Download - Laporan Prakerin Nurlatifah
-
LAPORAN PRAKTIK KERJA INDUSTRI
DI PT EQUILAB INTERNATIONAL CILANDAK JAKARTA
oleh
Nurlatifah
NIS 09.55.06533
KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA
Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri
Sekolah Menengah Kejuruan SMAK
Bogor
2013
-
LAPORAN PRAKTIK KERJA INDUSTRI
DI PT EQUILAB INTERNATIONAL CILANDAK JAKARTA
Sebagai Syarat untuk Mengikuti Ujian Akhir SMK Sekolah Menengah Analis
Kimia Bogor Tahun Ajaran 2012/2013
oleh
Nurlatifah NIS. 09.55.06533
KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA
Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri
Sekolah Menengah Kejuruan SMAK
Bogor
2013
-
LEMBAR PERSETUJUAN DAN PENGESAHAN
Disetujui dan disahkan oleh :
Disetujui oleh :
Yan Tirta Indra Kurniawan, S.SI
NIP 2009 06 00859
Pembimbing I,
Iwan Dwi Santoso S.Si
NIP 2004 09 13362
Pembimbing II,
Ir. Tin Kartini M.Si
NIP 19640316 199403 2 003
Pembimbing III,
Disahkan oleh,
Dra. Hadiati Agustine
NIP 19570817 198103 2 002
Kepala Sekolah Menengah Kejuruan SMAK Bogor
-
i
KATA PENGANTAR
Laporan Praktik Kerja Industri (Prakerin) di PT Equilab International ini
disusun sebagai laporan atau tugas akhir hasil pengalaman prakerin selama tiga-
setengah bulan yang dimulai pada tanggal 11 November 2012 hingga 27 Januari
2013. Laporan ini merupakan persyaratan bagi siswa/siswi kelas XIII untuk
mengikuti Ujian Akhir di Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor Tahun Ajaran
2012/2013.
Laporan ini diberi judul, Validasi Metode Analisis Senyawa Pyrazinamide
dalam Plasma Darah secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang secara garis
besar berisi Pendahuluan , Tinjauan Umum PT Equilab International, Kegiatan di
Laboratorium, Tinjauan Pustaka, Metode Analisis, Hasil dan Pembahasan, serta
Simpulan dan Saran. Adapun isi materi laporan ini lebih menekankan kepada
Validase Metode.
Puji syukur Penyusun panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas
rahmat dan karunia-Nya, Penyusun dapat menyelesaikan laporan prakerin ini
tepat pada waktunya. Penyusunan laporan ini juga terwujud berkat adanya
bimbingan, dorongan, serta bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,
Penyusun ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Dra. Hadiati Agustine selaku Kepala Sekolah Menengah Analis Kimia
Bogor beserta seluruh Staf Pendidik dan Kependidikan yang telah
memberikan bimbingan selama menjalani pendidikan di Sekolah.
2. Yan Tirta Indra Kurniawan, S.Si selaku Manajer Teknis PT Equilab
International sekaligus Pembimbing I Institusi yang telah membantu
dalam hal pengarahan dan memberikan kesempatan kepada Penyusun
untuk meaksanakan prakerin.
3. Bapak Iwan Dwi Santoso S.Si selaku Pembimbing II Institusi yang telah
membantu dalam hal pengarahan dan memberikan kesempatan kepada
Penyusun untuk melaksanakan prakerin.
4. Amilia Sari Ghani, S.Si, selaku Wakil Kepala Bidang Hubungan
Kerjasama Industri yang menjadi penyambung antara Penyusun dengan
PT Equilab Inernational.
5. Tin Kartini selaku Pembimbing Prakerin dari sekolah yang telah
membimbing Penyusun baik dalam kegiatan prakerin maupun dalam
penyusunan laporan ini.
-
ii
6. Ganjar Bayu Aji S.Si dan Kak Irawati Luthfy selaku Analis PT Equilab
International sekaligus Pembimbing yang telah membantu memberikan
pengarahan pada Penyusun selama melaksanakan prakerin.
7. Lucia Rat Handayani, S.Si; Teh Siti Halimah, Teh Euis Dewi Kurnia, Kak
Amalia Sabila, Kak Laras Wirahmawati, Kak Sri Wahyuni, Ka Ismi
Sakinah, Kak Gilang Aria Bintang, Mas Rahmad Dian, serta seluruh staf
PT Equilab International yang tidak dapat Penyusun sebutkan satu
persatu, yang telah memberikan dukungan dan masukan selama
prakerin.
8. Orangtua tercinta Dr. Arwan Sugiharo dan R. Dedeh Widiarsih, serta
segenap keluarga tercinta yang telah memberikan dukungan baik moril
maupun materiil kepada Penyusun secara tulus tiada henti.
9. Huda Yeni Rachmalia., rekan satu perjuangan Penyusun selama Prakerin
di PT Equilab International.
10. Sahabat-sahabat tercinta Ahmadi Apri Fathoni, Azaria Dian Mayangsari,
Gandes Fatiya Rahmah, Khisma Arum Firdaus, Zakia Maulida, Ilva
Mawasri Tartiwi, Saraswati Regina Putri, Rachmanda Febriati G., dan
rekan-rekan seperjuangan di Wisma Jihan yang maaf tak bisa disebutkan
satu persatu atas jasanya yang senantiasa mengiringi dalam setiap
langkah Penyusun di saat suka maupun duka.
11. Rekan-rekan angkatan seperjuangan tercinta Fosgena Survivor
Angkatan 55, Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor.
12. Serta semua pihak yang telah membantu pelaksanaan praktikum hingga
penyusunan laporan, yang tidak dapat Penyusun sebutkan satu persatu.
Tak ada satu pun gading yang tak retak, begitu pula manusia tidak ada
satupun yang sempurna. Oleh karena itu, Penyusun embuka diri untuk kritik dan
masukan yang dapat membantu penyempurnaan laporan ini sehingga dapat
dijadikan masukkan untuk perbaikan di masa yang akan datang.
Semoga laporan ini bermanfaat bagi pembaca pada umumnya dan
rekan-rekan sebidang keahlian, khususnya siswa/siswi Sekolah Menengah
Analis Kimia Bogor.
Bogor, Maret 2013
Penyusun
-
iii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................ i
DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... ix
BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1
A. Latar Belakang ....................................................................................... 1
B. Tujuan .................................................................................................... 2
C. Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Praktik Kerja Industri ............................ 3
D. Pembuatan Laporan ............................................................................... 3
BAB II INSTITUSI PRAKERIN ............................................................................ 5
A. Latar Belakang ....................................................................................... 5
B. Visi dan Misi ........................................................................................... 6
1. Visi ......................................................................................................... 6
2. Misi ........................................................................................................ 6
C. Standar Kerja ......................................................................................... 6
D. Ruang Lingkup Penelitian ...................................................................... 7
E. Metode Penelitian dan Peralatan ........................................................... 8
F. Tim Peneliti ............................................................................................ 8
G. Organisasi .............................................................................................. 8
BAB III KEGIATAN DI LABORATORIUM ........................................................... 9
A. Tinjauan Pustaka ................................................................................... 9
1. Obat ....................................................................................................... 9
2. Tuberkulosis......................................................................................... 12
a. Klasifikasi Penyakit TBC .................................................................. 14
b. Penularan ........................................................................................ 14
c. Diagnosis Penyakit TBC ................................................................... 15
d. Komplikasi Penyakit TBC ................................................................. 16
-
iv
3. Pyrazinamide ....................................................................................... 17
a. Farmakologi ..................................................................................... 18
e. Indikasi ............................................................................................. 18
f. Kontra-Indikasi ................................................................................. 18
g. Efek Samping ................................................................................... 19
h. Interaksi Obat ................................................................................... 19
4. Methyl prednisolone ............................................................................. 19
5. Plasma Darah ...................................................................................... 20
6. Validasi Metode ................................................................................... 22
a. Selektivitas ....................................................................................... 23
b. Akurasi ............................................................................................. 24
c. Presisi .............................................................................................. 24
d. Perolehan Kembali (Recovery)......................................................... 24
e. Kurva Kalibrasi Standar.................................................................... 25
f. Stabilitas .......................................................................................... 26
7. Teori Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .......................................... 28
a. Mekanisme Pemisahan .................................................................... 29
b. Instrumentasi KCKT ......................................................................... 33
B. Metode Analisis .................................................................................... 42
1. Dasar ................................................................................................... 42
2. Alat dan Bahan .................................................................................... 43
a. Alat .................................................................................................. 43
b. Bahan .............................................................................................. 44
3. Cara Kerja ............................................................................................ 44
a. Pembuatan Standar Pyrazinamide 500 g/mL .............................. 44
b. Pembuatan Internal Standar Methyl prednisolone 150 g/mL ....... 45
c. Persiapan Larutan Uji (Plasma Darah) ............................................. 45
-
v
d. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Pengawasan Mutu (Quality Control)
........................................................................................................ 46
e. Pengerjaan Analisis ......................................................................... 46
f. Kondisi Lingkungan .......................................................................... 47
g. Kondisi KCKT ................................................................................... 48
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 49
A. Kurva Kalibrasi Standar (Standard Calibration Curve) .......................... 49
1. Kurva Kalibrasi (Calibration Curve) ...................................................... 49
2. Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control Samples) ......................... 50
a. Linearitas ......................................................................................... 50
b. Batas Terendah Kuantifikasi (Lower Limit of Quantification/LLOQ) .. 51
B. Presisi (Precision) ................................................................................ 52
1. Pengujian Presisi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Precision Within-
Day Variation) ...................................................................................... 52
2. Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda (Inter-Assay Precision Day-
to-Day Variation) .................................................................................. 53
C. Akurasi (Accuracy) ............................................................................... 53
1. Pengujian Akurasi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Accuracy Within-
Day Variation) ...................................................................................... 53
2. Pengujian Akurasi pada Hari yang Berbeda (Intra-Assay Accuracy Day-
to-Day Variation) .................................................................................. 54
D. Selektifitas (Selectivity) ........................................................................ 55
1. Selektifitas Analit (Selectivity of Analyte) .............................................. 55
2. Selektifitas Internal Standar (Selectivity of Internal Standard) .............. 56
E. Perolehan Kembali (Recovery) ............................................................ 57
F. Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) .............................................. 58
G. Stabilitas (Stability) ............................................................................... 59
1. Stabilitas Larutan Standar (Stability of The Standard Solution) ............ 59
a. Pada Suhu Kamar ............................................................................ 59
-
vi
b. Pada Kondisi Penyimpanan ............................................................. 61
2. Stabilitas Sampel dalam Plasma (Stability of The Plasma Samples) .... 63
a. Pada Suhu Ruang ............................................................................ 63
b. Pada Kondisi Penyimpanan ............................................................. 65
c. Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan (Influences of Freeze
and Thaw Cycle) .............................................................................. 66
d. Stabilitas Pasca Preparasi (Post Preparative Stability) ..................... 68
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................. 75
A. Simpulan .............................................................................................. 75
B. Saran ................................................................................................... 75
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 76
LAMPIRAN ........................................................................................................ 79
-
vii
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Komposisi Plasma dan Fungsi Utamanya ............................................ 20
Tabel 2 Tabel Pembuatan Kurva Kalibrasi ........................................................ 46
Tabel 3 Komposisi Gradien ............................................................................... 48
Tabel 4 Kurva Kalibrasi Standar ....................................................................... 50
Tabel 5 Batas Terendah Kuantifikasi/LLOQ ...................................................... 51
Tabel 6 Pengujian Presisi Pada Hari yang Sama .............................................. 52
Tabel 7 Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda .......................................... 53
Tabel 8 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Sama ............................................. 54
Tabel 9 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Berbeda......................................... 54
Tabel 10 Pengujian Selektifitas Analit (Pyrazinamide) ....................................... 56
Tabel 11Pengujian Selektifitas Internal Standar (Methyl prednisolone) ............. 57
Tabel 12 Pengujian Recovery............................................................................ 58
Tabel 13 Pengujian Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) ............................ 59
Tabel 14 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Suhu Ruang ........................ 60
Tabel 15 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Suhu Ruang .............. 61
Tabel 16 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Kondisi Penyimpanan ......... 62
Tabel 17 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Kondisi Penyimpanan 63
Tabel 18 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Suhu Ruang 64
Tabel 19 PengujianStabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Suhu Ruang .... 64
Tabel 20 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Kondisi
Penyimpanan ....................................................................................... 65
Tabel 21 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Kondisi
Penyimpanan ....................................................................................... 66
Tabel 22 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap
Sampel Konsentrasi Rendah ................................................................ 67
Tabel 23 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap
Sampel Konsentrasi Tinggi .................................................................. 67
Tabel 24 Pengujian Stabilitas Sampel Pasca Preparasi .................................... 68
Tabel 25 Rangkuman Hasil Validasi Metode Analisis Pyrazinamide .................. 70
-
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Paru-paru Penderita TBC Melalui Sinar X ........................................ 12
Gambar 2 Bakteri Mycobacterium tuberculosis ................................................ 13
Gambar 3 Penyebaran Bakteri TBC ................................................................. 15
Gambar 4 Gambar Struktur Pyrazinamide ........................................................ 17
Gambar 5 Struktur Senyawa Methyl prednisolone ............................................ 19
Gambar 6 Instrumentasi KCKT ........................................................................ 33
Gambar 7 Bagan Pompa Reciprocating ........................................................... 34
Gambar 8 Bagan Pompa Sistem Pergantian .................................................... 35
Gambar 9 Bagan Pompa Tekanan Udara ........................................................ 36
Gambar 10 Linearitas Kurva Kalibrasi ............................................................... 51
-
ix
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Struktur Organisasi PT Equilab International ............................... 79
Lampiran 2 Instrumentasi HPLC (Waters Alliance e2695) ............................. 80
Lampiran 3 Pembuatan Reagen/Pereaksi ..................................................... 81
Lampiran 4 Prosedur Proses Analisis Data di KCKT...................................... 82
Lampiran 5 Prosedur Pemakaian pH-meter ................................................... 83
Lampiran 6 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko (Interday 1) .......... 84
Lampiran 7 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko+Internal Standar
(Interday 1) ................................................................................. 85
Lampiran 8 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 1 (Interday 1) ...... 86
Lampiran 9 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 2 (Interday 1) ...... 87
Lampiran 10 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 3 (Interday 1) ...... 88
Lampiran 11 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 4 (Interday 1) ...... 89
Lampiran 12 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 5 (Interday 1) ...... 90
Lampiran 13 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 6 (Interday 1) ...... 91
Lampiran 14 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control)
Konsentrasi Rendah (Interday 1) ................................................ 92
Lampiran 15 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control)
Konsentrasi Sedang (Interday 1) ................................................. 93
Lampiran 16 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control)
Konsentrasi Tinggi (Interday 1) ................................................... 94
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Dewasa ini, pembangunan di sektor industri semakin meningkat,
maka tidak dapat dipungkiri bahwa sekolah-sekolah kejuruan, khususnya
Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor harus mampu menghadapi tuntutan
dan tantangan yang senantiasa muncul dalam era-globalisasi seperti
belakangan ini. Mengingat tuntutan dan tantangan masyarakat industri di
tahun-tahun mendatang akan semakin meningkat dan bersifat padat
pengetahuan dan keterampilan, maka Pengembangan Pendidikan Menengah
Kejuruan khususnya rumpun Kimia Analis harus difokuskan kepada kualitas
lulusan. Hal ini sesuai dengan Pasal 15 Undang-undang Sisdiknas No. 20
Tahun 2003, yang menyebutkan bahwa Sekolah Menengah Kejuruan
merupakan pendidikan menengah yang mempersiapkan peserta didik
terutama untuk bekerja dalam bidang tertentu. Berkaitan dengan itu, maka
pola pengembangan yang digunakan dalam pembinaan sistem pendidikan
menjadi sangat penting.
Seorang analis kimia yang terampil tidak cukup hanya dibekali ilmu
kimia terapan dan praktikum-praktikum di sekolah. Melainkan perlu
pengalaman langsung di dunia industri. Hal ini disebabkan, banyaknya hal-
hal baru diluar teori yang diberikan di sekolah yang hanya akan didapatkan
dengan terjun langsung ke dunia industri.
Sesuai dengan tujuan dari program pendidikan di Sekolah Menengah
Analis Kimia Bogor (SMAKBo) yaitu menyiapkan lulusan untuk menjadi
tenaga kerja tingkat menengah dalam bidang teknisi pengelola laboratorium,
pengatur dan pelaksana analisis kimia, serta melanjutkan ke jenjang yang
kebih tinggi. Maka diperlukaan adanya kemitraan antara sekolah dengan
dunia industri yang akan membantu kekurangan sekolah melalui Praktik Kerja
Industri (Prakerin).
Pelaksanaan prakerin dibantu sepenuhnya oleh balai atau lembaga
pemerintah dan perusahaan-perusahaan industri yang berhubungan dengan
kimia dan atau mikrobiologi. Materi prakerin dititikberatkan pada latihan
-
2
analisis kimia yang merupakan analisis sehari-hari dan bukannya penelitian
seperti halnya pada program diploma atau sarjana. Pelaksanaan prakerin
dititikberatkan pada pemantapan metode analisis, program pengendalian
mutu, dan pengetahuan tentang komoditas yang dianalisis.
Saat pelaksanaan Praktik Kerja Industri (Prakerin) siswa dapat
melihat, mempelajari, dan mempraktikkan prosedur dan peralatan modern
yang tidak mungkin dilakukan di sekolah. Selain praktik laboratorium, siswa
juga berkesempatan untuk berkenalan dengan lingkungan kerja yang
sesungguhnya, sehingga dapat beradaptasi dengan baik dengan lingkungan
kerja yang akan dihadapi pada masa mendatang. Praktik kerja industri ini pun
dapat menambah pengalaman kerja, menambah wawasan secara berdikari
dibawah bimbingan yang terarah dan terpantau, baik oleh sekolah maupun
oleh institusi tempat dilaksanakannya prakerin. Sehingga bila lulus nanti akan
menjadi seorang analis kimia yang terampil, kreatif,produktif, dan bermoral.
Kesempatan para siswa SMAKBo dalam Praktik Kerja Industri
(Prakerin) ini tentunya telah menjadi suatu keuntungan yang sangat baik bagi
para pelaku industri pemula. Lebih jauh lagi dalam bidang kimia analisis yang
mendominasi perkembangan zaman, dan berdampak pada kemajuan
nasional. Individu yang terampil merupakan aset yang sangat penting untuk
kemajuan suatu negara. Selain itu, kegiatan Praktik Kerja Industri (Prakerin)
ini juga merupakan suatu syarat kelulusan untuk semua siswa kelas XIII
Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBo) yang dilakukan baik di
Instansi Pemerintah, BUMN, BUMD, Lembaga-lembaga Penelitian, serta
perusahaan yang memiliki Laboratoriun Kimia Analisis maupun Laboratorium
Mikrobiologi.
B. Tujuan
Tujuan pelaksanaan Praktik Kerja Industri (Prakerin) khususnya yang
berlangsung mulai 12 November 2012 hingga 1 Maret 2013 adalah sebagai
berikut:
1. Meningkatkan kemampuan dan memantapkan keterampilan siswa
sebagai bekal kerja yang sesuai dengan Program Studi Kimia Analisis.
2. Menumbuhkembangkan dan memantapkan sikap profesional siswa
dalam rangka memasuki Lapangan Kerja.
-
3
3. Meningkatkan wawasan siswa pada aspek-aspek yang potensial dalam
dunia kerja, antara lain : Struktur, Organisasi, Disiplin, Lingkungan
Kerja, dan Sistem Kerja.
4. Menigkatkan pengetahuan siswa dalam hal penggunaan Instrumen
Kimia Analisis yang lebih modern, dibandingkan dengan fasilitas yang
ada di sekolah.
5. Memperoleh masukan dan umpan balik, guna memperbaiki serta
mengembangkan pendidikan di Sekolah Menengah Analis Kimia.
6. Memperkenalkan Fungsi dan Tugas seorang Analis Kimia kepada
Lembaga-lembaga Penelitian dan Perusahaan Industri di tempat
pelaksanaan prakerin.
7. Melatih siswa agar dapat menerapkan pengetahuan dalam dunia kerja ,
baik teori maupun praktik yang telah diberikan di sekolah.
8. Menumbuhkan pengetahuan dalam analisis berbagai material di dunia
industri.
9. Memberikan peluang untuk penempatan lulusan dan kerja sama.
C. Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Praktik Kerja Industri
Prakerin dilaksanakan di unit atau bagian dalam Perusahaan Industri
atau Lembaga Penelitian, terutama yang mendukung terhadap kegiatan atau
pendidikan Kimia Analisis. Adapun tempat Prakerin yang dipilih oleh
Penyusun adalah PT. Equilab International yang berlokasi di Jalan RS.
Fatmawati Persil 33 Cilandak-Jakarta Selatan dengan waktu pelaksanaan
mulai 12 November 2012 sampai 1 Maret 2013.
D. Pembuatan Laporan
Pada akhir kegiatan Praktik Kerja Industri, siswa/siswi diwajibkan
membuat laporan yang nanti akan diujikan sebagai syarat kelulusan siswa.
Adapun tujuan pembuatan laporan ini yaitu :
1. Mengembangkan kemampuan siswa dalam mengumpulkan data dan
meningkatkan kemampuan berfikir terutama dalam mengevaluasi data.
2. Memantapkan dalam penerapan pelajaran bagi siswa dari sekolah ke
tempat prakerin.
-
4
3. Sebagai bahan ujian lisan dan pertanggungjawaban kepada sekolah
atas prakerin yang telah dilakukan.
4. Menambah koleksi pustaka di perpustakaan sekolah sehingga dapat
menambah ilmu bagi para pembaca.
-
5
BAB II
INSTITUSI PRAKERIN
A. Latar Belakang
PT Equilab International adalah suatu perusahaan independen di
Indonesia yang bergerak dalam bidang penelitian, khususnya dalam Uji
Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE) dan Uji Klinilk. Dalam rangka upaya
pemerintah Indonesia menyediakan obat yang bermutu baik dengan harga
relatif murah bagi masyarakat, Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM)
meminta produsen obat di Indonesia untuk juga membuktikan kualitas obat
salinan (copy) ekivalen dengan obat inovator melalui uji BA/BE disamping
standar-standar lain yang selama ini telah berlaku. Pembuktian melalui uji
BABE memiliki dampak yang sangat positif bagi masyarakat, pemerintah, dan
institusi farmasi karena :
1. Dapat meningkatkan keyakinan masyarakat bahwa obat yang
diproduksi di Indonesia mempunyai mutu yang baik disamping
harganya yang lebih kompetitif.
2. Memacu industri farmasi di Indonesia untuk terus memperbaiki kualitas
produknya.
3. Mendukung industri farmasi di Indonesia untuk dapat memasarkan
produknya di luar negeri.
Selain uji BA/BE, PT Equilab International juga memberikan jasa
untuk penelitian uji klinik dengan tujuan untuk menguji efektivitas dan
keamanan suatu obat/pengobatan pada sekelompok manusia sehat/penderita
dalam jumlah tertentu agar hasilnya dapat ditetrapkan pada penderita lain di
kemudian hari secara rutin.
-
6
B. Visi dan Misi
1. Visi
Menjadi perusahaan penyedia jasa penelitian terkemuka di
regional dan global, khususnya di bidang Bioavailabilitas/Bioekivalensi
(BA/BE) dan Uji Klinik dengan keunggulan bersaing yang memenuhi
standar internasional.
2. Misi
Adapun misi dari PT Equilab International diantaranya :
Mengembangkan dan melaksanakan penelitian yang
berkualitas tinggi.
Mengembangkan kemitraan berkelanjutan dengan pelanggan.
Menerapkan ilmu pengetahuan dan eknologi tepat guna, serta
menjunjung tinggi etika penelitian dengan mengutamakan
keselamatan subjek penelitian.
Beradaptasi aktif dalam mewujudkan standar obat bermutu.
Meningkatkan kemampuan sumber daya manusia dan sistem
secara berkelanjutan.
C. Standar Kerja
Dalam melakukan pengujian klinis pada subjek manusia, PT Equilab
International menggunakan standar Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB) yang
merupakan standar ICH-Good Practice yang telah diadopsi oleh pemerintah
Indonesia pada tahun 2001 dan WHO Annex 9 : Additional Guidance for
Organizations Performing In-Vitro Bioequivalence Studies. Standar Mutu dan
Kompetensi Laboratorium yang digunakan oleh PT Equilab International
adalah ISO/IEC 17025:2005 dan untuk operasional sistem manajemen untuk
kegiatan pengujian PT Equilab International memenuhi prinsip-prinsip
manajemen mutu dalam ISO 9001:2000 yaitu dalam melaksanakan
peningkatan berkesinambungan dan penentuan sasaran mutu yang
ditetapkan dalam kaji ulang manajemen. Lembaga yang mengakreditasi PT
Equilab International sesuai dengan sistem ISO/IEC 17025:2005 adalah
-
7
Komite Akreditasi Nasional sebagai lembaga akreditasi yang sesuai dengan
ISO/IEC 17011.
D. Ruang Lingkup Penelitian
PT Equilab International memfokuskan penelitian pada studi :
1. BA/BE yang mencakup :
Pengembangan dan validasi metode pengukuran kadar obat dalam
cairan biologis.
Penyusunan protokol penelitian.
Persiapan dan pengajuan permohonan perizinan (ethical clearance)
ke Komisi Etik.
Pemeriksaan kesehatan dan screening sukarelawan.
Pengambilan sampel sukarelawan.
Analisis sampel.
Pengolahan data dan analisa statistik.
Penyusunan laporan.
Dokumentasi.
2. Uji Klinik yang mencakup :
Penyusunan protokol.
Permohonan acuan etik (ethical reference) ke Komisi Etik.
Seleksi peneliti dan tempat penelitian.
Penelitian.
Screening data awal.
Pengukuran parameter-parameter pemeriksaan kesehatan di
laboratorium.
Pengumpulan data.
Pengolahan data dan analisis statistik.
Publikasi.
Dokumentasi.
3. Uji Farmasetik/Pharmaceutical Test yang mencakup :
Uji Disolusi Terbanding.
Uji Kadar.
Uji Farmasi lainnya.
-
8
E. Metode Penelitian dan Peralatan
Metode analisis yang digunakan dalam penelitian BA/BE harus
divalidasi terlebih dahulu yang menyangkut Spesififitas, Sensitivitas,
Linearitas, Presese, dan Reprodusibilitas dengan cara-cara yang sesuai
dengan ketentuan ISO/IEC 17025:2005 dan Validasi Metode untuk
Bioanalisis.
Laboratorium Equilab dalam analisis sampel menggunakan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High Performance Liquid Chromatography,
HPLC) dengan sistem deteksi : Ultra-Violet (UV), Detektor Photo Dioda Array
(Photodiode Array Detector), dan Fluoresensi (Fluorescence) ; Kromatografi
Cair Spektroskopi Massa (Liquid Chromatography Mass Spectrometer, LC
MS/MS) tandem, serta Kromatografi Cair Kinerja Ultra (Ultra Performance
Liquid Chromatography, UPLC MS/MS) tandem.
F. Tim Peneliti
PT Equilab International didukung oleh tenaga-tenaga peneliti yang
telah berpengalaman bertahun-tahun bekerja dengan HPLC-
UV/Fluorescence, LC MS/MS, UPLC MS/MS dan juga telah berpengalaman
melakukan uji BA/BE dan uji klinik. Kualifikasi para peneliti ini ialah Dokter,
Paramedis, Ahli Farmasi, Ahli Kimia, Ahli Statistik, dan Ahli Farmakologi.
G. Organisasi
Laboratorium PT Equilab International merupakan suatu kesatuan
yang secara legal dapat dipertanggungjawabkan. Laboratorium PT Equilab
International bertanggungjawab untuk melakukan pengujian sesuai
persyaratan standar ISO/IEC 17025:2005 dan untuk memuaskan kebutuhan
pelanggan, pihak yang berwenang atau organisasi yang memberikan
pengkuan, sesuai dengan yang tercantum pada Prosedur Tata Laksana
Organisasi. Sistem manajemen PT Equilab International mencakup pekerjaan
yang dilakukan dalam Fasilitas Laboratorium yang permanen. Untuk Bagan
Struktur Organisasi PT Equilab International terdaat di Lampiran 1.
-
9
BAB III
KEGIATAN DI LABORATORIUM
A. Tinjauan Pustaka
1. Obat
Obat dapat didefinisikan sebagai suatu zat yang dimaksudkan
untuk dipakai dalam diagnosis, mengurangi rasa sakit, mengobati atau
mencegah penyakit pada manusia atau hewan. Obat dapat berasal dari
alam, diperoleh dari sumber mineral, tumbuh-tumbuhan, dan hewan, atau
dapat dihasilkan dari sintesis kimia organik atau biosintesis. Bahan obat
dicampurkan dengan unsur-unsur farmasetik yang tidak aktif secara
fisiologi dalam pembuatan bermacam-macam bentuk sediaan yang
dipakai sekarang (Anonimus, 2012).
Berdasarkan sumbernya, obat digolongkan menjadi tiga, yaitu :
Obat alamiah, yaitu obat yang terdapat di alam seperti
pada tanaman, hewan, dan mineral.
Obat semisintetik, yaitu obat hasil sintesis yang bahan
dasarnya berasal dari bahan obat yang terdapat di alam.
Obat sintetik murni, yaitu obat yang bahan dasarnya tidak
berkhasiat, setelah disintesis akan didapatkan senyawa
dengan khasiat farmakologis tertentu.
Berdasarkan Permenkes, obat yang dipasarkan digolongkan
berdasarkan khasiatnya, yaitu :
Obat Narkotika.
Obat Keras.
Obat Bebas Terbatas.
Obat Bebas.
-
10
Berdasarkan penamaannya, obat dibedakan menjadi dua, yaitu :
Obat Generik, merupakan nama resmi obat yang
dikeluarkan oleh WHO.
Obat Paten, merupakan obat produksi suatu perusahaan
dengan nama khas yang dilindungi hukum, yang disebut
merek dagang (trade mark)
Obat memiliki peranan penting dalam bidang kesehatan, tetapi di
Indonesia beberapa harga obat terutama obat paten relatif mahal untuk
masyarakat menengah ke bawah. Sehingga, saat ini banyak produsen
obat yang telah membuat obat generik yang mengandung zat aktif,
bentuk, sediaan, kekuatan, indikasi, efektivitas, cara dan dosis yang sama
dengan obat patennya. Untuk membuktikan kualitas obat tersebut, Badan
Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) selaku regulator di Indonesia
mewajibkan kepada produsen obat tersebut untuk melakukan studi
Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE).
Bioavailabilitas adalah persentase dan kecepatan zat aktif dalam
suatu produk obat yang tersedia dalam sirkulasi sistemik yang berbentuk
utuh/aktif setelah pemberian produk obat tersebut diukur kadarnya dalam
darah terhadap waktu atau ekskresinya dalam urin. Sedangkan studi
Bioekivalensi adalah studi perbandingan Bioavailabilitas antara dua
formulasi obat (Obat Generik dan Obat Paten) yang memiliki zat aktif
sama. Sampel darah diperoleh dari subjek sehat (subjek yang telah
diperiksa kondisi kesehatannya terlebih dahulu) pada studi BA/BE,
kemudan dipisahkan plasmanya untuk dianalisis kadarnya dengan
menggunakan metode analisis yang sudah tervalidasi (Anonimus, 2004).
Pada tahun 1960-an diketahui bahwa produk obat yang
kandungan zat berkhasiatnya sama atau setara, memberikan efek
terapetik yang berbeda. Terbukti dua produk obat yang secara kimia
setara (pada penilaian in vitro) dapat memberikan perbedaan jumlah
kadar obat yang dicapai dalam plasma darah (penilaian in vivo). Hal ini
disebabkan perbedaan jumlah zat yang tersedia untuk memberikan efek
terapetik.
Syarat terpenting suatu produk obat adalah zat aktifnya dapat
mencapai bagian tubuh tempat obat itu diharapkan bekerja, serta dalam
jumlah yang cukup untuk memberikan respon farmakologis. Syarat ini
-
11
disebut ketersediaan obat secara biologis atau bioavailabilitas (Biological
Availability).
Ketersediaan biologis (Biological Availability) adalah jumlah
relatif obat atau zat aktif suatu produk obat yang diabsorpsi, serta
kecepatan obat itu masuk ke dalam peredaran darah sistemik. Obat
dinyatakan tersedia (available) jika setelah diabsorpsi obat tersebut
tersedia untuk bekerja pada jaringan yang dituju dan memberikan efek
farmakologis setelah berikatan dengan reseptor di jaringan tersebut.
Ketersediaan farmasetik (Pharmaceutical Availaibity) adalah ukuran untuk
bagian obat yang in vitro dilepaskan dari bentuk sediaannya dan siap
diabsorpsi. Dengan kata lain, kecepatan larut obat yang tersedia in vitro.
Dari penelitian pharmaceutical availability sediaan tablet
diketahui bahwa setelah ditelan tablet akan pecah (terdisintegrasi) di
dalam lambung menjadi granul-granul kecil. Stelah granul pecah, zat aktif
terlepas dan melarut (terdisolusi) di dalam cairan lambung atau usus.
Setelah melarut, obat tersedia untuk diabsorpsi. Peristiwa ini disebut fase
ketersediaan farmasetik. Berdasarkan uraian tersebut jelas bahwa obat
yang diberikan dalam bentuk larutan mencapai ketersediaan farmasetik
lebih cepat dibandingkan sediaan tablet, karena tidak mengalami tahap
disintegrasi.
Pharmaceutical availability ditentukan secara in vitro di
laboratoium dengan mengukur kecepatan melarut zat aktif dalam waktu
tertentu (dissolution rate). Pengukuran ini menggunakan metode dan alat
yang ditetapkan oleh United States Pharmacopeia/USP untuk meniru
seakurat mungkin keadaan alami di dalam saluran cerna. Akan tetapi,
cara penelitian yang praktis ini jarang memberikan hasil yang berkorelasi
dengan kadar obat dalam plasma in vivo, sehingga perlu dilanjutkan
dengan pengukuran bioavailabilitas obat.
Bioavailabilitas diukur secara in vivo dengan menentukan kadar
obat dalam plasma setelah tercapai keadaan tunak (steady state). Pada
keadaan ini, terjadi kesetimbangan antara kadar obat di semua jaringan
tubuh dan kadar obat di plasma relatif konstan karena jumlah obat yang
diabsorpsi dan dieliminasi adalah sama. Umumnya terdapat korelasi
yang baik antara kadar obat dalam plasma dan efek terpetik obat.
-
12
Bioavailabilitas obat sangat tergantung pada dua faktor, yaitu
faktor obat dan faktor pengguna obat. Terdapat kemungkinan obat yang
sama diberikan pada orang yang sama, dalam keadaan berbeda,
memberikan kurva dosis-respon yang berbeda. Faktor-faktor yang
mempengaruhi diantaranya :
1) Faktor Obat :
Kelarutan obat.
Ukuran partikel.
Bentuk fisik obat.
Dosage form
Teknik formulasi
2) Faktor Pengguna :
Umur, berat badan, luas permukaan tubuh.
Waktu dan cara obat diberikan.
Kecepatan pengosongan lambung.
Gangguan hepar dan ginjal.
Interaksi obat lain.
Di dalam tubuh manusia, Pyrazinamide terserap ke dalam aliran
darah. Kemudian plasma darah yang merupakan bagian cairan dalam
darah yang mengandung Pyrazinamide dianalisis sesuai metode yang
digunakan yaitu menggunakan instrumen HPLC-UV. Metode tersebut
harus divalidasi terlebih dahulu. Hal ini penting untuk menentukan
kualitas obat generik yang akan dibandingkan terhadap obat paten atau
inovator.
2. Tuberkulosis
Gambar 1 Paru-paru Penderita TBC Melalui Sinar X
-
13
Penyakit tuberkulosis ini paling sering menyerang paru-paru
walaupun pada sepertiga kasus menyerang organ tubuh lain dan
ditularkan orang ke orang. Penyakit ini juga salah satu penyakit tertua
yang diketahui menyerang manusia. Jika diterapi dengan benar,
tuberkulosis yang disebabkan oleh kompleks Mycobacterium tuberculosis,
yang peka terhadap obat, praktis dapat disembuhkan. Tanpa terapi
tuberkulosis akan mengakibatkan kematian dalam lima tahun pertama
pada lebih dari setengah kasus (Anonimus, 2013).
Pada tahun 1992 WHO telah mencanangkan tuberkulosis
sebagai Global Emergency. Laporan WHO tahun 2004 menyatakan
bahwa terdapat 8,8 juta kasus baru tuberkulosis. Pada tahun 2002,
sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi kuman tuberkulosis dan
menurut regional WHO jumlah terbesar kasus ini terjadi di Asia Tenggara
yaitu 33% dari seluruh kasus di dunia.
Indonesia berada dalam peringkat ketiga terburuk di dunia untuk
jumlah penderita TB. Setiap tahun muncul 500 ribu kasus baru dan lebih
dari 140 ribu lainnya meninggal. Seratus tahun yang lalu, satu dari lima
kematian di Amerika Serikat disebabkan oleh tuberkulosis.
Pengobatan tuberkulosis berlangsung cukup lama yaitu
setidaknya 6 bulan pengobatan dan selanjutnya dievaluasi oleh dokter
apakah perlu dilanjutkan atau berhenti, karena pengobatan yang cukup
lama seringkali membuat pasien putus berobat atau menjalankan
pengobatan secara tidak teratur, kedua hal ini ini fatal akibatnya yaitu
pengobatan tidak berhasil dan kuman menjadi kebal disebut MDR (Multi
Drugs Resistance), kasus ini memerlukan biaya berlipat dan lebih sulit
dalam pengobatannya sehingga diharapkan pasien disiplin dalam berobat
setiap waktu demi pengentasan tuberkulosis di Indonesia
Gambar 2 Bakteri Mycobacterium tuberculosis
-
14
a. Klasifikasi Penyakit TBC
Penyakit TBC diklasifikasikan atas 5 jenis, yaitu :
Tuberkulosis paru terkonfirmasi secara bakteriologis dan
histologis
Tuberkulosis paru tidak terkonfirmasi secara bakteriologis
dan histologis
Tuberkulosis pada sistem saraf
Tuberkulosis pada organ-organ lainnya
Tuberkulosis millier
b. Penularan
Penularan penyakit ini karena kontak dengan dahak atau
menghirup titik-titik air dari bersin atau batuk dari orang yang
terinfeksi kuman tuberkulosis, anak anak sering mendapatkan
penularan dari orang dewasa di sekitar rumah maupun saat berada
di fasilitas umum seperti kendaraan umum, rumah sakit dan dari
lingkungan sekitar rumah. Bakteri ini dapat menyebar melalui
pembuluh darah atau kelenjar getah bening. Oleh sebab itu, infeksi
TBC dapat menginfeksi hampir seluruh organ tubuh seperti: paru-
paru, otak, ginjal, saluran pencernaan, tulang, kelenjar getah
bening, dan lain-lain, meskipun demikian organ tubuh yang paling
sering terkena yaitu paru-paru.
Saat Mikobakterium tuberkulosa berhasil menginfeksi paru-
paru, maka dengan segera akan tumbuh koloni bakteri yang
berbentuk globular (bulat). Biasanya melalui serangkaian reaksi
imunologis bakteri TBC ini akan berusaha dihambat melalui
pembentukan dinding di sekeliling bakteri itu oleh sel-sel paru.
Mekanisme pembentukan dinding itu membuat jaringan di
sekitarnya menjadi jaringan parut dan bakteri TBC akan menjadi
dormant (istirahat). Bentuk-bentuk dormant inilah yang sebenarnya
terlihat sebagai tuberkel pada pemeriksaan foto rontgen.
Pada sebagian orang dengan sistem imun yang baik,
bentuk ini akan tetap dormant sepanjang hidupnya. Sedangkan
pada orang-orang dengan sistem kekebalan tubuh yang kurang,
-
15
bakteri ini akan mengalami perkembangbiakan sehingga tuberkel
bertambah banyak. Tuberkel yang banyak ini membentuk sebuah
ruang di dalam paru-paru. Ruang inilah yang nantinya menjadi
sumber produksi sputum (dahak). Seseorang yang telah
memproduksi sputum dapat diperkirakan sedang mengalami
pertumbuhan tuberkel berlebih dan positif terinfeksi TBC.
Dalam memerangi penyebaran Tuberkulosis terutama pada
anak anak yang masih rentan daya tahan tubuhnya maka,
pemerintah Indonesia telah memasukkan Imunisasi Tuberkulosis
pada anak anak yang disebut sebagai Imunisasi BCG sebagai salah
satu program prioritas imunisasi wajib nasional beserta dengan 4
jenis imunisasi wajib lainnya yaitu hepatitis B, Polio, DPT dan
campak.
c. Diagnosis Penyakit TBC
Diagnosa tuberkulosis dapat ditegakkan berdasarkan
gejala klinis, pemeriksaan jasmani, pemeriksaan bakteriologi ,
radiologi dan pemeriksaan penunjang lainnya.
Gambar 3 Penyebaran Bakteri TBC
-
16
Gejala klinis tuberkulosis dapat dibagi menjadi 2 golongan,
yaitu :
Gejala lokal
Apabila organ yang terkena adalah paru-paru, maka
gejala lokal ialah gejala respiratori atau gejala gejala yang erat
hubungannya dengan organ pernapasan (sedang gejala lokal
lain akan sesuai dengan organ yang terlibat).
Gejala respiratori ialah batuk lebih dari 2 minggu,
batuk bercampur darah. Dapat pula nyeri dada dan sesak
napas. Gejala respiratori sangat bervariasi, dari mulai tidak
ada gejala sampai gejala yang cukup berat tergantung dari
luas lesi. Sehingga terkadang pasien baru mengetahui dirinya
terdiagnosis Tuberkulosis saat medical check up.
Gejala sistemik
Gejala sistemik merupakan akibat atau lanjutan dari
gejala respiratori. Contoh gejala sistemik antara lain demam,
badan lemah yang disebut sebagai malaise, keringat malam,
anoreksia dan berat badan menurun menjadi semakin kurus
(Anonimus, 2011).
d. Komplikasi Penyakit TBC
Beberapa komplikasi yang sering ditemukan pada pasien
TBC atau TB antara lain sebagai berikut :
Kerusakan Tulang dan Sendi
Nyeri tulang punggung dan kerusakan sendi bisa
terjadi ketika infeksi kuman TB menyebar dari paru-paru ke
jaringan tulang. Dalam banyak kasus, tulang iga juga bisa
terinfeksi dan memicu nyeri di bagian tersebut.
Kerusakan Otak
Kuman TB yang menyebar hingga ke otak bisa
menyebabkan meningitis atau peradangan pada selaput otak.
Radang tersebut memicu pembengkakan pada membran
-
17
yang menyelimuti otak dan seringkali berakibat fatal atau
mematikan.
Kerusakan Hati dan Ginjal
Hati dan ginjal membantu menyaring pengotor yang
ada adi aliran darah. Fungsi ini akan mengalami kegagalan
apabila kedua organ tersebut terinfeksi oleh kuman TB.
Kerusakan Jantung
Jaringan di sekitar jantung juga bisa terinfeksi oleh
kuman TB. Akibatnya bisa terjadi cardiac tamponade, atau
peradangan dan penumpukan cairan yang membuat jantung
jadi tidak efektif dalam memompa darah dan akibatnya bisa
sangat fatal.
Gangguan Mata
Ciri-ciri mata yang sudah terinfeksi TB adalah
berwarna kemerahan, mengalami iritasi dan membengkak di
retina atau bagian lain.
Resistensi Kuman
Pengobatan dalam jangka panjang seringkali
membuat pasien tidak disiplin, bahkan ada yang putus obat
karena merasa bosan. Pengobatan yang tidak tuntas atau
tidak disiplin membuat kuman menjadi resisten atau kebal,
sehingga harus diganti dengan obat lain yang lebih kuat
dengan efek samping yang tentunya lebih berat (Pramudiarja,
2012).
3. Pyrazinamide
Memiliki nama lain yaitu Pyrazinecarboxamide; Pyrazinoic acid
amide; Pyrazine carboxylamide dan nama IUPAC : Pyrazine-2-
carboxamide dengan rumus molekul C5H5N3O. Memiliki bobot molekul
Gambar 4 Gambar Struktur Pyrazinamide
-
18
123,11 dengan kadar C sebesar 48,78%, H sebesar 4,09%, N sebesar
34,13%, dan O sebesar 13,00 %. Merupakan senyawa yang mulai
menyublim pada suhu 600C dan mempunyai titik didih pada 1890-1910C.
Memiliki kelarutan dalam air (15 mg/mL), metanol (13,8 mg/mL), etanol
(5,7 mg/mL), 2-propanol (3,8 mg/mL), dietil eter (1,0 mg/mL), kloroform
(7,4 mg/mL), dan iso-oktana (0,01 mg/mL).
a. Farmakologi
Pyrazinamide merupakan obat antituberkulosis yang
digunakan sebagai terapi kombinasi dengan antituberkulosis (TBC)
lainnya. Pyrazinamide aktif dalam suasana asam terhadap
mikobakterium. Pyrazinamide bersifat bakterisid terutama pada
basil tuberkulosis intraselular (Radhi, 2012).
Pada pemberian oral Pyrazinamide mudah diserap dan
tersebar luas ke seluruh jaringan tubuh. Kadar puncak dalam
serum tercapai dalam waktu kurang lebih 2 jam dan waktu paruh
antara 10 16 jam. Pyrazinamide mengalami hidrolisis dan
hidroksilasi menjadi asam hidroksi pirazinoat yang merupakan
metabolit utamanya dan diekskresi melalui filtrasi glomerulus.
e. Indikasi
Indikasi Pyrazinamide adalah untuk pengobatan
tuberkulosis yang diberikan bersama antituberkulosis lainnya (terapi
kombinasi).
f. Kontra-Indikasi
Penderita yang hipersensitif atau alergi terhadap
Pyrazinamide.
Penderita dengan gangguan fungsi hati atau gangguan fungsi
ginjal.
Hiperurisemia dan atau gout / asam urat.
Hipoglikemia (kadar gula darah rendah).
Penderita Diabetes.
Wanita hamil.
-
19
g. Efek Samping
Efek samping berupa artralgia, anoreksia, nausea, disuria,
malaise, demam, porfiria, hepatomegali splenomegali, jaundice,
kerusakan sel hati, fatal hemolysis, sideroblastik anemia, tukak
lambung, trombositopenia, rash, hepatotoksisitas, gout, intoleransi
saluran pencernaan, ulkus peptikum yang bertambah parah,
dysuria, urtikaria, pruritus, akne, fotosensitivitas, dan interstitial
nefritis.
h. Interaksi Obat
Probenesid dapat menghambat pengeluaran Pyrazinamide
melalui ginjal (Anonimus, 2011).
4. Methyl prednisolone
Merupakan padatan kristal yang berbobot molekul sebesar
374,47. Memiliki rumus molekul C22H30O5 dengan kadar C sebesar
70,56%, H sebesar 8,07%, dan O sebesar 21,36%. Kristal ini tidak larut
dalam air, larut dalam metanol, sedikit larut dalam aseton dan kloroform,
serta sangat sedikit larut dalam eter.
Pada metode analisis pyrazinamide dalam plasma darah
manusia menggunakan HPLC-UV, methyl prednisolone digunakan
sebagai standar internal. Standar internal yaitu penambahan zat lain yang
tidak sama dengan sampel atau standar akan tetapi mempunyai sifat
fisikokimia yang mirip dengan sampel dan bertujuan untuk mengurangi
variasi konsentrasi standar dan sampel akibat faktor-faktor yang
mempengaruhi kepekaan dan respon detektor seperti fluktuasi listrik,
Gambar 5 Struktur Senyawa Methyl prednisolone
-
20
temperatur kolom dan detektor, variasi injeksi dan sebagainya (Gritter,
1991).
5. Plasma Darah
Plasma darah merupakan bagian cair darah. Sekitar 90% plasma
terdiri dari air, 7-8% protein dan disamping itu plasma mengandung
karbohidrat, lipid, asam amino, dan garam anorganik terutama NaCl
(Mutschler, 1991). Komposisi plasma dan fungsi utamanya dapat dilihat
pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi Plasma dan Fungsi Utamanya
Kandungan Fungsi Utama
Air Pelarut bagi zat-zat lain
Garam (Natrium, Kalium,
Kalsium, Magnesium, Klorida,
Bikarbonat)
Penyeimbang tekanan osmosis,
mempertahankan pH, meregulasi
permeabilitas membran
Protein (Albumin, Fibrinogen,
Imunoglobulin)
Pembekuan darah, pertahanan
tubuh (antibodi)
Plasma berguna dalam pengaturan tekanan osmosis darah
sehingga dengan sendirinya jumlahnya dalam tubuh akan diatur, misalnya
dengan proses ekskresi. Plasma juga bertugas membawa sari-sari
makanan, sisa metabolisme, hasil sekresi dan beberapa gas (Mutschler,
1991).
Plasma darah dapat dipisahkan di dalam sebuah tabung berisi
darah segar yang telah dibubuhi zat anti-koagulan, yang kemudian
diputar sentrifugal sampai sel darah merah jatuh ke dasar tabung, sel
darah putih akan berada di atasnya dan membentuk lapisan buffy coat,
plasma darah berada di atas lapisan tersebut dengan kepadatan sekitar
1025 kg/m3 atau 1.025 kg/l. Serum darah adalah plasma tanpa
fibrinogen, sel dan faktor koagulasi lainnya. Fibrinogen menempati 4%
alokasi protein dalam plasma dan merupakan faktor penting dalam proses
pembekuan darah.
-
21
Di dalam plasma, obat berinteraksi dengan protein plasma,
jaringan atau makromolekul lain seperti melanin dan DNA membentuk
suatu kompleks obat-makromolekul, kompleks ini sering disebut ikatan
obat protein. Ikatan obat protein dapat berupa proses reversibel dan
irreversibel. Namun, sebagian besar obat berikatan atau membentuk
kompleks dengan protein dengan proses reversibel (Leon & Andrew,
1988). Ikatan obat protein yang reversibel ini menunjukan bahwa obat
mengikat protein dengan ikatan kimia yang lebih lemah dibandingkan
pada proses irreversibel, seperti ikatan hidrogen atau gaya Van der
Waals.
Komponen utama protein plasma yang bertanggung jawab
terhadap ikatan obat adalah albumin. Obat-obat asam lemah seperti
salisilat, fenilbutazon, dan penisilina terikat kuat dengan albumin. Namun,
kekuatan ikatan obat dengan albumin berbeda untuk masing-masing
obat. Protein lain seperti globulin yang dapat berikatan dengan obat-obat
hanya merupakan bagian terkecil dari keseluruhan ikatan protein plasma.
Dalam proses analisis, obat tersebut harus dipisahkan dari ikatan
proteinnya. Hal ini dikarenakan protein dapat mengganggu proses
analisis dan merusak kolom HPLC, sehingga usia kolom menjadi pendek.
Pemisahan protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan protein.
Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi
dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan
penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum
digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent. Protein
dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat
sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul,
atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein
memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya
protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan.
Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH
dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif
sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan
protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga
potein dapat mengendap (Farida, 2012).
-
22
Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam
dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga
molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein
mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifat lain yang
berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada
mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen.
Penggunaan pelarut organik seperti methanol dan asetonitril
sebagai zat pengendap protein sangat umum digunakan terutama yang
melibatkan metode analisis HPLC. Pengendapan ini berkaitan dengan pI
protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan
semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka
kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti
metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan
menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan
tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi
elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan
menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari
permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga
menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan
protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan.
Penggunaan methanol dan asetonitril mempunyai suatu keuntungan
karena kompabilitasnya dengan berbagai eluen yang digunakan dalam
metode HPLC.
6. Validasi Metode
Validasi metode adalah konfirmasi bahwa suatu metode dapat
memenuhi persyaratan tujuan penggunaannya, yaitu melakukan uji untuk
metode kerja yang bersangkutan dan mengumpulkan bukti atau hasilnya.
Validasi metode merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan penggunaannya. Validasi
metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa
metode analisis tersebut sudah sesuai peruntukannya. Metode analisis
yang sensitif dan selektif untuk evaluasi kuantitatif obat-obatan dan
merupakan suatu hal yang penting untuk keberhasilan pelaksanaan studi
-
23
praklinis, biofarmasetik, dan farmakologi klinis. Validasi metode
bioanalisis mencakup semua prosedur yang membuktikan bahwa suatu
metode khusus yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif pada analit
dalam suatu matriks biologis seperti darah, plasma, serum, atau urin,
dapat dipercaya dan memiliki ketertiruan (reproducible) untuk tujuan
penggunaannya (Anonimus, 2001).
Analisis obat-obatan dan metabolitnya dalam suatu matriks
biologis dilakukan dengan menggunakan suatu standar (reference
standard) dan menggunakan sampel kontrol (Quality Control). Kemurnian
dari standar pembanding yang digunakan untuk menyiapkan sampel yang
akan diberikan sejumlah standar (spiked sample) dapat mempengaruhi
data studi. Karena alasan inilah, standar pembanding analisis otentik
yang diketahui identitas dan kemurniannya harus digunakan untuk
menyiapkan larutan dengan konsentrasi tertentu.
Menurut pedoman USFDA (United States Food and Drug
Administration), Validasi Metode merupakan suatu prosedur yang
menunjukkan fakta yang digunakan untuk pengukuran analit secara
kuantitatif dalam matriks cairan biologis seperti : darah, plasma, serum,
atau urin yang dapat dipercaya dan reprodusibel. Parameter dasar untuk
Validasi Metode Bioanalisis meliputi Akurasi, Presisi, Selektivitas,
Sensitivitas, Reproduktivitas, dan Stabilitas. Pengukuran untuk masing-
masing analit dalam matriks biologi harus divalidasi. Selain itu, stabilitas
analit dalam sampel yang diberikan sejumlah standar juga harus
ditentukan. Metode yang disusun dan dikembangkan untuk metode
bioanalisis meliputi penentuan Selektivitas (Selectivity), Akurasi
(Accuracy), Presisi (Precision), Perolehan Kembali (Recovery), Kurva
Kalibrasi (Calibration Curve), Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect),
Limit Kuantitasi (Limit of Quantification), dan Stabilitas (Stability) Standar,
Internal Standar, dan Analit dalam sampel (plasma blanko) yang telah
diberi sejumlah standar (Spiked Sample) (Anonimus, 2001).
a. Selektivitas
Selektivitas adalah kemampuan dari suatu metode analisis
untuk membedakan dan menghitung jumlah analit terhadap
keberadaan komponen lain di dalam sampel. Untuk uji selektivitas,
-
24
analisis sampel blanko pada matriks biologis yang sesuai (plasma,
urin, atau matriks lainnya) harus diperoleh dari minimal enam
sumber. Setiap sampel blanko harus diuji gangguannya, dan
selektivitas harus dipastikan pada batas terendah dari kuantifikasi
(Lower Limit Of Quantification/LLOQ).
b. Akurasi
Ketepatan (akurasi) metode analisis menggambarkan
kedekatan hasil uji yang diperoleh dari metode yang digunakan,
dengan nilai sebenarnya. Akurasi ditentukan dengan mengulang
analisis sampel yang mengandung analit yang telah diketahui
jumlahnya. Akurasi harus diukur dengan menggunakan minimal
lima penetapan per konsentrasi. Penggunaan minimum tiga variasi
konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang ditentukan juga
dianjurkan. Nilai yang terukur harus berada dalam rentang 15,00
% dari nilai sebenarnya kecuali untuk LLOQ, yang seharusnya tidak
menyimpang dari rentang 20 %.
c. Presisi
Presisi suatu metode analisis menggambarkan kedekatan
pengukuran individu dari suatu analit ketika prosedur diterapkan
berulang kali ke beberapa alikuot dari satu volume matriks biologis
yang homogen. Presisi harus diukur menggunakan minimal lima
penentuan setiap konsentrasi. Penggunaan minimum tiga variasi
konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang ditentukan juga
dianjurkan. Presisi ditentukan pada setiap tingkat konsentrasi, yaitu
tidak boleh melebihi 15,00 % dari koefisien variasi (CV).
d. Perolehan Kembali (Recovery)
Menurut USFDA, Perolehan kembali (Recovery) suatu
analit dalam suatu pengujian adalah respon detektor yang diperoleh
dari sejumlah analit yang ditambahkan dan diekstrak dari matriks
biologis, dibandingkan dengan respon detektor yang diperoleh
untuk konsentrasi sebenarnya dari suatu standar yang murni.
-
25
Perolehan kembali berkenaan dengan efisiensi ekstraksi metode
analisis dalam batas-batas variabilitas. Perolehan kembali analit
tidak harus 100%, tetapi jangkauan perolehan kembali dari analit
dan standar harus konsisten, tepat, dan terulang. Pengujian
perolehan kembali (recovery) harus dilakukan dengan
membandingkan hasil analisis untuk sampel terekstraksi pada tiga
konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dengan standar yang tidak
diekstrak yang mewakili 100 % perolehan kembali.
e. Kurva Kalibrasi Standar
Suatu Kurva Kalibrasi (Standar) adalah hubungan antara
respon instrumen dan konsentrasi analit yang telah diketahui.
Suatu Kurva Kalibrasi harus dibuat untuk setiap analit dalam
sampel. Sejumlah standar yang cukup harus digunakan untuk
menentukan hubungan antara konsentrasi dan respon. Kurva
alibrasi harus disiapkan dalam matriks biologis yang sama seperti
sampel dalam studi yang dilakukan dengan melakukan sejumlah
standar (spike) pada matriks dengan konsentrasi analit yang
diketahui.
Jumlah standar yang digunakan dalam membuat Kurva
Kalibrasi akan menjadi fungsi dari hubungan antara rentang niali
analisis yang diantisipasi dan sifat dari analit. Konsentrasi standar
harus dipilih berdasarkan rentang konsentrasi yang diharapkan
pada studi tertentu. Kurva kalibrasi harus terdiri dari sampel blanko
(matriks sampel yang diproses tanpa Internal Standar) dan enam
sampai delapan sampel bukan nol yang mencakup rentang yang
diharapkan, termasuk batas bawah kuantifikasi.
1) Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode memperoleh
hasil uji yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit
dalam suatu rentang yang ditetapkan. Linearitas suatu
metode dapat diperoleh dengan menggambarkan secara
grafik hasil uji sebagai fungsi dari konsentrasi analit.
-
26
Linearitas biasanya ditetapkan dengan menghitung garis
regresi dari hasil uji terhadap konsentrasi analit.
2) Batas Terendah Kuantifikasi/Lower Limit of Quantification
(LLOQ)
Menurut pedoman validasi metode bioanalisis dari
USFDA untuk industri, LLOQ yaitu konsentrasi terkecil dari
suatu analit dalam suatu kurva kalibrasi yang dapat
dikuantitasi dengan tingkat kepercayaan yang tinggi dan dapat
diterima sebagai batas kuantitasi jika memenuhi kondisi
sebagai berikut :
Respon analit pada LLOQ harus paling sedikit 5 kali
respon blanko.
Area analit (respon) harus dapat diidentifikasi, diskrit, dan
terulang dengan presisi 20 % dan akurasi 80-120%.
Model yang digunakan untuk menggambarkan
hubungan antara respon dan konsentrasi haruslah model
yang paling sederhana. Pemilihan bobot dan penggunaan
persamaan regresi yang kompleks harus dapat ditepatkan.
Kondisi berikut harus dipenuhi dalam mengembangkan
sebuah Kurva Kalibrasi :
20% deviasi dari nominal konsentrasi LLOQ.
15% standar deviasi selain dari nominal konsentrasi
LLOQ.
Setidaknya empat dari enam standar bukan nol harus
memenuhi kriteria di atas, termasuk LLOQ dan Kurva
Kalibrasi Standar pada konsentrasi tertinggi.
f. Stabilitas
Stabilitas obat dalam suatu cairan biologis adalah fungsi
dari kondisi penyimpanan, sifat-sifat kimia obat, dan matriks.
Prosedur stabilitas harus mengevaluasi stabilitas analit selama
pengumpulan dan penanganan sampel, setelah penyimpanan
jangka panjang (beku pada suhu penyimpanan yang digunakan)
dan jangka pendek (suhu kamar, 20-28 C), dan setelah melalui
-
27
siklus pembekuan dan pencairan, kemudian proses stabilitas harus
mengevaluasi stabilitas analit selama pengumpulan dan
penanganan sampel. Ketentuan yang digunakan dalam pengujian
stabilitas harus mencerminkan situasi yang harus dihadapi selama
penanganan sampel sebenarnya dan pada analisis sampel.
Prosedur juga harus mencakup pengujian stabilitas analit
dalam larutan stok. Semua penentuan stabilitas harus
menggunakan seperangkat sampel yang disiapkan dari larutan stok
yang baru dibuat dalam matriks biologi yang bebas dari analit dan
pengotor. Larutan stok analit untuk pengujian stabilitas harus
disiapkan dalam suatu pelarut yang sesuai pada konsentrasi yang
telah diketahui.
Stabilitas juga dibagi menjadi 5 bagian, yaitu :
1) Stabilitas Pencairan dan Pembekuan (Freeze and Thaw
Stability)
Stabilitas analit harus ditentukan setelah tiga siklus
pembekuan dan pencairan. Setidaknya tiga alikuot pada tiap
konsentrasi (Rendah dan Tinggi) harus disimpan pada suhu
penyimpanan yang digunakan slama 24 jam dan dicairkan
tanpa bantuan pada suhu kamar. Ketika benar-benar cair,
sampel harus dibekukan kembali selama 12 sampai 24 jam
pada kondisi yang sama. Siklus pencairan dan pembekuan
harus diulang dua kali lagi, lalu dianalisis pada siklus ketiga.
Jika analit tidak stabil pada suhu penyimpanan yang
digunakan, sampel stabilitas harus dibekukan pada -200C
selama tiga siklus pembekuan dan pencairan atau
disesuaikan dengan kestabilan zat tersebut.
2) Stabilitas Suhu Jangka Pendek
Tiga alikuot dari tiap konsentrasi (Rendah dan Tinggi)
harus dicairkan pada suhu kamar dan disimpan pada suhu
tersebut selama 4-24 jam (berdasarkan durasi yang
diharapkan dimana sampel akan dipertahankan pada suhu
kamar dalam studi yang dituju) dan dianalisa.
-
28
3) Stabilitas Jangka Panjang
Waktu penyimpanan dalam pengujian stabilitas
jangka panjang harus melebihi waktu antara tanggal
pengambilan sampel pertama dan tanggal analisis sampel
berakhir. Stabilitas jangka panjang harus ditentukan dengan
menyimpan setidaknya tiga alikuot dari masing-masing
konsentrasi rendah dan tinggi pada kondisi yang sama
dengan sampel studi. Volume sampel harus cukup untuk
analisis pada tiga waktu berbeda. Konsentrasi dari semua
saampel stabilitas harus dibandingkan dengan rata-rata nilai
penghitungan kembali untuk standar pada konsentrasi yang
sesuai dari hari pertama pengujian Stabiitas Jangka Panjang.
4) Stabilitas Larutan Stok
Stabilitas larutan stok obat dan internal standar harus
diuji pada suhu ruang setidaknya 6 jam. Jika larutan stok
didinginkan atau dibekukan untuk periode yang berpautan,
stabilitas harus didokumentasikan. Setelah menyelesaikan
waktu penyimpanan yang dikehendaki, stabilitas harus diuji
dengan membandingkan respon instrumen dengan larutan
yang baru dibuat tersebut.
5) Stabilitas Pasca Preparasi
Stabilitas Pasca Preparasi diukur untuk
mengantisipasi stabilitas sampel selama proses injeksi di auto
sampler. Stabilitas pasca preparasi ditentukan dengan
melakukan pengujian kontrol sampel rendah, sedang, dan
tinggi selama periode waktu tertentu yang dibutuhkan oleh
satu batch analisis.
7. Teori Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi secara bahasa berasal dari kata chroma dan
graphein yang berarti menulis warna. Menurut IUPAC nomenclature,
chromatography is physical method of separation in which the
components to be separated are distributed between two phases, one of
which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase)
move in definite direction.
-
29
Metode analisis kimia secara umum haruslah memiliki sifat
selektifitas yang baik dan spesifik. Penghilangan gangguan terhadap
analat merupakan hal yang penting dalam analisis. Sampai pertengahan
abad XX, pemisahan dalam analisis dilakukan secara pengendapan,
distilasi, dan ekstraksi. Saat ini pemisahan dalam kegiatan analisis
umumnya dilakukan secara kromatografi.
Penerapan analisis secara kromatografi telah berkembang pesat
dalam kurun waktu lima puluh tahun terakhir untuk dapat menentukan
sifat-sifat senyawa dalam campuran kompleks. Peranan yang sangat
berarti dari kromatografi ditunjukkan misalnya dengan hadiah Nobel pada
tahun 1952 kepada A.J.P Martin dan R.L.M. Synge, dan sekitar 12 Nobel
antara tahun 1937 hingga 1972 yang seluruhnya diberikan atas jasa
pengembangan bidang kromatografi.
Kromatografi menerapkan prinsip tingkat lanjut dari proses
ekstraksi. Ekstraksi adalah suatu metode untuk memisahkan suatu
komponen dalam suatu cairan atau padatan dengan cairan lain yang tidak
saling bercampur, sehingga komponen tersebut berpindah ke dalam
cairan kedua. Pemisahan dapat terjadi karena adanya perbedaan
kecepatan gerak suatu komponen senyawa dengan senyawa lainnya
akibat perbedaan sifat yang dimiliki masing-masing senyawa terhadap
fasa diam maupun fasa gerak yang ada dalam sistem kromatografi (Day
dan Underwood, 1988).
Prinsip KCKT yaitu, dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan
melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam fase gerak
melalui penyuntikan atau injeksi. Di daam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara molekul yang terlarut dalam fase gerak terhadap fase diam maka
terjadilah pemisahan. Komponen yang lemah interaksinya dengan fase
diam akan keluar terlebih dahulu dari kolom. Setiap komponen campuran
yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor, kemudian akan
direkam dalam bentuk kromatogram.
a. Mekanisme Pemisahan
Mekanisme pemisahan dominan yang terjadi dalam sistem
KCKT ditentukan oleh jenis kolom yang digunakan. Terdapat
-
30
kemungkinan terjadi lebih dari satu proses pemisahan dalam satu
kolom. Dibandingkan dengan kromatografi gas, KCKT memiliki
mekanisme pemisahan lebih banyak, terdapat kemudahan untuk
mengubah secara radikal sifat kimia dan kekuatan elusi dari fase
gerak, fase penunjang dengan ukuran partikel 3, 5 atau 10 m
memiliki ukuran pori 50 -150 , dapat diikatkan dengan lapisan
sangat tipis bersifat polar atau nonpolar. Mekanisme pemisahan
yang mungkin adalah adsorpsi, partisi, penukar ion dan
kromatografi ekslusi.
1) Adsorpsi
Kromatografi adsorpsi, sering juga dinyatakan
sebagai kromatografi padat-cair atau kromatografi fase
normal. Istilah fase normal menunjukkan digunakannya fase
diam polar dengan fase gerak nonpolar. Sebagai fase diam
digunakan adsorben berpori yang pada sisi-sisinya memiliki
gugusan hidroksil baik yang bebas atau berikatan. Gugusan
tersebut akan menjadi sisi aktif yang menyebabkan interaksi
di permukaan terhadap molekul terlarut dalam fase gerak.
Fase gerak yang digunakan berupa pelarut nonpolar,
misalnya heksan yang dimodifikasi polaritasnya dengan
mencampurkan sejumlah kecil pelarut polar seperti 2-
propanol, diklorometana atau metil tersierbutil eter. Saat
sampel dimasukan ke dalam kolom, molekul dengan gugus
fungsi yang bersifat polar akan tertarik oleh sisi aktif fase
diam, kemudian digantikan oleh molekul polar dari fase gerak,
selanjutnya diadsorp kembali oleh sisi aktif selanjutnya hingga
keluar dari kolom. Molekul yang lebih polar akan diadsorp
lebih kuat dibandingkan molekul yang kurang polar sehingga
terelusi lebih lama.
2) Fase Terikat
Kromatografi fase terikat dapat digunakan untuk
sistem kromatografi fase normal atau fase terbalik. Pada
sistem fase terbalik, fase diam yang digunakan bersifat
-
31
nonpolar sedangkan fase gerak polar digunakan untuk
mengelusi komponen dalam kolom.
Sistem fase terbalik pada awalnya berupa fase
penunjang yang disalut dengan lapisan tipis fase diam, terikat
secara fisika. Hal ini akan menyebabkan fase diam akan
mudah terbawa oleh aliran fase gerak dan sangat rentan oleh
proses hidrolisis. Sistem ini kemudian dikembangkan dengan
mengikatkan secara kimia gugus tertentu pada permukaan
fase penunjang. Senyawa yang paling umum digunakan
sebagai fase diam adalah oktadekilsilan (octadecylsilane,
ODS), merupakan senyawa hidrokarbon, berupa cairan. Fase
diam ini biasanya diikatkan pada fase penunjang silika dengan
membentuk ikatan silileter atau ikatan siloksan.
Sistem fase normal diperoleh dengan mengikatkan
gugus nitril, nitro atau amino pada ujung fase penunjang.
Keuntungan dari fase terikat dibandingkan sistem adsorpsi
adalah kemungkinan dilakukannya elusi gradien. Elusi
biasanya dilakukan menggunakan pelarut yang relatif
nonpolar seperti tetrahidrofuran (THF), dietileter, kloroform
dan heksana.
3) Penukar Ion
Kromatografi penukan ion memanfaatkan perbedaan
tingkat afinitas ion-ion dalam larutan terhadap kumpulan ion
bermuatan yang terdapat pada kolom. Gugus fungsi alami
yang menjadi sisi aktif penukar ion adalah amonium kuartener
(-N+R3) untuk anion dan asam sulfonat (-SO3H) untuk kation.
Sebagai penunjang sisi aktif digunakan penukar ion yang
berasal senyawa berikatan silang dari polistiren, polidekstran,
dan silika.
Selanjutnya dikembangkan sistem penukar ion
menggunakan partikel yang lebih kecil. Lapisan tipis lateks
dijadikan sebagai penukar ion. Media penukar ion seperti ini
kemudian disebut sebagai resin penukar ion. Hasil dari
pengembangan ini adalah peningkatan terhadap kemampuan
-
32
pemisahan, kecepatan, efisiensi dan selektifitas. Sifat dari
resin dapat diatur dengan melakukan modifikasi terhadap
derajat ikatan silang, ukuran dan gugus fungsi penukar
ionnya.
4) Ekslusi
Kromatografi ekslusi dikenal juga dengan sebutan
kromatografi gel, filtrasi gel atau permeasi gel. Mekanisme
pemisahan terjadi berdasarkan pemilihan ukuran partikel
molekul. Molekul akan terdifusi dalam pori dengan ukuran
tertentu. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori akan masuk
dan mengalami pemisahan berdasarkan ukurannya.
Material yang digunakan dalam kromatografi ekslusi
pada awalnya adalah dekstran, kopolimer dari
stirenadivinilbenzena. Keterbatasan terjadi karena mudah
mengembang dan tidak tahan terhadap tekanan tinggi (hanya
sampai 300 psi). Dekstran hanya dapat digunakan untuk
larutan yang tidak mengandung air, disebabkan adanya
molekul air akan menyebabkan molekul yang akan dipisahkan
tidak dapat memasuki sistem kromatografi ekslusi. Untuk
sampel yang mengandung air dapat digunakan kopolimer 2-
dihidroksietilmetaakrilat, karena bersifat hidrofil.
Material yang lebih baik dibuat berbahan dasar silika
berpori dengan ukuran pori yang dapat diatur dengan kisaran
4 250 m. Dapat digunakan pada tekanan 3000 hingga
8000 psi, tahan hingga pH 10, kecepatan alir bisa ditinggikan,
dan yang paling menguntungkan adalah dapat digunakan
untuk memisahkan molekul yang larut dalam air atau dalam
pelarut organik.
-
33
b. Instrumentasi KCKT
Kecepatan alir yang cukup diperlukan dalam setiap sistem
kromatografi kolom. Untuk merealisasikan keadaan ini dalam
sistem KCKT yang menggunakan ukuran diameter partikel 2 10
m, penggunaan pompa tekanan tinggi mutlak diperlukan.
Keadaan inilah yang menyebabkan instrumen KCKT, menjadi lebih
kompleks dan tentunya lebih mahal dari sistem kromatografi yang
lainnya. Berikut digambarkan skema dari sebuah instrumen KCKT.
1) Tampungan Fasa Gerak
Peralatan KCKT mutakhir dilengkapi dengan satu
atau beberapa tampungan berbahan gelas atau stainless steel
dengan ukuran mulai 200 sampai 1000 mL. Peralatan
degasser disertakan untuk menghilangkan gas terlarut berupa
oksigen atau nitrogen yang akan mempengaruhi dengan
membentuk gelembung pada kolom dan detektor. Degasser
dapat berupa pompa vakum, sistem destilasi, peralatan
pemanas dan pengaduk atau sistem pengusiran
menggunakan gas mulia.
Pemisahan yang menggunakan satu jenis pelarut
dalam keadaan konstan dinamakan elusi isokratik. Seringkali
efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan elusi gradien.
Berbeda dengan sistem isokratik, pada elusi gradien terdapat
Gambar 6 Instrumentasi KCKT
-
34
2 atau 3 sistem pelarut yang berbeda, yang akan mengalami
perubahan komposisi dalam urutan deret berdasarkan waktu.
2) Sistem Pemompaan
Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam
sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan :
Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
Keluaran yang bebas denyut
Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 mL/menit
Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan relatif
yang baik (kesalahan < 0,5%)
Tahan terhadap korosi
Terdapat tiga jenis pompa yang sering digunakan
dalam sistem KCKT, yaitu :
a) Pompa Reciprocating
Pompa reciprocating adalah jenis pompa yang
paling banyak digunakan. Sekitar 90% peralatan
komersial menggunakan pompa jenis ini. Pada pompa
jenis ini, larutan dipompakan dengan gerakan maju
mundur piston yang digerakkan oleh motor penggerak.
Terdapat dua buah bola yang berperan sebagai katup
pembuka dan penutup, yang mengontrol keluar
masuknya solven dalam tabung pompa.
Gambar 7 Bagan Pompa Reciprocating
-
35
Kelemahan pompa adalah masih dihasilkannya
denyut yang harus diredam dengan pengaturan baseline
pada kromatogram. Kelebihan pompa jenis ini adalah
volum internalnya kecil (35 400 L), tekanan hingga
10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan
elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari
tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.
b) Pompa Sistem penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah
wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan
yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang
bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan
bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah
kapasitas pompa terbatas hanya 250 mL dan cukup sulit
saat solven harus mengalami penggantian.
c) Pompa Tekanan Udara (Pneumatic Pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa tekanan
udara merupakan wadah yang ditekan oleh gas
bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut
merupakan kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya
terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran
terbatas hanya sekitar 5000 psi, dipengaruhi oleh tekanan
balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan
untuk sistem elusi gradien.
Gambar 8 Bagan Pompa Sistem Pergantian
-
36
3) Injeksi Sampel
Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari
sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat menyebabkan
pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan
kapasitas. Sebagai akibatnya, volum injeksi harus dibatasi
hingga kisaran maksimum 500 L.
Terdapat beberapa metode yang digunakan untuk
menginjeksikan sampel ke dalam kolom yang dapat dibagi
menjadi, injeksi menggunakan syringe (syiringe injection),
injeksi aliran terhenti (stopped flow injection) dan injeksi
menggunakan katup (valve injection).
a) Injeksi menggunakan katup
Merupakan metode injeksi yang paling diterima
dan umum digunakan pada saat ini. Pemasukan sampel
ke dalam aliran fase gerak berlangsung dengan cepat,
aliran fase gerak tidak perlu dihentikan, mudah
digunakan, dapat disesuaikan untuk injeksi otomatis,
dapat digunakan pada tekanan hingga 6000 psi. Katup
enam jalur digunakan berpasangan dengan loop sampel.
Pada saat posisi pengambilan (charge), katup
terpisah dari jalur aliran fase gerak, tidak terjadi tekanan
Gambar 9 Bagan Pompa Tekanan Udara
-
37
sehingga loop dapat diisi dengan sampel. Dengan
memutar rotor pada posisi injeksi (inject), loop yang telah
diisi dengan sampel akan berhubungan dengan aliran
fase gerak dari kolom, sehingga sampel akan terbawa ke
dalam kolom.
Katup injeksi yang dipasarkan oleh Valco dan
Rheodine, memiliki loop untuk sampel diluar rotor
sehingga dapat dengan mudah diganti sesuai dengan
volum injeksi yang diinginkan.
b) Injeksi menggunakan syringe
Merupakan metode awal yang digunakan untuk
memasukan sampel ke dalam kolom. Diadaptasi dari
proses injeksi sampel dalam kromatografi gas. Sampel
diinjeksikan melalui sebuah penyegel septum.
c) Injeksi pada kolom (on column injection)
Metode injeksi ini disebut juga metode injeksi
aliran terhenti (stopped flow injection). Menggunakan
metode ini, pompa dimatikan, kemudian katup injeksi
dibuka, sampel diinjeksikan pada injector yang tidak
memiliki septum, pompa dinyalakan lagi, aliran fase gerak
kembali seperti pada pengaturan awal. Sistem ini tidak
menyebabkan kerugian dalam hal akurasi. Hanya saja,
keterulangan waktu retensi akan sulit untuk memberikan
hasil yang memuaskan.
4) Kolom KCKT
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung
stainless steel, walaupun untuk tekanan di bawah 600 psi
kolom kaca dapat digunakan.
Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang
kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika
diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain.
-
38
Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5
10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000
plat/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan
memproduksi kolom dengan kecepatan dan kinerja tinggi.
Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm
dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom
memiliki jumlah plat hingga 100.000 hanya dengan panjang 3
sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan
sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah
solven minimum menjadi pertimbangan penting karena
mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi
(chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair
yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous particle).
Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak
berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter
30 hingga 40 m. Lapisan tipis berpori silika, alumina, atau
resin sintetis divinil benzen polystirena dengan melapiskan
penukar ion pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel
berpori dengan diameter partikel 3 10 m terbuat dari silika,
alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin
penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film
berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika
terhadap permukaannya.
5) Detektor
Detektor ideal pada sistem KCKT memenuhi
persyaratan berikut:
Memiliki sensitivitas yang memadai. Kisaran umum
sensitivitas berkisar dari 10-8 hingga 10-15 gram zat terlarut
per pembacaan.
Stabil dan memiliki keterulangan yang baik.
Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi.
-
39
Waktu respon yang singkat.
Kemudahan pada penggunaan.
Memiliki volum internal yang kecil untuk mengurangi
pelebaran puncak.
Berikut merupakan beberapa jenis detektor dapat
digunakan pada sistem KCKT :
a) Detektor Absorban
Detektor Absorban Untuk meminimalkan
pelebaran puncak, detektor dirancang dalam vo