perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id analisis .../analisis...hepatitis b sangat mudah mengalami...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

ANALISIS MOLEKULER REGIO CORE PROMOTER DAN

PRECORE/CORE ISOLAT VIRUS HEPATITIS B 09IDSKAB-3

SKRIPSI

Untuk Memenuhi Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

IBNU YUDISTIRO

G.0009103

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

Surakarta

2012


commit to user

iv

ABSTRAK

Ibnu Yudistiro, G0009103, 2012. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan

Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B 09IDSKAB-3. Skripsi. Fakultas

Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Latar belakang: Infeksi Virus Hepatitis B (VHB) menjadi salah satu masalah

utama kesehatan di dunia karena memiliki angka kematian yang tinggi. Virus

hepatitis B sangat mudah mengalami mutasi karena bereplikasi melalui transkripsi

balik. Mutasi VHB sering ditemukan pada regio core promoter dan precore/core.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data molekuler dan variasi genetik pada

regio tersebut dengan isolat VHB 09IDSKAB-3.

Metode: Penelitian yang bersifat eksploratif ini dilaksanakan di Laboratorium

Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Ekstraksi

DNA dilakukan pada sampel dengan HBsAg positif yang diambil dari Komunitas

Man Sex with Man. Proses amplifikasi dengan PCR menggunakan primer KL-28

dan KL-6 kemudian dilakukan penentuan sekuens nukleotida pada regio tersebut.

Analisis molekuler dilakukan dengan aplikasi MEGA 4.0.

Hasil: Berdasarkan hasil analisis BLAST, isolat VHB 09IDSKAB-3 memiliki

skor BLAST tertinggi dengan isolat AP011085 yang berasal dari DKI Jakarta.

Ditemukan variasi genetik A1726C pada regio core promoter, T1860C, C1877T,

dan G1957C pada regio precore/core.

Simpulan: Isolat VHB 09IDSKAB-3 termasuk dalam kategori HBV genotipe B

subgenotipe B3 berdasarkan regio core promoter dan precore/core. Variasi

genetik yang terdapat pada isolat sampel mungkin mempengaruhi proses replikasi

dan produksi HBeAg/HBcAg, sehingga membutuhkan penelitian lebih lanjut.

Kata kunci: regio core promoter dan precore/core, isolat VHB 09IDSKAB-3,

analisis molekuler


commit to user

v

ABSTRACT

Ibnu Yudistiro, G0009103, 2012, Molecular Analysis of Core Promoter and

Precore/Core Regions of 09IDSKAB-3 Hepatitis B Virus Isolate. Mini Thesis,

Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.

Background: Hepatitis B virus (HBV) infection is a major health problem

leading to significant morbidity and mortality worldwide. HBV replicates its

DNA genome through reverse transcription from RNA intermediate. It is

vulnerable to a high number of mutations during such reverse transcription which

are frequently found in core promoter and precore/core regions. This study was

aimed to identify genetic variation of core promoter and precore/core regions of

09IDSKAB-3 HBV isolate.

Methods: This was an explorative experiment. DNA extraction was performed on

09IDSKAB-3 blood sample that was taken from Man Sex with Man Community.

Core promoter and precore/core regions were determined by PCR using KL-28

and KL-6 primers and direct sequencing of the corresponding region. Molecular

analysis was performed using MEGA 4.0.

Result: Based on BLAST result, 09IDSKAB-3 HBV isolate had the highest

similarity to isolate AP011085 from DKI Jakarta. Genetic variations A1726C in

core promoter, and T1860C, C1877T, G1957C in precore/core regions were found

in 09IDSKAB-3 isolate.

Conclusion: 09IDSKAB-3 HBV isolate was classified into genotype B and

subgenotype B3 based on core promoter and precore/core region. The genetic

variations found in this isolate may have influence to the replication efficiency

and HBeAg/HBcAg production, therefore need further study.

Keywords : core promoter and precore/core regions, 09IDSKAB-3 HBV isolate,

molecular analysis


commit to user

vi

PRAKATA

Puji syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT karena atas

karuniaNya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul ”Analisis

Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B

09IDSKAB-3”. Penelitian dan penulisan skripsi ini dapat terlaksana dengan baik

berkat bantuan, bimbingan, dan petunjuk dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis

ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Zainal Arifin A, dr., Sp.PD (KR), FINASIM, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

2. Muthmainah, dr., M. Kes, selaku Ketua Tim Skripsi FK UNS.

3. Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D selaku Pembimbing Utama atas bimbingan

dalam penyusunan skripsi ini.

4. Yulia Sari, S.Si., M.Si selaku Pembimbing Pendamping atas bimbingan dalam

penyusunan skripsi ini.

5. Hudiyono, Drs., M.Si selaku Penguji Utama yang telah memberikan

bimbingan, kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.

6. Leli Saptawati, dr., Sp.MK selaku Penguji Pendamping yang telah

memberikan bimbingan, kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi

ini.

7. Seluruh Dosen dan Staf Laboratorium Biomedik dan Mikrobiologi FK UNS.

8. Bagian Skripsi FK UNS yang turut memberi kelancaran pembuatan skripsi ini.

9. Ayahanda Suparmo, Ibunda Suharti serta adik-adikku yang sangat kucintai

dan kusayangi Azizah Muthi’ah dan Izzatunnisa Istiqomah. Keluargaku yang

selalu mendoakanku agar menjadi dokter yang baik.

10. Teman-teman Avicenna dan Wienda yang telah memberikan banyak bantuan

demi kelancaran skripsi ini.

11. Teman-teman seperjuangan dalam skripsi, Angga Dwi Prasetyo, Raden

Arteswara, Martinus Nuherwan, yang bahu membahu hingga selesainya

skripsi ini.

12. Teman-teman dan pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang

turut mendukung skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh

dari kata sempurna. Penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun

demi kebaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat

bermanfaat bagi dunia kedokteran umumnya dan pembaca khususnya.

Surakarta, Juni 2012

Ibnu Yudistiro


commit to user

vii

DAFTAR ISI

PRAKATA .................................................................................................... vi

DAFTAR ISI .............................................................................................. vii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ...................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xi

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang .................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ............................................................ 3

C. Tujuan Penelitian ................................................................ 3

D. Manfaat Penelitian .............................................................. 3

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka ................................................................. 4

1. Virus Hepatitis B ............................................................. 4

2. Gen Core . ........................................................................ 5

3. Regio Core Promoter ...................................................... 7

B. Kerangka Pemikiran ............................................................ 8

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian .................................................................... 9

B. Lokasi Penelitian ................................................................. 9

C. Objek Penelitian .................................................................. 9

D. Rancangan Penelitian .......................................................... 9

E. Instrumen Penelitian ............................................................ 10

1. Alat ................................................................................. 10

2. Bahan .............................................................................. 10

F. Cara Kerja ........................................................................... 11

1. Ekstraksi DNA HBV ........................................................ 11

2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR ........................................ 13

3. Sekuensing dan Analisis Data .......................................... 13


commit to user

viii

BAB IV HASIL PENELITIAN

A. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core 15

B. Variasi Genetik Regio Core promoter dan Precore/Core ...... 18

BAB V PEMBAHASAN

A. Regio Core Promoter Isolat 091DSKAB-3 ........................... 19

B. Regio Precore/Core Isolat 091DSKAB-3 ............................. 20

BAB VI PENUTUP

A. SIMPULAN ........................................................................ 26

B. SARAN .... ........................................................................... 26

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 27

LAMPIRAN


commit to user

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Virus Hepatitis B (VHB) merupakan salah satu virus penyebab hepatitis

pada manusia. Diperkirakan dua milyar penduduk dunia telah terinfeksi VHB

dan 350 juta jiwa di antaranya menjadi kronis, dan 600 ribu orang

diantaranya meninggal setiap tahun akibat VHB terkait sirosis hepatis dan

atau karsinoma hepatoseluler (WHO, 2009; Yu et al., 2010). Hepatitis B

merupakan penyakit endemik, terutama di negara berkembang dengan

populasi penduduk yang tinggi. Indonesia termasuk negara dengan kategori

intermediate to high endemic region dengan prevalensi HBsAg mencapai

5,1% dari populasi umum (Hasan, 2005). Sebanyak 13 juta penduduk

Indonesia merupakan penderita hepatitis B (Sekretariat Jenderal Kementerian

Kesehatan RI, 2011).

VHB merupakan virus DNA yang bereplikasi melalui transkripsi balik

dari RNA intermediate. Selama proses transkripsi balik tersebut, proses

mutasi genetik sangat rawan terjadi dengan angka mutasi mencapai satu

nukleotida/10.000 basa/tahun infeksi (Alexopoulou, 2009; Hunt et al., 2000).

Mutasi genetik VHB sering terjadi pada regio core promoter dan

precore/core (gen C).

Beberapa mutasi yang terjadi pada core promoter dan precore/core (gen

C) terkait dengan perubahan manifestasi klinis hepatitis B (Lin dan Kao,


commit to user

2

2011). Pasien yang terinfeksi oleh mutan tersebut cenderung mengalami

nekroinflamasi dan fibrosis hati yang lebih parah daripada pasien yang

terinfeksi VHB wild type (Al-Mahtab et al., 2007). Di samping itu, mutasi

genetik pada regio core promoter dan precore/core juga berpengaruh

terhadap proses perjalanan penyakit dan terapi hepatitis (Wang et al., 2005)

Oleh karena itu, analisis molekuler mengenai regio core promoter dan

precore/core diperlukan untuk memperoleh data mengenai variasi genetik

serta pengaruhnya pada penyakit hepatitis B.

Studi yang terkait dengan analisis regio core promoter dan precore/core

telah banyak dilakukan oleh peneliti di seluruh dunia. Publikasi mengenai

analisis molekuler regio core promoter dan precore/core dalam Pubmed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/) mencapai 880 publikasi di seluruh

dunia hingga Juni 2012, namun hanya terdapat lima publikasi yang dilakukan

di Indonesia (Heriyanto et al., 2012; Juniastuti et al., 2010; Utama et al.,

2009a, 2009b, 2011).

Pada penelitian ini kami melakukan analisis molekuler regio core

promoter dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 yang berasal dari Provinsi

Jawa Tengah. Data molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini

diharapkan dapat digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai virulensi,

strategi replikasi, patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi VHB terutama

di Indonesia.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


commit to user

3

B. Rumusan Masalah

Bagaimanakah analisis molekuler regio core promoter dan precore/core

virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3?

C. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data molekuler regio core

promoter dan precore/core virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3.

D. Manfaat Penelitian

1. Aspek teoritis

Manfaat penelitian ini adalah untuk mengetahui data molekuler regio

core promoter dan precore/core virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3.

2. Aspek aplikatif

Analisis molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini dapat

digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai strategi replikasi,

patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi VHB terutama di Indonesia.


commit to user

4

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Virus Hepatitis B

Virus hepatitis B merupakan kelompok virus DNA dan termasuk

dalam famili Hepadnaviridae. Virus hepatitis B diklasifikasikan menjadi 8

genotipe (A-H) berdasarkan perbedaan 8% atau lebih dalam urutan

nukleotida genom intergrup atau perbedaan 4% atau lebih dalam urutan

nukleotida gen S. Genotipe A, B, C, D, E, dan F dibagi menjadi

subgenotipe masing-masing berdasarkan perbedaan 4% atau lebih dalam

urutan nukleotida intragenotipe (Kurbanov et al., 2010).

Virion VHB atau disebut juga partikel dane, memiliki struktur

seperti bola dengan diameter 42 nm. Virion terdiri dari partikel genom

(DNA) untai ganda dan kapsid yang tersusun atas protein core

nukleokapsid dengan diameter 27 nm yang disebut dengan antigen core

VHB (HBcAg) (Seeger et al., 2007). HBcAg dikelilingi oleh mantel luar

lipoprotein yang disebut antigen surface (HBsAg) (Patient et al., 2009).

Genom VHB merupakan virus DNA kecil berukuran 3,2 kb yang

terbentuk dari transkripsi balik RNA intermediate (Seeger et al., 2007).

DNA VHB memiliki untai positif dan untai negatif. Untai positif DNA

terletak di sebelah dalam, dengan panjang 2/3 dari panjang genom.

Sedangkan untai negatif merupakan untai penuh yang terletak di sebelah


commit to user

5

luar (Seeger et al., 2007). Untai negatif menyandi empat Open Reading

Frame (ORF) yang letaknya saling tumpang tindih: ORF S untuk gen S

(surface), ORF C untuk gen C (core), ORF X untuk gen X, dan ORF P

untuk gen P (polymerase) (Liang, 2009) (Gambar 2.1). Keempat ORF

pada genom VHB dikontrol oleh empat promoter (promoter pre-S1, pre-

S2, core dan x) dan dua enhancer (Enh1 dan Enh2). Enhancer berfungsi

dalam pengaturan transkripsi RNA dan sinyal poliadenilasi yang

dibutuhkan untuk replikasi DNA (Seeger et al., 2007).

Gambar 2.1 Susunan genom VHB (genotipe A)

2. Gen Core

Gen core terdiri dari dua regio: regio precore (nukleotida 1814-

1900) dan regio core (nukleotida posisi 1901-2449) (Gambar 2.2). ORF C

merupakan penyandi HBcAg dan HBeAg, sehingga memiliki dua kodon


commit to user

6

inisiasi untuk pembentukan dua protein yang memiliki fungsi berbeda

tersebut. Produk translasi dari kodon inisiasi yang pertama menghasilkan

protein precore/core yang merupakan prekursor dari HBeAg, sedangkan

translasi kodon inisiasi yang kedua menghasilkan HBcAg (Alexopoulou,

2009).

HBcAg atau protein core merupakan protein utama nukleokapsid

(Patient et al., 2009). Terbentuknya nukleokapsid diawali oleh ikatan

polimerase virus pada stem loop struktur yang terdapat pada 5’end RNA

pregenomic (Alexopoulou, 2009). Protein core tersusun dari 183-185 asam

amino dengan berat molekul 21 kD (Seeger et al., 2007). Produk kedua

dari gen core adalah HBeAg yang merupakan hasil translasi dari mRNA

precore di lumen retikulum endoplasma. HBeAg memiliki berat molekul

yaitu 15 kD (Seeger et al., 2007). HBeAg merupakan antigen yang

ditampilkan di permukaan hepatosit dan merupakan antigen sasaran dari

imunitas humoral tubuh, dalam hal ini anti-HBe. Sehingga, keberadaan

HBeAg penting untuk diagnosis dan eliminasi virus di dalam tubuh

(Soewignjo, 2008).

Gambar 2.2 Gen core (dengan nomor posisi nukleotida).

core


commit to user

7

3. Regio Core Promoter

Core promoter memiliki peran yang sangat penting dalam proses

replikasi VHB, yaitu sebagai penginisiasi transkripsi untuk pembentukan

precore mRNA dan pregenomic RNA (pgRNA). Aktivitas core promoter

diatur oleh elemen enhancer II (EnII) yang terletak pada nukleotida 1685-

1773 (Alexopoulou, 2009). Core promoter tersusun atas Core Upstream

Regulatory Sequences (CURS) dan Basic Core Promoter (BCP). CURS

terbagi menjadi dua regio, yaitu regio A (nukleotida 1636-1703) dan B

(nukleotida 1704-1743), yang berfungsi menstimulasi aktivitas BCP (Yuh

et al., 1992). Regio BCP (nukleotida 1744-1851) terletak tumpang tindih

dengan 3’end gen X dan 5’end regio precore. Regio BCP memiliki elemen

cis-acting yang berfungsi mengatur reverse transcriptase pgRNA dan

precore mRNA (Alexopoulou, 2009). pgRNA berfungsi sebagai cetakan

untai negatif DNA VHB dan hasil translasinya akan membentuk protein

core (HBcAg) dan protein polimerase. Hasil translasi precore mRNA akan

membentuk HBeAg.


commit to user

8

B. Kerangka Pemikiran

Kandidat

diagnostik

Isolat VHB

Sekuensing

Kloning gen penyandi regio core promoter

dan precore/core

Analisis molekuler regio core promoter dan

precore/core

Vaksin Kandidat

diagnostik

Ekspresi mutasi pada

regio core promoter

Fokus Penelitian

Ekspresi mutasi pada

regio precore/core

Vaksin


commit to user

9

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini bersifat eksploratif.

B. Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret.

C. Objek Penelitian

Objek penelitian adalah aliquot sampel HBsAg positif 09IDSKAB-3.

D. Rancangan Penelitian

+

PCR

Sekuensing

Analisis regio core promoter

dan precore/core

Isolasi DNA

Sampel darah dari Komunitas Man Sex with Man.

Tes serologi HBsAg

-


commit to user

10

E. Instrumen Penelitian

1. Alat penelitian:

a. Centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman); b. Thermocycler

(Eppendorf, Hamburg, Jerman); c. Micropipet (P1000, P200, P10)

(Gilson, Wisconsin, USA); d. Vortex (Thermo Fisher Scientific,

Massachusetts, USA); e. Microwave (Panasonic, Osaka, Jepang); f.

Deepfreezer (New Brunswick Scientific, New Jersey, USA ); g.

Tube rack; h. Apparatus elektroforesis (chamber, comb, dan power

supply) (BioRad, California, USA); i. Gel documentation (BioRad,

California, USA); j. Autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang); k.

Refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang); l. Class II safety cabinet

(ESCO, Oregon, USA); m. Digital scale (Mettler Toledo,

Greifensee, Switzerland); n. Magnetic stirrer (Cimarex, Colorado,

USA); o. Glove; p. Masker; q. Tissue

2. Bahan penelitian:

a. 96-100% etanol; b. Sampel untuk isolasi DNA; c. Phosphate

Buffered Saline (PBS); d. Lysozyme dan lysozyme digestion buffer

(25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM EDTA, 1% Triton X-100); e. 3 M

natrium asetat (pH 5-5.5) dan 2.8 ml isopropanol; f. Tabung

microcentrifuge steril; g. Water bath atau heat blocks; h. PureLink™

Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen, California, USA); h.

Proteinase K (20 mg/ml); i. RNase A (20 mg/ml); j. GoTaq® Green


commit to user

11

Master Mix, 2X (Promega, Wisconsin, USA); k. Nuclease-free

water; l. Ethidium Bromide (EtBr).

F. Cara kerja

1. Ekstraksi DNA VHB

Prosedur penggunaan PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit:

a. Lysate dipersiapkan.

b. Binding DNA.

1) PureLink™ spin column dipindahkan ke dalam collection tube.

2) Lysate (~640 μl) dengan lysis/binding buffer dan etanol

dimasukkan ke dalam PureLink™ spin column.

3) Column dipusingkan dengan 10.000 g selama satu menit pada suhu

ruangan.

4) Collection tube dibuang dan spin column ditempatkan ke dalam

collection tube baru.

c. Pembilasan DNA

1) Column dibilas dengan 500 μl wash buffer 1 yang disiapkan

dengan etanol.

2) Column dipusingkan pada 10.000 g selama satu menit pada suhu

ruangan. Kemudian collection tube dibuang dan ditempatkan pada

collection tube baru.

3) Column dicuci dengan menggunakan 500 μl wash buffer 2 yang

disiapkan dengan etanol.


commit to user

12

4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama tiga menit

pada suhu ruangan, kemudian collection tube dibuang.

d. Eluting DNA

1) Spin column ditempatkan di dalam 1,5 ml microcentrifuge tube

steril.

2) DNA dielusikan menggunakan 25-200 μl PureLink™ Genomic

elution buffer.

3) Column diinkubasi pada temperatur ruangan selama satu menit.

4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama satu menit

pada suhu ruangan.

2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR

Hasil ekstraksi digunakan sebagai cetakan/template untuk amplifikasi

regio core promoter dan precore/core. Proses amplifikasi dan PCR

menggunakan GoTaq® Green Master Mix.

a. GoTaq® Green Master Mix dicairkan dengan temperatur ruangan.

b. Reaksi campuran disiapkan di es.


commit to user

13

Tabel 3.1 Komponen yang digunakan dalam PCR.

Komponen Jumlah

GoTaq® Green Master Mix, 2X 12.5 μl

Upstream primer, 10μM (KL6) 1 μl

Downstream primer, 10μM (KL28) 1 μl

DNA template 5 μl

Nuclease-Free Water 20 μl

Kemudian dilakukan proses preheated pada suhu 94ºC selama 5

menit, selanjutnya dilakukan 40 kali siklus PCR yang terdiri dari :

Tabel 3.2 Tahapan, suhu, dan durasi dalam siklus PCR.

Tahapan Siklus Suhu Durasi

Denaturasi 94ºC Satu menit

Annealing 55ºC Satu menit

Ekstensi 72ºC Dua menit

Regio core promoter dan precore/core diamplifikasi dengan PCR

menggunakan primer KL-28 dan KL-6 (Okamoto et al., 1990). Hasil

dibaca pada gel agarose 2% yang dicat dengan ethidium bromide (Lusida

et al., 2008).

3. Sekuensing dan Analisis Data

Sekuens nukleotida dari hasil amplifikasi ditentukan menggunakan

Big Dye Deoxy Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems,


commit to user

14

Foster City, CA) dan ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin Elmer). Data

sekuens yang diperoleh didaftarkan di National Center for Biotechnology

Information GenBank database dengan accession number JQ965948. Data

tersebut dibandingkan dengan data molekuler VHB di

GenBank/DDBJ/EMBL dan dianalisis menggunakan aplikasi MEGA 4.0

(Tamura et al., 2007). Multiple alignments dilakukan dengan

menggunakan metode CLUSTAL W (Lampiran 3-5). Phylogenetic tree

dibuat menggunakan metode Neighbor-Joining, Kimura Two-Parameter

dan Bootstrap 1000 Replication.


commit to user

15

BAB IV

HASIL PENELITIAN

A. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core

Untuk mendapatkan informasi dan data molekuler, isolat 09IDSKAB-3

dibandingkan dengan isolat lain di seluruh dunia yang sudah terdaftar di

dalam GenBank/DDBJ/EMBL. Isolat 09IDSKAB-3 dibandingkan dengan

reference isolates (genotipe A-H) dan isolat hasil analisis BLAST.

Isolat 091DSKAB-3 memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat

AP011085 yang berasal dari DKI Jakarta (Lampiran 2). Sedangkan reference

isolates dari genotipe A-H yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat

pada tabel 4.1.

Tabel 4.1 Daftar reference isolates.

No. Genotipe/

Subgenotipe

Accession

Number No.

Genotipe/

Subgenotipe

Accession

Number

1 A S50225 11 C4 AB04870

2 B1 AB010291 12 C5 AB241110

3 B2 AF 282917 13 C6 AB493841

4 B3 AB033555 14 D1 AY161157

5 B4 AY031267 15 D2 X72702

6 B5 AB219427 16 E X75657

7 B6 DQ463789 17 F X69798

8 C1 AB074756 18 G AF160501

9 C2 AF533983 19 H AY090454

10 C3 X75656


commit to user

16

Berdasarkan sekuens nukleotida regio core promoter dan precore/core,

isolat 09IDSKAB-3 dapat dikategorikan dalam VHB genotipe B dan

subgenotipe B3. Hal tersebut dapat dilihat dalam phylogenetic tree pada

gambar 4.1.

Gambar 4.1 Phylogenetic tree, berdasarkan sekuens nukleotida regio core

promoter dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 dibandingkan

dengan reference isolates genotipe A-H.

Keterangan: : Isolat sampel. : Isolat hasil analisis BLAST.


commit to user


commit to user

17

Analisis isolat 09IDSKAB-3 juga dilakukan pada tingkat asam amino

dan nukleotida. Hal ini diperlukan untuk mengetahui variasi genetik yang

terdapat pada regio core promoter dan precore/core dari isolat tersebut. Hasil

dari multiple alignment pada regio core promoter, precore dan core dapat

dilihat pada gambar 4.2-4.4.

Gambar 4.2 Hasil multiple alignment regio core promoter VHB isolat

09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences (aa

80-146).

Gambar 4.3 Hasil multiple alignment regio precore pada VHB isolat

09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences

yang memiliki genotipe sama (aa 1-29).

Gambar 4.4 Hasil multiple alignment regio core pada VHB isolat

09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences (aa

30-53).


commit to user

18

B. Variasi Genetik Regio Core Promoter dan Precore/Core

Berdasarkan hasil multiple alignment isolat 09IDSKAB-3 dengan

reference isolate (isolat AB033555), pada regio core promoter ditemukan

adanya subtitusi basa nukleotida 1726 dari adenine menjadi cytosine

(A1726C). Variasi genetik ini menyebabkan perubahan kodon 118 sehingga

asam amino aspargine berubah menjadi threonine (N118T).

Pada regio precore ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1860

dari thymine menjadi cytosine (T1860C). Variasi ini menyebabkan perubahan

kodon 16 dari asam amino isoleusine menjadi threonine (I16T). Selain itu

ditemukan pula subtitusi basa cytosine menjadi thymine pada nukleotida 1877

(C1877T) pada regio precore. Namun, subtitusi ini tidak menyebabkan

perubahan asam amino pada isolat sampel (silent mutation).

Pada regio core ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1957 dari

guanine menjadi cytosine (G1957C). Variasi genetik ini menyebabkan

perubahan kodon 48 sehingga asam amino leusine berubah menjadi

phenylalanine (L48F).


commit to user

19

BAB V

PEMBAHASAN

Berdasarkan phylogenetic tree, sekuens nukleotida regio core promoter

dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 dapat dikategorikan dalam VHB

genotipe B dan subgenotipe B3.

Berdasarkan hasil analisis BLAST, isolat 09IDSKAB-3 memiliki

kemiripan sekuens nukleotida tertinggi dengan isolat AP011085. Isolat

AP011085 merupakan isolat yang berasal dari DKI Jakarta yang juga

dikategorikan dalam VHB genotipe B dan subgenotipe B3. Menurut

Mulyanto et al. (2009) VHB genotipe B subgenotipe B3 merupakan genotipe

yang berasal dari Indonesia. Hingga saat ini belum ada laporan yang

menyatakan adanya penemuan VHB genotipe B subgenotipe B3 di negara

lain selain di Indonesia. Lusida et al. (2008) dalam penelitiannya mengenai

distribusi genotipe dan subgenotipe VHB di Indonesia, mengemukakan

bahwa ternyata VHB genotipe B merupakan kelompok genotipe yang

terdistribusi dominan di wilayah barat Indonesia (Jawa dan Sumatera),

sedangkan yang terdistribusi dominan di wilayah timur Indonesia (Papua)

adalah kelompok genotipe C dan D. Hal tersebut sesuai dengan hasil

penelitian ini, bahwa isolat 09IDSKAB-3 yang berasal dari Jawa Tengah

termasuk dalam kategori VHB genotipe B subgenotipe B3.


commit to user

20

A. Regio Core Promoter Isolat 09IDSKAB-3

Core promoter memiliki peran yang sangat penting dalam proses

replikasi VHB, yaitu sebagai penginisiasi transkripsi untuk pembentukan

precore mRNA dan pregenomic RNA (pgRNA). Aktivitas core promoter

diatur oleh elemen enhancer II (EnII) yang terletak pada nukleotida 1685-

1773 (Alexopoulou, 2009). Core promoter tersusun atas Core Upstream

Regulatory Sequences (CURS) dan Basic Core Promoter (BCP). CURS

terbagi menjadi dua regio, yaitu regio A (nukleotida 1636-1703) dan B

(nukleotida 1704-1743), yang berfungsi menstimulasi aktivitas BCP. Regio

BCP (nukleotida 1744-1851) terletak tumpang tindih dengan 3’ end gen X

dan 5’ end regio precore (Yuh et al., 1992). Regio BCP memiliki elemen cis-

acting yang berfungsi mengatur reverse transcriptase pgRNA dan precore

mRNA (Alexopoulou, 2009). pgRNA berfungsi sebagai cetakan untai negatif

DNA VHB dan hasil translasinya akan membentuk protein core (HBcAg) dan

protein polimerase, sedangkan hasil translasi precore mRNA akan

membentuk HBeAg. Oleh sebab itu, mutasi yang terjadi pada regio core

promoter dapat menyebabkan dampak klinis terhadap sel penjamu karena

terjadi perubahan transkripsi precore mRNA dan pgRNA VHB (Tatsukawa et

al., 2011).

Mutasi yang sering terjadi pada regio core promoter adalah mutasi

ganda A1762T/G1764A pada BCP. Mutasi A1762T menyebabkan perubahan

kodon 130 sehingga asam amino lysine berubah menjadi methionine

(K130M), sedangkan mutasi G1764A menyebabkan perubahan kodon 131


commit to user

21

sehingga asam amino valine berubah menjadi isoleusine (V131I) (Juniastuti

et al., 2010). Pengaruh biologis mutasi ganda VHB masih belum diketahui,

tetapi mutasi tersebut sering ditemukan pada berbagai macam keadaan infeksi

VHB. Hingga saat ini pengaruh yang sudah jelas diketahui adalah penurunan

produksi HBeAg dan peningkatan replikasi virus (Buckwold et al., 1996; Li

et al., 1999). Penurunan produksi HBeAg disebabkan penurunan produksi

precore mRNA, yang di sisi lain ternyata menyebabkan peningkatan produksi

pgRNA, proses enkapsidasi, dan protein core yang akan mengakibatkan

peningkatan replikasi virus. Beberapa penelitian melaporkan mutasi ganda ini

dapat menyebabkan terjadinya status HBeAg negatif (Horikita et al., 1994;

Hou et al., 1999; Okamoto et al., 1994). Ditinjau dari manifestasi klinis,

mutasi ini ditemukan secara signifikan pada pasien hepatitis B kronis,

hepatitis fulminan, dan karsinoma hepatoseluler (Baumert et al., 1996;

Buckwold et al., 1996).

Hasil analisis pada isolat 09IDSKAB-3 tidak ditemukan adanya mutasi

ganda BCP, sehingga faktor risiko isolat 09IDSKAB-3 terhadap hepatitis B

kronis, hepatitis fulminan, dan karsinoma hepatoseluler maupun terkait

dengan status HBeAg negatif tidak ada.

Mutasi yang ditemukan pada isolat 09IDSKAB-3 adalah mutasi

A1726C yang menyebabkan perubahan asam amino aspargine menjadi

threonine (N118T). Nukleotida 1726 terletak pada CURS, sehingga mutasi

ini mungkin akan menyebabkan terganggunya aktivitas BCP yang berdampak

pada gangguan proses replikasi virus. Menurut penelitian Yin et al. (2011)


commit to user

22

mutasi A1726C spesifik ditemukan pada keadaan klinis sirosis hepatis,

sehingga isolat 09IDSKAB-3 kemungkinan memiliki faktor risiko terhadap

sirosis hepatis dan mengalami perubahan pada proses replikasinya.

B. Regio Precore/Core (Gen Core) Isolat 09IDSKAB-3

Regio precore/core memiliki dua start codon yang menginisiasi

pembentukan dua protein yang berbeda. Inisiasi AUG (start codon) yang

pertama akan membentuk protein protein precore/core yang merupakan

prekursor HBeAg, sedangkan yang kedua akan membentuk protein core

(HBcAg) (Alexopoulou, 2009).

HBeAg merupakan protein VHB yang beredar di dalam darah dan

diproduksi ketika virus dalam fase replikasi, sedangkan HBcAg merupakan

protein penyusun nukleokapsid virus (Liang, 2009). Dalam pembentukan

virion VHB, protein core akan menyelubungi pgRNA dan polimerase yang

dikenal sebagai proses enkapsidasi. Proses enkapsidasi diinisiasi penempelan

polimerase pada sinyal enkapsidasi (ε), yaitu sebuah struktur berbentuk stem

loop yang terletak pada ujung 5’ pgRNA. Selain berfungsi dalam pengepakan

pgRNA, sinyal enkapsidasi berperan dalam menginisisasi proses transkripsi

(Alexopoulou, 2009).

Mutasi regio precore/core yang paling sering ditemukan dan dilaporkan

adalah mutasi G1896A. Mutasi ini menyebabkan perubahan asam amino

tryptophan menjadi stop codon sehingga terjadi kegagalan pembentukan

HBeAg (Okamoto et al., 1990). HBeAg tidak memiliki peran penting dalam

proses replikasi virus, tetapi diyakini bahwa HBeAg merupakan target


commit to user

23

imunitas humoral dan seluler, sehingga kegagalan pembentukan HBeAg

menyebabkan terbentuknya escape mutant yang berkontribusi terhadap

persistensi virus (Carman et al., 1993; Soewignjo, 2008). Mutagenesis dari

wild type menjadi mutan G1896A membutuhkan waktu beberapa tahun dan

prosesnya terjadi selama fase replikasi virus (Okamoto et al., 1990). Mutasi

ini dikaitkan dengan banyak kondisi klinis hepatitis, dari tingkatan ringan

hingga berat (Friedt et al.,1999; Juniastuti et al., 2010; Kao et al., 2000).

Kramvis dan Kew (2005) menyatakan bahwa faktor yang berkontribusi

terhadap frekuensi terjadinya mutasi ini adalah genotipe virus. Mutasi

G1896A dilaporkan hanya ditemukan pada pasien VHB dengan genotipe B,

D, E serta sebagian kecil genotipe C dan F. Genotipe tersebut memiliki basa

thymine pada nukleotida 1858 yang merupakan pasangan nukleotida 1896

pada stem loop pgRNA. Ikatan basa thymine-guanine yang tidak stabil,

memudahkan terjadinya mutasi yang membentuk ikatan basa thymine-

adenine yang lebih stabil yang dibutuhkan untuk membentuk sinyal

enkapsidasi yang lebih kuat. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar 5.1

(Alexopoulou, 2009).


commit to user

24

Gambar 5.1 Stem loop structure, perubahan ikatan T-G menjadi T-A

dibutuhkan untuk membentuk sinyal enkapsidasi yang lebih

kuat (Alexopoulou, 2009).

Mutasi lain regio precore yang menyebabkan hilangnya produksi

HBeAg adalah T1815C dan A1846T (Okamoto et al., 1990). Mutasi T1815C

menyebabkan hilangnya start codon karena asam amino methionine berubah

menjadi threonine. Mutasi A1846T tidak menyebabkan perubahan asam

amino (silent mutation). Namun demikian, Chen et al. (2006) dalam

penelitiannya menyatakan bahwa mutasi ini signifikan ditemukan pada pasien

dengan status HBeAg negatif.

Mutasi G1896A, T1815C, dan A1846T tidak ditemukan dalam

penelitian ini. Variasi nukleotida yang ditemukan pada regio precore adalah

subtitusi basa nukleotida 1860 dari thymine menjadi cytosine (T1860C) dan


commit to user

25

silent mutation C1877T. Subtitusi T1860C mungkin akan mengganggu proses

pembentukan HBeAg karena nukleotida 1860 terletak pada regio precore

yang hasil translasi akhirnya membetuk HBeAg. Sedangkan pada regio core

ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1957 dari guanine menjadi

cytosine (G1957C). Subtitusi ini mungkin akan mempengaruhi komposisi

nukleokapsid virus karena nukleotida 1957 terletak pada regio core yang

translasi akhirnya membentuk HBcAg.

Hingga saat ini belum ada penelitian yang melaporkan manifestasi dari

mutasi yang ditemukan pada regio precore/core isolat 09IDSKAB-3. Namun

ditinjau dari tidak ditemukannya mutasi G1896A, T1815C, dan A1846T

kemungkinan isolat 09IDSKAB-3 tidak terkait dengan status HBeAg negatif.


commit to user

26

BAB VI

PENUTUP

A. Simpulan

Berdasarkan regio core promoter dan precore/core, isolat

09IDSKAB-3 termasuk ke dalam kategori VHB genotipe B dan

subgenotipe B3. Sedangkan berdasarkan analisis BLAST, isolat

09IDSKAB-3 memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat AP11085

yang berasal dari DKI Jakarta dengan genotipe B subgenotipe B3.

Mutasi yang terjadi pada isolat 09IDSKAB-3 mungkin mempengaruhi

proses replikasi serta produksi HBcAg dan HBeAg virus.

B. Saran

Diperlukan penelitian lebih lanjut pada seluruh genom VHB untuk

mengetahui implikasi dari variasi nukeotida maupun asam amino isolat

09IDSKAB-3, terutama yang terkait dengan virulensi, replikasi,

patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id analisis .../analisis...hepatitis b sangat mudah mengalami...

Documents