1

UNIVERSITAS INDONESIA

PENENTUAN METABOLIT PAH DALAM URIN

Makky Januari Mukti, S.Si

DAFTAR ISI

Pendahuluan................................................................................................................................. 2

Metode Analisis........................................................................................................................... 3

Diagram Alir................................................................................................................................ 5

Daftar Pustaka.............................................................................................................................. 8

DEPARTEMEN KESELAMATAN DAN KESEHATAN KERJA

FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT

UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

2016

2

PENENTUAN METABOLIT PAH DALAM URIN

Makky Januari Mukti, S.Si

Pemantauan biologis paparan Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) telah dengan cepat

meluas sejak 1-hidroksipirena (1-OHP) diusulkan sebagai indeks biologis paparan pirena.

Karena pirena selalu ada dalam campuran PAH, indikator biologis ini tidak hanya menjadi

indikator penyerapan pirena, tetapi juga indikator tidak langsung dari semua PAH. Metabolit

PAH ditentukan dengan kromatografi cair kinerja ultra (UHPLC). Setelah hidrolisis

enzimatik untuk membebaskan metabolit dari bentuk terkonjugasinya, analit dipisahkan dari

matriks dan diperkaya secara ekstraksi fase padat. Komponen dipisahkan dalam kolom UPLC

dan metabolit ditentukan dengan detektor fluoresens.

Pendahuluan

PAH merupakan kelompok besar polutan organik yang ciri struktur molekulnya

terdiri atas setidaknya dua sistem cincin terkondensasi dan selain atom karbon dan hidrogen,

beberapa di antaranya mengandung heteroatom seperti sulfur dan nitrogen. Selain itu, PAH

juga diketahui di mana satu atau lebih atom hidrogen diganti oleh gugus nitro. PAH

dihasilkan dari proses pirolisis dan pembakaran tidak sempurna bahan organik. PAH di

lingkungan sebagian besar berasal dari sumber antropogenik. Mereka terbentuk dalam proses

pirolisis industri seperti karbonisasi suhu tinggi batubara atau dalam proses pengertakan

petrokimia (Lintelmann 1999).

Berbagai penelitian mengkonfirmasi efek karsinogenik PAH pada manusia. Estimasi

kuantitatif risiko kesehatan bagi pekerja di pabrik kokas telah dilaporkan dalam berbagai

penelitian. Insiden kanker diperkirakan sebesar 8 sampai 63 kasus untuk paparan seumur

hidup dari 105 orang untuk setiap nanogram dari benzo[a]pirena per m

3 udara. Sebagai dasar

pertimbangan pencegahan medis, nilai estimasi risiko yang direkomendasikan adalah 7 kasus

kanker per 105 orang yang terpajan untuk setiap nanogram dari benzo[a]pirena per m

3 udara

(Lintelmann 1999).

Jerman telah menetapkan nilai batas paparan teknis benzo[a]pirena yang berfungsi

sebagai indikator pencemaran PAH di udara, yaitu mencapai 5 µg/m3 untuk area produksi

dan dekat tungku pada pabrik kokas. Tempat kerja lainnya adalah 2 µg/m3

(Lintelmann

1999). Namun penentuan PAH di udara ambien di tempat kerja tidak cukup untuk

mengkonfirmasi estimasi risiko kesehatan individu. Oleh karena itu, berbagai upaya dibuat

dengan merancang metode pemantauan biologis.

Pengukuran metabolit terhidroksilasinya dalam urin merupakan titik awal yang

berguna untuk pengembangan metode pemantauan biologis PAH. PAH dimetabolisme secara

ekstensif dan enzim yang terlibat diklasifikasikan ke dalam dua kategori besar: enzim fase 1

yang mengkatalisis reaksi oksidatif, dan enzim fase 2 yang mengkatalisis reaksi konjugatif

PAH teroksidasi dengan senyawa endogen seperti asam sulfat, asam glukuronat dan

3

glutation. Metabolit PAH diekskresikan baik sebagai senyawa bebas atau dalam bentuk

konjugasinya (Jongeneelen et al. 1987).

Estimasi risiko kesehatan akibat paparan terhadap senyawa PAH sangat bergantung

pada kualitas dari metode analisis yang digunakan. Berbagai penelitian melaporkan hasil

pengukuran metabolit PAH secara HPLC sebagai metode yang diandalkan. Berkembangnya

teknologi instrumentasi analitik kemudian mengedepankan UHPLC untuk hasil analisis

dengan sensitivitas dan resolusi yang optimal.

Metode Analisis

Sampling dan penyimpanan

Waktu paruh untuk ekskresi metabolit PAH oleh pekerja yang terpajan PAH adalah

18 jam. Studi kinetika eliminasi menghasilkan kurva bifase dengan waktu paruh 1-2 hari pada

eliminasi pertama diikuti oleh fase eliminasi berikutnya dengan waktu paruh sampai 16 hari.

Oleh karena itu, urin sebaiknya diambil di akhir ingsut pada akhir pekan kerja. Stabilitas

metabolit PAH dalam urin bersifat baik dalam jangka panjang, tidak ada catatan hilangnya

analit selama 12 bulan dalam penyimpanan suhu -18 °C.

Preparasi Sampel

Sampel urin dari penyimpanan beku dicairkan dalam waterbath pada suhu 40 °C dan

selanjutnya dibawa ke suhu kamar. Sebelum aliquot diambil, sampel dipastikan telah

homogen. Sebanyak 10 mL urin dimasukkan ke dalam gelas piala lalu pH diatur sampai 5

dengan penambahan 1 M HCl. Sampel urin secara kuantitatif dipindahkan ke dalam 25 mL

labu ukur (gelas piala dibilas dengan bufer asetat lalu dipindahkan ke dalam labu ukur

tersebut). Akhirnya, labu ukur ditera dengan bufer asetat 0.1 M pH 5.

Larutan yang telah dibuat lalu dipindahkan ke dalam 50 mL tabung sentrifuga. Ke

dalamnya ditambahkan 25 µL larutan β-glukuronidase/arilsulfatase. Campuran diaduk secara

mekanis selama 10 menit dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37 °C selama 16 jam.

Setelah inkubasi, urin hasil hidrolisis disentrifugasi pada 2700 g. Supernatan diambil dan

diekstrak di kolom SPE C18. Trietilamina sebanyak 0.5% volume ekstrak ditambahkan pada

ekstrak lalu 200 µL diambil untuk analisis UHPLC. Jika analisis tidak segera dilakukan,

sampel dapat disimpan pada suhu -18 °C. Tidak ada catatan kehilangan analit ketika sampel

disimpan hingga empat minggu padah suhu -18 °C.

4

Analisis UHPLC

Standar Kalibrasi dan Deret Standar

Larutan induk dibuat dengan cara sebanyak 1 mg standar ditimbang dan dimasukkan

ke dalam labu ukur 100 mL dan ditera dengan metanol sehingga konsentrasinya 10 mg/L.

Selanjutnya dipipet dari larutan induk ke dalam labu ukur 10 mL dan 100 mL masing-masing

sebanyak 500 µL, yang sebelumnya telah diisi metanol masing-masing 5 mL dan 50 mL, lalu

ditepatkan hingga tanda tera dengan metanol sehingga diperoleh larutan standar A 0.5 mg/L

dan larutan standar B 0.05 mg/L. Akhirnya dipersiapkan deret standar antara 0.25 dan 30

µg/L dari larutan standar A dan B melalui pengenceran dengan akuades dengan skema

berikut.

Volume larutan standar (mL) Volume akhir tera

akuades (mL)

Konsentrasi

(mg/L) A (0.5 mg/L) B (0.05 mg/L)

- - 10 0

- 50 10 0.25

- 100 10 0.5

- 400 10 2

100 - 10 5

300 - 10 15

600 - 10 30

Pemrograman Alat

Sistem kolom : Fase terbalik

Detektor : Fluresens, eksitasi 242 nm dan emisi 388 nm

Suhu kolom : 40 °C

Fase gerak : Metanol-air terprogram

Laju alir : 0.8 mL/menit

5

Diagram Alir Metode Penetapan Metabolit PAH dari Sampel Urin secara UHPLC

Disusun oleh: Makky Januari Mukti, S.Si

Preparasi Sampel

Sampel dari

penyimpanan

–18 °C

Truang,

Dikocok

sempurna

Analisis UHPLC

Diinkubasi dalam

waterbath 37 °C 16 jam

10 mL supernatan

Ekstrak

Disentrifugasi 2700 g

Shaker 10'

Diaduk

Tabung sentrifuga 50 mL

25 mL

pH = 5

Aliquot 10 mL

Dicairkan

Waterbath 40 °C

1 M HCl

Ditera dengan bufer NaOAc 0.1 M pH = 5

+ 25 µL β-glukoronidase/arilsulfatase

Pra-kolom (SPE C18 Cartridge)

+ trietilamina (0.5% vol ekstrak)

6

Standar Kalibrasi Tera Me-OH

Lar. Induk 10 ppm

500 µL A = [0.5 ppm]

Tera Me-OH

500 µL B = [0.05 ppm]

Deret Standar

Tera aquades

[Induk] = 10 ppm

5 mL Me-OH

di awal

50 mL Me-OH

di awal

Tera

Me-OH

Aquades

10 mL

100 mL

10 mL

100 mL

1 mg standar

B A

50 µL 100 µL 400 µL 100 µL 300 µL 600 µL

0.25 ppb 0.5 ppb 2 ppb 5 ppb 15 ppb 30 ppb 0

7

Reagen

Larutan HCl 1 M

8.3 mL HCl = [1 M]

HCl 37%

Bufer NaOAc 0.1 M pH 5

8.2 g

NaOAc adjust pH sampai 5

Nb: Shelflife 3 bulan (suhu kamar)

NaOAc = [0.1 M]

pH 5

Tera akuades

50 mL akuades

di awal

tera

akuades

100 mL

1000 mL

+ asam asetat glasial

8

DAFTAR PUSTAKA

Jongeneelen FJ. 2001. Benchmark guideline for urinary 1-hydroxypyrene as

biomarker of occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Ann Occup Hyg.

45(1):3-13.

Jongeneelen FJ, Anzion RBM, Henderson PT. 1987. Determination of hydroxylated

metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in urine. J Chrom. 413:227-232.

Li H, Krieger RI, Li QX. 2000. Improved HPLC method for analysis of 1-

hydroxypyrene in human urine specimens of cigarette smokers. Sci Total Environ. 257:147-

153.

Lintelmann J. 1999. PAH metabolites. Biomonitoring Methods. 6:163-

186.doi:10.1002/3527600418.bi0pahmete0006. Cetak ulang dalam The MAK Coll for Occup

Health and Safety. 2012.