-
LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI
DETEKSI BAKTERI PATOGEN
NAMA:
AYU APRILLIANI 260110140078
PUTRI RARASWATI 260110140079
UMMI HABIBAH 260110140080
AYYU WIDYAZMARA 260110140081
ANGGIA DIANI 260110140082
SITI NURROHMAH 260110140083
AI SITI RIKA FAUZIAH 260110140084
NISA MAULANI 260110140085
TIFFANY SABILLA 260110140086
NURMALIA SARASWATI 260110140087
ADAM RENALDI 260110140090
FAMI FATWA 260110140095
RHEZA ANDIKA 260110140105
LABORATORIUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2015
-
I. Tujuan
Untuk mengetahui ada atau tidaknya bakteri patogen yang dapat menghemolisis
darah pada ekstrak
II. Prinsip
1. Hemolisis Bakteri
Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya zona
bening disekeliling koloni bakteri. Terdapat 3 tipe sifat hemolisis yaitu
alpha, beta, dan gama (Alderberg, 2001)
2. Agar Darah
Media Agar Darah merupakan media differensial yang berfungsi
membedakan bakteri berdasarkan kemampuan bakteri melisiskan sel darah
merah. Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya
zona bening disekeliling koloni bakteri (Alderberg, 2001)
3. Teknik Aseptis
Proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba
kontaminan, teknik aseptis digunakan sepanjang percobaan berlangsung,
baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan (Anton, 2008).
III. Teori Dasar
Hemolisis adalah rusaknya jaringan darah akibat lepasnya hemoglobin dari
stroma eritrosit (butir darah merah). Hemolisis dapat disebabkan karena
penurunan tegangan permukaan membrane sel dan dipengaruhi oleh beberapa
faktor, seperti pelarut organik, saponin, garam empedu, sabun, enzim, dan faktor
lain yang merusak komplek lemak-protein dari stroma. Faktor hemolisis ini
ditemukan pada bisa ular famili Elapidae (Cormack, 2008).
Membran sel darah termasuk membran yang permeabel selektif. Membran
sel darahmerah mudah dilalui atau ditembus oleh ion-ion H+, OH-, NH4+, PO4,
HCO3-, Cl-, dansubstansi seperti glukosa, asam amino, urea, dan asam urat.
-
Sebaliknya sel darah merah tidak dapat ditembus oleh Na+, K+, Ca2+, Mg2+,
fosfat organik, hemoglobin dan protein plasma.Secara umum membran yang
dapat dilalui atau di tembus oleh suatu substansi dapat dikatakan bahwa membran
ini permeabel terhadap substansi tersebut. Membran yang betul-betul semi
permeabel adalah membran yang hanya bisa di tembus oleh molekul air saja,
tetapi tidak dapat di tembus oleh substansi lain (Watson, 2009).
Prinsip dari hemolisis yaitu sel darah merah akan mengalami lisis
biladirendam dalam larutan (eritrosit melemah). Sedangkan tujuan dari hemolysis
dalam sediaan darah tebal berfungsi untuk melisiskan eritrosit sehingga parasite
yang ditemukan lebih banyak. Pada peristiwa hemolisis,
semakin tinggi konsentrasi lingkungan maka semakin lambat proses
hemolisis terjadi dan sebaliknya apabila konsentrasinya rendah maka proses
hemolisis akan semakin cepat. (Jonathan, 2006).
Dalam dunia mikrobiologi hemolisis digunakan untuk mengklasifikasi
mikroorganisme tertentu dengan cara mengamati kemampuan koloni bakteri
untuk menginduksi hemolisis bila ditanam pada agar darah. Ada 3 jenis hemolisis,
yaitu:
1. Hemolisis Alfa
Jenis hemolisis alfa atau yang biasa disebut juga hemolisis sebagian adalah
penurunan hemoglobin sel darah merah untuk methemoglobin dalam medium
sekitar koloni. Hal ini menyebabkan perubahan warna cokelat atau hijau
dalam medium. Warna dapat disamakan dengan memar sel. Pemeriksaan
mikroskopis sel darah merah alpha-hemolyzed menunjukkan bahwa membran
sel yang utuh. Hemolisis Alfa disebabkan oleh oksidasi besi dalam
hemoglobin yang mengacu pada lisis parsial dari sel darah merah dan
hemoglobin (Brown, 2001).
2. Hemolisis Beta
-
Hemolisis beta atau yang biasa disebut hemolisis total didefinisikan sebagai
lisis seluruh sel darah merah. Jenis hemolisis ini ditandai dengan sebuah zona
transparan yang jelas pada media di sekeliling koloni mikroba (Brown, 2001).
3. Hemolisis Gamma
Hemolisis Gamma disebut juga non-hemolisis. Mikroba dikategorikan sebagai
hemolisis gamma apabila ketika pengujian tidak terjadi perubahan karena
mikroba tidak dapat melisiskan sel darah merah (Brown, 2001).
Ada dua macam hemolysis, yaitu:
Hemolisis osmotik yang terjadi karena adanya perbedaan yang besar antara
tekanan osmosa cairan didalam sel darah merah dengan cairan yang berada
disekeliling sel darah merah. Tekanan osmosa sel darah merah adalah sama
dengan osmosa larutan NaCl 0, 9 %, bila sel darah merah dimasukkan
kedalam larutan NaCl0, 8 % belum terlihat adanya hemolisa, tetapi sel darah
merah yang dimasukkan kedalamlarutan NaCl 0, 4 % hanya sebagian saja dari
sel darah merah yang mengalami hemolisis dan sebagian lagi sel darah
merahnya masih utuh. Perbedaan ini desebabkan karena umur seldarah merah
yang sudah tua, membran sel mudah pecah, sedangkan sel darah merah yang
muda, membran selnya masih kuat. Bila sel darah merah dimasukkan kedalam
laritan NaCl 0,3 %, semua sel darh merah akan mengalami hemolisa sempurna
(Wulangi, 1993).
Hemolisis kimiawi membran sel darah merah dirusak oleh macam-macam
substansi kimia. Seperti,kloroform, aseton, alkohol, benzena dan eter,
substansi lain adalah bisa ular, kalajengking,dan garam empedu. (Wulangi,
1993).
Patogen merupakan organisme yang mengakibatkan makhluk hidup
menderita. Menderita dalam arti umum adalah merasakan sakit dan gelisah, akan
tetapi tumbuhan tidak dapat merasakan sakit dan gelisah. Pengertian Patogenesis
adalah proses dimana mekanisme infeksi dan mekanisme perkembangan suatu
penyakit. Infeksi adalah invasi inang oleh mikroba yang memperbanyak dan
-
berasosiasi dengan jaringan inang. Infeksi berbeda dengan penyakit. Kapasitas
bakteri menyebabkan penyakit tergantung pada patogenitasnya. Dengan kriteria
ini, bakteri dikelompokan menjadi 3, yaitu agen penyebab penyakit, patogen
oportunistik, nonpatogen (Purnomo, 2006).
Agen penyebab penyakit adalah bakteri patogen yang menyebabkan suatu
penyakit (contohnya Salmonella spp.). Patogen oportunistik adalah bakteri yang
berkemampuan sebagai patogen ketika mekanisme pertahanan inang diperlemah
(contoh E. coli menginfeksi saluran urin ketika sistem pertahanan inang
dikompromikan (diperlemah). Nonpatogen adalah bakteri yang tidak pernah
menjadi patogen. Namun bakteri nonpatogen dapat menjadi patogen karena
kemampuan adaptasi terhadap efek mematikan terapi modern seperti kemoterapi,
imunoterapi, dan mekanisme resistensi. Bakteri tanah Serratia marcescens yang
semula nonpatogen, berubah menjadi patogen yang menyebabkan pneumonia,
infeksi saluran urin, dan bakteremia pada inang terkompromi (Rollins, 2000).
Bahaya biologi (mikroba) pada pangan perlu mendapat perhatian karena jenis
bahaya ini yang sering menjadi agen penyebab kasus keracunan pangan.
Escherichia coli merupakan bakteri patogen yang sering menyebabkan keracunan
pangan dan juga menjadi salah satu mikrobaindikator sanitasi.Sedangkan
Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang biasa menghuni hidung, mulut,
tenggorokan, maupun kulit. Keberadaan Escherichia coli pada pangan dapat
menunjukkan praktek sanitasi lingkungan yang buruk sedangkan adanya
Staphylococcus aureus mengidentifikasi praktek higiene yang kurang (Wijaya,
2009).
-
Selama 3 dasawarsa terakhir, telah berkembang sejumlah metode baru dalam
identifikasi mikroba patogen pada produk pangan. Contoh metode-metode
identifikasi yang telah dikembangkan untuk meningkatkan kemampuan
identifikasi bakteri patogen seperti terlihat pada Tabel 1. Beberapa teknik tersebut
pada awalnya diperuntukkan bagi keperluan mikrobiologi medis/klinis, seperti
PCR dan ELISA. Teknik PCR sendiri telah diterima sebagai standar internasional
untuk identifikasi bakteri patogen pada produk pangan sejak beberapa tahun
terakhir (Dwiyitno, 2010).
Bakteriosin merupakan antimikroba yang digunakan untuk menonaktifkan
mikroba. Pengendalian bakteri patogen dapat dilakukan dengan kombinasi antara
bakteriosin yang dihasilkan bakteri asam laktat dan suhu tinggi (Arques et al.
2005)
IV. Alat, Bahan dan Gambar Alat
Alat:
1. Cawan petri
-
2. Inkubator
3. Mikro pipet
4. Ose loop
5. Tabung reaksi
6. Volume pipet
7. Vortex
Bahan:
1. Agar darah
2. Ekstrak
3. Larutan NaCl fisiologis steril
Gambar Alat
Cawan Petri Inkubator Mikro pipet
Ose loop Tabung Reaksi Volume Pipet
Vortex
-
V. Prosedur
1. Alat dan bahan disiapkan
2. Ekstrak ditimbang seberat 0,5 g. Dilarutkan dalam 4,5 mL NaCl fisiologis yang
berada dalam tabung reaksi I. kemudian dikocok dengan Vortex.
3. Ambil 0,5 mL larutan dari tabung reaksi I ke dalam tabung reaksi II yang berisi
4,5 mL NaCl fisiologis.
4. Ambil 0,5 mL larutan dari tabung reaksi II ke dalam tabung reaksi III yang berisi
4,5 mL NaCl fisiologis.
5. Oleskan dengan menggunakan ose loop penuh ke media agar darah.
6. Diinkubasi selama 18-24 jam dalam inkubator.
VI. Data pengamatan
1. Pengamatan Kemampuan Hemolisis Bakteri dalam Ekstrak Daun
Salam (Syzygium polianthum)
No. Perlakuan Hasil
1. Alat dan bahan yang sudah
disterilisasi disiapkan
Tersedia alat dan bahan-bahan yang
bebas bakteri
2. Ekstrak daun salam ditimbang
sebanyak 0,5 gram pada cawan
petri kecil dengan menggunakan
neraca analitik yang sudah ditara
terlebih dahulu
Didapatkan ekstrak daun salam
sebanyak 0,5 gram
3. Ekstrak daun salam sebanyak 0,5
gram tersebut diencerkan dengan
4,5 mL NaCl fisiologis steril
(perbandingan 1:10), dan
dihomogenkan dengan mesin
vortex.
Didapatkan suspensi ekstrak daun
salam yang homogen dengan
konsentrasi 10%
-
4. Ekstrak daun salam tersebut
diencerkan dengan cara diambil
0,5 mL ekstrak dengan
menggunakan mikropipet dan
dimasukkan pada tabung reaksi
lain yang berisi 4,5 mL NaCl
fisiologis steril. Campuran
ekstrak dihomogenkan dengan
mesin vortex.
Didapatkan suspensi ekstrak daun
salam yang homegen dengan
konsentrasi 1% dengan faktor
pengenceran 10-1
5. Ekstrak daun salam tersebut
kembali diencerkan dengan cara
diambil 0,5 mL ekstrak dengan
menggunakan mikropipet dan
dimasukkan pada tabung reaksi
lain yang berisi 4,5 mL NaCl
fisiologis steril. Campuran
ekstrak dihomogenkan dengan
mesin vortex.
Didapatkan suspensi ekstrak daun
salam yang homegen dengan
konsentrasi 0,1% dengan faktor
pengenceran 10-2
-
6. Cawan petri yang berisi agar
darah ditandai untuk membagi
daerah cawan Petri menjadi
menjadi bagian.
Cawan berisi agar darah terbagi
menjadi tiga daerah
7. Masing-masing ekstrak daun
salam yang telah dibuat
dioleskan pada permukaan agar
darah pada daerah yang berbeda
sebanyak satu Ose penuh
Masing-masing bagian diinokulasi
dengan ekstrak daun salam
8. Cawan berisi agar darah
diinkubasi selama 24 jam dan
diamati hasilnya
Di dapatkan hasil demikian.
-
2. Perhitungan
Larutan 1
0,5 gram Ekstrak dalam 4,5 mL NaCl fisiologi steril
= 10 %
Larutan 2 (Pengenceran 10-1
)
0,5 mL x 10 % = 5 mL x M
M = 1 %
Larutan 3 (Pengenceran 10-2
)
0,5 mL x 1 % = 5 mL x M
M = 0,1 %
VII. Pembahasan
Praktikum kali ini mengenai pengujian ekstrak yang diinokulasi pada media
agar darah (blood agar). Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah dalam
ekstrak yang diuji terdapat bakteri yang dapat menghemolisis darah sehingga
dapat ditetapkan eksrak ini dapat digunakan sebagai obat atau tidak. Prinsip dari
praktikum ini yaitu adanya perubahan pada media blood agar ketika dihemolisis
oleh bakteri yang terdapat dalam ekstrak dengan pengerjaan mengikuti aturan
teknik aseptis.
-
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi
senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut
yang sesuai (Depkes RI, 2000). Ekstrak yang diuji adalah ekstrak daun salam.
Ekstrak ini perlu diuji karena ekstrak ini selanjutnya akan digunakan sebagai
bahan dasar suatu sediaan yang diharapkan mempunyai efek terapeutik dan tidak
berbahaya bagi pasien. Berdasarkan aturan yang telah ditetapkan oleh BPOM,
ekstrak tidak boleh mengandung mikroba pathogen. Sehingga hasil dari pengujian
ekstrak pada blood agar ini yaitu dapat diketahui apakah ekstrak mengandung
mikroba pathogen yang dalam pengujian ini mikroba yang dapat menghemolisis
darah.
Blood agar digunakan untuk isolasi, menumbuhkan berbagai macam bakteri
pathogen dan menetapkan bentuk hemolisa dari bakteri tersebut. Media kultur ini
kaya nutrien yang menyediakan kondisi pertumbuhan bakteri yang optimal. pH
media ini sekitar 6,8 untuk menstabilkan sel darah merah dan menghasilkan media
hemolisa yang jelas. Kandungan yang didapat pada agar darah seperti nutrien
substrat (ekstrak hati dan pepton), NaCl, agar agar, darah domba. Media Agar
Darah (blood agar plate) merupakan media differensial yang berfungsi
membedakan bakteri berdasar kemampuan bakteri melisiskan sel darah merah.
Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya zona bening di
sekeliling koloni bakteri.
Pada pengujian ekstrak ini, seperti biasanya pada lab mikro biologi, kerja
yang dilakukan harus secara aseptis. Tujuannya yaitu untuk mencegah
kontaminasi mikroorganisme dan mencegah kontaminasi ruangan dan praktikan
dengan mikroorgansime. Menurut Pelczar dan Chan (2007), teknik aseptis sangat
penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan
keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas dari
kontaminan yang dapat mencemari. Cara kerja dalam lab mikrobiologi sangat
mempengaruhi terhadap hasil pengujian. Ketika pengerjaan di lab tidak aseptis,
maka dimungkinkan hasil yang didapat tidak akurat karena adanya kontaminasi
dari luar. Teknik aseptis ini dapat dilakukan dengan cara mensterilisasikan
terlebih dahulu peralatan gelas yang akan digunakan. Selain itu, saat melakukan
-
kerja, harus selalu di dekat api agar terhindar dari kontaminasi luar yang dapat
menyebabkan kesalahan pada hasil pengujian.
Langkah pertama yang harus dipersiapkan dalam percobaan kali ini adalah
membuat blood agar. Blood agar adalah media pertumbuhan mikroorganisme
yang digunakan untuk mengetahui apakah mikroorganisme tersebuat dapat
menghemolisis darah atau tidak dapat menghemolisis darah. Selain itu, dengan
menggunakan blood agar dapat diketahui apakah mikroorganisme tersebut
pathogen atau tidak. Blood agar merupakan media diferensial, bukan media
selektif. Media blood agar juga disebut media universal karena dapat digunakan
untuk menumbuhkan beragam jenis bakteri. Cara pembuatan blood agar cukup
mudah, disiapkan cawan petri yang telah di sterilkan lalu darah yang steril
dimasukkan kedalam cawan petri tersebut. Setelah itu ditambahkan agar nutrient
kedalam cawan petri yang telah diisi darah. Agar nutrient digunakan sebagai
pemadat media, lalu cawan petri di goyang diatas meja membentuk angka 8 untuk
menghomogenkan darah dengan agar nutrient. Setelah itu dibiarkan beberapa
menit hingga blood agar memadat. Pembuatan blood agar dilakukan dengan cara
aseptis.
Untuk pembuatan larutan ekstrak daun salam, ditimbang ekstrak sebanyak
0,5 gram dan dilarutkan dengan 4,5 ml NaCl fisiologis steril lalu dikocok hingga
homogen. Setelah homogen dilakukan pengenceran bertingkat dengan sebanyak 2
kali pengenceran. Setelah larutan ekstrak dibuat dalam 3 konsentrasi, 10-1
, 10-2
,
dan 10-3
. Cawan petri yang telah diisi blood agar dibagi 3 bagian untuk
menggoreskan dengan konsentrasi yang berbeda. Setelah itu dilakukan
penggoresan kedalam media blood agar yang tadi telah dibuat sebelumnya, lalu
diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam. Saat inkubasi cawan petri harus
dengan keadaan terbalik agar tidak ada uap air.
Media blood agar ini digunakan untuk isolasi, menumbuhkan berbagai
macam bakteri patogen dan menetapkan bentuk hemolisa dari bakteri tersebut.
Media kultur ini kaya nutrien yang menyediakan kondisi pertumbuhan bakteri
yang optimal. pH media ini sekitar 6,8 untuk menstabilkan sel darah merah dan
menghasilkan media hemolisa yang jelas. Kandungan yang didapat pada agar
-
darah seperti nutrien substrat (ekstrak hati dan pepton), NaCl, agar agar, darah
domba.
Media Agar Darah merupakan media differensial. Metode uji hemolisis
berdasarkan kemampuan bakteri menghemolisis sel darah merah pada Blood
Agar Plate yang ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni
(Chamanrokh et al, 2007). Terdapat 3 tipe sifat hemolisis yaitu alpha, beta, dan
gama. Hemolisis alpha terjadi penurunan hemoglobin sel darah merah di sekitar
koloni sehingga sekeliling bakteri akan tampak warna hijau atau coklat dalam
medium. Hemolisis beta didefinisikan lisis lengkap dengan tampilan warna
transparan disekeliling bakteri pada medium. Tipe hemolisis gamma
menunjukan kurangnya tanda hemolisis atau tidak ada zona bening serta
perubahan warna.
Untuk membaca reaksi hemolitik pada lempeng Blood agar (agar darah),
cawan petri harus diangkat ke sumber cahaya dan diamati dengan cahaya yang
datang dari belakang (cahaya yang ditransmisikan).
Pada perlakuan praktikum ini digunakan 3 konsentrasi berbeda dari larutan
ekstrak daun salam yang tercemar bakteri untuk diuji ada tidaknya bakteri patogen
didalamnya yang memiliki kemampuan dalam lisis darah. Konsentrasi yang
digunakan yaitu 10-1
, 10-2
, 10-3
, dimana ketiga konsentrasi ini digoreskan pada
satu cawan petri yang sebelumnya telah dibagi menjadi tiga bagian sama besar.
Hasil yang diperoleh dari inkubasi selama 24 jam menunjukkan hasil bahwa
pada ekstrak yang daun salam yang diteliti tidak mengandung bakteri patogen
yang dapat menghemolisis darah yang sesuai dengan literatur yang ditetapkan.
Hal ini dapat diketahui dengan tidak adanya zona bening pada ekstrak yang
digoreskan pada blood agar. Ketika ada zona bening menunjukkan bahwa bakteri
patogen berhasil melisis media blood agar, jika itu terdapat pada eksrak maka
ektrak tersebut tidak dapat dijadikan untuk obat karena dapat membahayakan
kesehatan tubuh sedangkan pada ekstrak daun salam yang diteliti saat praktikum
tidak ditemukan bakteri yang berbahaya yang bersifat patogen.
-
VIII. Simpulan
Ekstrak daun salam yang diteliti tidak mengandung bakteri patogen yang dapat
menghemolisis darah ditandai dengan tidak adanya zona bening pada ekstrak yang
digoreskan pada blood agar.
-
DAFTAR PUSTAKA
Alderberg M, Jawetz. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika.
Anton, W. 2008.Mikrobiologi Umum. Malang :Universitas Brawijaya
Arques, J.L., E. Rodriguez, G. Gaya, M. Medina, B. Guamis, and M. Nunez.
2005. In-activation of Staphylococcus aureus in raw milk cheese by
combinations of high-pressure treatments and bacteriocin producing lactic
acid bacteria. sJ. Appl. Microbiol. (98): 254-260.
Brown, A. 2001. Benson : Microbiological Applications Lab Manual. 8th Ed.
New York : The McGraw-Hill Companies.
Cormack. 2008. Histologi veterinner. Jakarta : UI Press.
Dwiyitno. 2010. Identifikasi Bakteri Patogen pada Produk Perikanan Dengan
Teknik Molekuler. Squalen Vol. 5 No. 2.
Jonathan. 2006. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta: EGC.
Novotny, L., Dvorska. L., Lorencova, A., Beran, V., and Pavlik, I. 2004. Fish: a
potential source of bacterial pathogens for human beings. Vet. Med.
Czech. 49 (9): 343358.
Purnomo, B. 2006. DASAR-DASAR PERLINDUNGAN TANAMAN :
Penggolongan Penyakitdan Patogen Tumbuhan.
Rollins, D.M. and Joseph, S.W. (2000). Pathogenic Microbiologi. Available at
http://www.life.umd.edu.com [30 November 2015]
Waswa, J., Irudayaraj, J., and Debroy, C. 2007. Direct detection of E. coli
O157:H7 in selected food systems by a surface plasmon resonance
biosensor. LWT. 40: 187192.
Watson, David G. 2009. Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi
dan Praktisi Kimia Farmasi Edisi 2. Jakarta : EGC.
Wijaya, R. 2009. Penerapan Peraturan Dan Praktek Keamanan Pangan Jajanan
Anak Sekolah Di Sekolah Dasar Kota Dan Kabupaten
Bogor.Skripsi.Bogor: Institut Pertanian Bogor.
-
Wulangi, K.S. 1993. Prinsip-prinsip Fisiologi Hewan. Jakarta : Depdikbud.