, y posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. P1

Determine el contenido orgánico de baja digestibilidad de la pared celular (Ob) por la pérdida de peso.

Si se resta el valor de Ob del valor de OCW se obtiene el valor de la fracción orgánica de la pared celular de lata digestibilidad.

Peso (gramos)




P3. Peso del papel filtro más residuo.

P4. Peso del papel filtro solo.

P5. Peso del residuo (P3 – P4).

P6 Peso de las cenizas (P1 – P2)

P7 Peso de la muestra fresca o parcialmente seca

Para el cálculo del contenido de pared celular orgánica de baja digestibilidad en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

Finalmente, el contenido de pared celular orgánica de alta digestibilidad se obtiene de la siguiente manera:



x100P

)P- (PIDAD(Ob)DIGESTIBILBAJA DEORGÁNICA CELULAR PARED DE PORCENTAJE

7

65

ObOCWIDAD(Oa)DIGESTIBIL ALTA DEORGÁNICA CELULAR PARED DE PORCENTAJE

100 xC


SECA TEPARCIALMEN Ob DE %SECA BASE EN (Ob) IDADDIGESTIBILBAJA DEORGÁNICA CELULAR PARED DE %


39

XI. DETERMINACIÓN DE LIGNINA Luego de la determinación de la fibra detergente ácido, uno de los componentes de esta fracción lo constituye la lignina. La lignina se determina al disolver u oxidar el componente orgánico de la fracción detergente ácido con una solución de H2SO4 al 72% por peso o una solución de KMnO4. La acción del ácido o el permanganato es la disolución de la lignina dejando como residuo lo que sería la celulosa. Se calcula el contenido de lignina por la pérdida de peso del material luego del tratamiento con cualquiera de las soluciones antes mencionadas. Para el caso del permanganato de potasio, se utiliza adicionalmente una solución decolorante, que remueve los residuos de permanganato, también conocida como solución demineralizadora.

REACTIVOS:

1. Determinación del contenido de lignina con H2SO4

Ácido sulfúrico al 72%: Utilice H2SO4 grado reactivo de gravedad específica 1.634 a 20 ºC o 12.0 M. Disuelva 1200 g de H2SO4 en 440 ml de agua destilada en un balón volumétrico tratando de mantener fría la solución. Estandarice la solución a 1634 g/l a 20 ºC removiendo la solución y adicionando o quitando agua o ácido sulfúrico según se requiera.

2. Determinación del contenido de lignina con KMnO4

Solución saturada de Permanganato de potasio: Disuelva 50 g de KMnO4 grado reactivo en un litro de agua destilada. Mantenga esta solución alejada de la luz solar. Es preferible almacenarla en botella de color ámbar o en una botella clara envuelta en papel de aluminio. Preferiblemente dentro de un anaquel.

Solución amortiguadora para lignina: En 100 ml de agua destilada disuelva 6.0 g de Fe(NO3)3·9H2O y 0.15 g de AgNO3. Prepare 500 ml de ácido acético glacial que contengan 5.0 g de acetato de potasio. Finalmente, mezcla las dos soluciones anteriores y añada 400 ml de alcohol ter-butílico. Mezcle completamente toda la solución.

Solución demineralizadora: En 700 ml de alcohol etílico al 95% disuelva 50 g de ácido oxálico. Añada 50 ml de HCl 12 N y 250 ml de agua destilada. Mezcle completamente.

Etanol al 80%: Utilice etanol grado reactivo y disuelva 80 ml de alcohol etílico al 95% con 200 ml de agua destilada.

Acetona

PROCEDIMIENTO

1. Determinación del contenido de lignina con H2SO4


El residuo del crisol donde se determinó la Fibra Detergente Ácido se utiliza para la determinación de lignina.

Coloque el crisol dentro de una bandeja de vidrio o vaso químico.

Agregue suficiente solución de H2SO4 al 72% para cubrir el contenido del crisol. La solución de ácido sulfúrico debe estar a temperatura del laboratorio, cerca de 15 ºC.

Agite con una varilla de vidrio el contenido y la solución de manera que todo el material reaccione con el ácido y se rompan los grumos.

Continúe agregando la solución de ácido sulfúrico hasta llenar la mitad del crisol y continúe revolviendo.

Verifique constantemente el volumen de ácido del crisol y agregue según disminuya el volumen. Realice esta operación durante tres horas, agitando siempre con la misma varilla de vidrio. Mantenga la reacción entre los 20 a 23 ºC, puede enfriar si fuese necesario.

Al finalizar las tres horas, filtre al vacío y lave el crisol con agua destilada caliente hasta que la solución filtrante no contenga residuos de ácido. Pruebe con papel para prueba de pH.

Lave las partes laterales del crisol y la varilla de vidrio.

Coloque el crisol en un horno de aire caliente de convección forzada a 100 ºC por un tiempo mínimo de 16 horas. Luego de este periodo coloque en un desecador para enfriar y registre el peso con exactitud de 0.0001 g. P3


40

Coloque el crisol con el residuo en un incinerador cuya temperatura máxima sea de 500 ºC e incinere el residuo por espacio de dos horas. Al término de este periodo, deje enfriar el incinerador por debajo de los 250 °C, coloque el crisol, aún caliente, en un horno de aire caliente de convección forzada a 100 ºC por una hora. Transfiera el crisol a un desecador para enfriarlo y posteriormente registre su peso con exactitud de 0.0001 g. P1

Peso (gramos)



P2. Peso del crisol solo52.

P3. Peso del residuo53.


P5 Peso de la muestra fresca o parcialmente seca54

Para el caso de ajuste por los análisis de los blancos, reste el promedio de peso (B) obtenido luego del secado e incineración de los crisoles con los blancos a los pesos de las cenizas de la muestra analizada.

Para el cálculo del contenido de lignina en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

PROCEDIMIENTO

2. Determinación del contenido de lignina con KMnO4

Todo lo anterior debe realizarse en duplicado.

El residuo del crisol donde se determinó la Fibra Detergente Ácido se utiliza para la determinación de lignina.

Coloque el crisol dentro de una bandeja de vidrio o vaso químico que contenga en el fondo una pequeña lámina de agua destilada.

Mezcle la solución saturada de KMnO4 y la solución amortiguadora para lignina en una relación de volúmenes de 2:1.

Agregue 25 ml de la mezcla de KMnO4 para cubrir el contenido del crisol.

Agite con una varilla de vidrio el contenido y la solución de manera que todo el material reaccione y se rompan los grumos.

Adicione agua a la bandeja o vaso de manera que se restrinja el flujo de solución de KMnO4 fuera del crisol. Continúe revolviendo.

Verifique constantemente el volumen de solución en el crisol y agregue según disminuya el volumen. La solución debe permanecer de color púrpura durante todo el periodo. Realice esta operación durante aproximadamente 90 minutos, agitando siempre con la misma varilla de vidrio.

Al finalizar los 90 minutos, filtre al vacío. No lave el crisol.

Coloque nuevamente el crisol en la bandeja o vaso limpio y agregue la solución demineralizadora hasta la mitad de la capacidad del crisol. Deje reposar por 15 minutos. Filtre al vacío.

Añada nuevamente suficiente solución demineralizadora para llenar la mitad del crisol, lave las paredes del crisol con solución demineralizadora con ayuda de una botella lavadora si fuera

52 Es el mismo peso del crisol utilizado para la determinación de Fibra Detergente Ácido 53 Es el mismo peso del residuo resultante en la determinación de Fibra Detergente Ácido 54 Es el mismo peso de la muestra utilizada para la determinación de Fibra Detergente Ácido

x100

5P

)cenizasB -4(P- 3PLIGNINA DE PORCENTAJE

100 xC


SECA TEPARCIALMENLIGNINA DE %SECA BASE ENLIGNINA DE %


41

necesario. Deje reposar por espacio de 20 a 30 minutos durante los cuales el residuo dentro del crisol debe estar de color blanco.55

Filtre al vacío y lave tres veces el contenido con alcohol etílico al 80%. Lave las partes laterales del crisol y la varilla de vidrio, y finalmente lave dos veces con acetona.

Cuando no se sientan vapores de acetona en la muestra, lleve el crisol a un horno de convección de aire forzado a temperatura de 100 °C por espacio de 16 horas. Retire y deje enfriar en un desecador por espacio de 30 minutos y pese con exactitud de 0.0001 g. P1

Peso (gramos)


P1. Peso del crisol mas residuo de celulosa

P2 Peso del crisol vacío56

P3 Peso del residuo o celulosa (P1 – P2)

P4. Peso del residuo de Fibra Detergente Ácido57.

P5 Peso de la muestra fresca o parcialmente seca58

Para el cálculo del contenido de lignina en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

55 Para el caso de que el residuo este un tanto amarillo repita la operación de decoloración. Esto es común con muestras que poseen

más de 35% de lignina en la Fibra Detergente Ácido. 56 Es el mismo peso del crisol utilizado en la determinación de Fibra Detergente Ácido 57 Es el mismo peso del residuo resultante en la determinación de Fibra Detergente Ácido 58 Es el mismo peso de la muestra utilizada para la determinación de Fibra Detergente Ácido

100 xC


SECA TEPARCIALMENLIGNINA DE %SECA BASE ENLIGNINA DE %

x100

5P

3P-4PLIGNINA DE PORCENTAJE


42

XII. DETERMINACIÓN DE MINERALES Los animales requieren consumir una serie de elementos minerales para el adecuado funcionamiento metabólico. Los componentes minerales que se encuentran en los alimentos están distribuidos en el tejido en diferentes formas, ya sea en forma iónica, formando sales y otros compuestos, así como formando parte estructural de compuestos orgánicos. De acuerdo a la cantidad relativa de las necesidades de los minerales, estos se dividen en macro y microminerales. Entre estos últimos, gracias a los avances tecnológicos, principalmente su sensibilidad, se ha encontrado la presencia de ellos en los tejidos animales, pero de algunos no se conoce aún su rol en el metabolismo. En un principio, los métodos para la determinación cuantitativa de minerales específicos, se basaba en la digestión y/o incineración de la muestra, para luego aplicar alguna técnica analítica entre las cuales tenemos las gravimétricas y por titulación. Posteriormente, con el avance del uso de los espectrofotómetros se desarrollaron técnicas colorimétricas, donde se conoce la longitud de onda donde el mineral puro o un compuesto determinado que contiene el mineral en estudio presentan su mayor absorción. El nivel o grado de absorción se compara con una serie de patrones o estándares y se determina la cantidad de mineral presente en la muestra. Estos métodos son todavía aceptables para la determinación de elementos que se encuentran presentes en grandes cantidades en la muestra. La fotometría de llama, más propiamente denominada espectrometría de emisión atómica de llama, es un método analítico rápido, simple y sensitivo para la determinación de iones de elementos trazas en solución. Debido a sus muy angostas y características líneas de emisión de la fase gaseosa atómica en la llama de plasma, el método está relativamente libre de interferencias de otros elementos. La precisión y exactitud típica del análisis de soluciones acuosas diluidas están cerca de ± 1-5% relativamente. El método es adecuado para muchos elementos metálicos, especialmente para aquellos metales que son fácilmente excitados a mayores niveles de energía a temperaturas de la llama: Na, K, Ca, Rb, Cs, Cu, Ba. Los no-metales, generalmente no producen átomos neutrales aislados en una llama, por lo que para ellos no es adecuada la determinación por espectroscopia de emisión de llama. La fotometría de llama es un método empírico de análisis, esto es que se debe calibrar el método cuidadosamente. Muchas diferentes variables experimentales afectan la intensidad de la luz emitida por la llama. Por consiguiente, calibraciones frecuentes y cuidadosas son necesarias para buenos resultados. Uno de los instrumentos utilizados para estos análisis es Coleman Flame Photometer, Model 21, con un quemador de consumo total que utiliza gas natural y oxígeno. El aislamiento de la longitud de onda se realiza por el uso de un simple filtro de interferencia. La luz de la llama se concentra hacia el final del cable de fibra óptica (“tubo de luz”) el cual transmite la luz hacia un fotodiodo en una pequeña caja electrónica en el fotómetro de llama. La electrónica allí convierte la salida del diodo en una emisión digital. CUIDADO. Aunque la llama es bastante pequeña, tiene tan elevada temperatura que el contacto de la piel con aún el borde externo de la llama produciría instantáneamente una quemadura de tercer grado. Exceptuando por el encendido de la llama, las manos deben mantenerse completamente fuera de la cámara durante el tiempo que la llama está ardiendo, aún si se ha disminuido su intensidad bastante entre los análisis. El principio se basa en que cualquier substancia cuando se expone a una suficiente alta temperatura será forzada a un estado excitado por colisión térmica. Debido a que estos estados son inestables, los átomos excitados o moléculas regresaran a su estado basal, disipando la energía absorbida de varias formas, una de ellas es la emisión de luz. Cada átomo o molécula tiene asociada a sí mismo una seria de niveles discretos de energía. En el estado separado atomizado, por consiguiente, los átomos excitados emitirán un característico juego de longitudes de onda denominados “espectros”. La intensidad de la luz así emitida es directamente proporcional al número de átomos que han sufrido dicha transición. De esta manera, monitoreando selectivamente una longitud de onda característica de un elemento volatilizado y excitado en una llama, se puede medir la concentración de dicho elemento directamente. Los metales alcalinos del Grupo 1 de la Tabla Periódica tienen niveles bajos de energía de excitación y por tal motivo son bien adecuados para análisis por emisión de llama. Sodio y Potasio ambos pueden ser


43

analizados por fotometría de llama en menor tiempo, a bajas concentraciones y con gran precisión y exactitud que por cualquier otra técnica. Cambios al azar en la temperatura de la llama o tasas de aspiración y varias interferencias químicas pueden causar fluctuaciones en la señal de emisión, dando una respuesta bastante inestable. Para compensar por esta inherente inestabilidad en la salida, el Litium se añade en una cantidad constante tanto en muestras como estándares como un “estándar interno” La electrónica compara la señal de las concentraciones variables de Sodio y Potasio en la muestra contra la señal de la concentración constante y muestra la razón de estas dos cantidades directamente en unidades de concentración del elemento analizado. Fluctuaciones al azar en la llama pueden pues afectar tanto los estándares internos y al Sodio y Potasio igualmente, la razón permanece sin afectación, y se puede obtener una lectura exacta y estable. Posteriormente el desarrollo de nuevos equipos como el espectrofotómetro de absorción atómica se pueden medir pequeñas diferencias en concentraciones, así como determinar concentraciones de elementos trazas. Este equipo permite analizar el contenido de determinado elemento en una sustancia midiendo el nivel de absorción de longitudes de onda específicas al analizar la llama que se produce al quemar la sustancia a altas temperaturas donde alcanza su disociación atómica. El nivel de energía absorbida se relaciona con la cantidad del elemento presente. Otro método utiliza el horno de grafito para muestras en estado sólido. Dado que algunos de estos equipos son costosos, muchos de los métodos gravimétricos, por titulación y colorimétricos son utilizados en algunos laboratorios en forma rutinaria. La precisión y exactitud de estos métodos depende del cuidado que se tenga en el procedimiento, en especial la contaminación durante el mismo. En muchos casos, el contenido de minerales de una muestra obtenida en campo, tales como heno, pastos de corte, entre otros, contienen minerales provenientes de la contaminación por el contacto con el suelo, por lo que el contenido de minerales se eleva. Otra fuente de contaminación puede ser el instrumento con el cual se obtuvo la muestra, por lo que se recomienda el uso de instrumentos de acero inoxidable.

A. DETERMINACIÓN DE CALCIO Entre los elementos que revisten cierta importancia en la nutrición animal se encuentra el calcio, que gran parte del mismo se encuentra como constituyente de los huesos y dientes. No obstante, el calcio posee otras funciones en el metabolismo y fisiología animal Los métodos pueden ajustarse si la medición se desea realizar en una mezcla mineral o en un alimento. En este procedimiento el calcio presente en la muestra es forzado a formar un precipitado de oxalato de calcio por la adición de una solución saturada de oxalato de amonio a la solución de las cenizas del material evaluado. Este precipitado se lava completamente con hidróxido de amonio para eliminar el exceso de oxalato de amonio. Por la acción del ácido sulfúrico, el oxalato de calcio forma ácido oxálico y sulfato de calcio. El ácido oxálico es determinado utilizando una solución estandarizada de KMnO4. Las reacciones involucradas en el proceso para la determinación del contenido de calcio de la muestra son las siguientes:

REACTIVOS:

1. Determinación de calcio en mezcla mineral

Ácido Clorhídrico 3 N: Diluya ácido clorhídrico concentrado 12 N en una relación 1:3 en agua destilada. Esto es 250 ml de HCl concentrado y llevar hasta un litro de solución. Concentración aproximada 3 N.

Ácido nítrico concentrado: Utilice ácido nítrico concentrado 15.9 N grado reactivo.

Ácido sulfúrico concentrado: Utilice ácido sulfúrico concentrado 36.0 N grado reactivo.

Solución de rojo de metilo (indicador)

Hidróxido de amonio: Solución de hidróxido de amonio 7.25 N: Diluya hidróxido de amonio concentrado (14.5 N) en

una relación 1:1 en agua destilada.

O8H10COSOK 2MnSO 2KMnO OC5H SO3H

OCHCaSO SOH OCaC

22424442242

42244242


44

Solución de hidróxido de amonio 0.3 N: Diluya hidróxido de amonio concentrado (14.5 N) en una relación 1:50 en agua destilada.

Solución saturada de oxalato de amonio: Prepare una solución al 4.2% de oxalato de amonio utilizando agua destilada.

Permanganato de potasio 0.1 N: Diluya 3.16 g de KMnO4, grado reactivo, en un litro de agua destilada. Mantenga esta solución alejada de la luz solar. Es preferible almacenarla en botella de color ámbar o en una botella clara envuelta en papel de aluminio. Preferiblemente dentro de un anaquel.

2. Determinación de calcio en forrajes

Permanganato de potasio 0.05 N: Diluya 1.58 g de KMnO4, grado reactivo, en un litro de agua destilada. Mantenga esta solución alejada de la luz solar. Es preferible almacenarla en botella de color ámbar o en una botella clara envuelta en papel de aluminio. Preferiblemente dentro de un anaquel.

PROCEDIMIENTO

1. Determinación de calcio en mezcla mineral


Coloque un crisol de porcelana en un incinerador a 600 °C por espacio de dos horas.

Retire el crisol del incinerador y déjelo enfriar por aproximadamente 60 m en un desecador.

Coloque el crisol en una balanza analítica y agregue aproximadamente 2 g de muestra, finamente molida, con exactitud de 0.0001 g (P1) o puede utilizar el residuo de la determinación de cenizas

Coloque el crisol con la muestra en el incinerador, cierre la puerta y encienda el incinerador.




Añada al crisol 40 ml de HCl (1:3) y unas gotas de HNO3 concentrado.

Coloque el crisol en una plancha caliente y lleve hasta punto de ebullición debajo de una campana extractora de gases.

Transfiera la solución a un frasco volumétrico de 250 ml, deje enfriar y lleve hasta la marca de 250 ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.

Deje reposar y transfiera una alícuota de 25 ml de la solución a un vaso químico y agregue 75 ml de agua destilada. Añada dos gotas de rojo de metilo.

Añada, gota a gota, solución de NH4OH 7.5 N hasta lograr un pH de 5.6 o hasta que la coloración de la solución sea chocolate-anaranjada. Si se pasa del color, agregue unas gotas de HCl 7.5 N para corregir y volver al color naranja. Finalmente, al llegar al color deseado, añada dos gotas adicionales de HCl 7.5 N. La coloración debe cambiar a rosado, no naranja, y el pH debe estar entre 2.5 a 3.0.

Diluya hasta 150 ml con agua destilada.

Lleve la solución a punto de ebullición sobre una hornilla y añada lentamente 10 ml de solución saturada caliente de oxalato de amonio. El color puede cambiar a anaranjado o amarillo, si este fuera el caso, añada unas gotas de la solución de HCl 3 N hasta que la solución vuelva a tomar el color rosado.

Deje reposar toda la noche para que se asiente el precipitado.

Filtre el sobrenadante en papel filtro o en un crisol tipo Gooch, y lave varias veces el precipitado con la solución de NH4OH 0.3 N.

Coloque el papel filtro o crisol en el mismo vaso químico donde se obtuvo el precipitado y añada 125 ml de agua destilada y 5 ml de ácido sulfúrico. Asegurarse de haber disuelto todo el precipitado.

Caliente la solución hasta los 70 ºC y titule con la solución de KMnO4 0.1 N hasta que el color de la solución cambie levemente a rosado. La temperatura de la solución no debe bajar de 60 ºC.59

Corrija el volumen utilizado con lo consumido por los blancos.

Calcule el porcentaje de calcio.

59 Cuando utiliza papel filtro, este puede causar la pérdida de color en pocos segundos.


45

2. Determinación de calcio en forrajes




Coloque el crisol en una balanza analítica y agregue aproximadamente 2.5 g de muestra, finamente molida, con exactitud de 0.0001 g (P1) o puede utilizar el residuo de la determinación de cenizas


Cuando la temperatura alcance los 600 °C deje las muestras por espacio de dos horas.60





Transfiera la solución a un frasco volumétrico de 250 ml, deje enfriar y lleve hasta la marca de 250 ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.

Deje reposar y transfiera una alícuota de 25 ml de la solución a un vaso químico y agregue 75 ml de agua destilada. Añada dos gotas de rojo de metilo.61

Añada, gota a gota, solución de NH4OH 7.5 N hasta lograr un pH de 5.6 o hasta que la coloración de la solución sea chocolate-anaranjada. Si se pasa del color, agregue unas gotas de HCl 7.5 N para corregir y volver al color naranja. Finalmente, al llegar al color deseado, añada dos gotas adicionales de HCl 7.5 N. La coloración debe cambiar a rosado, no naranja, y el pH debe estar entre 2.5 a 3.0.

Diluya hasta 150 ml con agua destilada.

Lleve la solución a punto de ebullición sobre una hornilla y añada lentamente 10 ml de solución saturada caliente de oxalato de amonio. El color puede cambiar a anaranjado o amarillo, si este fuera el caso, añada unas gotas de la solución de HCl 3 N hasta que la solución vuelva a tomar el color rosado.

Deje reposar toda la noche para que se asiente el precipitado.

Filtre el sobrenadante en papel filtro o en un crisol tipo Gooch, y lave varias veces el precipitado con la solución de NH4OH 0.3 N.

Coloque el papel filtro o crisol en el mismo vaso químico donde se obtuvo el precipitado y añada 125 ml de agua destilada y 5 ml de ácido sulfúrico. Asegurarse de haber disuelto todo el precipitado.

Caliente la solución hasta los 70 ºC y titule con la solución de KMnO4 0.05 N hasta que el color de la solución cambie levemente a rosado. La temperatura de la solución no debe bajar de 60 ºC. 6263

Corrija el volumen utilizado con lo consumido por los blancos.

Calcule el porcentaje de calcio.

Para el cálculo del contenido de calcio en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

60 En algunos casos se recomienda precalentar e incinerar la muestra en una campana sobre una plancha caliente hasta que deje de

emanar humo y luego se transfiere al incinerador. Esto aumenta la manipulación de la muestra y puede aumentar el grado de error.

61 Se recomienda utilizar una alícuota de 100 ml para granos. 62 Cuando utiliza papel filtro, este puede causar la pérdida de color en pocos segundos. 63 Para precisión en el método se debe ajustar el peso de la muestra, el tamaño de la alícuota y la concentración de KMnO4 de manera

que se consuman cerca de 20 ml de KMnO4.

x100alicuota de Volumenx P

250 x 0.020 x N x KMnO de ml CALCIO DE PORCENTAJE

1

KMnO4 4


SECO TEPARCIALMEN CALCIO DE %SECA BASE EN CALCIO DE %


46

B. DETERMINACIÓN DE FÓSFORO Otro de los minerales que tiene gran importancia en la nutrición animal lo constituye el fósforo. Este es otro elemento que se encuentra formando parte estructural en tejidos, como huesos y dientes, así como de otros compuestos que tienen que ver con el metabolismo y fisiología, tales como el ADP, proteínas, lípidos, entre otros. Uno de los métodos más utilizados para la determinación del fósforo es el colorimétrico, aunque también pueden utilizar otras técnicas como la espectrofotometría atómica. En este procedimiento, el fósforo, como ácido fosfórico, reacciona con el molibdato de amonio y vanadato de amonio dando como resultado la formación, en un medio ácido, del complejo de amoniofosfomolibdato y vanadio de color amarillo. Este complejo se reduce dando paso a lo que se conoce como azul de molibdeno, encontrándose una alta correlación entre la intensidad del color azul con la concentración de fósforo.

REACTIVOS:

Reactivo de molibdenovanadato: Disuelva 27 g de molibdato de amonio en 400 ml de agua destilada caliente y deje reposar para enfriar. Prepare una solución de 1.12 g de metavanadato de amonio (NH4VO3) en 300 ml de agua caliente y deje reposar para enfriar. Añada posteriormente a la solución de molibdato 250 ml de ácido nítrico. Finalmente, añada lentamente la solución de molibdato a la solución de vanadato y lleve el volumen final a un litro. Guarde la solución resultante en una botella ámbar.

Solución estándar de fósforo: Disuelva 4.394 g de KH2PO4 en agua y lleve a un litro de solución. Esta solución contiene 1000 ppm o 1 mg/ml de fósforo. Se preparan distintas soluciones tomando alícuotas de 0, 5, 10. 15, 20, 25, 30, 35 y 40 ml que contienen 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40 ppm de fósforo, las que se transfieren a volumétricos de 50 ml y agregue los reactivos en la secuencia que se aplicaran a la alícuota de la muestra.

PROCEDIMIENTO











Con ayuda de un papel filtro, transfiera la solución a un frasco volumétrico de 250 ml, deje enfriar y lleve hasta la marca de 250 ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.

Tome una alícuota de 10 ml y transfiérala a un volumétrico de 50 ml, añádale 5 ml de la solución de molibdenovanadato. Tape el volumétrico y mezcle completamente. Lleve hasta el aforo de 50 ml con agua destilada, tape el volumétrico y mezcle completamente.64

Deje reposar por 10 minutos y lea la absorbancia a los 400 nm, tanto de la muestra en duplicado como de las soluciones patrones.

Determine la ecuación de regresión con las lecturas de las soluciones estándares y determine la concentración de fósforo en la muestra.

Existen diferentes programas para computadoras o ciertas calculadoras que pueden realizar algunas operaciones de tipo científico o estadísticas que permiten estimar directamente la ecuación de regresión que

64 En este momento proceda a realizar la adición de la solución de molibdatovanadato a las alícuotas de las soluciones estándares de

fósforo.


47

se adecue a los datos obtenidos en la determinación de fósforo en la muestra. Un método más simple, consiste en utilizar una hoja milimetrada o cuadriculada donde se colocan las lecturas de absorción obtenidas para cada concentración de las soluciones estándares, se traza la línea recta que contenga el mayor número de puntos, luego se proceda a “interpolar” la lectura obtenida para la muestra y determinar su concentración. Esto implica que existe la posibilidad de que cada persona pueda trazar una línea diferente, y por consiguiente obtener diferentes valores para la muestra. Al no contar con una calculadora o computadora es posible determinar el valor de la ecuación de regresión realizando las operaciones que se describen en la siguiente tabla. Esto permitiría estimar la concentración de fósforo en la muestra, con la sustitución de la lectura en la ecuación obtenida. En esta tabla r corresponde al coeficiente de correlación, b al coeficiente de regresión o pendiente de la curva, a al intercepto o valor de

y para x = 0, y Y = a + bX corresponde a la ecuación de regresión, donde X es la concentración a determinar para cada muestra. Por consiguiente, una vez obtenida la lectura para la muestra, su concentración

corresponderá a: X = ( Y - a)/b, donde Y es reemplazado por la lectura de absorbancia obtenida de la muestra.

Concentración Absorbancia XY X2 Y2

x y Xy x2 y2

ppm (X) % (Y) X - X Y - Y

∑X = ∑Y= ∑XY = ∑X2= ∑Y2= ∑xy = ∑x2 = ∑y2 =

X = Y = (∑X∑Y)/n = (∑X)2/n = (∑Y)2/n =

r2 = (∑xy)2/(∑x2 ∑y2) r = 2r b = ∑xy/∑x2 a = Y - b X Y = a + bX

Una vez determinada la concentración de fósforo en la alícuota, se calcula la concentración de fósforo en la muestra de acuerdo a la siguiente ecuación:

Para el cálculo del contenido de fósforo en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

x100 ml 1 x 10 x P

ml 250 x Fósforo de ppm FÓSFORO DE PORCENTAJE

61


SECO TEPARCIALMEN FÓSFORO DE %SECA BASE EN FÓSFORO DE %


48

C. DETERMINACIÓN DE POTASIO Un método por el cual se puede analizar el contenido de potasio en una muestra es utilizando el Fotómetro de Llama. A continuación, un procedimiento común empleado para el análisis con este método. De forma general el Uso del Fotómetro de llama es como se detalla a continuación.

Lea inicialmente las instrucciones para el uso y protección adecuadas del equipo.

Cuando esté listo con las muestras y patrones, llame al Técnico de Laboratorio para que encienda la llama.

Se estabiliza el fotómetro de llama.

Aspire agua deionizada por lo menos dos minutos para limpiar y estabilizar el equipo.

Mientras se aspira el agua deionizada coloque el control en CERO en la unidad de lectura a 0.0 unidades.

Podrá darse algunas variaciones de lectura en el lector.

Aspire primeramente la solución estándar más concentrada, y use el botón de GANANCIA (GAIN) para establecer la lectura en 100.0 unidades.

Verifique nuevamente el CERO con agua deionizada y la lectura de 100 con la concentración estándar más concentrada.

Ahora proceda a aspirar todas las concentraciones estándar y los desconocidos uno a uno, aspirando agua deionizada entre cada lectura para limpiar la unidad.

El quemador mostrara un “efecto de memoria”.

Repita todos los pasos de lectura nuevamente por una segunda vez para obtener un buen juego de lecturas duplicadas.

Repita todo por una tercera vez si fuera necesario para un tercer juego de lecturas.

Cuando termine, aspire agua deionizada por lo menos dos minutos.

Llame al Técnico de Laboratorio para que apague la unidad.

Limpie el área de trabajo

Entre los mecanismos principales para el uso de este método están el principio de que las soluciones de las muestras son atomizadas o aspirados como fina neblina hacia las llamas. El principio es la conversión de las soluciones de muestra en aerosoles por un atomizador. Esto no implica un cambio químico en la muestra en este estado. El atomizador no convierte nada en átomos. Seguidamente, el calor de la llama vaporiza los constituyentes de la muestra, pero aún no ocurre ningún cambio químico. Por el calor de la llama más la acción del gas reductor (combustible) las moléculas e iones de las muestras son descompuestas y reducidas para dar átomos. Ejemplo: Na+ + e- →Na0. El calor de la llama causa excitación de algunos átomos hacia altos niveles electrónicos. Los átomos excitados se revierten hacia su estado basal por la emisión de energía lumínica o fotones, һ, de una característica longitud de onda medida por un detector. En la figura 10 se presenta un esquema de un Fotómetro de llama.

Los átomos en el estado de vapor presentan una línea espectral, no una banda, debido a que no hay enlaces covalentes por lo que no hay subniveles vibracionales para causar una amplitud en la línea. Un filtro de vidrio coloreado es usualmente capaz de aislar la línea de un elemento analítico si este ha sido bien separado de otras líneas de emisión. Por ejemplo, para medir Na y K en una muestra que contenga ambos esta es la separación de las líneas.

Emisión de Na || K ||

___________________________________

400 500 600 700 800

(nm)

Figura 10. Esquema general de un fotómetro de llama.

Rendija Filtro

Fotodetector

Lente

Aerosol entra en la llama

Espejo

Combustible

Aire del

compresor

Sumidero

Muestra


49

La fotometría de llama cuantitativa se obtiene analizando la relación de la intensidad de la emisión en función de la concentración de iones de la muestra en solución que se está midiendo. Está relación es lineal sobre un amplio rango, pero se da una desviación a bajas y altas concentraciones tal como se muestra en la figura 11.

A muy bajas concentraciones la emisión cae por debajo de lo esperado. Debido a la ionización (algunos átomos vuelven a iones, ejemplo: K → K+ + e- .Y además hay una insignificante ionización a altas temperaturas. No obstante, hay una región lineal. Se da una desviación negativa a altas concentraciones debido a una auto absorción. Los fotones emitidos por los átomos excitados son parcialmente absorbidos por los átomos en su estado basal en la llama.

Una mezcla de propano y aire o gas natural y aire dan una buena llama, un elevado nivel de calor, y una mínima emisión de luz de fondo. Pero siempre se requiere correr un blanco con el solvente para establecer la emisión a cero. Las soluciones diluidas, como se indicó con anterioridad, tienden a salirse de la parte lineal de la curva de emisión. Se puede calibrar con estándares adecuadamente, por ejemplo, de 0.05 hasta 0.25 mM de K+. El uso de soluciones de muy bajas concentraciones de Na+ y K+ dan problemas para evitar contaminación. Especialmente el Na+ que se libera lentamente de vidrio, contacto con la piel, en algunos casos. Los efectos de interferencia de aniones y cationes pueden causar errores, aumento o disminución. El efecto de “amortiguamiento de la radiación” por la dilución de estándares y muestras promueven inconsistencias. El uso de fotometría de llama como una herramienta cuantitativa puede remontarse hasta los trabajos de Kirchhoff y Bunsen en los años de 1860. Pero su uso e historia moderna se inicia en los años de 1940 cuando los instrumentos se hicieron mayormente disponibles para resolver satisfactoriamente los problemas de introducción de muestras reproducibles y detección. La fotometría de llama rápidamente se desarrolló en una herramienta analítica confiable para la determinación de diversos cationes de interés farmacéutico, notablemente Sodio, Potasio y Litio. La técnica es útil en el análisis de drogas voluminosas, formas de dosis y muestras clínicas tales como sangre y orina. Hay fotometría de llama tradicional o de baja temperatura de la llama. La fotometría de alta temperatura ha evolucionado hacia otras técnicas diversas típicamente identificadas por sus fuentes de temperatura. Por ejemplo, Espectrometría de emisión atómica acoplada a plasma inductiva (ICP-AES por sus siglas en inglés).

PROCEDIMIENTO






Cuando la temperatura alcance los 600 °C deje las muestras por espacio de dos horas o una noche.



Añada al crisol HCl (1:1).


Con ayuda de un papel filtro, transfiera la solución a un frasco volumétrico de 50 ml, deje enfriar y lleve hasta la marca de 50 ml con agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente.

Tome una alícuota de 1 ml y transfiérala a un volumétrico de 10 ml, afore con 9 ml de agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente. Dilución 1:10

Concentración

Intensidad de

emisión


50

Tome una alícuota de 1 ml de la dilución anterior y transfiérala a un volumétrico de 10 ml, afore con 9 ml de agua destilada. Tape el volumétrico y mezcle completamente. Dilución 1:100

Proceda a calibrar el fotómetro de llama con las soluciones patrones de Potasio. El ero se calibra con agua destilada y el 100% de emisión con la solución patrón de 30 ppm de potasio.

Determine el porcentaje de emisión de los patrones de Potasio para la construcción de la gráfica de análisis. % de emisión vs ppm de Potasio en los patrones.

Los patrones se preparan tomando alícuotas de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 ml de una solución valorada de 100 ppm de Potasio y transfiriendo cada alícuota a matraces volumétricos de 100 ml, procediéndose a completar o aforar el volumen con agua destilada.

Lea la emisión de la muestra primero en el extracto original y luego en las diluciones se requiere.

Determine la ecuación de regresión con las lecturas de las soluciones estándares y determine la concentración de Potasio en la muestra.

Existen diferentes programas para computadoras o ciertas calculadoras que pueden realizar algunas operaciones de tipo científico o estadísticas que permiten estimar directamente la ecuación de regresión que se adecue a los datos obtenidos en la determinación de potasio en la muestra. Un método más simple, consiste en utilizar una hoja milimetrada o cuadriculada donde se colocan las lecturas de absorción obtenidas para cada concentración de las soluciones estándares, se traza la línea recta que contenga el mayor número de puntos, luego se proceda a “interpolar” la lectura obtenida para la muestra y determinar su concentración. Esto implica que existe la posibilidad de que cada persona pueda trazar una línea diferente, y por consiguiente obtener diferentes valores para la muestra. Al no contar con una calculadora o computadora es posible determinar el valor de la ecuación de regresión realizando las operaciones que se describen en la siguiente tabla. Esto permitiría estimar la concentración de potasio en la muestra, con la sustitución de la lectura en la ecuación obtenida. En esta tabla r corresponde al coeficiente de correlación, b al coeficiente de regresión o pendiente de la curva, a al intercepto o valor de

y para x = 0, y Y = a + bX corresponde a la ecuación de regresión, donde X es la concentración a determinar para cada muestra. Por consiguiente, una vez obtenida la lectura para la muestra, su concentración

corresponderá a: X = ( Y - a)/b, donde Y es reemplazado por la lectura de absorbancia obtenida de la muestra.

Concentración Absorbancia XY X2 Y2

x y Xy x2 y2

ppm (X) % (Y) X - X Y - Y

∑X = ∑Y= ∑XY = ∑X2= ∑Y2= ∑xy = ∑x2 = ∑y2 =

X = Y = (∑X∑Y)/n = (∑X)2/n = (∑Y)2/n =

r2 = (∑xy)2/(∑x2 ∑y2) r = 2r b = ∑xy/∑x2 a = Y - b X Y = a + bX

Una vez determinada la concentración de fósforo en la alícuota, se calcula la concentración de potasio en la muestra de acuerdo a la siguiente ecuación:

alicuota de Volumenx P

0.25 x Potasio de ppm POTASIO DE PORCENTAJE

1


51

Para el cálculo del contenido de potasio en base seca se debe realizar el siguiente ajuste:

Por interpolación se puede obtener el % de potasio de la muestra interpolando el porcentaje de emisión en la gráfica construida y realizar las siguientes operaciones: donde F es igual a 1, si la lectura es del extracto original, 10, si la lectura es de la primera dilución (1:10) y 100 si la lectura es de la segunda dilución (1:100)


SECO TEPARCIALMEN POTASIO DE %SECA BASE EN POTASIO DE %

1000

F 25 de Mpp de %


52

XIII. LITERATURA CONSULTADA Abe, T. The studying data of the Livestock Experiment Station. Vol. 2. 1988 AOAC International. Official Methods of Analysis. 17th Ed. W. Horwitz, Editor. 2000. Chapman, H, y Prat, P. Métodos de Análisis para Suelos, Plantas y Aguas. Editorial Trillas, México, 195

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1971 Harris, L., J. Malcon A. y E.W. Crampton. An International Feed nomenclature and methods for

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2000. Jurgens, M. H. Animal Feeding and Nutrition. Kendall/Hunt Publishing Company, 4ta. Ed., 1978 Labconco Corporation. Guide to Kjeldahl Nitrogen Determination Methods and Apparatus. 2-41-9/98-

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guÍa para el anÁlisis bromatolÓgico de muestras … de laboratorio.pdfla toma de muestra tiene...

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