Download - Imunologi Test
IMUNOLOGY LABORATORIUM TEST
Dr. Ira Arundina,drg, MSi
- Ilmu yg mempelajari tentang imunitas atau respons kekebalan tubuh
akibat rangsangan molekul asing
- Mempelajari reaksi dari tubuh terhadap invasi suatu antigen dan pembentukan
antibodi akibat antigen yang masuk
Sistem imun baik spesifik maupun non spesifik akan melindungi tubuh dan mengeliminasi agen penyakit
Diperlukan suatu cara pemeriksaan untuk memperkuat diagnostik morfologik dengan mengukur derajat imunitas
Konsep dasar adalah reaksi antigen-antibodi
Macam pemeriksaan teknik imunologi :
1. Radioimmunoassay (RIA)2. Immunohistochemistry : - direct
- indirect3. Imunofluoresense : - direct
- indirect4. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) - Direct ELISA - Indirect ELISA - Sandwich ELISA
Jaringan segar Embeded tissue (parafin blok) Kultur sel : sel fibroblas, sel epitel, sel
hepatosit, sel odontoblas, sel endotel dll
Bahan Sitologi Saliva Cairan tubuh : darah, GCF
Radioimmunoassay (RIA)Radioimmunoassay (RIA)
Prinsip dasar :Prinsip dasar : Didasarkan pada reaksi antara antibodi Didasarkan pada reaksi antara antibodi
(dalam konsentrasi terbatas) dengan (dalam konsentrasi terbatas) dengan berbagai konsentrasi antigenberbagai konsentrasi antigen
* Digunakan untuk menemukan antigen * Digunakan untuk menemukan antigen tunggal/antibodi dalam cairan biologistunggal/antibodi dalam cairan biologis
* Tehnik pemeriksaan untuk menentukan * Tehnik pemeriksaan untuk menentukan antibodi/antigen dengan reagen yang antibodi/antigen dengan reagen yang bertanda zat radioaktifbertanda zat radioaktif
Ab + Ag berlabel + radioisotop
Ikatan Ab-Ag berlabel- radioisotop
Jumlah Ag berlabel yg terikat pd Ab diukur dg gamma counter
Untuk mendeteksi antigen seluler dengan menggunakan antibodi
Mempelajari struktur/komponen sel/jaringan yang berfungsi sebagai antigen
Identifikasi jenis sel berdasar morfofungsi
IMUNOHISTOKIMIA ADALAH METODA PEWARNAAN JARINGAN YANG MENGGUNAKAN REAKSI IMUNOLOGIK DAN REAKSI KIMIAWI
IMUNOHISTOKIMIA
1. REAKSI IMUNOLOGIK : DITANDAI DENGAN ADANYA REAKSI ANTARA ANTIGEN
DENGAN ANTIBODI
2. REAKSI KIMIAWI : DITANDAI DENGAN ADANYA REAKSI ENZYMATIK YAITU ANATARA ENZYM
DENGAN SUBSTRAT
PADA IMUNOHISTOKIMIA DIKENAL ADA BEBERAPA METODA ANTARA LAIN : METODE DIRECT, INDIRECT, METODA ABC, METODA B-SA
SEBELUM MELAKUKAN REAKSI INI HENDAKNYA DIPERHATIKAN TERLEBIH DAHULU, DARI BAHAN YANG DIWARNAI
APABILA BAHAN BERUPA HASIL SAYATAN YANG BERASAL DARI PENYAYATAN DINGIN, MAKA SEGERA DAPAT DILAKUKAN PEWARNAAN. BILA BAHAN BERASAL DARI SAYATAN YANG DIPEROSES MELALUI PARAFFIN, MAKA HARUS DILAKUKAN DEPARAFFINISASI SAMPAI PADA AIR.
SEBELUM DILAKUKAN PEWARNAAN IMUNOHISTOKIMIA, SAYATAN YANG DIPEROLEH BAIK DARI FROZEN SECTION, MAUPUN DARI SAYATAN PARAFFIN YANG TELAH DILAKUKAN DEPARAFFINISASI, TERLEBIH DAHULU HARUS DIBERIKAN PEROKSIDA. TUJUANNNYA ADALAH UNTUK MENGHILANGKAN ENDOGENUS PEROKSIDASE, KARENA ENZYM INI DAPAT MEMBERIKAN REAKSI POSITIF PALSU.
SETELAH DIBERIKAN PEROKSIDA (H202), MAKA SAYATAN JARINGAN TERSEBUT HARUS DIRENDAM DALAM LARUTAN TRYPSIN 0,025%. TUJUANNYA PEMBERIAN ENZYM KADAR RENDAH INI ADALAH UNTUK MENGHILANGKAN DEBRIS PROTEIN YANG TERBENTUK, YANG KEMUNGKINAN DEBRIS TERSEBUT MENUTUPI EPITOP DARI BAHAN YANG HENDAK DIDETEKSI. OLEH KARENA ITU HARUS DILAKUKAN PADA TEMPRATUR 37 DERAJAD CELCIUS
SELAIN YANG TELAH DIKEMUKAKAN DI ATAS, MAKA UNTUK MEMBUKA EPITOP YANG KEMUNGKINAN TERTUTUP OLEH SUATU DEBRIS, AGAR REAKSI ANTARA EPITEP DENGAN ANTIBODI YANG DIBERIKAN DAPAT BERLANGSUNG TANPA HAMBATAN, MAKA PROSES TERSEBUT DAPAT DILAKUKAN DALAM MICROWAVE.
SETELAH MEMBICARAKAN PERSIAPAN DARI PEWARNAAN IMUNOHISTOKIMIA, SEKARANG AKAN DIBICARAKAN PRINSIP DASAR DARI MASING-MASING METODA TERSEBUT
A. REAKSI IMUNOHISTOKIMIA METODA DIRECT
CUCI-PBS
CUCI-PBS
HAEMATOKSILINCUCI-AIR– DEHYDRASI–CLEARING – MOUNTING
KUNCI: APABILA ENZYM YANG DIGUNAKAN PEROKSIDASE, MAKA SUBSTRAT YANG DIPAKAI ADALAH PEROKSIDA
TIMBUL REAKSI WARNA
B. IMUNOHISTOKIMIA METODA INDIRECT
KUNCI :
CUCI PBS
CUCI PBS
CUCI PBS
HAEMATOXYLINCUCI AIR - DEHYDRASI-CLEARING - MOUNTING
TIMBUL REAKSI WARNA
B. REAKSI IMUNOHISTOKIMIA METODA BS-A (BIOTIN STREPTASVIDIN AMPLIFIED)
CUCI- PBS
CUCI-PBS
CUCI-PBS
HAEMATOK SILIN
CUCI-PBS – CUCI AIR – DEHIDRASI – CLEARING – MOUNTING
KUNCI :
1.
2.
3.
4.
5.
CUCI-PBS
Metode imunologi untuk mendeteksi Ab dari berbagai kelas imuniglobulin dalam serum, saliva, cairan otak.
Prinsip : mereaksikan Ab dg Ag spesifik dan anti-antibodi berlabel FITC (Fluoresense Isothiocyanat) hijau
Label Rhodamin merah
IMUNO FLUORESENSI
METODA IMUNO FLUORESNSI HAMPIR SAMA DENGAN METODA IMUNO HISTOKIMIA, HANYA PADA METODA INI YANG DITAMPAKKAN BUKAN REAKSI WARNA, MELAINKAN BERUPA SUATU PANCARAN FLUORESENSI
BAHAN FLUORESENSI YANG PALING SERING DIGUNAKAN ADALAH : FITC ( LFUORECENCE ISO TIO CYANAT)
PENCUCIAN
NAMPAK TERPENDAR PADA PENGAMATAN MIKROSKOP FLUORESEN
Metoda ada 2 macam :1. direct immunofluoresense : Ab langsung
dilabel2. indirect immunofluoresense : melalui Ab
sekunder (Ig fragment)
Banyak dipakai untuk menentukan Ag/bahan tertentu yg tidak diketahui, Ig atau komplemen
Aplikasi klinis :- Penentuan beberapa kuman seperti basil TB- Penentuan beberapa virus- Penentuan Parasit
Ag (yg tidak diketahui) fiksasi (aseton)
Ab yg dilabel bahan fluoresens
Inkubasi
Cuci dg PBS Keringkan
Mikroskop fluoresens
Cara:1. Sel terinfeksi difiksasi dengan
aceton-20oC2. Di blok dengan serum FCS 1%3. Direaksikan dengan Ab yang
dilabel dengan FITC dan inkubasi 45 men-1h 37oC
4. Dicuci lalu ditambahkan oil emersi 10 ul-20 ul di atas sel
5. Dianalisis dengan mikroskop fluoresen
Indirect immunofluoresenseIndirect immunofluoresense
Lebih banyak digunakan untuk menemukan Lebih banyak digunakan untuk menemukan antibodiantibodi
Aplikasi klinis :Aplikasi klinis :
1.1. Penentuan Ig terhadap basil TBPenentuan Ig terhadap basil TB
2.2. Penentuan antibodi terhadap toxoplasmaPenentuan antibodi terhadap toxoplasma
3.3. Penentuan sel imunokompeten kankerPenentuan sel imunokompeten kanker
Ag fiksasiAg fiksasi
Antibodi (serum penderita)Antibodi (serum penderita)
Inkubasi Inkubasi Ag-Ab komplekAg-Ab komplek
konjugate (anti human globulin berlabel konjugate (anti human globulin berlabel fluoresen)fluoresen)
InkubasiInkubasi
Mikroskop fluoresenseMikroskop fluoresense
Metode Imunofluoresen Metode Imunofluoresen (indirect)(indirect)
Cara:Cara:1.1. Sel terinfeksi difiksasi Sel terinfeksi difiksasi
dengan aceton-20oCdengan aceton-20oC2.2. Di blok dengan serum FCS Di blok dengan serum FCS
1%1%3.3. Direaksikan dengan Ab 1 dan Direaksikan dengan Ab 1 dan
inkubasi 45 men-1h 37oCinkubasi 45 men-1h 37oC4.4. Dicuci dengan PBS lalu di Dicuci dengan PBS lalu di
reaksikan dengan Ab2 reaksikan dengan Ab2 inkubasi 45 men-1h 37oCinkubasi 45 men-1h 37oC
5.5. Dicuci dengan PBS lalu Dicuci dengan PBS lalu direaksikan dengan direaksikan dengan konjugate Fab IgG dilabel konjugate Fab IgG dilabel FITCFITC
6.6. Dicuci lalu ditambahkan oil Dicuci lalu ditambahkan oil emersi 10 ul diatas selemersi 10 ul diatas sel
7.7. Dianalisis dengan mikroskop Dianalisis dengan mikroskop fluoresenfluoresen
Ag + Ab + Konjugate (Fab IgG dilabel FITC) – dianalisis dg Mikros. Fluoresen
Imunofluoresen (indirect)Imunofluoresen (indirect)
Cara:Cara:1.1. Sel terinfeksi difiksasi dengan Sel terinfeksi difiksasi dengan
aceton-20oCaceton-20oC2.2. Di blok dengan serum FCS 1%Di blok dengan serum FCS 1%3.3. Direaksikan dengan Ab 1 (ab Direaksikan dengan Ab 1 (ab
monoklonal) dan inkubasi 45 monoklonal) dan inkubasi 45 men-1h 37oCmen-1h 37oC
4.4. Dicuci dengan PBS lalu di Dicuci dengan PBS lalu di reaksikan dengan Ab2 reaksikan dengan Ab2 inkubasi 45 men-1h 37oCinkubasi 45 men-1h 37oC
5.5. Dicuci dengan PBS lalu Dicuci dengan PBS lalu direaksikan dengan konjugate direaksikan dengan konjugate Fab IgG dilabel RhodaminFab IgG dilabel Rhodamin
6.6. Dicuci lalu ditambahkan oil Dicuci lalu ditambahkan oil emersi 10 ul diatas selemersi 10 ul diatas sel
7.7. Dianalisis dengan mikroskop Dianalisis dengan mikroskop fluoresenfluoresen Ag + Ab + Konjugate (Fab IgG di
label Rhodamin) – dianalisis dg MF
ELISA (ELISA (Enzyme-linked Enzyme-linked Immunosorbent AssayImmunosorbent Assay))
► Salah satu metode untuk mengukur secara Salah satu metode untuk mengukur secara kualitatif maupun kuantitatif kadar antigen kualitatif maupun kuantitatif kadar antigen atau antibodi, hormon, Interleukin dengan atau antibodi, hormon, Interleukin dengan menggunakan enzim sebagai label menggunakan enzim sebagai label
► Pengembangan dari deteksi Pengembangan dari deteksi imunofluoresens dan radioaktifimunofluoresens dan radioaktif
► Dewasa ini metode ELISA merupakan Dewasa ini metode ELISA merupakan metode yang banyak digunakan di metode yang banyak digunakan di laboratorium dan dalam berbagai laboratorium dan dalam berbagai penelitian di bidang imunologi. penelitian di bidang imunologi.
1. Memiliki sensitivitas yang tinggi2. Lebih spesifik3. Peralatan yang dibutuhkan relatif
lebih sedikit
Sensitivitas uji ELISA dipengaruhi oleh :1. Sifat dan berat molekul antigen2. Afinitas reaksi antigen – antibodi3. Perbandingan kadar antigen –
antibodi
1. Direct ELISA2. Indirect ELISA3. Sandwich ELISA
Prinsip:a. Ag + Ab (dilabel alkaline phospatase/peroxydase): Directb. Ag + Ab + Konjugate (dilabel Alkaline phospatase/peroxydase): Indirect
Prinsipnya:Antigen + Antibodi yang dilabel (HRP-peroxidase, Alkaline phosphatase)
Sampel : plasma, serum, cairan cerebrospinal, liquor, cairan hibridoma, cairan ketuban, homogenat jaringan, feces, urine
Kerugian: sulit ab primer dilabel, banyak ab nonspesifik terlabel, kurang spesifik
Keuntungan: tidak diperlukan purifikasi ab primer
1. Coating antigen dengan buffer coating 4oC, 24 h
2. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%3. Blocking dengan BSA 1% atau creamer 4%
dan inkubasikan 45 men pada temp 37oC4. Cuci seperti ad 2.5. Tambahkan antibodi (sampel) yang sudah
dilabel dan inkubasikan 45 men pada temp 37oC
6. Cuci seperti ad 27. Tambahkan substrat (OPD/NPP)8. Stop dengan HCL 1N/NaOH9. Baca dengan Elisa reader dg panjang
gelombang 450 (cat. Perlu optimasi)
Ag + Ab + Konjugate (dilabel Alkaline phosphatase/peroxydase)
Sampel: plasma, serum, cairan cerebrospinal, liquor, cairan hibridoma, cairan ketuban, homogenat jaringan, feces, urine
Kerugian : lebih lama, biaya tinggi Keuntungan: lebih spesifik, dan sensitif
1. Coating antigen dengan buffer coating pada temp 4oC selama 24 jam
2. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%3. Blocking dengan BSA 1% atau creamer 4% dan
inkubasikan 45 men pada temp 37oC4. Cuci seperti ad 2.5. Tambahkan antibodi (sampel) dan inkubasikan
45 men pada temp 37oC6. Cuci seperti ad 2.7. Tambahkan konjugat Fab-α- IgG HRP-Peroxidase
/alakaline phosphatasedan inkubasikan 45 men pada temp 37oC
8. Cuci seperti ad 2.9. Stop dengan HCL 1N/NaOH10. Baca dengan Elisa reader dg panjang
gelombang 450 (cat. Perlu optimasi)
1. Coating pada mikroplate ab monoklonal temp. 4oC, 24 h2. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%3. Blocking dengan BSA 1% atau creamer 4% dan
inkubasikan 45 men pada temp 37oC4. Tambahkan antigen dengan buffer coating pada temp 4oC
selama 24 jam5. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%6. Tambahkan antibodi (sampel) dan inkubasikan 45 men
pada temp 37oC7. Cuci seperti ad 2.8. Tambahkan konjugat Fab IgG HRP-Peroxidase /alakaline
phosphatasedan inkubasikan 45 men pada temp 37oC9. Cuci seperti ad 2.10. Stop dengan HCL 1N/NaOH11. Baca dengan Elisa reader dg panjang gelombang 450
(cat. Perlu optimasi)