dibawakan oleh : mastura (20504017) merry (20504009)

27 April 2005/ Metabolisme Glikogen/ Kel I/ Mastura (20504017)-Merry (20504009)

1/15

Mutasi Pada Gal83 Glycogen-Binding Domain Mengaktifkan Snf1/Gal83 Kinase Pathway Dengan Mekanisme Glycogen-Independent

Dibawakan Oleh :

Mastura (20504017)

Merry (20504009)


2/15

Pendahuluan Glycogen Storage


3/15

Glikogen penyimpan karbohidrat Glikogen jika glukosa ( fase eksponensial ) Glikogen jika glukosa ( fase stationer )

Saccharomyces cerevisiae Snf1 kinase homolog dengan mamalian AMP-activated protein kinase (AMPK)

Keduanya berperan dalam regulasi metabolisme glikogen


4/15

Snf1 kinase dan AMPK Catalytic subunit : -subunit Regulatory subunit : -subunit Mediates heterotrimer formation : -subunit

• Snf1 kinase-subunit : Snf1

-subunit : Snf4

-subunit : Gal83, Sip1, Sip2

Gal83 -subunit memediasi interaksi Snf1 dan Sip4


5/15

Latar Belakang

AMPK dan Snf1 kinase penting untuk regulasi metabolisme glikogen

-subunit AMPK terdiri dari N-isoamylase domain glikogen & enzim percabangan

Contoh :

Mutasi -subunit mempengaruhi glycogen storage glycogen storage disease


6/15

Tujuan

Untuk menentukan peran glycogen-binding domain pada -subunit in vivo

Untuk mengetahui pengaruhnya terhadap regulasi metabolisme glikogen

Menentukan mekanisme yang terjadi antara glycogen-binding domain dengan aktivitas Snf1 kinase/ AMPK


7/15

Metodologi Penelitian

Strains and genetic methods

Plasmids

Ekspresi GBD Gal83 & Sip2 pada bakteri

S. cerevisiae strains Medium yeast extract-peptone-dextrose

pRT12, pHW33, pHW39, pHW40 Gal83 pHW30, pHW35, pHW38 Sip2

Kultur ditumbuhkan (OD 600 nm) ekspresi protein pengambilan sel (sentrifugasi) dilisis (PBS) lisat (sentrifugasi dan kromatografi pada Ni-agarose


8/15

Inokulasi kultur mid-log sentrifugasi resuspensi dlm sodium karbonat ditempatkan dalam heating block glukosa yang dilepaskan dihitung menggunakan oksidasi glukosa oksidase

Glycogen-binding domain Gal83 atau Sip2 murni diinkubasi sentrifugasi supernatan dihilangkan, pellet dicuci identifikasi fraksi dengan elektroforesis immunoblotting

Uji Pengikatan Glikogen

Uji Kandungan Glikogen

Immunoblot analysis

Microscopy

Protein dipisahkan oleh SDS-Page dideteksi oleh anti-GFP antibodi

Nikon Eclipse E800 fluorescence microscope


9/15

Kinase assays

-Galactosidase assays

Preparation of RNA and Northern blot analysis

Sel ditumbuhkan dalam SC inkubasi filtrasi kromatografi uji aktivitas melalui fosforilasi SAMS peptide

Transforman SC glukosa SC gliserol Aktivitas -Galactosidase diuji

RNA diendapkan dengan etanol elektroforesis dilacak dengan 32P-labeled DNA


10/15

Hasil Penelitian

Mutasi Gal83 & Sip2 menghasilkan Gal83W184A,R214Q dan Sip2W186A,R216Q

Mutasi residu pada GBD meniadakan pengikatan glikogen


11/15

Double mutasi sip2gal83 akumulasi glikogen

Mutasi Gal83 GBD akumulasi glikogen


12/15

Level protein

Distribusi nukleoplasmik

Aktivitas katalitik Snf1


13/15

Mutasi Gal83 meningkatkan ekspresi RNA yang mengkode Glycogen Synthase

Mutasi GBD mempengaruhi Snf1/Gal83 pada sel yang tidak mengandung glikogen


14/15

Kesimpulan Mutasi Gal83 GBD mempengaruhi

secara positif fungsi Snf1/Gal83 kinase

GBD mengatur fungsi Snf1/Gal83 kinase dengan mekanisme yang tidak bergantung pada glikogen

Adanya kemungkinan bahwa domain mengikat molekul lain yang mirip glikogen yang dapat mengatur aktivitas katalitik


15/15

Terima Kasih

dibawakan oleh : mastura (20504017) merry (20504009)

Documents