KARAKTERISASI MOLEKULER PADI TRANSGENIK
DENGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA
RIZKI AYU KARTINI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
RIZKI AYU KARTINI. Karakterisasi Molekuler Padi Transgenik dengan
Beberapa Metode Isolasi DNA. Dibimbing oleh EMAN KUSTAMAN dan
KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
Tanaman padi merupakan penghasil beras sehingga menjadi salah satu
komoditas pangan utama. Ukuran butir merupakan kualitas yang sangat penting
dalam beras. Salah satu usaha yang dilakukan dalam penelitian guna
meningkatkan produksi padi adalah melalui perakitan tanaman transgenik yang
disisipkan gen Os-GS3 (Oryza sativa Grain Size 3). Materi yang digunakan dalam
penelitian ini adalah padi varietas T-309. Padi yang telah disisipi gen Os-GS3
ditanam dan dianalisis keberadaan gennya melalui PCR serta karakterisasi
molekulernya melalui hibridisasi Southern. Metode isolasi DNA yang digunakan
dalam penelitian ini adalah skala cepat, skala miniprep, dan skala besar, sehingga
diperoleh metode yang efisien dari segi waktu penyelesaian dan sumberdaya yang
digunakan untuk PCR dan hibridisasi Southern. Analisis PCR dari ketiga metode
menghasilkan ukuran pita yang sama, yaitu 500 bp. Pengujian hibridisasi
Southern menggunakan metode skala besar menghasilkan pita atau salinan gen,
sedangkan pada metode miniprep tidak ada. Metode skala cepat adalah metode
paling efisien untuk analisis PCR, sedangkan metode skala besar paling efisien
untuk hibridisasi Southern. Hasil pengujian pada pembungkaman ekspresi gen Os-
GS3 dengan antisense RNA berhasil ketika 4 transgen yang terintegrasi ke dalam
genom tanaman.
Kata kunci: Padi, Isolasi DNA, Hibridisasi Southern.
ABSTRACT
RIZKI AYU KARTINI. Molecular Characterization of Transgenic Rice Plants
with of DNA Isolated using Multiple Methods. Under the direction of EMAN
KUSTAMAN and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
Rice is a major food commodity for agroindustrial country. Grain size is a
major determinant of grain quality. One attempt that has been made in research to
increase rice production is assembly of transgenic plants inserted with Os-GS3
(Oryza sativa Grain Size 3) gene. The material used in this study is cultivar Taipei
309. Rice plants that have been inserted with Os-GS3 gene were grown and the
presence of the genes was analyzed through molecular characterization by PCR
and Southern hybridization. DNA isolation methods used in this study were the
simple method, miniprep scale, and large scale. They were compared to obtain the
most efficient method in terms of turnaround time and resources used for PCR
and Southern hybridization. PCR analysis of the three methods produced bands of
the same size, in that 500 bp. Southern hybridization test of the DNA isolated
using the large scale method produced bands or copy genes, where as that isolated
using miniprep method did not produce band. The fast scale method is the most
efficient DNA isolation method for PCR analysis, where as the large scale method
is the most efficient DNA isolation method for Southern hybridization. The results
in the silencing of gene expression of Os-GS3 with antisense RNA was successful
when 4 transgenes integrated into the plant genome.
Keyword: Rice, DNA isolation, Hybridization Southern.
KARAKTERISASI MOLEKULER PADI TRANSGENIK
DENGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA
RIZKI AYU KARTINI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Karakterisasi Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa
Metode Isolasi DNA
Nama : Rizki Ayu Kartini
NIM : G84080061
Disetujui
Komisi Pembimbing
Ir. H. Eman Kustaman Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko
Ketua Anggota
Diketahui
Dr. I Made Artika, M. App. Sc
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
penelitian dan penulisan skripsi ini dengan baik yang berjudul “Karakterisasi
Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa Metode Isolasi DNA”. Kegiatan
penelitian yang merupakan salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia ini dilakukan dari bulan Februari 2012 sampai dengan Juli
2012 di Laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi
dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar 3A, Bogor, Jawa
Barat.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyelesaian penelitian ini baik secara langsung maupun tidak
langsung. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ir. H. Eman Kustaman
selaku ketua pembimbing dan Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko selaku anggota
pembimbing yang telah memberikan bimbingan, motivasi, dan masukan.
Terimakasih penulis persembahkan kepada kedua orang tua tercinta, kakak,
abang, M. Yuda Ramdani atas segala kasih sayang, perhatian, doa dan
dukungannya dalam setiap langkah penyusunan karya ilmiah ini baik semangat
maupun motivasi untuk selalu berusaha agar menjadi lebih baik. Tidak lupa pula
penulis sampaikan ucapan terima kasih kepada mba Dewi, kak Falin, kak Indra,
dan segenap staf di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian atas peran dan
kerjasamanya yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan selama
penelitian Riris, Ihsan, Naso, Restu, Andi, mas Nazar atas motivasi dan saran
yang diberikan kepada penulis. Selain itu penulis ucapkan terimakasih kepada
teman-teman seperjuangan Biokimia 45, Kenyar, Silvi, Yoan, Titus, Devid, Edo,
dan juga sahabat-sahabat yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu atas
segala bantuan, masukan, kritik, dan motivasi yang diberikan.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini jauh dari kesempurnanaan. Untuk
itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun untuk perbaikan di
masa mendatang. Akhir kata penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2012
Rizki Ayu Kartini
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta Timur pada tanggal 21 April 1990 dari ayah
bernama Freddy Latief dan ibu bernama Marni Lusia. Penulis merupakan anak
keempat dari empat bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari TK At-Taqwa dan Sekolah Dasar di SD
negeri Harapan Jaya XIII kemudian melanjutkan pendidikan ke jenjang Sekolah
Menengah Pertama di SMP Negeri 5 Bekasi. Tahun 2008 penulis menyelesaikan
pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 4 Bekasi dan pada tahun
yang sama lolos seleksi masuk dan melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Di IPB penulis mengambil
mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum
mata kuliah Biokimia Umum untuk mahasiswa S1 Departemen Biologi tahun
ajaran 2011/2012. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi kemahasiswaan di
IPB dan organisasi mahasiswa daerah, diantaranya penulis pernah aktif sebagai
staf keilmuan Bioanalisis Community Research and Educatioan of Biochemistry
periode 2010/2011, dan staf Himpunan Keluarga Mahasiswa Bekasi di Bogor
selama dua periode tahun 2009-2011.
Penulis juga pernah aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti panitia Green
Festival IPB 2009, Masa perkenalan Kampus Mahasiswa Biokimia tahun 2009,
Pesta Sains Nasional 2009 dan 2010, Biokimia Expo 2010, Seminar kesehatan
2011, dan beberapa kepanitiaan lainnya. Penulis melakukan Praktik Lapang di
Laboratorium Mikrobiologi PT. Frisian Flag Indonesia, Jalan Raya Bogor Km 5,
Pasar Rebo, Jakarta Timur dengan judul Analisis Cemaran Mikroba pada Susu
Bubuk dengan Metode Enumerasi dan Deteksi. Penulis dalam bidang karya ilmiah
pernah mendapat hibah dana bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
(DIKTI) dalam Pekan Kreativitas Mahasiswa (PKM) untuk kategori Bidang
Gagasan tertulis pada tahun 2009 dan Bidang Penelitian pada tahun 2010.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ………………………………………………………... x
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………... xi
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………... xii
PENDAHULUAN ………………………………………………………... 1
TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………….. 2
Tanaman Padi………………………………………………………… 2
Isolasi DNA…………………………………………………………... 3
Gen Os-GS3…………………………………………………………... 3
Polymerase Chain Reaction (PCR)…………………………………... 4
Hibridisasi Southern………………………………………………….. 4
Elektroforesis Gel Agarosa…………………………………………… 5
BAHAN DAN METODE …………………...……………………………. 6
Bahan dan Alat……………………………………………………….. 6
Metode Penelitian …......…..…………………...…………………….. 6
HASIL DAN PEMBAHASAN ...………………………………….……... 10
DNA Hasil Isolasi Menggunakan Metode Cepat, Miniprep, dan Skala
Besar…………………………………………………………………..
10
DNA Hasil Polymerase Chain Reaction Menggunakan Metode
Cepat, Miniprep, dan Skala Besar…………………………………….
11
Karakterisasi Molekuler Berdasarkan Hibridisasi Southern ……… 12
Karakterisasi Molekuler dengan Fenotipe Tanaman Padi Transgenik
Kultivar Taipei 309 …………………………………………………
14
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………. 15
Simpulan ……………………………………………………………... 15
Saran …………………………………………………………………. 15
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….. 15
LAMPIRAN ……………………………………………………………… 18
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Perbedaan morfologi dan fisiologi tanaman padi subspecies Indica,
Japonica, dan Javanica…………………………………. …………………
3
2 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi ………….. 11
3 Hasil analisis dan pola integrasi gen sisipan Os-GS3) pada generasi
pertama (T0) pada kultivar Taipe 309 menggunakan primer hpt untuk
PCR dan pelacak hpt untuk hibridisasi Southern …………………………
13
4 Jumlah salinan gen menggunakan DNA yang diisolasi metode skala besar
dengan fenotipe tanaman padi……………………………………………..
14
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Perbedaan butir padi Indica dan Japonica ……………………………….... 3
2 Proses umum PCR ………………..……………………………………….. 4
3 Susunan perangkat blotting Membran …………………………………… 10
4 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer Hpt……………………. 11
5 Hasil hibridisasi Southern…………………………………………………. 13
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ………………………………………………...…..... 19
2 DNA genom yang telah di potong enzim BamHI ………………………. 20
3 DNA pelacak yang telah diberi label DIG-11-dUTP …………………… 20
4 DNA Genom setelah proses transfer ke membran ….…………………... 20
5 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi………..……..... 21
6 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi………………... 22
7 Komposisi larutan hibridisasi Southern………………………………….. 24
1
PENDAHULUAN
Tanaman padi (Oryza sativa L.)
merupakan penghasil beras sehingga menjadi
salah satu komoditas pangan utama dan saat
ini hingga beberapa tahun mendatang, beras
tetap menjadi sumber utama gizi dan energi
bagi lebih dari 90% penduduk Indonesia (BPS
2011). Oleh karena itu, produksi beras
nasional harus ditingkatkan untuk memenuhi
kebutuhan pangan nasional. Beberapa langkah
untuk meningkatkan produksi pangan dapat
diusahakan melalui intensifikasi,
ekstensifikasi, dan diversifikasi (Yuniati
2004). Salah satu cara intensifikasi pertanian
dapat dilakukan melalui perbaikan genetika
tanaman dengan pendekatan bioteknologi atau
teknologi molekuler untuk meningkatkan
produktivitas tanaman padi. Bioteknologi atau
teknologi molekuler memiliki peranan penting
dalam menghasilkan kultivar dengan sifat
unggul baru (Soedarini & Patricia 2006).
Beberapa varietas baru dapat direkayasa
melalui transfer gen dari organisme lain ke
dalam tanaman padi, sehingga dihasilkan padi
transgenik yang memiliki sifat unggul.
Ukuran butir merupakan penentu utama
dari bobot biji. Dalam aplikasi pemuliaan,
ukuran butir biasanya dievaluasi oleh bobot
biji, yang berhubungan positif dengan
beberapa karakter termasuk panjang, lebar,
dan ketebalan butiran biji. Ukuran butir juga
merupakan sifat kualitas yang sangat penting
dalam beras. Dengan demikian, pemahaman
dasar genetik dan molekuler ukuran biji
sangat penting bagi program perbaikan beras.
Salah satu usaha yang dilakukan dalam
penelitian guna meningkatkan produksi padi
adalah melalui perakitan tanaman transgenik
yang disisipi gen antisense Os-GS3 (Oryza
sativa Grain Size 3) (Jiang et al. 2005; Fan et
al. 2006).
Gen merupakan salah satu komponen
penting untuk riset biologi molekuler dan
pengembangan bioteknologi. Usaha untuk
memahami ataupun memodifikasi berbagai
proses biologi pada tingkat molekuler,
memerlukan tersedianya gen-gen yang terlibat
di dalam proses tersebut termasuk informasi
yang terkait dengan gen-gen tersebut.
Identifikasi dan karakterisasi gen seringkali
diperlukan dalam berbagai percobaan
molekuler antara lain isolasi ataupun
mempelajari ekspresinya (Santoso 2001).
Identifikasi gen dapat dilakukan antara
lain dengan analisis PCR untuk melihat ada
atau tidaknya gen dan hibridisasi Southern
untuk mengetahui jumlah salinan transgen
pada tanaman transgenik. Dalam analisis gen
menggunakan metode hibridisasi Southern
dibutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan
murni. PCR membutuhkan DNA dalam
jumlah sedikit dan tidak perlu murni, metode
ini dapat dilakukan lebih cepat dibandingkan
dengan hibridisasi Southern namun lebih
mudah terkontaminasi oleh DNA lain
(Padmadi 2009).
Materi yang digunakan dalam penelitian
ini adalah padi varietas T-309. Padi yang telah
disisipi gen Os-GS3 ditanam dalam tanah dan
dianalisis keberadaan gennya melalui PCR
serta dikarakterisasi molekulernya melalui
hibridisasi Southern. Metode isolasi DNA
yang digunakan dalam penelitian ini adalah
metode skala cepat, metode skala miniprep,
dan metode skala besar. Permasalahan yang
dihadapi ketika isolasi DNA antara lain
jumlah sumber daya dan efisiensi waktu
pengerjaan sampel. Metode isolasi DNA skala
miniprep memerlukan sekitar 200 mg jaringan
daun dan dalam 1 hari (7 jam) seorang analis
dapat mengerjakan maksimal 24 sampel
karena proses menghancurkan daun dibantu
dengan menggunakan mesin (tissue lyser),
sedangkan metode skala besar memerlukan
sekitar 2 g jaringan daun dan dalam 1 hari (7
jam) seorang analis dapat mengerjakan 8
sampel karena proses menghancurkan daun
harus dikerjakan secara manual menggunakan
mortar. Pada situasi tertentu sejumlah besar
tanaman transgenik harus dianalisis PCR
dalam waktu singkat, sehingga perlu
eksplorasi metode isolasi DNA cepat.
Demikian juga perlu dieksplorasi
kemungkinan penggunaan DNA yang
diisolasi dengan skala miniprep dalam analisis
hibridisasi Southern sehingga dapat
dikerjakan ketika tanaman masih dalam fase
bibit untuk menghemat tempat di rumah kaca.
Dibutuhkan juga analisis lanjutan untuk
mengetahui jumlah salinan gen antisense Os-
GS3 yang efektif untuk menaikkan ukuran
biji.
Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi
DNA, perbanyakan DNA, hibridisasi
Southern, dan karakterisasi padi transgenik.
Isolasi DNA dilakukan dengan 3 metode,
yaitu metode skala cepat, miniprep, dan besar.
Perbanyakan DNA dilakukan dengan PCR
menggunakan DNA yang diisolasi dengan
metode skala cepat, miniprep, dan skala besar.
Analisis lebih lanjut dengan hibridisasi
Southern dari sampel DNA yang diisolasi
dengan metode skala besar dan miniprep.
Karakterisasi padi transgenik diamati melalui
2
salinan transgen antisense Os-GS3 dengan
keefektifan dalam menaikkan bobot biji.
Hipotesis yang dikemukakan dalam penelitian
ini yaitu hasil isolasi DNA dan analisis PCR
dalam mengidentifikasi tanaman padi yang
positif transgenik diharapkan sama
menggunakan sampel DNA yang diisolasi
dengan metode cepat, miniprep, dan skala
besar, jumlah salinan transgen yang
tersisipkan di dalam genom tanaman padi
transgenik pada hibridisasi Southern
menggunakan DNA yang diisolasi dengan
metode miniprep sama dengan metode skala
besar, semakin besar jumlah transgen
antisense Os-GS3 maka akan semakin efektif
menaikkan bobot biji. Penelitian ini
diharapkan dapat menganalisis metode isolasi
DNA yang efisien dari segi waktu
penyelesaian dan sumberdaya yang digunakan
untuk PCR dan hibridisasi Southern dari
tanaman padi transgenik. Selain itu,
mengidentifikasi jumlah salinan transgen
antisense Os-GS3 untuk menaikkan ukuran
biji.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Padi
Tanaman padi (Oryza sativa L.)
diklasifikasikan dalam divisi Spermathopyta,
subdivisi Angiospermae, kelas
Monocotyledone, bangsa Gramineae
(Poales), genus Oryza, dan jenis Oryza sativa
L (Remelia 2008). Secara umum padi dapat
tumbuh di daerah tropis/subtropis dengan
curah hujan yang baik adalah 200 mm/bulan
atau 1500-2000 mm/tahun. Di dataran rendah
padi tumbuh pada ketinggian 0-650 m di atas
permukaan laut dengan temperatur 22-27
sedangkan di dataran tinggi 650-1500 m di
atas permukaan laut dengan temperatur 19-
23 (Padmadi 2009).
Padi merupakan tanaman semusim yang
berumpun kuat dengan tinggi tanaman 0.5-2
m, akar padi adalah akar serabut yang efektif
dalam penyerapan hara, tetapi peka terhadap
kekeringan. Akar padi terkonsentrasi pada
kedalaman antara 10-20 cm. Padi berumur
pendek yaitu kurang dari satu tahun dan satu
kali berproduksi, helai daun berbentuk garis,
sebagian besar bertepi kasar dan panjangnya
15-80 cm, serta memiliki malai dengan
panjang 14-40 cm yang tumbuh ke atas dan
ujungnya menggantung. Malai padi berupa
bulir yang beraneka ragam, kadang berjarum
pendek atau panjang, licin atau kasar
berwarna hijau atau coklat. Bulir yang masak
akan menghasilkan buah yang kaya akan pati
amilosa dan amilopektin (Departemen
Pertanian Badan Penelitian dan
Pengembangan Pertanian 2003; Remelia
2008).
Pertumbuhan padi dari pembibitan hingga
panen dibagi menjadi 3 fase yaitu vegetatif,
reproduktif, dan pematangan. Fase vegetatif
yaitu awal pertumbuhan sampai pembentukan
malai, fase reproduktif yaitu pembentukkan
malai sampai pembungaan, dan fase
pematangan yaitu pembungaan sampai gabah
matang. Organ tanaman padi secara
keseluruhan dibedakan menjadi vegetatif
meliputi akar, batang, dan daun sedangkan
organ generatif meliputi malai, bunga, dan
gabah (Banasiak 2010).
Tanaman padi yang ditanam di Asia
dikelompokkan menjadi 3 subspesies
berdasarkan pada perbedaan morfologi,
fisiologi, biokimia dan molekuler, yaitu Oryza
sativa Indica, Oryza sativa Japonica dan
Oryza sativa Javanica. Ketiga jenis subspesies
tersebut biasanya memiliki hubungan dari
perbedaan pada habitat tumbuhnya dan
produk yang dihasilkan (Purmaningsih 2006).
Padi kultivar Taipei 309 (T-309) adalah salah
satu varietas padi yang termasuk dalam
subspesies Japonica. Berdasarkan pada
karakteristik morfologi dan fisiologinya, padi
dari subspesies Japonica memiliki daun yang
berwarna hijau pekat dan ukurannya lebih
sempit, butir padi pendek dan membulat
dibandingkan dengan butir padi Indica yang
lebih panjang dan ramping (Gambar 1), pada
lemma dan palea memiliki bulu yang panjang
dan struktur butir yang padat, serta kadar
amilum sekitar 10—20% (Smith & Dilday
2002). Perbedaan morfologi dan fisiologi
antara tanaman padi yang berasal dari
subspesies Indica, Japonica dan Javanica
dapat dilihat pada Tabel 1.
Tanaman padi kultivar T-309 sering
digunakan sebagai padi model penelitian bagi
tanaman monokotil dan mudah ditransformasi.
Dalam bidang kultur in vitro, tanaman padi
kultivar T-309 memiliki beberapa kelebihan
dibandingkan dengan varietas lain dari
subspesies japonica. Menurut Purnamaningsih
(2006), padi T-309 memiliki respon yang
lebih mudah dan responsif dalam induksi
kalus. Padi T-309 juga memiliki regenerasi
kalus yang lebih cepat, hal tersebut
dikarenakan kandungan poliamin pada padi
Japonica lebih tinggi daripada Indica.
Poliamin tersebut akan berperan dalam proses
pembelahan, pemanjangan dan proliferasi sel.
Semakin tinggi kandungan poliamin maka
3
Gambar 1 Perbedaan butir padi Indica dan
Japonica (Sumber IRRI 2010)
Tabel 1 Perbedaan morfologi dan fisiologi
tanaman padi subspesies Indica,
Japonica, dan Javanica (Sumber
Smith & Dilday 2002)
Karakteristik Indica Japonica Javanica
Daun Lebar
hingga
sempit
Sempit Lebar
dan
kaku
Warna daun Hijau
muda
Hijau tua Hijau
muda
Butir padi Panjang
hingga
pendek,
ramping
dan
sedikit
rata
Pendek
dan
membulat
Panjang,
lebar,
dan
tebal
Jaringan Lunak Keras Keras
Kadar
amilum
23-31% 10-20% 20-25%
semakin responsif apabila ditumbuhkan
secara in vitro.
Isolasi DNA
Sel makhluk hidup memiliki dinding sel
pada bagian luarnya, sehingga untuk
mengeluarkan materi DNA dari inti, dinding
sel harus dipecah terlebih dahulu dengan cara
mekanik ataupun enzimatik yang biasa disebut
sebagai proses isolasi DNA. DNA merupakan
bahan penyusun gen dan
makromolekul beruntai ganda berbentuk
heliks yang berfungsi sebagai pewarisan sifat
yang menyimpan beragam materi genetik.
Tiap molekul DNA terdiri atas dua rantai
panjang yang masing-masing tersusun dari
empat jenis penyusun kimiawi yang disebut
nukleotida (Campbell et al.2002).
Masing-masing nukleotida itu sendiri
terdiri atas tiga bagian, yaitu suatu molekul
organik yang disebut basa nitrogen, suatu
pentose (gula berkarbon lima), dan gugus
fosfat. Terdapat dua keluarga basa nitrogen,
yaitu basa purin dan pirimidin (Campbell et
al. 2002). Basa purin meliputi adenin dan
guanin, sedangkan basa pirimidin meliputi
timin dan sitosin (Manz et al. 2004). Masing-
masing basa tersebut tersusun atas basa
nitrogen, molekul gula, dan fosfat (Campbell
et al. 2002). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,
yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis dinding dan
membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4)
Pemurnian; dan (5) Pemekatan. Prinsip-
prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2,
yaitu sentrifugasi dan pemekatan (Sambrook
& Russell 2001). Isolasi DNA/RNA
merupakan langkah awal yang harus
dikerjakan dalam karakterisasi molekuler
tanaman padi transgenik sebelum melangkah
ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan
memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang
terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.
Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga
dihasilkan pelet sel yang mengandung
DNA/RNA total (Faatih 2009).
Gen Os-GS3
Definisi gen secara umum adalah unit fisik
dan fungsional dari pewarisan sifat yang
mengandung informasi untuk sintesis protein
atau keseluruhan sekuens asam nukleat yang
dapat ditranskripsikan menjadi RNA
fungsional dan protein, pada waktu dan
tempat yang tepat selama pertumbuhan dan
perkembangan organisme. Gen berperan
dalam proses ekspresi gen (Qu et al. 2008).
Ekspresi gen dipengaruhi oleh lingkungan
internal dan eksternal seperti perkembangan
fisik atau perilaku dari organisme itu. Gen
tersusun atas urutan basa nukleotida, yang
terdiri dari daerah yang mengkode suatu
informasi genetik (ekson), daerah yang tidak
mengkode informasi genetik (intron), dan
bagian yang mengatur ekspresi gen yaitu
sekuens pengontrol ekspresi gen (Campbell et
al. 2002; Nelson & Cox 2008).
Gen antisense Os-GS3 (Oryza sativa-
Grain Size 3) merupakan gen untuk
meningkatkan produktivitas dan salah satunya
adalah pengendali ukuran butir gabah.
Ukuran butir merupakan faktor penentu utama
dari bobot biji. Selain itu, jumlah malai per
tanaman dan jumlah butir padi per malai juga
dapat digunakan sebagai faktor penentu utama
dari ukuran butir. Dalam aplikasi pemuliaan,
ukuran butir biasanya dievaluasi oleh bobot
4
biji, yang berkorelasi positif dengan beberapa
karakter termasuk panjang biji padi, lebar biji
padi, dan ketebalan butiran biji padi (Jiang et
al. 2005; Fan et al. 2006).
Ukuran butir juga merupakan faktor yang
penting terhadap kualitas pada padi. Meskipun
terdapat ukuran karakteristik gabah beragam,
namun mayoritas konsumen di China,
Amerika Serikat, dan sebagian besar negara
Asia lebih menyukai padi yang ramping dan
panjang. Sebagai contoh, rasio panjang atau
lebar 2.8 cm merupakan standar kualitas
nasional padi indica di Cina. Dengan
demikian, pemahaman dasar genetik dan
molekuler dari ukuran butir padi sangat
penting bagi program peningkatan beras
(Jiang et al. 2005; Fan et al. 2006).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase chain reaction adalah teknik
cepat untuk mengamplifikasi fragmen DNA
spesifik secara in vitro dengan menggunakan
sepasang primer untai tunggal pendek (primer
reverse dan forward). Sejumlah kecil fragmen
DNA yang diinginkan dapat di amplifikasi
secara berulang sampai jutaan kali dalam
beberapa jam menggunakan teknik ini.
Polymerase chain reaction merupakan metode
yang sensitif, selektif, dan cepat dalam
menggandakan DNA target yang diinginkan
(Murray et al. 2003), sehingga dari satu pasag
molekul DNA dapat diperbanyak menjadi
jutaan kali lipat setelah 30-40 siklus PCR
(Campbell et al. 2002). Komponen-komponen
yang dibutuhkan untuk PCR yaitu fragmen
DNA yang akan diamplifikasi (DNA cetakan),
sepasang primer oligonukleotida, enzim DNA
polymerase yang tahan panas, empat macam
nukleotida (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP),
serta bufer reaksi yang mengandung MgCl2.
Alat ini mampu secara cepat mengubah
temperatur yang dibutuhkan untuk siklus
berulang (Berg et al. 2007; Nelson & Cox
2008).
Siklus PCR dibagi menjadi 3 tahap yaitu
pemisahan utas DNA pada suhu tinggi
(denaturasi), penempelan primer, dan
pemanjangan primer menjadi utas baru DNA
oleh enzim DNA polimerase (Gambar 2).
Tiap-tiap tahapan memerlukan suhu yang
berbeda. Tahap denaturasi merupakan tahap
awal reaksi yang berlangsung pada suhu
tinggi, yaitu 94oC hingga 96
oC, dilakukan
sampai 5 menit untuk memastikan semua utas
DNA terpisah. Tahap denaturasi bertujuan
untuk memisahkan utas ganda DNA menjadi
utas tunggal sebagai DNA cetakan dengan
memutuskan ikatan hidrogen antar pasangan
basa. Semakin panjang untaian rantai DNA,
semakin lama waktu yang diperlukan untuk
tahap denaturasi (Berg et al. 2007; Sambrook
& Russell 2001).
Tahap kedua adalah penempelan primer
atau annealing pada suhu sekitar 42 o
C hingga
65 o
C. Suhu penempelan ini bersifat spesifik
yang merupakan rata-rata dari nilai Tm yang
dimiliki masing-masing primer, yaitu forward
(5’-end) dan reverse (3’-end). Perbanyakan
fragmen DNA dilakukan secara selektif dan
spesifik oleh sepasang oligonukleotida yang
disebut primer. Primer merupakan sekuen
DNA pendek dengan frekuensi 15 hingga 25
panjang basa dan berutas tunggal. Primer
menempel pada bagian DNA cetakan yang
memiliki urutan basa komplementer dengan
urutan basa primer. Tahap ini di dalam
replikasi sel berfungsi sebagai inisiasi sintesis
DNA oleh primase untuk membentuk RNA
primer pada situs ori (Sambrook & Russell
2001).
Tahap ketiga adalah perpanjangan primer
yang bertujuan memberikan kondisi optimum
bagi kerja enzim Taq polimerase dalam
memanjangkan primer guna membentuk utas
DNA baru (Clark & Pazdemik 2009; Handoyo
2001). Enzim polimerase yang digunakan
untuk mengaatalisis penempelan dua buah
primer pada proses PCR salah satu jenisnya
adalah Taq polimerase. Taq DNA polimerase
yang diisolasi dari bakteri Thermus aqutiqus
(Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Taq
Gambar 2 Proses umum PCR
(Berg et al. 2007)
Pemisahan utas ganda
DNA pada suhu tinggi
Penempelan primer
Pemanjangan primer
menjadi DNA utas baru
5
polimerase memiliki stabilitas termal yang
tinggi atau tahan terhadap suhu mendidih 100
oC, aktivitas maksimalnya berlangsung pada
suhu 92-95oC (Sambrook & Russell 2001).
Hibridisasi Southern
Hibridisasi merupakan proses identifikasi
gen-gen hasil analisis DNA dengan
menggunakan enzim restriksi yang sesuai dan
diidentifikasi dengan fragmen gen target yang
spesifik yang telah diberi label dengan
radioisotop seperti 32
P, fosfat radioaktif atau
dengan substansi nonradioisotop. Substansi
nonradiosotop yang sering digunakan sebagai
label adalah biotin dan digoksigenin (DIG).
Proses hibridisasi dan visualisasi
diawali dengan transfer DNA dari gel agarosa
ke bahan padat seperti nilon berpori atau
membran nitroselulosa. Transfer DNA disebut
dengan ‘Southern blotting’, mengacu pada
penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern
(1975). Southern transfer dan hibridisasi
DNA digunakan untuk mempelajari
bagaimana peran gen dalam genom dengan
pemetaan titik-titik restriksi dan segmen DNA
genomik (Berg et al. 2007).
Southern blot telah lama dikenal sebagai
salah satu landasan analisis DNA. Transfer
Southern dan teknik hibridisasi yang berkaitan
telah dimanfaatkan untuk memperoleh
informasi tentang organisasi fisik sekuen
tunggal dan ganda pada kompleks genom,
mempercepat suksesnya percobaan kloning
pada gen eukariot (Primrose & Tywman
2006). Teknik Southern blot dapat digunakan
dalam menganalisis keberadaan dan jumlah
salinan dari gen hasil transformasi pada
tanaman transgenik. Apabila jumlah salinan
gen transforman terlalu banyak pada genom
maka kemungkinan akan terjadi proses
membloking pada gen tertentu (Tang et al.
2007), namun apabila gen terkopi antara 1-10
kemungkinan tidak akan menimbulkan gene
silencing pada gen-gen lain (Santoso 2008).
Istilah Southern blot sekarang digunakan
untuk mengambarkan transfer DNA dari gel
ke membran, yang pada mulanya dilakukan
secara kapiler ke membran nitroselulosa
(Kumar et al. 2010). Transfer DNA dalam
Southern blot dapat dilakukan pada beberapa
tipe membran, bufer transfer dan metode
transfer. Membran yang paling populer
digunakan adalah membran nitroselulosa,
nilon bermuatan positif dan nilon tidak
bermuatan. Walaupun ketiga membran ini
mempunyai sifat yang berbeda tetapi
ketiganya dapat digunakan untuk berbagai
macam aplikasi. Keuntungan utama membran
nilon adalah relatif kuat dan dapat digunakan
untuk hibridisasi lebih dari 10X, sedangkan
membran nitroselulosa mudah robek tetapi
memberikan background yang lebih bersih
pada beberapa proses hibridisasi (Sambrook &
Russell 2001).
Transfer DNA dari gel ke membran dapat
dilakukan dengan menggunakan metode
transfer kapiler, elektroforesis dan vakum.
Transfer kapiler seperti yang digunakan oleh
Southern (1975), menggunakan aliran larutan
garam untuk menarik DNA ke membran
dengan adanya gaya kapiler yang ditimbulkan
bahan penyerap seperti kertas dan tisu.
Transfer kapiler hingga saat ini masih populer
digunakan karena selain caranya cukup
mudah, biaya relatif murah, dan efisien.
Metode ini memerlukan waktu transfer yang
relatif lama (12-16 jam). Transfer
elektroforesis pada mulanya dikembangkan
untuk transfer protein, dapat menekan waktu
kerja tetapi tidak berkerja dengan baik pada
konsentrasi bufer garam yang tinggi sehingga
kurang cocok dengan bufer nitroselulosa.
Transfer vakum mungkin merupakan cara
yang paling ideal dengan waktu yang relatif
cukup singkat (1-2 jam) mampu mentransfer
DNA lebih efisien dan memberikan sinyal
hibridisasi dua sampai tiga kali lipat
dibandingkan transfer DNA kapiler (Coleman
& Gregory 2006).
Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis gel agarosa digunakan
untuk mengetahui keberadaan dan
membedakan jenis asam nukleat yang didapat
dari hasil ekstraksi serta digunakan untuk
menganalisis produk hasil pemotongan
dengan enzim retriksi. Prinsip dasar
elektroforesis adalah berdasarkan laju
perpindahan suatu molekul oleh gaya gerak
listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekulnya,
semakin kecil ukurannya maka molekul akan
semakin cepat lajunya, begitu pula sebaliknya.
Sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur
pada gel yang berada di dalam larutan
penyangga dan dialirkan listrik pada tegangan
tertentu. Molekul-molekul sampel akan
bergerak di dalam matriks gel ke arah salah
satu kutub listrik sesuai muatannya. Arah
pergerakan untuk RNA dan DNA adalah
menuju elektroda positif karena adanya
muatan negatif pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya (Berg et al. 2007).
Gel agarosa umumnya digunakan untuk
menganalisis fragmen-fragmen berukuran
besar (lebih dari 200 bp). Agarosa bersifat
6
tidak toksik, kompleks berupa bubuk yang
terdiri atas campuran dua unit dasar galaktosa,
agarosa, dan agaropektin (Sambrook &
Russell 2001). Konsentrasi dari agarosa di
dalam gel menentukan ukuran pori-pori rata-
rata. Ukuran pori-porinya lebih besar dari
pori-pori pada gel poliakrilamid sehingga
asam nukleat dan protein yang terlalu besar
untuk dipisahkan oleh gel poliakrilamid dapat
dipisahkan menggunakan gel ini. Gel agarosa
mengandung gugus-gugus bermuatan
terutama sulfat dan beberapa gugus
karboksilat. Gugus-gugus ini berinteraksi
dengan gugus-gugus bermuatan pada protein
sehingga menimbulkan efek pertukaran ion
(Manz et al. 2004).
Elektroforesis gel biasanya dilakukan
untuk tujuan analisis, namun dapat digunakan
sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan untuk teknik
lebih lanjut, seperti kloning. Ukuran DNA
dapat ditentukan dengan menyertakan marka
atau penanda yang digunakan pada proses
elektroforesis. Setelah tahap elektroforesis
selesai, dilakukan metode pewarnaan dan
penghilangan warna. Metode pewarnaan pada
DNA atau RNA merupakan pewarnaan gel
agarosa yang dilakukan dengan menggunakan
larutan etidium bromida selama 15 menit. Hal
ini dilakukan dengan tujuan agar molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet.
Penghilangan warna dilakukan dengan cara
gel dimasukkan ke dalam aquades selama 5
hingga 7 menit (Manz et al. 2004).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi
DNA terdiri atas daun padi T-309 tipe liar dan
padi transgenik GS3 (T-GS (2), T-GS (5), T-
GS (9), T-GS (12), T-GS (13)) natrium
bisulfit, bufer ekstraksi (10 mL Tris-HCl pH 8
M, 10 mL EDTA0.5 M, 12.5 mL NaCl 4M,
67.5 mL akuades), nitrogen cair, 20% SDS,
natrium asetat, kalium asetat, isopropanol
dingin, etanol 70%, bufer TE (Tris-EDTA),
RNAse, 0.5 M NaOH. Bahan-bahan yang
digunakan pada tahap PCR terdiri atas bufer
PCR, MgCl 25 mM, dNTP set 10 mM, primer
hpt Forward dan Reverse 10 mM, Taq DNA
polymerase (5 U/ L), DNA hasil isolasi 10
ng/ L, dan akuades steril. Bahan-bahan yang
digunakan untuk elektroforesis yaitu loading
dye, bufer TAE 1x, agarosa, DNA hasil PCR,
marker, etidium bromide 2 mg/L, dan
akuades.
Bahan-bahan yang digunakan untuk
hibridisasi southern adalah pelacak hpt, DIG-
11-dUTP, anti-Digoxigenin, enzim restriksi
BamHI, kertas blotting, kertas Whatmann
3MM, membran nilon Hybond N+,
Amersham Hyperfilm (GE Healthcare), dan
substrat CDP-Star. Bahan lain yang digunakan
adalah larutan developer dan larutan fixer,
Tween 20, plasmid (100 pg/ L), LiCl,
heksanukleotida, klenow enzim, reagen
blocking, larutan depurinasi (HCl dan
akuades), larutan denaturasi (NaOH, NaCl,
dan akuades), larutan netralisasi (Tris base,
dan akuades), larutan 20x SSC (NaCl, Tri
natrium sitrat dihidrat, dan akuades), larutan
washing 1 (20x SSC, 10% SDS, dan akuades),
larutan washing 2 (20X SSC, 10% SDS, dan
akuades), larutan bufer 1 (tris hidroksimetil,
NaCl, dan akuades), larutan washing buffer
(larutan bufer 1 dan tween 20), larutan bufer 2
(larutan bufer 1 dan reagen blocking), larutan
antibodi (larutan bufer 2 dan Anti-DIG AP),
larutan bufer 3 (Tris base, NaCl, dan
akuades), larutan stripping buffer (NaOH,
10% SDS, dan akuades), HCl 1N, dan HCl
0.1N.
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian
ini terdiri atas timbangan analitik, shaker,
tissue lyser, mortar, gunting, kertas tisu,
pensil, sendok, bak, stopwatch, botol 250 mL,
botol 500 mL, botol 1000 mL, gelas kimia
500 mL, gelas kimia 1000 mL, strirrer, gelas
ukur 500 mL, labu Erlenmeyer 250 mL, oven,
microwave, vortex, gelas piala, tabung
eppendorf (0.2 mL, 1.5 mL, dan 2 mL),
grinding balls, pipet mikro, tip, mortar,
penangas air, bak es, dan mesin sentrifus IEC-
Centra 4B. Selain itu, digunakan pula
elektroforesis Hoefer scientific instruments,
UV cross linker, UV illuminator Chemidoc
EQ Biorad, nanodrop Thermo scientific,
mesin PCR Thermal Cycle Tetrad, kaset, dan
sentrifus mikro.
Metode Penelitian
Isolasi DNA Padi Skala Besar (Modifikasi
Dellaporta et al. 1983; Wang et al. 1993)
Daun tanaman padi tipe liar Taipei 309 (T-
309), Taipei Grain Size-2 (T-GS (2)), T-GS
(5), T-GS (9), T-GS (12), dan T-GS (13)
ditimbang menggunakan timbangan analitik
sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam mortar
dan disiram dengan nitrogen cair, kemudian
digerus hingga menjadi serbuk. Serbuk
tersebut kemudian dimasukkan ke dalam
tabung berukuran 50 mL dan diberi label
7
nama sampel untuk masing-masing tabung.
Tabung yang telah berisi serbuk daun padi
kemudian disimpan ke dalam bak yang berisi
nitrogen cair. Setelah sampel disimpan, dibuat
larutan 1 dengan komposisi 100 mL bufer
ekstraksi yang dimasukkan ke dalam botol
250 mL yang selanjutnya dicampur dengan
0.38 gram natrium bisulfit. Sebelum
digunakan, larutan 1 tersebut diinkubasi di
dalam penangas air pada suhu 650C.
Sampel daun padi masing-masing tersebut
ditambahkan 15 mL larutan 1 dan 1 mL SDS
20%, dikocok hingga homogen, dan
diinkubasi pada suhu 650C selama 15 menit
(setiap 5 menit dikocok) lalu diangkat. Setelah
itu, ditambahkan sebanyak 5 mL kalium asetat
5 M, lalu tabung dibolak-balik hingga
homogen dan diinkubasi di dalam bak es
selama 20 menit. Suspensi tersebut
selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan
4000 rpm selama 20 menit. Kemudian
supernatan (cairan) di saring menggunakan
kertas tisu Kimwipes dan dipindahkan ke
dalam tabung 50 mL yang baru.
Isopropanol dingin ditambahkan sebanyak
10 mL ke dalam cairan dan diinkubasi ke
dalam freezer dengan suhu (-200C) selama 30
menit. Kemudian sampel disentrifugasi pada
kecepatan 4000 rpm selama 20 menit lalu
cairan di buang. Kemudian sampel tersebut
disentrifugasi lagi pada kecepatan 4000 rpm
selama 2 menit dan sisa dari cairan di pipet
menggunakan pipet mikro sehingga cairan
tidak ada sama sekali di dalam tabung
tersebut. Setelah itu, tabung sampel yang
berisi pelet di keringkan ke dalam oven
dengan suhu 65 selama 10 menit.
Pelet yang telah kering dilarutkan ke
dalam 700 akuades dan 5 RNAse dan
diinkubasi pada suhu 65 selama 30 menit
dengan di kocok setiap 10 menit. Suspensi
tersebut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL
dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000
rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan
dipindahkan ke dalam tabung dengan ukuran
1.5 mL yang baru. Sebanyak 75 natrium
asetat 3 M dan 500 isopropanol dingin
ditambahkan dan dicampur serta diinkubasi
pada 28 selama 5 menit. Sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 selama
5 menit dan supernatan dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL
etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali
selama 2 menit pada kecepatan 10000 rpm
dan cairan dibuang. Kemudian disentrifugasi
kembali pada kecepatan 10000 selama 30
detik dan cairan dibuang dengan pipet. Pelet
yang diperoleh dikeringkan dalam oven
selama 10 menit. Pelet yang telah kering
dilarutkan dengan 150 µL larutan TE. Tahap
selanjutnya adalah diukur kemurnian dan
konsentrasinya dengan spektrofotometer.
Isolasi DNA Padi Miniprep (Modifikasi
Dellaporta et al. 1983; Wang et al. 1993)
Daun tanaman padi tipe liar Taipei 309 (T-
309), Taipei Grain Size-2 (T-GS (2)), T-GS
(5), T-GS (9), T-GS (12), dan T-GS (13)
ditimbang menggunakan timbangan analitik
sebanyak 0.1 gram lalu daun padi tersebut
dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam
tabung 1.5 mL serta diberi label untuk
masing-masing sampel. Setelah itu
dimasukkan satu grinding ball ke dalam
tabung 1.5 mL yang sudah berisi potongan
daun padi. Kemudian tabung yang sudah
berisi potongan padi dan grinding ball
tersebut disusun di dalam rak tissue lyser dan
disiram dengan nitrogen cair, kemudian
sampel tersebut dihancurkan oleh alat tissue
lyser tersebut hingga menjadi serbuk. Tabung
yang telah berisi serbuk daun padi kemudian
disimpan ke dalam bak yang berisi nitrogen
cair. Setelah sampel disimpan, larutan 1
dibuat dengan komposisi 10 mL bufer
ekstraksi yang dimasukkan ke dalam tabung
50 mL yang selanjutnya dicampur dengan
0.038 gram natrium bisulfit. Sebelum
digunakan larutan 1 tersebut diinkubasi di
dalam penangas air pada suhu 650C.
Dimasukkan larutan 1 sebanyak 1 mL ke
dalam masing-masing tabung yang berisi
serbuk sampel daun padi. Setelah itu, larutan 1
dipipet ke dalam tabung lalu ditambahkan
1000 L dan 68 L SDS 20% kemudian
diinkubasi selama 15 menit dengan suhu 650C
di dalam penangas air dan setiap 2 menit
tabung dibolak-balikan agar tercampur dengan
rata. Kemudian ditambahkan sebanyak 334
L kalium asetat 5 M, tabung dibolak-balik
kembali hingga tercampur dengan rata, dan
dan diinkubasi di dalam bak es selama 20
menit Tabung-tabung yang telah diinkubasi
kemudian disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 12000 rpm, pindahkan
cairan sebanyak 800 L dipindahkan ke dalam
tabung 1.5 mL baru. Dipipet isopropanol
dingin sebanyak 600 L ke dalam tabung
yang berisi cairan dan tabung dibolak-balik
hingga tercampur rata lalu diinkubasi selama
30 menit ke dalam freezer (-200C).
Setelah diinkubasi selama 30 menit lalu
disentrifugasi selama 10 menit dengan
8
kecepatan 12000 rpm kemudian cairan
dibuang. Untuk memastikan bahwa cairan
sudah tidak ada maka disentrifugasi 30 detik
dengan kecepatan 12000 rpm lalu sisa dari
cairan tersebut dipipet menggunakan pipet
mikro. Kemudian tabung yang berisi pelet
dioven selama 10 menit dengan suhu 65 .
Tabung yang berisi pelet tersebut
ditambahkan 200 L ddH2O dan 2 L RNAse
lalu diinkubasi ke dalam penangas air dengan
suhu 65 selama 30 menit dan tabung
dibolak-balik setiap 10 menit. Tahap
selanjutnya, tabung tersebut disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 12000
rpm. Cairan dipindahkan ke dalam tabung
baru dengan ukuran 1.5 mL. Ditambahkan
natrium asetat 3 M sebanyak 25 dan 150
isopropanol dingin lalu dikocok dan
diinkubasi ke dalam freezer -20 selama 30
menit. Sampel disentrifugasi dengan
kecepatan 12000 selama 5 menit dan
supernatan dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL
etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali
selama 10 menit pada kecepatan 12000 rpm
dan cairan dibuang. Kemudian disentrifugasi
kembali pada kecepatan 12000 selama 30
detik. Pelet yang diperoleh dikeringkan dalam
oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering
dilarutkan dengan 30 µL larutan TE. Tahap
selanjutnya adalah diukur kemurnian dan
konsentrasinya dengan spektrofotometer.
Isolasi DNA Padi Skala Cepat (Modifikasi
Collard et al. 2007)
Daun tanaman padi tipe liar Taipei 309 (T-
309), Taipei Grain Size-2 (T-GS (2)), T-GS
(5), T-GS (9), T-GS (12), dan T-GS (13)
ditimbang menggunakan timbangan analitik
sebanyak 0.1 gram lalu daun padi tersebut
dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam
tabung 1.5 mL serta diberi label untuk
masing-masing sampel. Setelah itu
dimasukkan satu grinding ball ke dalam
tabung 1.5 mL yang sudah berisi potongan
daun padi. Kemudian tabung yang sudah
berisi potongan padi dan grinding ball
tersebut disusun di dalam rak tissue lyser dan
disiram dengan nitrogen cair, kemudian
sampel tersebut dihacurkan oleh alat tissue
lyser tersebut hingga menjadi serbuk. Tabung
yang telah berisi serbuk daun padi kemudian
disimpan ke dalam bak yang berisi es.
Dimasukkan 0.5 M NaOH sebanyak 50 L
dengan menggunakan pipet mikro ke dalam
tabung yang berisi sampel tetapi perlakuan
tersebut tetap dilakukan di dalam bak es.
Kemudian tabung-tabung sampel yang berada
di dalam bak es tersebut digoyang
menggunakan shaker selama 10 menit.
Setelah itu, ditambahkan 0.1 M Tris-HCl pH
8.0 sebanyak 400 L ke dalam tabung sampel
dan dilanjutkan dengan digoyang-goyangkan
kembali menggunakan shaker agar semua
larutan tercampur dengan rata. Sampel
tersebut disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 12000 rpm dan sebanyak
250 L supernatan di pipet ke dalam tabung
1.5 mL baru. Supernatan disentrifugasi
kembali selama 5 menit dengan kecepatan
12000 rpm. Tahap selanjutnya adalah diukur
kemurnian dan konsentrasinya dengan
spektrofotometer.
Analisis Kuantitatif DNA Genomik dengan
Nanodrop (Thermo Fisher Scientific 2009)
Sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan ke
dalam lubang ukur. Setelah itu, tutup
nanodrop dan tekan tombol read blank pada
komputer. Kertas tissue digunakan untuk
membersihkan sisa buffer TE. Kemudian
sampel DNA dimasukkan sebanyak 2 µL ke
dalam lubang ukur, kemudian pilih menu read
sample. Hasil pengukuran berupa nilai
kemurnian sampel akan muncul dalam satuan
konsentrasi ng/ µL. DNA yang murni dapat
dilihat pada 260/Å280.
Amplifikasi DNA dengan PCR (Trijatmiko
et al. 2011)
Hasil isolasi DNA tanaman T-309 yang
telah disamakan konsentrasinya selanjutnya
diamplifikasi dengan mesin PCR. Amplifikasi
DNA padi mula-mula disiapkan sebanyak 20
buah tabung mikro. Setiap tabung diisi dengan
reaksi amplifikasi yang terdiri 2 µL 10x bufer
PCR, 1.2 µL MgCl2 25 mM, 0.4 µL dNTP
mix 10 mM, 1 µL primer forward hpt 10 µM,
1 µL primer reverse hpt 10 µM, 0.16 µL Taq
DNA polymerase 5 U/µL, 5 µL DNA 10 ng/
µL, dan 9.24 µL ddH2O. Sekuen primer yang
digunakan adalah Forward 5” GAT GCC
TCC GCT CGA AGT AGC G 3” dan Reverse
5” GCA TCT CCC GCC GTG CAC 3”. Total
volume reaksi PCR adalah 20 µL. Kemudian
dijalankan program pada mesin PCR. Profil
PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi
94˚C selama 5 menit, denaturasi 94˚C selama
30 detik, penempelan primer 65˚C selama 30
detik, dan pemanjangan primer 72˚C selama
30 detik. Proses tersebut diulang sebanyak 30
siklus.
9
Analisis Kualitas dengan Elektroforesis Gel
Agarosa (Sambrook & Russell 2001)
Disiapkan terlebih dahulu 1% gel agarosa
dengan 1x bufer TAE pada cetakan. Sebanyak
1 g agarosa ditimbang dan dicampur dengan
100 mL TAE. Larutan tersebut dimasukkan ke
dalam microwave selama 2 menit. Larutan
yang sudah tercampur dimasukkan ke dalam
cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur.
Setelah gel agarosa memadat, gel dimasukkan
ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x
bufer TAE. Sebanyak 10 µL produk PCR
ditambahkan dengan 2 µL loading dye dan
dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke
dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder
sebagai marker untuk melihat ukuran DNA.
Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus
dengan voltase 80 volt selama 35 menit. Gel
agarosa diwarnai dengan larutan etidium
bromida (20 mg/L) selama 10 menit,
kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan
air selama 10 menit. Gel Pita-pita DNA
selanjutnya ditampakkan dengan chemidoc gel
system.
Hibridisasi Southern (Trijatmiko et al.
2011)
Analisis Integrasi gen Os-GS3 (Oryza
sativa Grain Size3) di dalam tanaman padi
transgenik. Hibridisasi Southern yang
mengacu pada prosedur yang telah dilakukan
oleh Trijatmiko et al. (2011) menggunakan
pelabelan Digoxigenin -11-dUTP (DIG-11-
dUTP). Kegiatan tersebut terdiri atas
beberapa tahap, yaitu pemotongan DNA
menggunakan enzim restriksi BamHI,
pelabelan marker, transfer DNA yang sudah
dipotong dengan enzim restriksi ke membran
Hybond N+ (GE Healthcare), pelabelan
pelacak hibridisasi membran dengan pelacak
yang telah di label, dan deteksi sinyal dengan
larutan CDP star.
Lima DNA sampel padi transgenik dan
padi tipe liar generasi T0 dipotong
menggunakan enzim restriksi BamHI.
Pemotongan dilakukan dengan total volume
150 l pada masing-masing DNA. Sebanyak
33 L akuades dan 15 L larutan buffer 10x
dimasukkan ke dalam tabung steril 1.5 mL,
lalu dilanjutkan dengan ditambahkannya
enzim restriksi BamHI (10 U/ L) sebanyak 2
L. Tahap selanjutnya dimasukkan DNA hasil
isolasi sebanyak 100 L ke dalam tabung 1.5
mL. Tabung diinkubasi pada suhu 37 o
C
selama 16 jam. Ditambahkan sebanyak 0.1 x
volume natrium asetat (3M) dan sebanyak 2.5
x volume etanol 96%. Kemudian tabung
diinkubasi pada freezer (-20oC) selama 2 jam.
Tabung disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 .
Cairan dibuang kemudian ditambahkan etanol
70% sebanyak 500 L, lalu disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama
2 menit. Cairan kembali dibuang
menggunakan pipet 20 L dan tabung
dikeringkan selama 2 menit. Tahap
selanjutnya, sebanyak 15 L 0.1x TE dan 3
L loading dye ditambahkan ke masing-
masing tabung tersebut. Setelah itu, tabung
diinkubasi pada suhu 65 oC selama 15 menit.
Pelabelan marker 1 Kb dilakukan dengan
menyiapkan 10x dNTP mix didalam tabung
0.5 mL dengan komposisi 1 mM dATP
sebanyak 2 L, 1 mM dCTP sebanyak 2 L, 1
mM dGTP sebanyak 2 L, 0.65 mM dTTP
sebanyak 1.3 L, dan 0.35 mM DIG-11-dUTP
sebanyak 7 L. Tahap selanjutnya, sebanyak 3
L 1 Kb, 10x heksanukleotida sebanyak 2 L,
10x dNTP mix sebayak 2 L, klenow enzim
sebanyak 1 L, dan nucleid free water (NF)
sebanyak 12 L dimasukkan ke dalam tabung
1.5 mL. Setelah itu, tabung yang berisi
campuran larutan tersebut dipanaskan pada
suhu 100 oC selama 10 menit lalu dimasukkan
ke dalam es selama 2 menit, kemudian
diinkubasi pada suhu 37 o
C selama 3 jam.
Ditambahkan EDTA 0.2 mol/L sebanyak 2 L
dan 2.5 L LiCl 4 N serta etanol absolut
sebanyak 75 L. Tahap berikutnya, tabung
disimpan pada frezzer selama 1 jam dan
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Cairan dibuang lalu pelet
dicuci dengan etanol 70%. Tahap terakhir,
etanol 70% dibuang dan pelet dikeringkan
menggunakan oven dengan suhu 50 o
C atau
dikering anginkan kemudian pelet dilarutkan
pada bufer TE 1x sebanyak 50 L.
Proses transfer DNA tanaman padi
transgenik yang dipotong dengan
menggunkan enzim restriksi BamHI ke
membran Hybond -N+
diawali dengan dibuat
gel agarosa dengan konsentrasi 0.7% dalam
1x buffer TAE (Tris Acetat acid-EDTA) dan
didiamkan hingga memadat. DNA yang telah
di potong kemudian dimasukkan sebanyak 18
L dan dimasukkan sebanyak 5 L marker
yang telah dilabel oleh DIG ke dalam masing-
masing sumur selama 16 jam (semalam) pada
tegangan 20 volt. Di hari berikutnya, tegangan
diubah menjadi 15 volts dan ditunggu hingga
5 jam. Gel kemudian direndam dalam larutan
10
depurinasi selama 10 menit pada suhu ruang,
kemudian dibilas dengan menggunakan
akuades, diikuti dengan perendaman dalam
larutan denturasi selama 2 x 15 menit pada
suhu ruang, dan terakhir direndam dalam
larutan netralisasi selama 2 x 15 menit pada
suhu ruang. Kemudian gel direndam dengan
larutan 20x SSC selama 10 menit pada suhu
ruang. Semua proses dilakukan dengan
menggoyang gel agarose di dalam larutan
tersebut. Transfer DNA ke membran Hybond
–N+ dilakukan dengan proses kapiler
menggunakan 20x bufer SSC selama 20 jam
(Gambar 3). Setelah DNA berpindah ke
membran, DNA pada membran difiksasi
menggunakan UV selama 5 menit pada 302
nm.
Pelabelan pelacak gen dilakukan
menggunakan teknik amplifikasi PCR. Reaksi
PCR dengan total volume 50 L
menggunakan primer forward dan reverse
masing-masing 1 L (5 mM), 5 L 10x buffer
PCR, 3 L MgCl2 (25 mM), 0.5 L dATP (10
mM), 0.5 L dGTP (10 mM), 0.5 L dCTP
(10 mM), 0.44 L dTTP (10 mM), enzim Taq
polymerase (5 U/ L) sebanyak 0.4 L, dan 5
L pelacak Hpt (100 pg/ L). Profil suhu yang
digunakan adalah predenaturasi 95 selama 2
menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi
pada suhu 95 selama 30 detik, penempelan
primer pada suhu 60 selama 30 detik, dan
pemanjangan pada suhu 72 selama 40 detik.
Tahapan akhir PCR dilakukan pemanjangan
akhir pada suhu 72 selama 7 menit. Untuk
mengetahui keberhasilan pelabelan pelacak,
sebanyak 5 L produk PCR labeling dengan
Dig-11-dUTP berdampingan dengan produk
PCR tanpa DIG-11-dUTP dengan teknik
elektroforesis pada gel agarosa 1% (w/v) dan
Gambar 3 Susunan perangkat blotting
membran
hasilnya dianalisis dengan menggunakan
CEMIDOC.
Membran yang mengandung DNA
kemudian dihibridisasi dengan pelacak yang
sudah terlabel. Proses ini dimulai dengan
memanaskan larutan DIG Easy Hyb pada
suhu 42 . Membran direndam dengan larutan
DIG Easy Hyb sebanyak 50 L yang
diletakkan dalam kotak plastik dan
digoyang pada suhu
42 selama 3 jam. Setelah itu larutan DIG
Easy Hyb dimasukkan ke dalam tabung 50
mL dan ditambahkan dengan larutan pelacak
yang telah dilabel setelah itu campuran larutan
tersebut dimasukkan kembali ke dalam kotak
plastik dan digoyang kembali selama 16 jam
pada suhu 42 .
Membran yang sudah dihibridisasi
kemudian dicuci dengan larutan Wash 1 pada
suhu kamar selama 2 x 5 menit, diikuti dengan
pencucian dengan larutan Wash 2 pada suhu
68 selama 2 x 15 menit. Membran
diseimbangkan dengan larutan washing buffer
selama 2 menit, diikuti dengan inkubasi
membran dalam larutan bufer 2 selama 2 jam.
Membran diinkubasi selama 30 menit dalam
40 mL larutan Anti-Digoxigenin-Alkalin
Fosfatase atau Antibody conjugate (Anti-DIG)
(Roche).
Membran dipindahkan ke dalam kotak
plastik baru dan untuk menghilangkan
kelebihan antibody conjugate, membran
diinkubasi selama 2 x 15 menit dalam
washing buffer. Membran direndam dengan
larutan bufer 3 selama 3 menit (Lampiran 8).
Untuk pendeteksian sinyal dilakukan
penambahan substrat CDP-Star ke membran.
Kemudian membran ditutup dengan plastik
wrap dan diletakkan ke dalam kaset. Film X-
Ray diletakkan di atas membran dan
didiamkan hingga 6 jam. Proses selanjutnya
film X-Ray direndam dengan larutan
developer selama 45 detik, air 30 detik, dan
larutan fixer selama 30 detik maka jejak dari
cahaya yang dihasilkan bisa dilihat sebagai
pita-pita pada film X-Ray.
Analisis fenotipe tanaman padi kultivar
Taipei-309
Analisis fenotipe tanaman padi kultivar
Taipei-309 dilakukan dengan cara mengamati
tinggi tanaman padi dan jumlah anakan
tanaman padi. Setelah itu dilakukan
pemanenan dan diamati panjang malai, jumlah
cabang malai dalam satu malai, jumlah gabah
hampa dalam satu malai, jumlah gabah isi
11
dalam satu malai, dan berat 100 bulir padi isi
dari setiap sampel (Jiang et al. 2005).
Tinggi tanaman padi dan panjang malai
diamati menggunakan penggaris. Berat 100
bulir padi isi dari setiap sampel ditimbang
menggunakan timbangan analitik. Tahap
selanjutnya dilakukan analisis antara jumlah
salinan gen dari masing-masing sampel padi
baik tansgenik maupun tipe liar dengan hasil
data fenotipe.
HASIL DAN PEMBAHASAN
DNA Hasil Isolasi Menggunakan Metode
Cepat, Miniprep, dan Skala Besar Isolasi DNA merupakan tahap yang
penting dalam analisis gen dengan PCR.
Isolasi DNA dilakukan melalui empat tahap
yang meliputi pemanenan sampel padi, lisis,
pemurnian atau penghilangan dari komponen
selain DNA, dan pemekatan DNA (Sambrook
& Russell 2001). Daun padi yang digunakan
adalah daun yang masih muda (Ardiana 2009)
dikarenakan teksturnya yang masih lunak dan
sedikit mengandung serat sehingga mudah
dalam proses penggerusan. Selain itu daun
muda banyak mengandung DNA karena aktif
dalam proses pembelahan dan pertumbuhan
sel.
Metode isolasi yang digunakan pada
penelitian ini adalah metode skala cepat,
miniprep, dan skala besar. Masing-masing
metode tersebut memiliki kelebihan dan
kekurangan. Pada penelitian ini akan dipilih
metode yang paling efisien dari segi waktu
pengerjaan tetapi tetap memenuhi syarat untuk
digunakan dalam analisis PCR. Kelebihan
metode cepat dan miniprep adalah
penggunaan sampel daun padi dalam jumlah
sedikit (0.5-1 gram), sedangkan pada metode
skala besar memerlukan sampel dalam jumlah
banyak (2 gram). Kekurangan dari isolasi
DNA miniprep adalah tahapan prosedur yang
digunakan harus mengikuti 20 langkah
sehingga seorang analis dapat mengerjakan
maksimal 24 sampel dalam 1 hari (7 jam)
dengan menggunakan mesin penggerus
jaringan daun padi (tissue lyser). Demikian
halnya pada tahapan isolasi DNA skala besar,
seorang analis hanya mampu menyelesaikan 8
sampel karena proses pelembutan daun harus
dikerjakan secara manual tanpa dibantu mesin
penggerus (mortar). Pada tahapan isolasi
DNA skala cepat hanya mengikuti 8 langkah
sehingga seorang analis dapat mengerjakan
100 sampel dalam 1 hari (7 jam).
Parameter keberhasilan isolasi DNA dapat
dilihat secara kuantitatif. Uji kuantitatif DNA
dilakukan melalui penentuan konsentrasi dan
kemurnian DNA dengan menggunakan
nanodrop. Metode isolasi skala miniprep dan
skala besar menghasilkan kemurnian yang
baik jika dibandingkan dengan metode skala
cepat. Hal ini terlihat dari hasil nanodrop
sampel DNA (Tabel 2). Kemurnian DNA padi
menggunakan isolasi DNA miniprep dan skala
besar yang diperoleh berkisar antara 1.81-
1.93. Namun kemurnian DNA padi
menggunakan isolasi DNA skala cepat
berkisar antara 1.12-1.64 yang
mengindikasikan masih terkandungnya
protein, kemungkinan karena pada isolasi
skala cepat tidak digunakan larutan untuk
mengendapkan protein dan hanya
menggunakan larutan NaOH sebagai bufer
ekstraksinya.
Menurut Brown (2001) DNA yang murni
mempunyai nilai absorbansi 260 dibagi
dengan nilai absorbansi 280 ( 260/Å280)
berkisar 1,8 hingga 2,0. Apabila nilainya
kurang dari 1,8 maka sampel DNA masih
mengandung kontaminan protein dan untuk
menghilangkannya ditambahkan proteinase.
Apabila nilainya lebih dari 2,0 maka sampel
DNA masih mengandung kontaminan RNA,
dan untuk menghilangkannya ditambahkan
ribonuklease.
DNA Hasil Polymerase Chain Reaction
Menggunakan Metode Cepat, Miniprep
dan Skala Besar Sampel DNA padi yang telah diisolasi dan
di analisis kuantitatif selanjutnya dianalisis
lebih lanjut untuk mengetahui secara tepat
suatu tanaman mengandung gen target yang
diintroduksikan ke dalam jaringan tanaman,
dapat dilakukan analisis menggunakan PCR.
Teknik PCR adalah suatu teknik untuk
mengamplifikasi sekuen DNA tertentu dengan
menggunakan primer spesifik secara in vitro
(Apriana 2008) . Sampel yang digunakan
adalah 5 tanaman transgenik dan 1 tanaman
tipe liar sebagai kontrol negatif. Analisis
molekuler dengan PCR dilakukan
menggunakan primer hpt. Suhu annealing
yang digunakan adalah 65 . Plasmid
pCAMBIA 1301 35S Os-GS3 digunakan
sebagai kontrol positif .
Analisis elektroforesis dari produk PCR
dari 5 tanaman transgenik yang masing-
masing diisolasi dengan ketiga metode
menunjukkan hasil yang sama (Gambar 4).
Semua sampel transgenik menghasilkan pita
yang ukurannya sama dengan kontrol positif
plasmid, yaitu 500 pb (pasangan basa).
Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
12
Tabel 2 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi
Sampel Isolasi Konsentrasi ( g/mL) A260/280
Taipei-309 (kontrol
negatif) Skala cepat 70.1 1.31
T-GS (2)* Skala cepat 82.3 1.22
T-GS (5)* Skala cepat 139 1.42
T-GS (9)* Skala cepat 119 1.64
T-GS (12)* Skala cepat 31 1.12
T-GS (13)* Skala cepat 93.3 1.47
Taipei-309 (kontrol
negatif) Miniprep 347.0 1.88
T-GS (2)* Miniprep 108.0 1.90
T-GS (5)* Miniprep 399.6 1.87
T-GS (9)* Miniprep 368.2 1.93
T-GS (12)* Miniprep 534.7 1.84
T-GS (13)* Miniprep 681.2 1.90
Taipei-309 (kontrol
negatif) Skala besar 771.3 1.89
T-GS (2)* Skala besar 2084.7 1.83
T-GS (5)* Skala besar 1007.1 1.82
T-GS (9)* Skala besar 2741 2.87
T-GS (12)* Skala besar 675.9 1.88
T-GS (13)* Skala besar 1934.7 1.81
Gambar 4 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer hpt. M=marker, A=air, 1=kontrol negatif
skala cepat, 2-6=sampel, 7=kontrol negatif miniprep, 8-12=sampel, 13=kontrol negatif
skala besar, 14-18=sampel, P=plasmid
Mulyaningsih (2011) juga menunjukkan bahwa
pita yang dihasilkan dengan menggunakan
primer hpt adalah 500 pb. Hasil ini
menunjukkan bahwa dalam 5 tanaman
transgenik telah mengandung transgen.
Ketiadaan perbedaan hasil PCR antara DNA
yang diisolasi dengan ketiga metode dan
menunjukkan bahwa metode skala cepat
merupakan metode yang paling efisien apabila
hanya digunakan dalam tahap mengidentifikasi
keberadaan gen target pada tanaman padi
transgenik. Padmadi (2009) menyebutkan
bahwa sampel DNA yang digunakan pada
analisis PCR tidak harus merupakan DNA
murni.
Karakterisasi Molekuler menggunakan
Hibridisasi Southern
Persiapan DNA genom merupakan hal yang
utama sebelum melakukan hibridisasi Southern.
Sampel DNA genom yang diisolasi harus
memiliki kualitas yang baik yaitu murni dan
utuh (tidak mengalami degradasi) (Nafari
2006). Pada penelitian ini persiapan DNA
genom tanaman dilakukan menggunakan dua
metode yaitu skala besar dan skala miniprep.
Metode skala cepat tidak digunakan untuk
hibridisasi Southern karena dalam isolasi DNA
M A 1 2 3 4 5 6
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M P
500pb
300pb
100pb
1000pb
12000pb
500pb
Keterangan: (*)= nomor tanaman
13
hanya menggunakan larutan NaOH sebagai
bufernya, sehingga kemurnian sampel yang
dihasilkan sangat buruk apabila digunakan
dalam analisis ini. Hasil analisis DNA
menggunakan PCR dan hasil analisis salinan
gen yang dihasilkan pada metode isolasi
miniprep dan skala besar dapat dilihat pada
Tabel 3.
Analisis Southern dimulai dengan
pemotongan sampel DNA genom menggunakan
enzim restriksi BamHI. Ezim ini akan
memotong satu kali pada daerah T-DNA
sehingga pita DNA yang dihasilkan akan
menggambarkan jumlah salinan transgen yang
terintegrasi (Berg et al. 2007). Hasil
pemotongan DNA genom dengan enzim
restriksi menghasilkan jutaan fragmen yang
rapat dan ukurannya yang bervariasi baik berat
molekul yang tinggi maupun berat molekul
rendah, sehingga fragmen-fragmen ini tidak
dapat dilihat secara visual sebagai pita yang
terpisah. Oleh karena itu, dihasilkan smear
merata dari atas ke bawah yang menunjukkan
bahwa pemotongan telah sempurna (Lampiran
2).
Pelacak yang digunakan dalam analisis
Southern adalah gen hpt. Pelacak hpt dilabel
dengan digoxigenin menggunakan metode
amplifikasi PCR dengan pCAMBIA 1301 35S
Os-GS3 sebagai cetakan. Analisis elektroforesis
menunjukkan bahwa produk PCR yang telah di
label memiliki laju migrasinya lebih lambat jika
dibandingkan dengan produk amplifikasi tanpa
senyawa label (kontrol), karena DIG memiliki
berat molekul yang tinggi dari hasil amplifikasi
yang mengandung DIG, sehingga akan
memiliki berat molekul yang lebih tinggi dari
hasil amplifikasi kontrol yang tidak
mengandung DIG. Hal ini menunjukkan bahwa
proses label sudah berhasil (Lampiran 3).
Proses transfer DNA ke membran juga
merupakan hal penting dalam menentukan
keberhasilan hibridisasi Southern. Hal yang
perlu diperhatikan dinataranya harus terjadi
penempelan sempurna antara gel dan membran
tanpa adanya gelembung udara diantara
kedunya. Dalam penelitian ini setelah proses
transfer, gel direndam dalam Et-Br dan
divisulalisasi menggunakan sinar UV. Hasil
pengecekan menunjukkan bahwa transfer DNA
ke membran terjadi secara sempurna karena
tidak ada DNA yang tertinggal di gel agarosa
(Lampiran 4). Hal ini sesuai dengan penelitian
Nafari (2006) yang menggambarkan
keberhasilan transfer DNA dari gel ke
membran.
Proses hibridisasi juga merupakan hal
penting dalam melakukan hibridisasi Southern.
Hibridisasi merupakan pembentukan utas ganda
antara DNA genom dengan utas tunggal dengan
DNA pelacak utas tunggal yang telah diberi
label DIG-11-dUTP (Coleman & Gregory 2006;
Roche 2009). Pre-hibridisasi sangat diperlukan
sebelum dilakukannya hibridisasi untuk
memblok bagian membran yang tidak
mengandung fragmen-fragmen DNA agar dapat
meminimalisir background pada hasil foto,
sehingga diharapkan hanya DNA sampel yang
berpasangan dengan pelacak yang muncul saat
deteksi.
Tabel 3 Hasil analisis dan pola integrasi gen sisipan (Os-GS3) pada generasi pertama (T0) pada
kultivar Taipei 309 menggunakan primer hpt untuk PCR dan pelacak hpt untuk hibridisasi
Southern
Sampel
PCR Salinan gen
Metode skala
cepat
Metode skala
miniprep
Metode skala
besar
Metode
skala besar
Metode
skala
miniprep
Taipei 309 tipe
liar
- - - 0 0
T-GS (2)*
+ + + 2 0
T-GS (5)* + + + 4 0
T-GS (9)* + + + 1 0
T-GS (12)* + + + 0 0
T-GS (13)* + + + 1 0
Keterangan: (*)= nomor sampel tanaman
14
Analisis hibridisasi Southern
menggunakan sampel DNA yang diisolasi
dengan metode skala besar menunujukkan 2
tanaman transgenik yang memiliki 1 salinan
transgen, 1 tanaman transgenik memiliki 2
salinan transgen, dan 1 tanaman transgenik
memiliki 4 salinan transgen (Gambar 5). Pita
yang dihasilkan berbeda setiap sampelnya, hal
ini disebabkan oleh banyaknya T-DNA yang
masuk ke dalam genom tanaman transegenik.
Pada penelitian hibridisasi Southern
menggunakan DNA yang diisolasi dengan
skala besar dapat dikatakan berhasil karena
ukuran pita mendekati dengan kontrol positif
(13 kb) atau lebih dari 10 kb. Satu tanaman
transgenik tidak menghasilkan pita DNA,
kemungkinan transgennya masuk ke dalam sel
sehingga positif ketika di deteksi dengan PCR
tetapi tidak terintegrasi ke dalam genom
tanaman dan tidak menghasilkan pita saat di
deteksi dengan analisis Southern. Seperti
diharapkan tanaman yang tidak di
transformasi tidak menghasilkan pita DNA,
yang menunjukkan bahwa pelacak dan kondisi
hibridisasi yang digunakan benar-benar
mampu mendeteksi secara spesifik
keberadaan transgen.
Analisis hibridisasi Southern
menggunakan sampel DNA yang di isolasi
dengan skala miniprep tidak menghasilkan
pita DNA pada semua sampel yang di uji.
Hal ini mungkin disebabkan oleh DNA yang
diisolasi dengan metode miniprep meemiliki
berat molekul yang rendah. Hibridisasi
Southern membutuhkan DNA dalam bentuk
utuh dan memiliki berat moleul yang tinggi
(Trijatmiko et al. 2011).
Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi
Transgenik Kultivar Taipei 309
Keberhasilan teknik transformasi genetik
ditandai dengan keberhasilan menyisipkan
rangkaian gen yang diintroduksikan ke dalam
genom tanaman sehingga dapat diekspresikan
dan tetap terpelihara dalam seluruh
pembelahan sel berikutnya. Oleh karena itu,
diperlukan upaya mengkonfirmasikan
integritas gen yang diintroduksikan dan
menentukan jumlah salinan gen tersebut di
dalam genom tanaman serta menentukan gen
tersebut dapat berfungsi dengan benar yang
dapat dilihat dari fenotipe tanaman padi
tersebut (Santoso 2008). Gen yang disisipkan
ke dalam genom tanaman harus dapat
diekspresikan sehingga menghasilkan protein
yang diinginkan. Gen-gen yang diekspresikan
pada tanaman pada awalnya adalah gen-gen
asli dari sumbernya (bakteri, jamur, hewan
Gambar 5 Hasil hibridisasi Southern. M=
marker, (metode isolasi DNA
skala besar) 1=T-309, 2=T-GS
(2), 3=T-GS (5), 4=T-GS (9),
5=T-GS (12), 6=T-GS (13);
(metode isolasi DNA skala
miniprep) 7=T-309, 8= T-GS
(2), 9=T-GS (5), 10=T-GS (9),
11=T-GS (12), 12=T-GS (13),
P=plasmid
tanaman), namun kebanyakan ekspresi dari
gen tersebut di dalam tanaman sangat rendah
(Rahmawati 2006). Keberhasilan program
transformasi genetik dapat dilihat dari
fenotipe tanaman transgenik yang
dibandingkan dengan fenotipe tanaman tipe
liar, sehingga pada penelitian ini akan
dibandingkan fenotipe tanaman transgenik
dengan jumlah salinan gen setiap sampel dan
fenotipe tanaman tipe liar
sebagai kontrol.
Gen Os-GS3 merupakan regulator negatif
dari pertumbuhan ukuran biji. Bahan yang
digunakan dalam penelitian ini adalah
antisense RNA dari gen Os-GS3 yang
dimasukkan ke dalam varietas padi T-309
dengan harapan dapat membungkam ekspresi
gen Os-GS3 sehingga ukuran biji bisa lebih
besar. Antisense adalah utas asam nukleat
DNA yang tidak diranskripsikan, merupakan
utas pasangan dari utas yang ditranskripsikan
(utas sense) (Fan 2006). Pengamatan fenotipe
menunjukkan 1 tanaman transgenik (T-GS
(5)) yang memiliki 4 salinan transgen yang
bobot 100 butir lebih tinggi dari tanaman tipe
liar, yaitu 2.669 g dibandingkan dengan 2.469
g (Tabel 4).
Tanaman transgenik lain dengan jumlah
salinan transgen 1 atau 2 memiliki bobot 100
butir padi tidak melebihi tanaman padi tipe
liar. Hal ini menunjukkan bahwa
pembungkaman ekspresi gen Os-GS3 bisa
13kb 15kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P
12kb
15
Tabel 4 Jumlah salinan gen menggunakan DNA yang diisolasi metode skala besar dengan fenotipe
tanaman padi
Berhasil ketika 4 salinan transgen terintegrasi
ke dalam tanaman. Pada penelitian ini dapat
dikatakan bahwa sampel yang memiliki
jumlah salinan gen 4 mengalami
pembungkaman gen yang akan
mengakibatkan ukuran butir padi menjadi
lebih besar sehingga bobot bulir padi akan
semakin berat. Sedangkan sampel dengan
jumlah salinan gen 1-2 kecil kemungkinan
atau tidak mengalami pembungkaman gen
sehingga ukuran butir padi menjadi lebih
kecil.
Penelitian sebelumnya menununjukkan
bahwa semakin banyak jumlah salinan
transgen pada genom tanaman maka akan
semakin tinggi presentase pembungkaman gen
(Tang et al. 2007). Tang et al. (2007) juga
memperoleh data
presentase pem bahwa siRNA tidak terdeteksi
pada individu transgenik yang memiliki 1-3
salinan gen, tetapi siRNA terdeteksi pada
individu transgenik yang memiliki 4-7 salinan
gen. Terbentuknya small interfering RNA
(siRNA) pada sekuen transgenik yang
merupakan tanda terjadinya pembungkaman
gen. Pembungkaman gen adalah salah satu
fenomena yang menyebabkan terjadinya
kegagalan dalam mengekspresikan gen dan
terbentuknya dupleks RNA yang
mengakibatkan terhalangnya proses translasi
sehingga pembentukan protein terganggu
(Malik 2005).
Meskipun gen Os-GS3 ditargetkan untuk
rekayasa ukuran biji padi,
kemungkinan
pembungkaman ekspresinya juga berpengaruh
pada karakter fenotipe yang lain. Tanaman
transgenik T-GS (5) (5.500) menunjukkan
jumlah anakan yang lebih banyak dari
tanaman tipe liar (3.250). Hal ini
mengindikasikan bahwa gen Os-GS3 yang
menyandi protein transmembran juga
memiliki pengaruh terhadap jumlah anakan
(Fan 2006). Penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa gen sd-1 yang menyandi
enzim GA-20 oksidasi detektif selain
menyebabkan tanaman memiliki postur kerdil
juga berpengarug pada ukuran biji dan
panjang malai (Baoensen et al. 1993;
Spielmeyer et al. 2002).
Panjang malai, jumlah cabang malai,
gabah hampa, gabah isi tanaman transgenik
tidak ada yang lebih unggul dibandingkan
dengan T-309, sehinga dapat dikatakan bahwa
tidak semua fenotipe dapat dibandingkan
dengan jumlah salinan gen yang terintegrasi
dalam genom tanaman padi transgenik.
Menurut Kolensik et al. (2004) penentuan
Sampel Jumlah
salinan
gen
Berat
100
butir
padi (g)
Tinggi
tanaman
(cm)
Jumlah
anakan
Panjang
malai
(cm)
Jumlah
cabang
malai
Gabah
hampa
Gabah
isi
T-309 0 2.469 111.825 3.250 22.171 12.353 40.294 107.294
T-GS
(2)
2 1.888 127.750 3.250 19.680 9.850 81.650 21.750
T-GS
(5)
4 2.669 104.050 5.500 21.567 8.667 23.667 106.167
T-GS
(9)
1 1.740 106.729 2.857 12.300 8.000 42.000 13
T-GS
(12)
0 * 88.768 1 * * * *
T-GS
(13)
1 2.168 125.250 2.000 15.175 10.000 64.500 16.25
Keterangan: *= tanaman mati sebelum dilakukan analisis fenotipe selanjutnya
16
fungsi gen dari fenotipe yang diekspresikan
akan menjadi sulit apabila ada dua atau lebih
posisi T-DNA dalam satu genom. Gen tidak
hanya elemen-elemen yang memisah dan
menghasilkan pengaruh individu yang jelas,
tetapi interaksi gen satu dengan yang lainnya
memberikan fenotipe yang berbeda secara
menyeluruh (Sudharmawan 2009).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penelitian mengenai isolasi DNA dengan
menggunakan metode skala cepat, miniprep,
dan skala besar telah berhasil dilakukan. Pada
hasil PCR diperoleh ukuran pita yang sama
(500 pb) setiap metode isolasi yang
digunakan. Metode isolasi skala cepat
merupakn metode yang paling efisien pada
PCR. Metode Hibridisasi Southern mutlak
memerlukan DNA yang diisolasi dengan
metode skala besar. Hasil pembungkaman
ekspresi gen Os-GS3 dengan antisense RNA
berhasil ketika ada 4 transgen yang
terintegrasi ke dalam genom tanaman.
Saran
Diperlukan analisis lanjutan pada tahap
ekspresi level RNA yaitu dengan
menggunakan reverse transcriptase
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan
Northern blot untuk membuktikan terjadinya
pembungkaman ekspresi gen Os-GS3.
DAFTAR PUSTAKA
Apriana A. 2008. Over-ekspresi gen
OsWRKY76 untuk ketahanan terhdapat
cendawan blas (Pyricularia grisea Sacc.)
pada padi [Tesis]. Bogor: Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Ardiana DW. 2009. Teknik isolasi DNA
genom tanaman papaya dan jeruk dengan
menggunakan modifikasi bufer CTAB.
Buletin Teknik Pertanian. 1: 12-16.
Banasiak A. 2010. Putative dual pathway of
auxin transport in organogenesis of
Arabidopsis. Planta 1: 49-61.
Baoensen X, Shinya O, Fumio K, Kastsu I.
1993. Character expression of the
semidwarfing sd-1 in rice (Oryza sativa
L.). J. Genet Genomic 20: 522-560.
Berg MJ, JL Tymoczko, L Stryer. 2002.
Biochemstry. Fifth Ed. San Fransisco: WH
Freeman.
Berg MJ, JL, Tymoczko, L Stryer. 2007.
Biochemistry. Sixth Ed. San Fransisco:
WH Freeman.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita
Resmi Statistik. Jakarta: BPS
Campbell NA, JB Reece, LG Mitchell. 2002.
Biologi. Ed ke-5. Lestari R, EIM Adil, N
Anita, Andri, Wibowo WF, W Manulu,
penerjemah; Safitri A, L simarmata, HW
Hardani, editor. Jakarta: Erlangga.
Terjemahan dari: Biology Fifth Edition.
Clark DP, Pazdermik NJ. 2009. Biotechnology
Applying the Genetic Revolution. London:
Elsevier Academic Press.
Colard BCY, A Das, PS Virk, DJ Mackill.
2006. Evaluation of quick and dirty DNA
extraction methodes for marker-assisted
selection in rice (Oryza sativa L.). Plant
Breedings. 126: 47-50.
Coleman WB, Gregory JT. 2006. Molecular
Diagnostic: for the Clinical Laboratorium.
Totowa: Humana Press.
Dellaporta Sl, Jonathan W, James BH. 1983.
A plant DNA minipreapration: version II.
Plant molecular Biology Reporter 1: 19-
21.
Faatih M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA
Kromosom. J. Penelitian Sains &
Teknologi. 10: 61 – 67.
Fan C, Yongzhong X, Hailiang M, Tingting L,
Bin H, Caiguo X, Xianghua L, Qifa Z.
2006. GS3, a major QTL for grain lenght
and weight and minor QTL for grain
width and thickness in rice, encodes a
putative transmembran protein. Theor
Appl gene 112: 1164-1171.
Handoyo D, Ari R. 2001. Prinsip umum dan
pelaksanaan polymerase chain reaction
(PCR). Unitas 9:17-29.
17
[IRRI]. 2010. Morfologi dan pertumbuhan
padi. [terhubung berkala] http:// www.
Knowledgebank. Irri. Org/ morph/
morphology.htm [13 Maret 2012].
Jiang GH, Xue YH, Cai GH, Xiang HL, Yu
QH. 2005. Identification of quantitative
loci for grain appearance and miling
quality using a doubled-haploid rice
population. Journal of Integrative Plant
Biology 47: 1391-1403.
Kolensik et al. 2004. Establishing and
efficient Ac/Ds tagging system in rice:
Large scale analysis of Ds flanking
sequences. The Plant Journal 37: 301-314.
Kumar S, L Arul, D Talwar. 2010. Generation
of market-free Bt transgenic indica rice
and evaluation of its yellow stem borer
resistance. J.Appl Genet 5: 243-257.
[Departemen Pertanian Badan Penelitian dan
Pengembangan Pertanian]. 2003. Panduan
Sistem Karaterisasi dan Evaluasi Tanaman
Padi. Bogor: Komisi Nasional Plasma
Nutfah.
Malik A. 2005. RNA therapeutic, pendekatan
baru dalam terapi gen [ulasan]. Majalah
Ilmu Kefarmasian 2: 51-61.
Manz A, Nicole P, Dimitri I. 2004.
Bioanalytical Chemistry. London: Imperial
College Press.
Mulyaningsih ES. 2011. Pengembangan padi
gogo indica toleran kekeringan melalui
transformasi genetik gen regulator HD-Zip
OSHOX6 dan seleksi populasi padi
mengandung marka genetic QTL 12.1
[Disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell
VW. 2003. Harper’s Illustrated
Biochemistry. New York: McGraw Hill.
Nafari IB. 2006. Kestabilan pewarisan gen
entC dan pmsB pada paditransgenik
generasi ketiga (T2) [Skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Nelson DL, MM Cox. 2008. Lehninger
Priciples of Biochemistry. Fifth ed. New
York: WH Freeman.
Padmadi B. 2009. Identifikasi sifat aroma
tanaman padi menggunakan marka
berbasis gen aromatik [Skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Primrose SB, RM Twyman. Principle of Gene
Manipulation and Genomics. Seventh Ed.
Cornwall: Blackwell publishing.
Purmaningsih, R. 2006. Induksi Kalus dan
Optimasi Regenerasi Empat Varietas Padi
Melalui Kultur In Vitro. Jurnal
Agrobiogen 2: 74-80.
Qu S, A Desai, R Wing, V Sundaresan. 2008.
A versatile transposon-based activation tag
vector system for functional genomics in
cereals and other monocot plants. Plant
Physiology 146: 189-199.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan
perbaikan sifat genetik padi menggunakan
transformasi Agrobacterium. Jurnal
AgroBiogen 2: 36-44.
Remelia M. 2008. Analisis T-DNA pembawa
transposon AC/Ds pada T0 dan aktivitas
Ds pada T1 tanaman padi (Oryza sativa L)
kultivar nipponbare [Skripsi]. Jakarta:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
Roche. 2008. DIG Application Manual for
Filter Hybridization. Menheim:Roche
Diagnostic GmbH.
Sambrook J, DW Russell. 2001. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Edisi 3.
New York: Coldspring Harbor Laboratory
Press.
Santoso D. 2001. Pengembangan pelacak
DNA spesifik gen melalui bioinformatika:
identifikasi gen penyandi protein biji 21
kDa pada kakao UAH Indonesia. Menara
Perkebunan 69: 10-17.
18
Santoso TJ. 2008. Identifikasi begomovirus
Indonesia pada tomat dan analisis
diversitas genetik gen AV1 serta
pemanfaatannyauntuk pengembangan
tanaman tahan virus [disertasi]. Bogor:
Program Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Smith CW, RH Dilday. 2002. Rice: Origin,
History, Technology and Production. New
Jersey: Willey & Sons.
Soedarini B, Patricia N. 2006. Pangan
transgenik: suatu pilihan yang dilematis.
Renai 2: 129-144.
Spielmeyer W, March HE, Peter MC. 2002.
Semidwarf (sd-1), “green revolution” rice,
contains a defective gibberellins 20-
oxidase gene. Plant Biology 13: 9043-
9048.
Sudharmawan AAK. 2009. Analisis segregasi
persilangan varietas padi tahan dan rentan
terhadap cekaman kekeringan. Agroteksos
19: 109-114.
Tang W, Ronald J. Newton, Douglas A.
Weidner. 2007. Genetic transformation
and gene silencing mediated by multiple
copies of a transgene in eastern white pine.
Experimental Botany 58: 545–554.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop
2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User
Manual. Wilmington: Thermo Fischer
Scientific.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,
Kohli A. 2011. Molecular Analysis of
Transgenic Plants. NewYork: Springer.
Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A
simple method of preparing plant samples
for PCR. Nucleid Acids Research 21:
4153-4154.
Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai
Glycine max (L.) merril toleran terhadap
NaCl untuk penanaman di lahan salin.
Makara SAins 1: 21-24.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop
2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User
Manual. Wilmington: Thermo Fischer
Scientific.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,
Kohli A. 2011. Molecular Analysis of
Transgenic Plants. NewYork: Springer.
Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A
simple method of preparing plant samples
for PCR. Nucleid Acids Research 21:
4153-4154.
Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai
Glycine max (L.) merril toleran terhadap
NaCl untuk penanaman di lahan salin.
Makara SAins 1: 21-24.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop
2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User
Manual. Wilmington: Thermo Fischer
Scientific.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,
Kohli A. 2011. Molecular Analysis of
Transgenic Plants. NewYork: Springer.
Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A
simple method of preparing plant samples
for PCR. Nucleid Acids Research 21:
4153-4154.
Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai
Glycine max (L.) merril toleran terhadap
NaCl untuk penanaman di lahan salin.
Makara SAins 1: 21-24.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop
2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User
Manual. Wilmington: Thermo Fischer
Scientific.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,
Kohli A. 2011. Molecular Analysis of
Transgenic Plants. NewYork: Springer.
Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A
simple method of preparing plant samples
for PCR. Nucleid Acids Research 21:
4153-4154.
Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai
Glycine max (L.) merril toleran terhadap
NaCl untuk penanaman di lahan salin.
Makara SAins 1: 21-24.
19
LAMPIRAN
20
Lampiran 1 Tahapan penelitian
Isolasi DNA metode cepat, miniprep, skala besar
Analisis kuantitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Uji dengan elektroforsesis
Uji hibridisasi Southern
Uji fenotipe padi
Karakterisasi molekuler antara jumlah salinan gen
dengan fenotipe padi
21
Lampiran 2 Elektroforegram DNA genom yang di potong enzim BamHI
Lampiran 3 Elektroforegram DNA pelacak yang di beri label DIG-11-dUTP
Lampiran 4 Elektroforegram DNA Genom setelah proses transfer ke membran
DNA pelacak yang telah di label DIG-11-dUTP
DNA pelacak yang tidak di label DIG-11-dUTP
22
Lampiran 5 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi
Sampel Jumlah salinanan gen Tinggi tanaman padi
(cm)
Jumlah anakan
T-309 0 117.1 4
99.3 2
119 4
111.9 3
Rata-rata 111.825 3.250
T-GS (2) 2 121 4
120 2
134.5 4
135.5 3
Rata-rata 127.750 3.250
T-GS (5) 4 119.6 5
88.5 6
Rata-rata 104.050 5.50
T-GS (9) 1 126 3
104 2
127.4 1
96 2
66 3
124 7
103.7 2
Rata-rata 106.786 2.857
T-GS (12) 0 95 2
94.8 0
76.5 1
Rata-rata 88.767 1
T-GS (13) 1 135 3
124.5 2
116.5 1
125 2
Rata-rata 125.25 2
23
Lampiran 6 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi
Sampel Jumlah
salinan gen
Panjang
malai (cm)
Jumlah
cabang
malai
Gabah
hampa
Gabah isi Berat 100
butir padi
T-309 0 22.5 14 9 144 2.469
2 18.2 9 62 30
3 23.5 12 10 141
4 18.1 9 15 63
5 19.5 11 51 81
6 28.5 13 16 127
7 22 14 42 129
8 20.8 11 23 79
9 20 13 59 149
10 21.5 14 33 96
11 23.9 13 24 119
12 24.1 14 37 147
13 36 13 20 42
14 20.5 14 47 86
15 24 15 47 151
16 22 14 59 114
17 22.5 15 39 124
18 23.5 16 41 159
19 23.5 12 21 148
20 20 13 52 115
21 23.9 14 80 100
22 19.6 12 16 120
23 23.5 13 42 140
24 18 7 32 36
25 24.5 13 33 118
26 26.8 11 17 165
27 18.9 10 32 66
28 21 15 112 58
29 22 9 39 104
30 23.5 12 106 42
31 20 11 34 116
32 16.5 8 42 30
33 23.5 14 43 139
34 17.5 12 35 170
Rata-rata 22.171 12.353 40.294 107.294 2.469
T-GS (2) 2 22.3 11 102 38 1.888
17 7 74 15
21.9 11 127 17
17.4 9 59 22
22 12 79 27
20 11 84 21
18.7 11 90 28
22.1 10 82 31
20 11 83 35
22.1 12 85 57
19.1 11 69 22
20 9 74 28
18.5 11 84 19
18.9 8 76 9
17 6 54 16
17.6 6 42 12
19.9 9 64 6
24
Lanjutan
Sampel Jumlah
salinan gen
Panjang
malai (cm)
Jumlah
cabang
malai
Gabah
hampa
Gabah isi Berat 100
butir padi
19.9 11 106 8
20 11 103 18
19.2 10 96 6
Rata-rata 19.680 9.850 81.650 21.75 1.888
T-GS (5) 4 23.5 10 13 120 2.669
24.1 11 23 177
24.9 9 24 126
17.2 7 27 65
21 8 28 87
18.7 7 27 62
Rata-rata 21.567 8.667 23.667 106.167 2.669
T-GS (9) 1 12.3 8 42 13 1.740
Rata-rata 12.3 8 42 13 1.740
T-GS (12) 0 * * * * *
T-GS (13) 1 15.5 10 51 37 2.168
13.6 10 88 8
18.1 12 76 12
13.5 8 43 8
Rata-rata 15.175 10 64.5 16.25 2.168
Keterangan: *= tanaman mati sebelum dilakukan analisis lanjut fenotipe
25
Lampiran 7 Komposisi larutan hibridisasi Southern
Larutan Komposisi
Larutan depurinasi Sebanyak 400 mL akuades dan 20.8 mL
HCl dimasukkan ke dalam gelas kmia
500 mL kemudian di stirrer.
Larutan denaturasi Sebanyak 400 mL akuades, 10 g
NaOH, dan 43.83 g NaCl dimasukkan
ke dalam gelas kimia 500 mL.
Larutan netralisasi Sebanyak 800 mL, 60.57 tris base, dan
87.66 g NaCl dimasukkan ke dalam
gelas kimia 1000 mL lalu di strirrer
20x SSC Sebanyak 800 mL akuades, 175.32 g
NaCl, dan 88.23 g tri-natrium sitrat
dimasukkan ke dalam gelas kimia lalu
di stirrer
Wash buffer 1 800 mL akuades dimasukkan ke dalam
gelas kimia dan ditambahkan 100 mL
20x SSC dan 10 mL 10% SDS lalu di
stirrer.
Wash buffer 2 800 mL akuades dimasukkan ke dalam
gelas kimia dan ditambahkan 5 mL 20x
SSC dan 10 mL 10% SDS lalu di
stirrer.
Washing buffer Sebanyak 600 mL 25ncuba asam
maleat dimasukkan ke dalam gelas
kimia dan ditambah 1.8 mL Tween 20.
Blocking solution Ditambahkan 250 mL bufer asam
maleat dan 2.5 g blocking reagent
dimasukkan ke dalam botol lalu di
inkubator pada suhu 68 kemudian di
diaduk.
Antibody solution Dimasukkan 40 mL blocking solution
ke dalam tabung 50 mL dan
ditambahkan 4 L Anti-Digoxigenin-
AP lalu diaduk.