Download - IX. Prosedur Analisis
LAMPIRAN
AOAC, Assn. of Official Analytical Chemists. 1990. Official methods of analysis. Method 985.29. 15th (eds). Washington D.C.
197
I. Prosedur Analisis
Lampiran 1. Analisis penentuan kadar air (AOAC, 1990)
1. Cawan kosong dibersihkan, lalu diberi label kemudian dipanaskan di dalam oven
pada suhu 105ºC selama 15 menit, kemudian ditimbang menggunakan timbangan
analitik. Sampel yang telah dihaluskan ditimbang di dalam cawan sebanyak 2 g.
2. Cawan beserta isinya dipanaskan di dalam oven pada suhu 105ºC selama 2 jam.
3. Cawan selanjutnya di pindahkan ke dalam desikator, lalu didinginkan kemudian
ditimbang.
4. Cawan dipanaskan kembali di dalam oven hingga diperoleh berat konstan (selisih
penimbangan berturut-turut kurang dari 0,2 mg). Nilai kadar air bahan diperoleh
melalui persamaan :
Kadar air bahan (%) =
Keterangan:
BCK = Berat Cawan Kosong
(BC+I)* = Berat Cawan dengan Isi Setelah Dipanaskan
BS = Berat Sampel
Lampiran 2. Analisis kadar pati (AOAC, 1990)
198
Sebanyak 2-5 g pati aren ditimbang dimasukkan ke dalam beker glass 250 mL
kemudian ditambahkan 50 mL aquades dan diaduk selama 1 jam. Suspensi disaring
dengan kertas saring kemudian dicuci dengan aquades sampai volume filtrat menjadi
250 mL. Residu dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam erlenmeyer
dengan pencucian 200 mL aquades dan ditambahkan 20 mL HCl 25% (berat jenis
1,125), ditutup dengan pendingin balik dan dipanaskan di atas penangas air mendidih
selama 2,5 jam. Setelah dingin dinetralkan dengan larutan NaOH 45% dan diencerkan
sampai volume 500 mL kemudian disaring. Kadar gula dinyatakan sebagai kadar
glukosa dari filtrat yang diperoleh. Penentuan glukosa seperti pada penentuan gula
reduksi (Metode Nelson Somogyi). Kadar glukosa dikalikan 0,9 adalah merupakan
kadar pati.
Lampiran 3. Analisis kadar amilosa (AOAC, 1990)
Penentuan kurva Standar :
Amilosa murni ditimbang sebanyak 0,04 g dan dimasukkan ke dalam labu ukur
100 mL dan ditambahkan 1 mL etanol 95% dan 9 mL larutan 1 N NaOH.
Dipanaskan selama 10 menit dalam penangans air mendidih, kemudian
didinginkan dan ditambahkan aquades sampai volume 10 mL dan digojog.
Dipipet larutan tersebut sebanyak 1, 2, 3, 4, 5 mL dan dipindahkan ke labu ukur
100 mL, diasamkan dengan menambahkan 1 mL 1N asam asetat, kemudian 2
mL larutan iodin 0,2% dan selanjutnya ditambahkan aquades sampai volume
100 mL, digojog dan dibiarkan selama 20 menit.
199
Ditentukan besar absorbansi larutan pada panjang gelombang 620 nm. Dibuat
kurva standar
Penentuan amilosa sampel:
Sampel ditimbang sebanyak 1 g dimasukkan dalam labu ukur 100 mL,
ditambahkan 1 mL etanol 95% dan 9 mL larutan 1 N NaOH. Dipanaskan
selama 10 menit, dalam penangas air mendidih, kemudian didinginkan dan
ditambahkan aquades sampai volume 100 mL dan digojog.
Larutan tersebut diambil sebanyak 5 mL dan dimasukkan dalam labu ukur 100
mL. Diasamkan dengan menambahkan 1 mL 1N asam asetat, kemudian 2 mL
larutan iodin 0,2 % dan selanjutnya ditambahkan aquades sampai volume 100
mL, digojog dan dibiarkan selama 20 menit.
Ditentukan besar absorbansi larutan pada panjang gelombang 620 nm. Dibuat
kurva standar.
Lampiran 4. Analisis kadar protein (AOAC, 1990)
1. Ditimbang bahan kering 50-60 mg dan dimasukkan ke dalam labu kjeldahl (50 mL)
dan ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat.
2. Dididihkan dalam ruang asap sampai jernih dan kemudian dilanjutkan pendidihan
30 menit. Setelah dingin dinding labu dicuci dengan sedikit akuades dan dididihkan
lagi selama 30 menit.
200
3. Setelah dingin dipindahkan ke dalam labu distilasi Kjeldahl mikro dan ditambah 5-
10 mL akuades dan 15-16 mL larutan NaOH-Na2S2O3 (40:5 g dan dilarutkan
dengan akuades sampai 100 mL).
4. Segera dilakukan distilasi uap, destilat ditampung dalam Erlenmeyer 100 mL yang
telah berisi 5 mL larutan asam borat 4 % (larutan jenuh) dan diberi 1 mL indikator
campuran (metil merah-metilen biru) atau (metil merah-brom cresol green).
Distilasi diakhiri bila semua N telah terdestilasi yaitu bila tetesan distilat tidak
bersifat basa lagi.
5. Distilat dititrasi dengan 0,02 N HCl
6. Dihitung totan N dan % protein dalam bahan
Lampiran 5. Analisis kadar lemak (AOAC, 1990)
1. Labu lemek dicuci bersih, kemudian dipanaskan di dalam oven selama 1 jam pada
suhu 105oC, selanjutnya didinginkan di dalam desikator selama 30 menit lalu
ditimbang dan dicatat beratnya.
2. Sampel ditimbang sebanyak 20 g kemudian dimasukkan ke dalam labu penyari
selongsong yang terbuat dari kertas saring. Selanjutnya labu penyari dimasukkan ke
dalam soklet dan diekstraksi lemaknya selama 4-6 jam dengan pelarut heksan.
3. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari lemak dengan rotari vakum
evaporator. Labu lemak dipanaskan di dalam oven yang dilengkapi dengan blower
selama 1 jam pada suhu 100oC, kemudian didinginkan di dalam desikator selama 30
menit lalu ditimbang dan dicatat beratnya. Pemanasan dan penimbangan diulang
201
beberapa kali hingga diperoleh berat labu lemak konstan. Kadar lemak sampel
ditentukan melalui persamaan :
[A – B]Kadar lemak (%) = x 100 %
Berat sampel
Keterangan:A = Berat labu + berat lemakB = Berat labu kosong
Lampiran 6. Analisis kadar abu (AOAC, 1990)
Kadar abu ditentukan dengan metode pemanasan dalam tanur bersuhu 550oC.
Mula-mula cawan pengabuan dipanaskan dalam tanur, lalu didinginkan di dalam
desikator selama 15 menit, kemudian ditimbang. Proses ini diulangi sampai diperoleh
berat konstan. Ke dalam cawan tersebut di atas diisi sampel sebanyak 2 g, kemudian
dimasukkan ke dalam tanur dibakar sampai diperoleh abu yang berwarna kelabu dan
mempunyai berat yang konstan.
Pengabuan dilakukan dalam dua tahap, yaitu pertama pada suhu sekitar 400oC.
Pada tahap ini pintu tanur dibiarkan terbuka, sebab bahan yang dibakar akan
mengeluarkan asap. Pemanasan dilanjutkan pada suhu 550oC dengan pintu tanur
tertutup. Abu didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang. Kadar abu ditentukan
dengan persamaan :
[Z – X]Kadar Abu (%) = x 100%
Y
X = Berat cawan pengabuan kosongY = Berat SampelZ = Berat cawan pengabuan + sampel setelah dipanaskan di dalam tanur
Lampiran 7. Analisis kadar RS (AOAC, 1990)
202
1. Timbang 3 g sampel
2. Suspensikan sampel dalam 150 mL buffer fosfat 0,08 M, pH 5,9
3. Suspensi pati digelatinisasi lalu didinginkan pada suhu ruang
4. Tambahkan 10 µl α-amilase lalu inkubasi pada suhu 85oC selama 75 menit dan
didinginkan pada suhu ruang
5. Atur pH larutan pada pH 4,3 dengan menambah larutan HCl
6. Tambahkan 20 µl amiloglukosidase dan diinkubasikan pada suhu 60oC selama
45 menit.
7. Ambil 10 µl supernatan dan tambahkan 10 mL GOD, inkubasi pada suhu 20oC
selama 20 menit.
8. Tera absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm.
Kadar RS dihitung dengan rumus (Ebihara et al., 2006):
RS (g/100g) = 1 – (G x 0,9 / W) x 100
Keterangan : G = berat glukosa (g)W = berat sampel (g)
Lampiran 8. Analisis persen butiril dan derajat substitusi (Singh et al., 2004)
Sebanyak 1,0 gram pati butirat dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 mL dan
kemudian ditambah dengan 50 mL etanol 75%. Dispersi pati dipanaskan dan diagitasi
pada suhu 50oC di dalam waterbath selama 30 menit dan kemudian didinginkan pada
suhu kamar. Setelah dingin, ke dalam suspensi pati ditambahkan 40 mL larutan 0,5 M
KOH dan kemudian digoyang dengan menggunakan shaker selama 30 menit pada suhu
kamar. Setelah di-shaker, kelebihan alkali dititrasi dengan menggunakan larutan 0,5 M
HCl dan dengan menggunakan phenolphthatelin sebagai indikator sampai warna merah
203
muda menghilang. Sebagai blanko digunakan pati aren alami. Jika W = berat
substituen yang terikat dan menggantikan gugus hidrogen pada gugus OH (% berat), M
= berat molekul substituen (gugus butiril = 71), W/M = jumlah mol substituen, 1 x
W/M = total berat hidrogen (%), 162 = berat molekul satuan glukosa (anhidro,
C6H10O5) dan (100 – W + 1 x W/M)/162 = berat mol satuan glukosa, maka:
W/MDS = ———————————
(100-W + 1 x W/M)/162
162 W= —————————— M {100-W(1-1/M)}
162 WDS = ———————————
M {100-W(1-1/M)}
162 WDS = ——————————
100 M – (M-1) W
[(Blanko-Sampel) mL x M HCl x 0,071 x 100]% butiril (W) = ———————————————————
Berat kering sampel (g)
Lampiran 9. Analisis pengikatan gugus butiril
Spektrum FTIR pati alami dan pati butirat diukur menggunakan metode KBr
seperti yang dikemukakan oleh Pushpamalar et al. (2006). Sampel dicampur dengan
KBr dengan perbandingan pati / KBr = 1:4. Campuran tersebut dimampatkan untuk
mendapatkan pelet yang transparan dan kemudian sampel dikenai sinar infrared
dengan spektrometer (MIDAC, prospect 269, Costa Mesa, CA, USA). Setiap spektrum
dianalisis dalam kisaran resolusi 500-4000 cm-1.
204
Lampiran 10. Analisis kristalinitas
X-ray difraksi pati alami dan pati butirat diukur menggunakan metode
Miao et al. (2011). Analisis X-ray difraksi dilakukan dengan X-ray difraktometer PRO
Pert-X-ray (PANalytical, Almelo, Belanda) yang beroperasi pada 40 kV dan 30 mA
dengan Cu Kα radiasi (λ = 1,5406 Å). Sampel pati dikemas dalam sel kaca persegi (15
x 10 mm, ketebalan 0,15 cm) dan discan dengan kecepatan 2o/min pada sudut difraksi
(2θ) mulai 3o sampai 70o pada suhu kamar. Kristalinitas dihitung sesuai dengan
persamaan berikut: Xc = Ac / (Aa + Ac), dimana Xc adalah kristalinis, Ac adalah
daerah kristal dan Aa adalah daerah amorf pada X-ray diffractogram.
Lampiran 11. Analisis water dan oil holding capacity
WHC dan OHC pati alami dan pati butirat diukur menggunakan metode
Larrauri et al. (1996). Dua puluh lima mililiter akuades atau minyak zaitun komersial
ditambahkan ke 250 mg sampel kering, diaduk dan dibiarkan pada suhu kamar selama
1 jam. Setelah sentrifugasi residu ditimbang, WHC dan OHC dihitung sebagai g air
atau minyak per g sampel kering.
Lampiran 12. Analisis daya mengembang dan kelarutan
Daya mengembang dan kelarutan ditentukan berdasarkan metode yang
dikemukakan oleh Adebowale et al. (2009). Pati disuspensikan dengan akuades (1%,
b/v) dengan tabung reaksi yang telah diketahui beratnya (W1). Kemudian dipanaskan
pada penangas air suhu 80oC selama 30 menit, lalu didinginkan hingga suhu ruang.
205
Selanjutnya disentrifugasi pada 3400 rpm selama 15 menit, sehingga terpisah residu
dan supernatan. Residu dan air yang tertahan setelah disentrifugasi kemudian ditimbang
(W2). Swelling power pati (berdasarkan berat kering ditentukan sebagai berikut:
Daya mengembang (g/g) = (W2 – W1)/ Berat pati.
Supernatan (5 mL) dikeringkan hingga berat konstan pada suhu 110oC. Residu
yang terdapat setelah dikeringkannya supernatan, menunjukkan jumlah pati yang
terlarut dalam air (%).
Lampiran 13. Analisis kadar gula reduksi (AOAC, 1990)
Penentuan Kurva Standar adalah sebagai berikut :
1. Dibuat larutan glukosa standar dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 60 dan 70 ppm.
2. Masing-masing larutan glukosa standar tersebut dipipet 2 mL lalu dimasukkan ke
dalam tabung reaksi.
3. Ditambahkan 1 mL larutan fenol 5%, kemudian digojog
4. Ditambahkan dengan cepat 5 mL asam sulfat pekat dengan cara menuangkan secara
tegak lurus ke permukaan larutan.
5. Dibiarkan selama 10 menit, lalu digojog kemudian ditempatkan dalam penangans
air selama 15 menit.
6. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490 nm.
7. Selanjutnya ditentukan nilai hubungan persamaan antara konsentrasi larutan
glukosa standar dengan absorbansi.
Penetapan Sampel sebagai berikut :
206
1. Sampel ± 5 g dilarutkan ke dalam aquades 100 mL, lalu diaduk dengan pengaduk
magnetik stirrer pada kecepatan 300 rpm selama 30 menit.
2. Disentrifugasi pada kecepatan 3.000 selama 15 menit, lalu didekantasi.
3. Filtrat yang diperoleh ditentukan absorbansinya seperti pada penetapan kurva
standar.
4. Kadar glukosa ditentukan dengan membandingkan hasil pengukuran absorbansi
sampel dengan kurva standar.
Lampiran 14. Penentuan rendemen RS
Berat RS Rendemen RS %) = x 100 %
Berat sampel
Lampiran 15. Analisis nuclear magnetic resonance (NMR)
Struktur kimia RS menggunakan spektrometer resonansi magnetik inti (nuclear
magnetic resonance, NMR) spektroskopi yang dilengkapi dengan NMR Bruker Avance
II instrument pada frekwensi 600 MHz (field 14 T, operasi pada 600 MHz) untuk 1H
dan 13C-NMR. Sampel RS dari pati aren alami dan pati aren butirat masing-masing 25
mg dimasukkan dalam tabung injektor dan selanjutnya ditambahkan pelarut dimetil
sulfoksida-d6 (0,75 mL), kemudian dilarutkan pada suhu 75oC untuk mendapatkan
larutan yang homogen. Analisis sampel pada suhu 25oC dengan cara menginjeksikan
tabung injektor ke dalam NMR spektroskopi.
Lampiran 16. Analisis pengikatan garam empedu in vitro (Barsby et al., 2000)
207
Absorpsi asam/garam empedu (asam kolat, sodium taurokolat, sodium
deoksikolat) secara in vitro. Sampel (100 mg) dicampur dengan 10 mL larutan dari
setiap asam / garam empedu. Larutan tersebut dibuat dengan menambahkan asam /
garam empedu dengan konsentrasi 2 µmol/mL pada pH 7,6 dengan menggunakan 0,1
molar buffer fosfat. Sampel uji dan blanko diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit,
selanjutnya disentrifugasi pada 2000 rpm selama 5 menit. Sampel sebanyak 50 µL
ditambah 5 mL asam sulfat 70% dan 1 mL larutan furfural yang baru (2,3 g/L) yang
dicampurkan untuk setiap perlakuan. Setelah 80 menit, absorbansi diukur pada λ 510
nm. Hasil dinyatakan dalam persen absorpsi asam empedu.
Lampiran 17. Analisis kolesterol metode Barsby et al., 2000 dikombinasikan metode CHOD-PAP menggunakan pereaksi kit
Sampel (100 mg) ditambahkan dengan 2 mL emulsi. Komposisi emulsi yang
digunakan 1 % lesitin, 1,375 % garam sodium dari asam deoksikolak dan 0,225 %
kolesterol yang dipreparasi dalam 0,1 molar buffer fosfat pada pH 6.8. Inkubasi selama
satu jam pada suhu 37oC dalam shaker water bath. Sampel dan standar diambil
sebanyak 20 µl dan dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung kolesterol
esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipyrine, peroksidase dan bufer)
kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran
diinkubasi pada suhu 20o- 25oC selama 20 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya
pada panjang gelombang 500 nm. Dengan cara yang sama dilakukan untuk blanko dan
standar. Total kolesterol (%) dihitung dengan rumus:
Abs. sampelTotal kolesterol = x 100 %
208
Abs.standart
Lampiran 18. Penghitungan jumlah sel bakteri
Penghitungan bakteri menggunakan metode plating (Sanz et al., 2005;
Vardakou et al., 2008). Sampel hasil fermentasi (1 mL) dengan lama waktu inkubasi 0,
24 dan 48 jam masing-masing diencerkan dalam larutan pengencer steril 9 mL yang
mengandung pepton 0.05% dan sistein 0.01%, kemudian divorteks untuk memperoleh
tingkat pengenceran 10-1, selanjutnya dibuat seri pengenceran sampai 10-8 dengan cara
yang sama. Dari masing-masing pengenceran diambil 1 mL kemudian ditambahkan
media selektif (10 - 13 mL) secara pour plate pada cawan petri kemudian diinkubasi
pada suhu 37oC selama 48 jam. Media selektif yang digunakan diantaranya total plate
count untuk total bakteri, columbia agar, glukosa 5 g/L, sistein HCl 0,5 mg/L dan asam
propionat (0,5 mL/L) dengan pH 5 untuk Bifidobacterium spp., rogosa agar dan
supplemen asam glasial asetat 1,32 mL/L untuk Lactobacillus spp., trypticase soy agar,
supplemen kanamycin 75 mg/L, haemin 5 mg/L, vancomycin 75 mg/L dan laked horse
blood 50 mL untuk Bacteroides spp., reinforced clostridial agar, supplemen
nonvobiocin 8 mg/L dan colistin 8 mg/L untuk Clostridium spp. Jumlah koloni antara
30 - 300 dari setiap cawan petri dihitung dan dinyatakan dalam colony forming unit /
mL (Log CFU/mL).
Lampiran 19. Penghitungan indeks prebiotik
Persamaan yang digunakan untuk menghitung indeks prebiotik (IP) berdasarkan
persamaan yang digunakan oleh Palframan et al. (2003), sebagai berikut:
209
IP = (Bif /Total) – (Bac / Total) + (Lac / Total) – (Clos /Total): Bif, Bac, Lac, Clos,
dan Total merupakan jumlah populasi bakteri bertuturt-turut Bifidobacteria,
Bacteroides, Lactobacilli, Clostridia, dan total bakteri. Persamaan ini mengasumsikan
bahwa peningkatan populasi Bifidobakteria dan atau Lactobacilli memberikan efek
positif, sedangkan Bacteroides dan atau Clostridia memberikan efek negatif.
Lampiran 20. Analisis perubahan pH
Nilai derajat keasaman (pH) diukur pada setiap perlakuan setelah inkubasi 0,
12, 24, dan 48 jam dengan menggunakan pH meter. pH meter dinyalakan, kemudian
elektroda dimasukkan ke dalam larutan buffer pH 4, dibiarkan sampai stabil dan
selanjutnya dibilas dengan akuades kemudian dikeringkan. Elektroda yang sudah
kering, dimasukkan lagi ke dalam larutan buffer pH 7 dan dibiarkan sampai stabil lalu
dibilas dengan akuades kemudian dikeringkan. Pengukuran pH sampel dengan cara
memasukkan elektroda ke dalam larutan sampel, dibiarkan sampai stabil dan dicatat
nilai pH yang ditunjukkan pada layar.
Lampiran 21. Analisis SCFA dengan Gas Chromatography
Satu milliliter (1 mL) sampel hasil kultur fermentasi, disentrifugasi pada 5000
rpm selama 30 menit, supernatan dimasukkan ke dalam tabung efendof dan disimpan
pada suhu 4oC sebagai bahan analisis. Supernatan diambil 1 μL dan diinjeksikan ke
dalam sistem kromatografi gas. Alat kromatografi gas yang digunakan adalah merek
Shimadzu GC 8A, jenis kolom gelas (GP 10% SP 1200 on 1% H3PO4), panjang kolom
2 meter, diameter kolom 3 mm, suhu injektor 220°C, suhu kolom 130°C. Jenis detektor
210
Flame Ionisation Detector, suhu detektor 230° C, dan tekanan gas nitrogen sebagai gas
pembawa 1,3 mL/cm2. Data dari U.V. detektor diintegrasikan menggunakan paket
software Value Chrom TM. Produksi asam asetat, propionat dan butirat pada masing-
masing sampel dihitung dengan kurva kalibrasi eksternal dengan menggunakan standar
asam asetat, asam propionat dan asam butirat. Konsentrasi asam lemak rantai pendek
dihitung berdasarkan luas peak sampel terhadap luas peak standar.
211