Download - Pendahuluan Makalah PABA (1)
MAKALAH BIOANALISIS
METODE ENZIMATIK UNTUK PENENTUAN SELEKTIF 4-AMINOBENZOIC
ACID PADA URIN
Disusun oleh :
Meita Eryanti (098114026)
Defi Krishartantri (098114031)
Melantina Maria (098114035)
Mayke Prasastia (098114037)
E.Raras Pramudita (098114040)
Christiana Lambang K. (098114041)
Kelas : B
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta
2011
PENDAHULUAN
Tujuan penelitian ini adalah untuk menampilkan metode yang lebih baik dalam
determinasi PABA dengan kombinasi teknik enzimatik dan kolorimetri dan membandingkan
metode ini dengan colorimetric assay untuk menghitung konsentrasi PABA total dalam
sampel urin dari pasien yang menjalani test fungsi pancreas dengan bentiromide.
4-amonibenzoic acid (PABA) digunakan sebagai komponen beberapa obat (misalnya
untuk analgesik atau anestesi), senyawa sunscreen, bentiromide (reagen yang digunakan
untuk mendiagnosa fungsi pankreas yang jika dihidrolisis menghasilkan PABA dan bisa
diukur dalam urin), dan sebagai senyawa untuk menguji kadar N-asetilasi dari obat obat
arilamin yang secara klinis biasa digunakan untuk terapi.
Metode untuk mendeterminasi PABA sebenarnya sudah ada (misalnya metode
diazocopling Bratton Marshall dan metode 4-dimetilaminobenzaldehide). Akan tetapi metode
metode tersebut memiliki spesifisitas yang rendah karena metode tersebut didasarkan pada
reaksi yang biasa untuk senyawa amin aromatis. Syarat untuk menggunakan metode tersebut
adalah sampel yang dianalisis menggunakan metode kolorimetri harus bebas dari senyawa
amin aromatis lainnya selain PABA.
FAD dependent monooxygenase, 4-aminobenzoate hydroxylase dimurnikan dan
dikarakterisasi dari jamur Agaricus bisporus. Kemudian enzim tersebut dapat merubah
PABA menjadi 4-hydroxyalanine seperti pada skema berikut:
Enzim mengkatalis dekarboksilasi hidroksilasi PABA dan membentuk 4-
hydroxyaniline dengan adanya NADH dan O2. Hasil reaksinya, HA, bisa diubah ke bentuk
indofenol stabil dengan mengkoplingnya dengan fenol dalam suasana asam. Indofenol itu
yang kemudian dikuantifikasi secara kolorimetri.
METODE PENELITIAN
1. Reagen yang digunakan
Semua bahan yang digunakan ada dalam tingkat analisis. Bahan bahan tersebut
adalah:
4-aminobenzoate hidroksilase dari A. bisporus. Enzim murni yang digunakan
memiliki aktivitas spesifik dari 23 kU / g protein di bawah kondisi pengujian
standar, di mana 1 U mewakili jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
mengoksidasi 1 µmol dari PABA per menit
Bentiromide (N-benzoil-L-tyrosyl-4-aminobenzoic acid; 500mg dalam 10 mL
saline) diperoleh dari Eizai Pharmaceutical Co (Osaka, Jepang)
N-(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida, FAD, NADH, PABA, dan HA dibeli
dari Sigma Chemical Co (St Louis, MO)
2. Penyiapan sampel urin
Sampel urin dikumpulkan dari 30 pasien yang menjalani tes fungsi pankreas dengan
bentiromide, 11 pasien yang memakai berbagai obat selain bentiromide, dan 10 relawan
yang sehat.
Sampel urin pasien yang disediakan oleh Departemen Laboratorium Kedokteran, Sekolah
Kedokteran, University of Tokushima, dari pasien rawat inap yang dicurigai sakit
pankreas, pencernaan, dan penyakit lainnya
Para pasien menjalani tes fungsi pankreas dengan diberikan oral 500 mg bentiromide
dengan air berlebih (> 200 ml) setelah puasa semalam
Urin dikumpulkan selama 6 jam setelah pemberian bentiromide
Tidak ada makanan atau obat yang diambil selama tes kecuali untuk asupan air
3. Penyiapan ekstrak ragi
Kue yang dipress (ragi roti, berat basah 40 g) dihomogenisasi dengan 100 mL H2SO4
50 mmol / L
Digunakan homogenizer Polytron kecepatan 4000 rpm selama 3 mm pada 0⁰C
(Kinematika, Kriens/Luzern, Swiss)
Homogenat diekstrasi dengan 100 mL etil asetat
Dipisahkan lapisan etil asetat dengan sentrifugasi pada 2000 x g selama 10 menit
Ekstraksi diulangi tiga kali dan pelarut diuapkan
Residu dilarutkan dalam 10 mL buffer potassium fosfat (100 mmol / L, pH 7,0), dan
residu ini digunakan sebagai bahan biologis yang terdiri dari PABA alami dan
arylamines lainnya
4. Persiapan sampel untuk penentuan PABA total
1 mL urin dimasukkan dalam tes tabung srew-capped Pyrex (12 mm x 4,5 cm)
Tambahkan 1 mL KOH 4 mol / L
Panaskan campuran pada 100⁰C selama 2 jam sesuai dengan metode Braganza untuk
memastikan pembebasan PABA dari PABA konjugat tanpa degradasi spontan dari PABA
Hidrolisat dinetralkan dengan menambahkan 0,25 mL asam asetat glasial, diencerkan sampai
25 mL dengan air deionisasi
PABA diukur untuk mengevaluasi spesifisitas dari metode yang diusulkan
5. Metode enzimatik untuk penentuan PABA
0,4 mL larutan sampel yang mengandung 0-250 µmol PABA per liter, ditambahkan 100 µL
(50 mU) dari larutan enzim dan 1 mL dari buffer potassium fosfat 100 mmol/L, pH 7.0
(mengandung FAD 0,17 mmol, NADH 0,75 mmol, dan 0,3 g per liter serum albumin sapi)
Inkubasi campuran pada 30⁰C selama 20 menit, dan ditambahkan 0,6 mL reagen asam
trikloroasetat 200 g/L untuk menguraikan NADH yang tidak bereaksi, sehingga tidak akan
mengganggu pembentukan pewarna indophenols
Setelah 5 menit, tambahkan 0,6 mL reagen kopling: NaOH 0,83 mol/L, fenol 0,2 mol/L, dan
Na2CO3 1,67 mol/L
Inkubasi campuran ini pada 30⁰C selama 20 menit
Ukur pewarna indophenol dihasilkan pada panjang gelombang 630 nm (Menggunakan
spektrofotometer model 200-20; Hitachi Ltd, Tokyo, Jepang) dalam kuvet kuarsa 1 cm dan
suatu blanko enzim
Untuk mempersiapkan blanko enzim, menggunakan 100 µL buffer potassium fosfat (100
mmol/L, pH 7,0) bukan dari larutan enzim 100 µL
Sampel dengan konsentrasi yang lebih besar dari batas yang dinyatakan linearitas harus
diencerkan dengan air deionisasi
6. Penentuan PABA dengan metode Diazo-kopling
Penentuan konsentrasi PABA dengan metode diazo-kopling sesuai prosedur Bratton dan
Marshall sebagai perbandingan
1 mL larutan sampel yang mengandung PABA 0-250 µmol/L, ditambahkan 1 mL larutan
HCI 100 mmol/L dan 0,2 mL dari masing-masing larutan berturut-turut dengan interval 4
menit:
(a) NaNO2 1 g/L, dalam larutan HC1 1,2 mol/L
(b) asam sulfamat 5 g/L, dan
(c) N-(1-naftil) etilendiamina hidroklorida 1 g/L
Setelah 20 menit, pewarna diazo terbentuk, diukur pada 550 nm terhadap blanko reagen
HASIL
Linearitas dan spesifisitas
Indolphenol terbentuk dari kondensasi HA dan fenol dibawah kondisi standar
pengujian untuk metode enzimatik memperlihatkan absorbs maksimum pada panjang
gelombang 630 nm dan stabil pada pH 10 – 12. Linearitas yang bagus antara konsentrasi HA
dan absorbansi pada panjang gelombang 630 nm didapat hingga konsentrasi 40 µmol/L.
gambar satu menunjukkan waktu pembentukan PABA secara enzimatik menjadi HA dalam
adanya berbagai jumlah enzim dibawah kondisi standar pengujian.
Jumlah kuantitatif perubahan PABA menjadi HA ditunjukkan pada setiap konsentrasi
enzim. Ketika kurva kalibrasi untuk metode enzimatik (keseluruhan reaksi, mulai dari PABA
hingga terbentuk indolphenol) diplotkan sebagai standar larutan PABA, kurva melalui
asalnya, dan konsentrasi PABA dan absorbansi pada panjang gelombang 630 nm
berhubungan secara linear hingga paling tidak untuk PABA konsentrasi 40µm/L. Jika tidak
ada enzim, PABA tidak memberi warna yang berarti pada panjang gelombang 630 nm pada
kondisi standar percobaan. Molar absortivitas indophenols adalah 2.8x104 L.mol-1.cm-1 pada
panjang gelombang 630 nm dibandingkan diazo yang nilainya 5.8x10-4 L.mol-1.cm-1 pada
panjang gelombang 550 nm.
Presisi
Ketika reprodusibilitas metode enzimatik diperkirakan untuk sampel urin dengan
PABA yang berbagai konsentrasi, terhitung dalam 10 kali replikasi, CV yang didapat 1.2%
dengan rata rata konsentrasi 0.86 mmol/L dan 0.5% pada rata rata konsentrasi 2.07 mmol/L.
presisi tersebut dinilai dengan menguji sampel urin (2 konsentrasi PABA yang berbeda)
rangkap 3 tiap hari untuk 10 hari berturut turut. CV tiap rangkap 3 tersebut adalah 2.7% pada
0.95 mmol/L dan 2.4% pada 2.29 mmol/L.
Korelasi antara metode enzimatik dan metode diazokopling
Konsentrasi PABA diuji dengan mengemukakan metode (x) yang dibandingkan
dengan penentuan menggunakan metode diazokopling (y) untuk hydrolisate sampel urin dari
sukarelawan yang sehat, yang diberi berbagai jumlah PABA. Persamaan keduanya terlihat
bagus yaitu: y = 1.03x + 0.15mmol/L (r=0.999). sampel urin dari sukarelawan yang sehat
dideteksi dengan metode enzimatik, tapi memberi hasil yang tidak bisa dideteksi PABAnya.
Analitical recovery
Analitical recovery dilakukan dengan 2 cara yaitu menggunakan sampel urine dari
pasien yang telah diberikan bentiromide dan alikuot dari yeast ekstrak, dimana pada
keduanya terdapat amin aromatis lain yang tidak diketahui yang bukan berasal dari PABA.
PABA dalam jumlah tertentu ditambahkan untuk memperkirakan jumlah PABA yang
diperoleh dari sampel. PABA ditambahkan pada larutan sampel yang akan dianalisis secara
kuantitatif dan dideteksi dengan menggunakan dua metode yaitu metode enzimatik dan
metode pengkoplingan diazo, tetapi nilai yang diperoleh dari metode pengkoplingan diazo
lebih tinggi dibandingkan dengan metode enzimatik (Tabel 1), menunjukkan adanya amin
aromatis selain dari PABA.
Selektivitas
Untuk melihat selektifitas dari metode enzimatik, dibandingkan dengan konsentrasi
dari PABA pada urin dari 30 pasien yang sedang mencalani tes fungsi pankreas yang
kadarnya diambil dari kedua metode tersebut. Pasien meminum obat sebelum malam berlalu.
Delapan sampel dari 30 pasien diuji dengan metode pengkoplingan diazo yang memberikan
hasil yang konstan dengan metode enzimatik, tetapi 22 sampel lain dianalisis dengan metode
pengkoplingan-diazo yang menunjukkan suatu nilai dimana antara 6% dan 37% lebih tinggi
diperoleh dari metode enzimatik (21,7±7,9%, mean±SD). Secara keseluruhan koefisien
korelasi antara kedua metode tersebut adalah 0,994, dngan slope 1,11, dan y-intersep adalah
0,07 mmol/L (y=metode pengkoplingan-diazo, n=30).
Interferensi
Sampel urin dari pasien yang meminum berbagai macam obat yang sama dengan
yang telah tercantum pada kurva klinis diatas yang sedang ditest fungsi pankreasnya, tetapi
tidak mendapatkan bentiromide, yang diperiksa dengan cara yang sama dengan menentukan
konsentrasi PABA. Tujuh dari sebelas sampel memberi hasil yang positif (ekuivalen dengan
0,6-1,73 mmol/L PABA) yang dideteksi dengan metode pengkoplingan-diazo, sedangkan
semua nilai dari metode enzimatik perlu dicari lagi jumlahnya. Inhibitor pada metode
enzimatik yaitu sampel urin yang diuji dengan cara yang sama dengan pengujian recovery
seperti yang telah dijelaskan diatas, sebelum dan sesudah hidrolisis sampel urin. Peneliti juga
mengamati adanya efek tanpa inhibitor pada metode enzimatik dan penambahan PABA pada
sampel perolehan secara kuantitatif.
Peneliti juga melakukan pengujian secara in vitro pada obat yang biasa digunakan
(e.g.xylocaine, hydralazine, diazepam, sulfamethoxazol, phenacetin, prokain, asetaminofen,
clonidin, dan furosemid) yang mungkin dapat mengganggu metode enzimatik atau metode
pengkoplingan-diazo. Setiap obat yang ditambahkan pada sampel urin dari relawan yang
sehat pada konsentrasi 100mg/L. Sampel ini diambil dari hasil hidrolisis dan analitis
prosedurnya telah dijelaskan diatas. Hampir semua obat-obatan diatas, kecuali diazepam,
prokain, dan phenacetin, tidak menghasilkan absorbansi pada 630 nm pada metode enzimatik.
Hanya diazepamyang terhambat pada konversi enzimatik dari PABA ke HA, tetapi
penghambatan tersebut diabaikan pada konsentrasi diazepam <10 mg/L pada sampel urin.
Penghambatan ini juga dapay dihindari dengan menambahkan jumlah enzim berlebih
(100mU) dalam standart dala kondisi pengujian. Prokain dan acetominofen adalah derivat
dari 4-aminobenzoic acid dan 4-hidrokxyanilin, berturut-turut, terdapat kesalahan pada kedua
metode tersebut. Terutama pada penambahan prokain pada sampel urin didapatkan nilai
PABA sebagai hasil kuantitatif (97%-100%) pada kedua metode ini. Perolehan kembali
acetaminofen sebagai 4-hydroxyanilin antara 0,7%-8%, menunjukkan bahwa sebagian besar
acetaminofen terdegradasi oleh hidrolisis basa. Phenacetin dan obat sulfa seperti
sulfamethoxazol memberikan absorbansi yang signifikan pada 550 nm pada metode
pengkoplingan-diazo, tetapi tidak mengganggu metode enzimatik.
PEMBAHASAN
Prinsip kerja dalam metode enzimatik ini yaitu mengukur 4-Aminobenzoic acid
(PABA) dengan menggunakan enzim 4-aminobenzoate hydroxylase menjadi 4-
hydroxyaniline (HA). HA dikonversi menjadi indophenol dengan melakukan reaksi
pengklopingan dengan fenol pada kondisi alkali.
Peneliti memilih sampel berupa PABA karena PABA merupakan komponen dari
beberapa obat misalnya analgesik atau anestesi. Metode yang selama ini digunakan untuk
mengukur PABA adalah metode kolorimetri tapi metode ini tidak spesifik pada PABA karena
metode itu berdasar adanya reaksi umum untuk banyak senyawa amin aromatis. Jika
menggunakan metode kolorimetri maka sampel tersebut harus dipastikan bebas dari senyawa
amin aromatis selain PABA. Oleh karena itu, peneliti mengajukan metode baru yang
merupakan kombinasi antara metode enzimatik dan kolorimetri.
Metode enzimatik ini dapat menentukan PABA dengan lebih spesifik daripada
pengukuran umumnya yaitu kolorimetri dengan metode diazo kopling. Kurang spesifitasnya
pengukuran kolorimetri untuk PABA diatasi dengan mengkombinasi reaksi enzimatik untuk
mengubah PABA menjadi HA dan pengukuran HA dengan kolorimetri. Enzim spesifik untuk
amin aromatis dengan gugus karboksil pada posisi orto atau para. Perubahan enzimatik dari
PABA menjadi HA juga bermanfaat bagi pengukuran kolorimetri HA karena indophenol
spesifik untuk HA. Pada penentuan awal PABA dengan reaksi pengkoplingan secara
langsung dengan penambahan phenol pada hypochlorite menunjukkan reproduktifitas yang
buruk.
Meskipun reaksi hidroksilase 4-aminobenzoat secara stoikiometri membutuhkan 1
mol NADH untuk mengkonversi 1 mol PABA menjadi HA, beberapa kandungan aromatik
seperti asam anthranilik dan 4-aminosalisilat, dapat bertindak sebagai substrat dengan luas
tertentu. Namun, baik bahan maupun produk yang dibentuk dari asam anthranilik dan 4-
aminosalisilat melalui reaksi pembentukan enzimatik dengan indophenol dilakukan di bawah
kondisi yang digunakan pada metode yang diusulkan. Karena, metode pewarna indophenol
lebih selektif dan spesifik dibandingkan pengukuran spektrofotometri yang secara langsung
mengukur jumlah NADH yang digunakan untuk reaksi enzimatik. Hasil dari kedua reaksi
metode diazo pengkoplingan dan metode baru yang diajukan oleh peneliti dengan sampel
urin menunjukkan beberapa perbedaan antara perkiraan konsentrasi PABA dengan dua
metode mengusulkan bahwa urin pasien mungkin mengandung amin aromatik sebagai
metabolit yang diadministrasikan pada obat atau makanan. Pada kecepatan satu malam,
disarankan dipercepat, mungkin karena tidak cukup untuk menghindari interferensi obat
secara kompleks. Dari tes interferensi obat, banyak obat tidak tercampur pada metode enzim,
kecuali obat yang berhubungan pada asam 4-aminobenzoic dan 4-hydroxyaniline. Obat sulfa
yang bereaksi dengan metode reaksi pengkoplingan diazo tidak menunjukkan efek pada
metode kami. Tes in vitro interferensi obat menunjukkan 100mg/L Diazepam menghambat
perubahan enzimatik PABA menjadi HA. Namun, hasil sampel urin pasien yang menerima
20mg Diazepam menghasilkan diazepam pada konsentrasi therapetik ( 4-20mg untuk pasien
dewasa) tidak mengganggu metode kami. Pada eksperimen, pasien yang menjalani tes fungsi
pankreas dengan bentiromide menurut laporan yang diterima tidak ada obat yang
berhubungan dengan asam 4-aminobenzoic sebelum puasa. Ini mengindikasikan gangguan
pada obat atau makanan dapat dihindari dalam semalam, sehingga ketidaklanjutan
pengobatan dapat diminimalkan dengan menggunakan metode enzimatik. Dengan metode
pertama yang diandalkan, menentukan konsentrasi PABA pada cairan tubuh ketika pasien
masih mengkonsumsi obat.
Kekurangan utama metode yang dipresentasikan ini adalah membutuhkan persiapan
enzim, 4-aminobenzoat hidrosilase, dan membutuhkan waktu untuk persiapan sampel. Enzim
yang digunakan pada metode ini harus bebas dari tirosinase yang ada pada mushroom, yang
dapat dengan mudah dikenali oleh kromatografi ion exchange atau step pertama dari
purifikasi dengan kromatografi afinitas ekstrak yang secara komersial mengandung
mushroom A. bisporus. Studi lebih lanjut sekarang dalam proses untuk mengubah tahap
waktu konsumsi seperti penambahan reagen multipel dan pengubahan enzimatik PABA
menjadi HA, dan juga mengevaluasi aplikasi metode baru ini pada jenis spesimen lain seperti
darah, serum, dan plasma
KESIMPULAN
Metode enzimatik bisa menjadi metode yang lebih spesifik pada pengukuran PABA
dibanding dengan metode diazokopling biasa karena bisa mengurangi pembacaan absorbansi
dari penggangggu.