Download - Sinopsis Rencana Penelitian
1
SINOPSIS RENCANA PENELITIAN
HUBUNGAN KEKERABATAN GENETIK KARET (Hevea brasiliensis Muell.Agr.)
BERBASIS MARKA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Oleh : Muhammad Nur Kholis
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Tanaman keret (Hevea brasiliensis Muell.Agr.) penghasil karet alam
merupakan salah satu komoditas perkebunan penting bagi Indonesia. Komoditi karet
indonesia merupakan komoditas eksport andalan perkebunan kedua setelah CPO, dan
Indonesia merupakan negara penghasil dan pengekport karet alam urutan ke 2 setelah
Thailand. Sedangkan kontribusi eksport karet dan produk karet terhadap ekport non
migas pada periode Januari-Agustus 2011 sebesar 9,51 % (Ditjenbun, 2011).
Perkembangan komoditas karet tergantung dari bahan tanam karet yang
dibudidayakan, bahan tanam karet yang memiliki kualitas terbaik akan meningkatkan
komoditas perkebunan karet di indonesia. Bahan tanam karet yang dibudidayakan saat
ini merupakan klon asal persilangan berbagai tetua terpilih yang kemudian
diperbanyak dengan cara okulasi. Masing-masing klon memiliki karakter agronomi
yang berbeda seperti tingkat produksi, pertumbuhan sebelum dan setelah lateks
disadap, ketebalan kulit, kandungan karet kering dan warna lateks, serta ketahanan
terhadap penyakit (Simmonds, 1989). Penentuan tetua dapat dipelajari dengan melihat
hubungan kekerabatan dari masing-masing klon tanaman karet yang sudah ada
sebagai dasar program pemuliaan tanaman tersebut.
Hubungan kekerabatan antar populasi atau antar klon karet telah dipelajari
baik secara morfologi, agronomi maupun dengan menggunakan marka molekular
molekular. Hubungan kekerabatan berdasarkan karakter morfologi ataupun agronomi
belum dapat menunjukkan hubungan kekerabatan secara utuh karena karakter tersebut
dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Karakter genetik dinilai tepat dalam
menentukan hubungan kekerabatan antar klon karet yang dapat dijadikan untuk
pengembangan keilmuan selanjutnya, seperti untuk program pemuliaan tanaman
karet.
Salah satu marka yang dapat digunakan untuk menganalisis karakter genetik
hubungan kekerabatan adalah marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).
Metode RAPD merupakan kombinasi teknik PCR menggunakan primer-primer
dengan sekuen acak untuk keperluan amplifikasi lokus acak dari genom (Rafalski et
al., 1991). Teknik ini digunakan untuk mengidentifikasi genotipe tumbuhan, karena
memiliki kelebihan dalam pelaksanaan dan analisisnya. Dibandingkan dengan
penanda DNA yang lain, seperti restriction fragment length polymorphisms (RFLP)
dan simple sequence repeats(SSR), teknik RAPD lebih murah, mudah dilakukan,
cepat memberikan hasil, menghasilkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah banyak,
tidak memerlukan pengetahuan tentang latar belakang genom yang dianalisis dan
mudah memperoleh primer acak yang diperlukan untuk menganalisis genom semua
jenis organisme (Tingey et al., 1994 dalam Poerba and Martanti, 2008). Teknik ini
telah digunakan untuk menganalisis hubungan kekerabatan berbagai varietas
2
Capsicum sp. (Adetula, 2006), Cucumis sativus L. (Julisaniah et.al., 2008), kerabatan
Durio zibethinus (Ruwaida et.al., 2009), Pisum sativum (Ahmad et.al., 2010) dan
Camellia (Wang et.al.,2011). Hubungan kekerabatan genetik dari berbagai klon
tanaman karet tersebut dapat dijadikan sebagai dasar program pemuliaan tanaman
karet yang dapat memunculkan klon-klon unggul sehingga akan meningkatkan
komoditas karet Indonesia.
1.2. Rumusan Masalah
Bagaimanakah keragaman genetik dan hubungan kekerabatan klon karet
(Hevea brasiliensisis Muell.Agr.) berdasarkan marka RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA).
1.3. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman dan hubungan
kekerabatan genetik karet (Hevea brasiliensisis Muell.Agr.) berdasarkan marka
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).
1.4. Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah mengetahui hubungan kekerabatan berbagai
jenis klon tanaman karet dan dasar dalam hal pemuliaan klon tanaman karet sebagai
upaya meningkatkan hasil produksi karet di Indonesia.
II. BAHAN DAN METODE
1.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian akan dilaksanakan pada bulan Oktober 2013 – Juli 2014 di
Laboratorium Biologi Molekular Departemen Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
Fakultas Agronomi dan Hortikultura Institut Pertanian Bogor.
1.2. Bahan Penelitian
Bahan merupakan tanaman keret terdiri dari anjuran komersial dari Direktorat
Jendral Perkebunan Tahun 2010-2014 yang dikelompokkan menjadi tiga kelompok
yaitu kelompok klon penghasil lateks (IRR 104, IRR 112, IRR 118, IRR 220, BPM
24, PB 260, PB 330, dan PB 340) dan penghasil lateks-kayu (RRIC 100, IRR 5, IRR
39, IRR 42, IRR 107, dan IRR 119), serta benih anjuran untuk batang bawah
(AVROS 2037, GT 1, BPM 24, PB 260, RRIC 100, dan PB 330).
1.3. Isolasi DNA Karet
DNA Diisolasi dari 0,3 gram daun muda dari masing-masing klon yang diuji
dengan menggunakan metode Orozco-Castillo et.al. (1994). Endapan DNA dicuci
dengan 70% etanol, dikeringanginkan dan dilarutkan dalam 500 µL buffer TE (10mM
Tris HCL, 1 mM EDTA, pH 7,5) dan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1
jam dan ditambahkan 20 µL RNAase A (10 mg/ml). DNA diendapkan dengan 2
volume 100% etanol dan 0,1 volume 3 M Na-asetat. DNA dielektroforesis pada 1,4%
gel agorose.
Kuantitas DNA diukur menggunakan alat Gene Quant, yaitu sejumlah 7 μL
DNA contoh diambil dan dilakukan pengukuran konsentrasi, rasio, dan absorbansi
(230 nm, 260 nm, 280 nm dan 320 nm), selanjutnya DNA tersebut dilarutkan dengan
3
H2O sesuai kebutuhan. Prinsip kerja Gene Quant adalah menghitung rasio dan
konsentrasi DNA dengan memanfaatkan optical density (OD) DNA pada
penyerapan/absorbansi beberapa macam gelombang cahaya (230 nm, 260 nm, 280 nm
dan 320 nm).
1.4. Analisis RAPD
Analisis RAPD dibuat dengan volume 25 µL reaksi PCR yang mengandung
50 ng DNA dari setiap klon, 10 pmol primer DNA (0,4 µM), 100 µM dNTP, 1 U Taq
polimerase (Promega) dan 2,5 µL Taq polimerase 10x buffer Promega ( 500mM
KCL, 15mM MgCl2, 100 mM Tris-HCL pH 9,0). Primer dekamer (OPN-05, OPN-06,
OPN-08, OPN-010, OPN-11, OPN-12, OPN-17, OPH-1, OPH-01, OPH-03, OPH-05,
OPH-18 dan OPH-19) dari Operon Technologies (Alameda, CA) digunakan dalam
percobaan ini (Oktavia et.al., 2011).
Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Perkin Elmer Gene Amp
PCR System 2400. Program PCR terdiri dari 1 siklus pada 94°C selama 3 menit; 45
siklus pada 94°C selama 1 menit, 37°C selama 1 menit, 72°C selama 2 menit; 1
siklus pada 72°C selama 1 menit; diakhiri dengan penyimpanan pada 4°C. Produk
PCR kemudian dielektoforesis dengan agarose 1,4 % (Promega) dan divisualisasikan
di atas UV transilumimator kemudian didokumetasikan dengan alat foto Polaroid tipe
667.
1.5. Analisis Data
Jarak genetik dihitung berdasarkan pengukuran Nei’s (Nei, 1987) dengan
menggunakan program komputer POPGENE 1.32. Dendogram menggunakan metode
UPGMA dibuat menggunakan data jarak genetik tersebut untuk mengetahui
hubungan kekerabatan antar klon karet.
DAFTAR PUSTAKA
Adetula O.A., 2006. Genetic diversity of Capsicum using Random Amplified Polymorphic
DNAs. African Journal of Biotechnology 5 (2) : 120-122
Ahmad G., Mudasir R. Kudesia, Shika and M.K. Srivastava. 2010. Genetic Diversity in Pea
(Pisum sativum) Using RAPD Analisis. Genetic Engineering and Biotechnology
Journal : GEBJ -16
Julisaniah N.I., L. Sulistyowati and A. N. Sugiharto. 2008. Analisis Kekerabatan Mentimun
(Cucumis sativus L.) menggunakan Metode RAPD-PCR dan Isozim. Biodiversitas 9
(2) : 99-102
Karp A., O. Seberg and M. Buiatti. 1996. Molecular Techniques in The Assesment of
Botanical Diversity. Ann. Bot. 78 : 143-149.
Nei, M. 1987. Estimation of Average Heterozygosity and Genetic Distance from A Small
Number of Individuals. Genetics 89 : 583 - 590
Oktavia F., M. Lasminingsih and Kuswanhadi. 2011. Selection of parent trees for Rubber
(Hevea brasiliensis) breeding based on RAPD analysis. Nusantara Bioscience 3 :
124-129
Orozco-Castillo, C. K. J. Chalmers, R. Waugh and W. Powell. 1994. Detection of genetic
diversity and selective gen introgression in coffee using RAPD markers. Theor Appl
Genet 8 : 934-940.
4
Poerba Y.S. and D. Martanti. 2008. Keragaman Genetik berdasarkan Marka Random
Amplified Polymorphic DNA pada Amorphophallus muelleri Blume di Jawa.
Biodiversitas 9 (4) : 245-249
Rafalski, J.A., S.V. Tingey and J.G.K.Williams. 1991. RAPD markers-a new technology for
genetic mapping and plat breeding. AgBitech News and Information 3: 645-648.
Ruwaida I.P., E. Yuniastuti and Supriyadi. 2009. Analisis Keragaman Tanaman Durian
Sukun (Durio zibethinus) Berdasarkan Penanda RAPD. Bioteknologi 6 (2): 96-105.
Simmonds N.W. (1989). Rubber Breeding. InWebster CC, Baulkwill WJ (ed). Rubber. New
York, Longman Scientific & Technical. p. 85 – 124.
Wang X.F., H.Y. Zheng, W.H. Zheng, C.Q. Ao, H.Y. Jin, L.H. Zhao, N. Li and L.R. Jia.
2011. RAPD-based Genetic Diversities and Correlation with Morphological Traits
Camelia (Theaceae) Cultivars in China. Genetic and Molecular Research. 10 (2):
849-859