Download - Rekayasa Genetika HG7 Mutagenesis(1)
-
Mutagenesis Evania Hutasoit (1206248483) Fhani Melliana (1206212413)
Haqqyana (1206262090) Retno Ulfiah (1206262102)
Sharima Umaya (1206212325)
Kelompok HG-7
-
OUTLINE PRESENTASIPengertian dan Jenis Mutagenesis Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Kelebihan Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Mencari Kode Basa Nitrogen Apoptin Menentukan Letak Theorin 108 Membuat Primer PCR Sesuai Jenis Mutasi Pelaksanaan Proses PCR Transformasi Plasmid ke Host Screening dari Hasil Transformasi Permasalahan-Permasalahan yang Mungkin Terjadi dalam Penggunaan Site
Directed Mutagenesis Quality Control Penggunaan Site Directed Mutagenesis
-
PROBLEM STATEMENTTheorin 108 sangat
berpengaruh pada fungsi apopin sebagai penginduksi kematian sel pada sel kanker. Untuk mengklarifikasi fungsi Theorin 108, mutasi apoptin!
e
-
PENGERTIAN & JENIS
REKAYASA GENETIKA
MUTAGENESIS
-
MUTAGENESIS/mjutdnss/
Perubahan informasi genetik pada suatu organisme yang disebabkan oleh mutagen fisika dan kimia
-
JENIS MUTAGENESISDirected
Oligonuclotide Oligonucleotide directed with Plasmid DNA PCR Amplified Oligonucleotide
Random Directed evolution or molecular breeding
Insertional Signature tagged Virus
PCR Site Directed Mismatched 5Add on Cassette
our focus
-
SITE DIRECTED MUTAGENESIS
Mutasi yang terjadi pada lokasi spesifik suatu untai DNA
Merupakan mutagenesis in vitro Menggunakan primer oligonuklei2da yang dimodikasi khusus
-
METODE YANG DIPILIH UNTUK MEMUTASI THEORIN 108 DARI GEN APOPTIN ADALAH
Q5 SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
-
Q5 SITE-DIRECTED
REKAYASA GENETIKA
MUTAGENESIS KIT
-
Q5 Site-Directed Mutagenesis KitDESCRIPTION
non-overlapping primers (1 mutagenic and 1 silent) merupakan turunan dari
QuickChange
Mampu melakukan insersi dan delesi panjang dapat diaplikasikan secara luas dalam percobaan laboratorium
Modifikasi standar basa tunggal serta delesi dan adisi dengan panjang berapapun, termasuk adisi sinyal lokalisasi nuklir ke protein terkloning
Q5 Hot Start High-Fidelity Polymerase
-
Q5 Site-Directed Mutagenesis KitKit Components:
Disimpan pada suhu (C)
Konsentrasi
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix -20 2X
KLD Enzyme Mix -20 10X
KLD Reac2on Buer -20 2X
Control SDM Primer Mix -20 10 M
Control SDM Plasmid -20 5 g/ml
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Eciency) -80
pUC19 Transforma2on Control Plasmid -20 0.05 ng/l
SOC Outgrowth Medium 4
-
KELEBIHAN
REKAYASA GENETIKA
Q5 SITE-DIRECTEDMUTAGENESIS
-
1 DESAIN PRIMERTUMPANG TINDIH
TIDAK
kuat amplifikasi eksponensial menghasilkan persentase yang tinggi dari mutasi yang diinginkan dari berbagai template
-
2 LIGASI INTRAMOLEKUL DAN TRANSFORMASI MENJADI NEB EFISIENSI TINGGI YANG KOMPETEN MENGHASILKAN SEL DALAM KOLONI TINGGI
-
3
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase mengurangi waktu screening
TINGKAT KESALAHAN
SANGAT RENDAH
-
4
SUHU KAMAR
HOT START POLIMERASE MEMUNGKINKAN SET UP REAKSI PADA
-
5 REDUKSI DPNL MEMUNGKINKAN BERBAGAI KONSENTRASI TEMPLATE AWAL
-
6 PENGGUNAAN PRIMER STANDAR MENGHILANGKAN BIAYA TAMBAHAN DARI OLIGOS TERFOSFORILASI OLIGOS YANG DIMURNIKAN
-
7 PCR MASTER MIX MUDAH DIGUNAKAN DAN MULTI-ENZIM KLD CAMPURAN YANG UNIK MENAWARKAN KENYAMANAN DAN KUALITAS
-
8 LANGKAH PERLAKUAN YANG CEPAT DAN LANGSUNG DILAKUKAN PADA SUHU KAMAR DALAM 5 MENIT
-
MENCARI KODE BASA NITROGEN
REKAYASA GENETIKA
APOPTIN
-
Chicken anemia virus (CAV), merupakan virus non-envelopedyang resitant terhadap inaktivasi termal dan perlakuan oleh pelarut lipid (von Bulow and Schat, 1997). CAV merupakan agen kausatif dari penyakit anemia pada ayam, penyakit ini menyebabkan anemia aplastik, atropi pada organ getah bening, dan imunosupresi pada ayam.
Vir us ini mentranskripsi dan mentranslasi protein protein viral, VP1, VP2, dan VP3, yang masing masing dikodekan oleh ORF3, ORF1, dan ORF2 dari genom CAV. Protein VP3, terdiri atas susunan 121 asam amino atau dengan kata lain tersusun oleh 363 basa nukleotida.
MENCARI GEN APOPTIN
-
Amplifikasi CAV dengan kultur virus Isolasi Virus
Kultur CAV Subkultur CAV
Isolasi DNA/Plasmid dengan metode fenol - kloroform
Isolasi genom CAV Alat-alat: Larutan NaAc 3 M Larutan 100% EtOH Larutan etanol Aquades Sampel MDCC-MSB1 Larutan fenol Kloroform Bahan-bahan : Tabung reaksi Alat pendingin Alat sentrifugasi Labu erlenmeyer
TAHAPAN MENCARI KODE APOPTIN
-
TAHAPAN ISOLASI CAV Menambahkan larutan fenol jenuh dengan volume yang sama
seperti sampel.
Mengocok sampel selama 3 menit kemudian melakukan sentrifugasi pada 14000 rpm selama (5 menit)
Fenol akan terpisah pada bagian bawah tabung. Lapisan atas dipisahkan dan dicampurkan dengan kloroform pada volume yang sama dengan sampel.
Sampel disentrifugasi kembali pada 14000 rpm (5 menit). Supernatan dipisahkan.
Menambahkan larutan NaAc 3 M pada sampel sebanyak 1/10 dari volume sampel. Dan kemudian menambahkan juga 100% EtOH sebanyak 2 kali volume sampel.
-
TAHAPAN ISOLASI CAV
Setelah itu pelet dibiarkan kering sehingga tidak ada cairan lagi didalam sampel.
Pelet kemudian disuspensikan didalam air. Sampel tersebut mengandung DNA virus CAV yang murni untuk kemudian dilakukan tahapan berikutnya.
Setelah mengocok sampel selama beberapa detik, sampel didinginkan pada suhu -20oC selama 30 menit.
Sentrifugasi pada 14000 rpm (5 menit). Bila tidak terbentuk pelet pada sampel lakukan ulang sentrifugasi.
Memisahkan pelet dari supernatan dengan pipet perlahan. Menambahkan etanol untuk mengendapkan DNA (DNA bersifat yang sangat
polar struktur fosfat).
-
MENENTUKAN LETAK
REKAYASA GENETIKA
THEORIN 108
-
MENENTUKAN LETAK THEORIN 108
Terdapat 121 asam amino penyusun gen apoptin. Melalui urutan tersebut kita menentukan posisi Threonin 108 dengan menghitung dari belakang susunan asam amino tersebut.
1 MNALQEDTPP GPSTVFRPPT SSRPLETPHC REIRIGIAGI 41 TITLSLCGCA NARAPTLRSA ADNSESTGF KNVPDLRTDQ 81 PKPPSKKRSC DPSEYRVSEL KESLITTTPS RPRTARRCIR L 121 Threonin 108
-
Menerjemahkan asam amino ke susunan basa menggunakan converter pada : http://in-silico.net/tools/biology/sequence_conversion
-
Menjadi
SETELAH DIPEROLEH SUSUNAN BASA THEORIN 108 (ACG) MAKA THEORIN 108 DIMUTASI MENJADI ASAM AMINO LAIN DENGAN MENGUBAH POSISI BASA 322 MENJADI G, DAN URUTANNYA MENJADI GCG
-
Threonin
(ACG) Alanin
(GCG)
Substitusi Klarifikasi
GCG ADALAH ASAM AMINO ALANIN, MAKA THEORIN DISUBSTITUSI OLEH ALANIN. PERUBAHAN 1 BASA DIMAKSUDKAN SUPAYA TIDAK TERJADI PERUBAHAN SIGNIFIKAN DAN UNTUK MENGKLARIFIKASI FUNGSI THEORIN 108 PADA APOPTIN DALAM INDUKSI SEL KANKER. OLEH KARENA ITU, THEORIN DIMUTASI DENGAN ASAM AMINO LAIN
-
MEMBUAT PRIMER
REKAYASA GENETIKA
PROSES PCRSESUAI JENIS MUTASI
-
MENDESAIN PRIMERDesain primer yang dipilih memiliki beberapa parameter yang harus diikuti untuk
menghasilkan primer yang cocok dan paling optimal dalam melakukan quick
change site directed mutagenesis.
Kedua primer mutagen harus mengandung mutasi yang diinginkan dan anneal ke
sekuen yang sama pada untai yang komplemen pada
plasmid.
Panjang primer harus sekitar 25 sampai 45 basa, dengan suhu leleh (Tm) 780C. Primer dengan panjang lebih dari 45 basa dapat digunakan namun dapat meningkatkan kemungkinan terbentuknya struktur sekunder yang akan mempengaruhi efisiensi reaksi mutagenesis. Persamaan yang digunakan untuk menentukan Tm primer.
-
Tm = 81,5 + 0,41(%GC) 675/N - %mismatch (1)
N adalah panjang basa primer
Nilai %GC dan %mismatch adalah bilangan bulat
Untuk perhitungan Tm primer untuk proses yang melibatkan delesi dan insersi
menggunakan persamaan yang telah dimodifikasi berikut ini.
Tm = 81,5 + 0,41(%GC)-675/N (2)
Dimana N tidak melibatkan basa yang akan diinsersi ataupun didelesi
Gen apoptin akan di-mutagenesis dengan menggunakan Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit dari New England Biolabs. Pada sistem tersebut DNA yang akan dimutasi diperlukan dalam bentuk plasmid. Karena itu, tahapan awal sebelum dilakukan mutagenesis adalah
kloning gen apoptin ke dalam plasmid vektor.
-
MODIFIKASI GEN APOPTINATGAACGCTC TCCAAGAAGA TACTCCACCC GGACCATCAA CGGTGTTCAG GCCACCAACAAGTTCACGGC
CGTTGGAAAC CCCTCACTGC AGAGAGATCC GGATTGGTAT CGCTGGAATTACAATCACTC TATCGCTGTG
TGGCTGCGCG AATGCTCGCG CTCCCACGCT AAGATCTGCAACTGCGGACA ATTCAGAAAG CACTGGTTTC
AAGAATGTGC CGGACTTGAG GACCGATCAACCCAAGCCTC CCTCGAAGAA GCGATCCTGC GACCCCTCCG
AGTACAGGGT AAGCGAGCTAAAAGAAAGCT TGATTACCAC TACTCCCAGC CGACCCCGAA CCGCAAGAAG
GTGTATAAGACTGTAA
Modifikasi gen apoptin akan dilakukan dengan cara PCR.
Oleh karena itu, perlu dilakukan desain primer untuk memperbanyak gen apoptin serta memperpanjang gen tersebut dengan situs enzim restriksi.
(BamI apoptin HindII)
-
PRIMER YANG AKAN DIGUNAKAN DALAM GEN APOPTIN
Forward : 5-GGATCCATGCGCTGCAGGAGGATACC-3
Reverse : 5-AAGCTTTTACAGTCTTATACACCTT-3
-
TRANSFORMASI GEN DAN VEKTOR KE DALAM HOST CELL E. COLI
Vektor yang telah disisipkan gen apoptin akan dimasukkan ke sel host E.Coli. Teknik transformasi yang digunakan adalah elektroporasi karena DNA plasmid yang dibutuhkan untuk transformasi tidak perlu terlalu banyak.
Elektroporasi dilakukan dengan cara membuat perbedaan potensial (kejutan). Perbedaan potensial biasanya dibuat dengan charging kapasitor kemudian discharging melintasi elektroda.
Perbedaan potensial menyebabkan pembentukan pori pada membran sel.Pori tersebut membuat struktur membran sel menjadi permeable untuk proses pemindahan DNA menuju sitoplasma dalam sel.
-
SCREENING SEBELUM MENYISIPKAN GEN
Untuk seleksi klon rekombinan,
digunakan metode colony PCR.
Colony PCR adalah teknik untuk
mendeteksi ligasi yang sukses
dilakukan dalam vektor gen
kloning.
-
PERSIAPAN METODE COLONY PCR
Tabung PCR ditambahkan komponen PCR yaitu, buffer enzim Taq polimerase, dNTP mix, enzim Taq polimerase, primer reverse
dan primer forward.
Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR
dan memasuki tahap predenaturasi dengan suhu 95 oC
selama 5 menit.
-
PELAKSANAAN METODE COLONY PCR
Denaturasi 1 menit
pada 95 oC
Annealing selama 30 detik pada suhu 55 oC
Sintesis selama 2
menit pada 72 oC
Pasca sintesis pada 72 oC
selama 5 menit dan 15 oC selama 10
menit.
Hasil PCR dideteksi dengan
elektroforesis.
Siklus diulang 30 kali
-
MENYISIPKAN GEN APOPTIN KE DALAM VEKTOR
Gen apoptin dimasukkan kedalam MCS pada vektor yang telah disesuai dengan metode Q5 Site Directed Mutagenesis yaitu pUC19. Vertor ini telah disediakan oleh perusahaan penyedia Q5 Site Directed Mutagenesis.
Gen apoptin dimasukkan kedalam daerah restriksi diantara EcoR1 dan BamH1. Pada daerah EcoR1 akan dimasukkan ujung N Terminal, sedangkan pada daerah BamH1 dimasukkan ujung C Terminal dari gen apoptin.
Gen apoptin yang disisipkan adalah gen apoptin yang belum dimutasi, hal ini karena dengan menggunakan metode Q5 site directed mutagenesis dibutuhkan plasmid yang sudah tersisipi gen apoptin yang nantinya akan di PCR dengan primer yang sudah didesain dengan jenis mutasi yang diinginkan.
-
Pemilihan daerah EcoR1 dan BamH1 karena ketersediaan enzim restriksi yang dijual dan kedua daerah restriksi ini menghasilkan sticky end sehingga akan meningkatkan kemungkinan adanya penyisipan yang sempurna.
Penyisipan dilakukan dengan metode cut and ligase.
-
PELAKSANAAN
REKAYASA GENETIKA
PROSES PCR
-
BAHAN YANG DIGUNAKAN UNTUK PROSES PCR
Q5 hot start high fidelity 2X master
mix 12,5 L dengan konsentrasi 1X
10M forward primer 1,25L
dengan konsentrasi 0,5M
10M reverse primer 1,25L
dengan konsentrasi 0,5M
Template DNA ( 1 25 ng/L ) 1L
dengan konsentrasi 1
25 ng
Nuclease free water
-
TAHAP PELAKSANAAN PCR
Initial Denaturation dengan suhu 980C selama 30 detik
25 Cycles dengan suhu 980C selama 10 detik, kemudian 50 720C selama 10 30 detik selanjutnya 720C selama 20
30 detik/kb
Final Extension dengan suhu 720C selama 2 menit
Hold dengan suhu 4 100C
-
KLD TREATMENT (KINASE, LIGASE, DPNI)
Bahan yang dibutuhkan:
Produk PCR 1L, 2X KLD Reaction Buffer sebanyak 5L dengan konsentrasi 1X, 10X KLD Enzyme Mix sebanyak 1L dengan konsentrasi 1X dan nuclease free water
sebanyak 3L
Semua bahan yang sudah ada kemudian dicampur dengan cara memipet naik dan
turun kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.
-
TRANSFORMASI
REKAYASA GENETIKA
PLASMID KEHOST
-
Menyiapkan tabung dengan NEB 5- dengan sel E. Coli kompeten dalam es
Menambahkan 5L dari campuran KLD pada tahap sebelumnya yang berisi sel
yang dicairkan
Pelan-pelan mengocok tabung 4-5 kali untuk
dicampurkan,
Meletakkan pada es selama 30 menit
Dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit
Melakukan heat shock pada suhu 420C selama 30 detik
Mencampur sel dengan mengocok tabung dan
membolak-balik
Melakukan inkubasi selama 370C selama 60 menit dengan pencocokan
(250 rpm)
Memipet 950L pada suhu ruang SOC dalam
campuran
TAHAPAN TRANSFORMASI
-
SELEKSI HASIL AKHIR SEBELUM SCREENING
Menyebar hasil akhir sebanyak 50-100L ke
dalam plate untuk menseleksi
Menginkubasi semalaman pada
suhu 370C
OPSIONAL Bisa juga dilakukan pengenceran dengan 10-40 untuk transformasi campuran di
SOC sebelum disebar di plate
TUJUAN Untuk menghindari keberadaan koloni yang terlalu dekat
-
SCREENING
REKAYASA GENETIKA
HASIL DARITRANSFORMASI
-
METODE SCREENING YANG DIPILIH SESUAI JENIS VEKTOR YANG
DIGUNAKAN, MENGGUNAKAN:
BLUE WHITE SCREENING
-
MENGAPA BLUE WHITE SCREENING?
Pemilihan ini dikarenakan vektor memiliki area LacZ
yang merupakan pengkode sintesis beta-
galaktosidase.
-
MENGAPA PROSES SCREENING DILAKUKAN?Screening ini baru membuktikan apakan tahapan penyisipan
dan transformasi berhasil atau tidak.
Untuk mengetahui apakah mutasi berhasil atau tidak dan adakah pengaruh keberadaan Threonin 108 pada aktivitas apoptosis maka perlu dilakukan langkah tambahan seperti
pengujian aktivitas apoptosis hasil mutasi pada sel tumor atau dengan melakukan sekuensing untuk mengetahui urutan basa
nitrogen baru.
-
Menebarkan sel pada plate LB (100 g/ml ampicillin,40 g/ml X-gal, 50 g/ml IPTG) yang
dijaga pada suhu ruangan
Membiarkan plate tersebut semalaman pada suhu 370C hingga ditumbuhi sel
Membiarkan plate pada suhu 300C selama 24 jam agar warna yang dihasilkan lebih terlihat
TAHAPAN SCREENING
-
PERMASALAHAN YANG MUNGKIN TERJADI DALAM
REKAYASA GENETIKA
PENGGUNAANSITE-DIRECTED MUTAGENESIS
-
PERMASALAHAN Koloni hasil
transformasi tidak ada atau sedikit
Hasil PCR tidak ada atau sedikit
Efisiensi mutageneis
rendah
False Positive
Plasmid yang dihasilkan tidak mengandung mutasi yang diinginkan
-
KOLONI YANG DIHASILKAN PROSES SANGAT MINIM
Memastikan primer yang digunakan murni Menggunakan annealing temperature Mengecek mutasi yang diinginkan pada primer
Mengecek primer
Visualisasi template DNA dengan gel agarosa
Memastikan hasil PCR yang murni
Hanya 1 l, jika terlalu banyak dapat mengurangi efisiensi transformasi
Produk PCR yang digunakan untuk reaksi
KLD
Kurang dari 5 l, jika lebih harus digunakan sebelum proses transformasi
Hasil reaksi KLD yang digunakan pada
transformasi
-
Menggunakan pipet yang berukuran sangat kecil, dan memasukkan pipet ke bawah lapisan mineral
Mineral tidak terlibat dalam transformasi ketika memipet DNA
yang sudah direaksikan dengan Dpn I
Menambahkan jumlah DNA yang telah direaksikan dengan enzim hingga 4l
Memas2kan cukupnya DNA mutan yang disintesis pada
proses transformasi
Sesuai dengan agen seleksi yang digunakan pada plates
Tanda yang terseleksi pada plasmid
Sel kompeten disimpan dalam suhu-80C Sel kompeten (E. Coli) telah disimpan dalam suhu rendah
Hasil transformasi dikatakan efisien jika mengandung 1 x 109 Colony Farming Units (CFU) per g.
Mengecek efisiensi trasnformasi sel kompeten
-
EFISIENSI MUTAGENESIS RENDAH
Dipengaruhi penggunaan thermal cyclers, oleh karena itu parameter-parameter yang mempengaruhi perlu diperhatikan untuk meningkatkan efisiensi mutagenesis dan mengontrol reaksi Memastikan agar plate dipersiapkan dengan benar, untuk blue-white screening plates diinkubasi pada suhu 30C selama 24 jam
Campuran dNTP harus dihindarkan dari proses freeze-thaw, siapkan single aliquot yang akan digunakan lalu disimpan pada suhu -20C
M u n c u l n y a s t r u k t u r sekunder yang dapat m e n g h i b i s i r e a k s i mutagenesis. Struktur sekunder tersebut dapat d i h i l angkan deng an meningkatkan annealing temperature hingga 65C
-
HASIL PCR TIDAK ADA ATAU SEDIKIT
Memastikan Ta (optimal
annealing temperature)
Memastikan waktu elongasi cukup untuk panjang
plasmid (10-20 detik per kb
plasmid)
Memastikan konsentrasi
akhir tiap primer 0.5 m
Memurnikan primer dengan
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(PAGE)
False Positives
Kualitas primer rendah Mengecek degradasi
gel akrilamid atau sintesis ulang primer
Pembuatan primer yang salah
Meningkatkan annealing temperature
hingga 68C
-
MUTASI YANG DIINGINKAN TIDAK ADA PADA PLASMID
Memastikan desain primer mutagenik sudah benar
Mengoptimasi kondisi PCR
Menggunakan sel kompeten yang didesain untuk mencegah adanya rekombinasi plasmid DNA
Menggunakan 1-25 ng template pada tahapan PCR
-
QUALITY CONTROL
REKAYASA GENETIKA
PENGGUNAANSITE-DIRECTED MUTAGENESIS
-
QUALITY CONTROL TRANSFORMERTM SITE-DIRECTED MUTAGENESIS KIT
T r a n s f o r m e r S i t e - D i r e c t e d Mutagenesis Kit didesain untuk melangsungkan mutagenesis dengan metode site-directed pada rantai ganda DNA
Satu Kit terdiri dari 2 Box dengan konten sebagai berikut: Box 1: 200 l E. coli BMH 71-18 mutS Box 2: 150 l 10 X Annealing buffer 100 l 10 X Synthesis buffer 30 l T4 DNA polymerase 30 l T4 DNA ligase 20 l Nde I endonuclease 20 l pUC19M plasmid DNA
20 l Control Selection Primer (25mer) GAGTGCACCATGGGCGGTGTGAAAT
20 l Control Mutagenic Primer (22mer) CAGGGTTTTCCCAGTCACGACG
Sistem yang sangat efisien untuk site-directed mutagenesis in-vitro
Mutasi Spesifik (Substitusi, delesi, atau insersi dapat diperkenalkan ke gen target atau daerah kloning dengan situs restriksi yang unik dan dengan bacterial selection marker)
Kit dapat digunakan untuk meningkatkan delesi searah
-
QUALITY CONTROLKONDISI
PENYIMPANAN
Kotak penyimpanan 1: -70C.
Kotak penyimpanan 2: -20C.
UMUR PENYIMPANAN RAK
Disimpan dalam kondisi penyimpanan yang sesuai hingga 1 tahun sejak tanggal produksi
KONDISI SHIPPING
Kotak 1 dan Kotak 2: Dry Ice (70C)
Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit diuji untuk menguji kesuksesan mutagenesis menggunakan DNA pUC19M. Persen koloni biru yang dihasilkan ialah 78.4%