BAB VIII BIOSINTESIS PROTEIN Asam deoksiribonukleat (DNA) adalah pembawa informasi genetic di dalam suatu sel, yang dalam bentuk kode berisi semua informasi yang diperlukan untuk mengarahkan sintesis semua protein dan asam nukleat di dalam sel. DNA telah diisolasikan untuk pertama kali dari inti sel dalam tahun 1869, akan tetapi fungsinya baru dimengerti tahun 1944, ketika Avery dan kawan-kawan menerbitkan hasil penelitiannya. Organisme yang digunakan dalam penelitiannya adalah pneumococcus yang bertanggung jawab terhadap pneumonia pada manusia. Bentuk penyebab infeksi organisme ini memiliki kulit luar mukopolisakarida berlendir disebut kapsul yang diperlukan untuk kemampuannya menimbulkan penyakit. Jenis-jenis penyebab infeksi ini membentuk koloni yang rata dan dinamakan bentuk-S. Mutan pneumococcus yang bukan penyebab infeksi tanpa kulit kapsul dan membentuk koloni kasar apabila tumbuh diatas plat pakan. Yang ini dinamakan bentuk-R. Avery dan rekan-rekannya mengetahui bahwa apabila mereka membuat preparat murni DNA dari bentuk-S penyebab infeksi dan membuatnya diserap oleh kultur R-pneumococcus, maka bentuk bukan penyebab infeksi diubah menjadi yang penyebab infeksi, yaitu pemberian DNA bentuk-S menyebabkan R-pneumococcus mengambil alih sifat-sifat khas turun temurun dari S-pneumococcus. Penemuan ini secara kuat menetapkan DNA sebagai pembawa informasi genetic. Bukti selanjutnya dari peran DNA sebagai pembawa informasi genetic berasal dari penelitian Chargaff, yang mempelajari secara seksama susunan basa DNA bermacam-macam spesies. Mereka menemukan bahwa jumlah molar empat basa utama yang ditemukan pada DNA: adenin, guanin, sitosin dan timin saling berhubungan sesuai persamaan: [adenin] = [timin] membiak dan [guanin] = [sitosin] Karena sel berkembang biak menurut proses pembelahan, maka DNA harus dalam bentuk tepat sama dalam tiap sel dari generasi ke generasi. Tambahan pula berfungsinya suatu induvidu sel yang normal diperlukan penggunaan informasi genetic yang dikandung oleh DNA untuk mengarahkan biosintesis protein. Kedua hal ini menentukan peranan bahan genetic di dalam sel dan menimbulkan dogma pusat genetika molecular (Gambar 8.1)

86

Virus RNA DNA transkripsi Informasi genetic RNA translasi informasi genetic Protein

Pembalik transkriptase

Arus informasi genetik

Gambar 8.1. Dogma pusat dari genetika molecular. Anak panah menggambarkan arah arus informasi genetic. Garis-garis terputus menunjukkan keadaan khusus yang menyimpang dari bagan ini. N N N Tiga proses utama yang terlihat pada Gambar 8.1 adalah: N N N 1. Replikasi: menyangkut perangkaian secara linear satuan-satuan monomer DNA untuk membentuk replikat atau kopi yang tepat dari rangkaian struktur DNA yang lama. Proses ini memungkinkan pembentukan dua molekul anak DNA selama pembelahan sel, masing-masing satu kopi yang tepat dari induk DNA. N N N 2. Transkripsi: menyangkut perangkaian secara linear satuan-satuan RNA dengan N menggunakan suatu bagian khas yang kecil (gen) dari untaian DNA sebagai model. N N N N Molekul RNA tidak saja menyediakan cetakan kerja bagi biosintesisi protein, tetapi juga bekerja sebagai pembawa istimewa untuk asam amino serta juga Gambar 2. Basa-basa utama purin dan pirimidin serta memperlengkapi tempat tautan dimana sintesis protein akan berlangsung. gambaran struktur kovalen 3. Translasi: meliputi perangkaian secara linear monomer-monomer asam amino, umum asam nukleat N dengan menggunakan satu jenis khas RNA sebagai cetakan dan jenis khas RNA lain sebagai pembawa dan pengubah N asam amino. Ini sesuai dengan proses yang sesungguhnya dalam sintesis protein. Pembentukan pasangan basa dan prinsip komplementaritas 1 Basa-basa pirimidin 3 sitosin, timin, dan urasil merupakan pusat bagi fungsi asam-asam nukleat karena dalam struktur kovalen suatu asam nukleat, basanya N berpencar dari tulang punggung pentosa-fosfodiester yang sangat mirip dengan N gugus-gugus R suatu protein. Gambar 8.2 merupakan basa-basa purin dan N N pirimidin serta hubungannya dengan struktur kovalen suatu asam nukleat.2 4 5

NH2 H

O CH3 H

O N N

873

O H Sitosin (C) NH2

O H Timin (T)

O H urasil (U) NH2 H

O H Adenin (A) O-

O H O H3C O CH2 O H H ribosa P-

H

Guanin (G)

O

P O

P O

Ujung 5 (fosfat)

H O H O CH2 O H H O-

NH2 ribosa P ribosa H H H CH2 O H H H H O H ribosa P ikatan N- glikosida O P NH2 ribosa P

O

P

O ribosa Ikatan 3, 5 fosfodiester P ribosa Ikatan 3 fosfat ester P

O

P

O O

Ikatan 5-fosfat ester

Ujung 3 (hidroksil) ribosa P ribosa P ribosa P

= Gugus fosfat

ribosa P ribosa P 88

A = Adenin U 3 A U = Urasil C

G = Guanin = Sitosin 5

G

C

U

A

Suatu triribonukleotida

5

triribonukleotida Komplementer

3

Pasangan-pasangan basa terbentuk 3 A U G C 5

U

A

5 dari untaian komplementer

3

Untai rangkap trinukleotida dihubungkan dengan cara pembentukan pasangan basa Gambar 8.3. Prinsip komplementaritas. Kedua untai tersebut adalah anti paralel Suatu tri-ribonukleotida yang mnegandung A, G, C dan U seperti terlihat pada Gambar 3. Trinukleotida yang akan dapat mengikat diri padanya paling kuat, dan karenanya dengan kemungkinan yang paling tinggi, akan merupakan suatu trinukleotida, yang masing-masing dari tiga basanya membentuk pasangan basa

89

dengan basa yang bersesuaian di dalam trinukleotida. Kedua rantai yang secara sempurna berpasangan basa dengan cara ini dikatakan mempunyai rangkaian nukleotida komplementer. DNA Setiap sel hidup mengandung satu atau lebih satuan genetic yang disebut kromosom, masing-masing berisis stuan untaian rangkap DNA yang bebrbentuk spiral. Di dalam sel prokariotik, DNA tergabung dengan poliamin-poliamin kecil yang bermuatan positif. Kromosom eukariotik lebih kompleks dan berisi RNA dan protein bersama-sama dengan DNA.Tabel mencantumkan kadar DNA yang diperkirakan untuk beberapa tipe organisme. Tabel 8.1 Kadar DNA selular yang diperkirakan untuk beberapa tipe organisme(sel diploid) Organisme Mamalia Burung Jamur bakteri Struktur DNA Beberprapa hal yang menyolok mengenai model Watson Crick serta beberapa kenyataan pentingtentang struktur DNA . 1. Struktur menyeluruh dari DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang menngulung dpada suatu heliks rangkap. Iniditunjukkan secara skematik dalam Gambar 8.4 . 2. Kedua rantai digabungkan dengan cara berpasangan-basa dan dengan interaksi scara hidrofobik yang melibatkan lingkaran-lingkaran purin dan pirimidin dari basa. Urutan basa dari satu untaian komplementer dengan urutan basa dari untaian lain. Gram DNA setiap sel 6 x 10-12 6 x 10-12 kira-kira 6 x 10-12 kira-kira 6 x 10-12 Jumlah pasangan basa 5500 x 106 2000 x 106 20 x 106 2 x 106

90

Gambar 8.4. Konfigurasi menyeluruh dari helix rangkap DNA . Kedua untaian adalah komplementer dan anti-paralel 3. Letak basa-basa dari purin dan pirimidin ada sebelah dalam heliks dan tulang punggung pentosa-fosfodiester membentuk permukaanluar heliks. Lingkaran-lingkaran purin dan pirimidin yang planar adalah tegak lurus terhadap sumbu panjang heliks untuk menjamin terjadinya berpasanganbasa lebih efektif.

91

4. Serat-serat DNA secara sendiri-sendiri pad heliks rangkap adalah anti pararel; artinya stu serat membentang dari ujung 3 ke ujung 5, sedang serat yang lain membentang dari ujung 5 ke ujung 3. Ini seetara dengan ungkapan bahwa serat-serat mempunyai polaritas berlawanan. 5. Kedua serat heliks rangkap hanya daopat dipisahkan dengan jalan menguraikan kumpilan heliks-heliks tadi dan tidak dapat hanya denagn menariknya lepas. Penguraian kumparan DNA terjadi selama replikasi dan sebagian selama transkripsi. Dapat juga dilakukan denngan heliks. Pada denaturasi DNA letak serat-serat sangat terpisah. 6. Jumlah panjang DNA dalam suatu sel dapat berkisar anatar 1,2 mm pada E. coli hingga 2 meter pada mamalia. 7. Kromosom tunggal tunggal dari DNA berserat dua pada bakteri telah dibuktikan berbentuk bundar Organisme bertingkat tinggi mengandung lebih dari satu kromosom dan setiap molekul DNA berimbang lebih panjang. Adalah mungkin bahwa organisme bertingkat tinggi juga berbentuk bundar. CH3 H N C-1 O H H N H 10.85A Replikasi DNA Hipotesis Watson-Crick mengusulkan bahwa tiap untaian sulur ganda DNA digunakan sebagai suatu cetakan bagi replikasi DNA keturunan/anak yang bersifat komplementer. Dengan cara ini, dua dupleks keturunan molekul-molekul DNA yang sama dengan DNA induk. Hipotesis ini telah dibuktikan dan percobaan yang cermat dilakukan oleh Matthew Meselson dan Franklin Stahl (1957). Gambar 8.5 menunjukkan prinsip percobaan mereka. Mereka membutuhkan sel-sel E. coli selama beberapa generasi pada medium dengan ammonium klorida (NH4Cl) HH H N H H N N C-1 C-1 C O N H

T N O

N A

N

H

H O H N 10.85A N C N C-1 N H

92

digunakan sumber nitrogen satu-satunya yang mengandung

15

N, isotop nitrogen

berat, sebagai ganti atom N yang biasa yaitu, isotop yang banyak dijumpai 14N. dengan demikian seluruh komponen nitrogen sel yang tumbuh pada medium ini, termasuk bom pada DNAnya menjadi sangat diperkaya oleh15

N. DNA yang

diisolasi dari sel menunjukkan densitas kira-kira sati persen lebih berat pada (14N) DNA normalnya.meskipun ini hanya merupakan perbedaan kecil, campuran DNA (15N) berat dan (14N) ringan di dalam larutan sesium klorida pekat dapat dipisahkan melalui sentrifusi. Sesium klorida digunakan karena larutan molekul ini menunjukkan berat jenis yang mendekati DNA . Bila suatu larutan CsCl membentuk gradien densitas yang berkesinambungan. Oleh karena gaya sedimentasi, konsentrasi CsCl pada dasar tabung lebih tinggi dalam karena itu, larutan menjadi lebih pekat dari di bagian atas. Spesimen DNA yang dilarutkan di dalam CsCl akan mencapai posisi keseimbangan pada tabung di mana densitasnya akan setara dengan larutan CsCl. Karena (15N) DNA sedikit lebih pekat daripada (14N) DNA ,(15N) DNA akan mencapai posisi keseimbangan yang lebih rendah pada gradien CsCl daripada (14N) d (Gambar 8.6 ). Maselson dan stahl memindahkan sel-sel E. coli yang tumbuh pada media15

N, dimana seluruh untaian DNA mejadi berat, ke dalam media segar dengan

NH4Cl yang mengandung isotop 14N normal. Media agar menunjukkan sel-sel ini tumbuh da media 14N sehingga mencapai sebanyak dua kalinya. DNA kemudian diisolais dari sel-sel dan densitasnya dianalisa dengan prosedur pengendapan yang telah disebutkan diatas. DNA hanya membentuk suatu pita tunggal pada gradien CsCl pada pertengahan densitas antara DNA ringan normal yang mengandung14

N dan DNA berat dari pertumbuhan sel-sel, khusus pada14

15

N . Hal ini

merupakan hasil yang tepat diharapkan bila sulur pada DNA dari sel-sel keturunan mengandung satu untaian (Gambar 8.6). (a) Repliksi konservatif (b) Repliksi semikonservatif DNA induk berat N baru dan satu untaian15

N lama dari DNA induk

93

Generasi pertama

Generasi kedua

Gambar 8.5. Prinsip percobaan Meselson-Stahl untuk membedakan antara dua 15 kemungkinan mekanisme replikasi DNA berat atau N DNA (hitam) pada waktu replikasi berlangsung pada suatu media ringan,untai ringan adalah yang berwarna. Bila sel-sel dibiarkan meningkat lagi dua kali jumlah pada media 14N, DNA yang diisolasi memperhatikan dua pita, satu menunjukkan densitas yang setara dengan DNA ringan yang normal dan lainnya menunjukkan densitas DNA hybrid yang terlihat setelah sel pertama jumlahnya menjadi dua kali, Maselson dan stahl dengan demikian tiba pada kesimpulan bahwa tiap dupleks DNA keturunan pada dua generasi sel-sel mengandung satu untaian induk dan satu untaian yang baru dibuat, tepat dengan pernyataan hipotesis Watson-Crick. Jenis replikasi ini disebut semi konservatif, karena hanya satu untaian induk dipertahankan pada tiap DNA keturunan (Gambar 8.5 dan 8.6). Pengamatan mereka dengan jelas meniadakan replikasi konservatif, di mana satu dupleks DNA keturunan mempunyai dua untaian baru. Hal ini juga meniadakan suatu mekanisme penyebaran di mana tiap untaian keturunan DNA mengandung potongan pendek dari kedua induk dan DNA baru bergabung bersama secara acak. Arah pengendapan DNA Berat (1 s N) DNAinduk (kedua untaian berat)

94

DNA Ringan

(1 4 N) DNA normal dengan dua untaian ringan kesimpulan

Hasil percobaan DNA setelah satu generasi pada (1 4 N)NH4Cl

generasi pertama kedua DNA mengandung satu untaian ringan dan satu untaian berat generasi kedua terbentuk dua DNA hibrid dan dua DNA ringan

DNA setelah dua generasi DNA ringan DNA hibrid

Gambar 8.6. Hasil percobaan Meselson-Stahl DNA berat atau 15 Dengan DNA mencapai keseimbangan pada posisi yang lebih rendah dari pada DNA ringan atau 14N DNA pada gradien densitas CsCl. Hibrida DNA mengadakan keseimbangan pada posisi menengah. Uji DNA keturunan pada generasi pertama dan kedua menunjukkan bahwa replikasi DNA bersifat semikonservatif. Mekanisme Replikasi DNA Karena setiap untaian DNA mengandung urutan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida untai padanannya, maka setiap untai dapat bertindak sebagai templat untuk sintesis untai DNA yang baru. Kemampuan setiap molekul untai DNA untuk bertindak sebagai templat untuk menghasilkan suatu untaian komplemen yang baru memungkinkan sel untuk mengkopi atau membuat replica gennya sebelum ditransfer ke keturunannya. Proses pengkopian berlangsung da waktu yang sangat singkat dan tepat. Proses ini dibantu oleh sekelompok protein yang disebut mesin pengkopi. Untai DNA heliks ganda biasanya sangat stabil karena kedua untai terikat bersama melalui sejumlah ikatan hydrogen antara basa-basa kedua untai. Hanya temperatur mendekati air mendidih yang dapat memberikan energi termal untuk

95

memisahkan kedua untai ini. Tetapi agar dapat digunakan sebagai templat, helix ganda harus dibuka dan kedua untai dipisahkan untuk dapat mengekspos basa yang tidak berpasangan. Proses replikasi DNA dimulai oleh protein inisiator yang mengikat DNA dan membuka iaktan hydrogen antara basa-basa. Posisi /bagian DNA yang pertama kali dibuka disebut dengan origin of replication (ori). Daerah ori mengandung urutan nukleotida yang kaya dengan pasangan basa AT. Hal ini berhubungan dengan kondisi dimana DNA untai ganda harus membuka. Pada kromosom bakteri atau ragi terdapat ori dengan panjang kurang lebih 100pB. Genom manusia mempunyai 10.000 ori yang memungkinkan.sel untuk membuat replica DNA dalam waktu yang cepat. DNA yang sedang melakukan replikasi di bawah mikroskop electron terlihat mempunyai bentuk Y yang disebut dengan garpu replikasi (replication fork). Pada garpu ini mesin replikasi bergerak sepanjang DNA , membuka kedua untai dan menggunakan masing-masing untai sebagai cetakan untuk membuat untai anak baru. Replikasi DNA pada bakteri dan kromosom eukariot berlangsungsecara dua arah (bidirectional). Struktur anti pararel dari kedua untai DNA ganda menimbulkan masalah dalam proses replikasi. Sintesis DNA dikatalisis oleh enzim DNA polimerase dan berlangsung dari arah 5 ke 3: enzim menambahkan nukleotida baru pada ujung 3 dari untai DNA yang sedang tumbuh. DNA merupakan untai ganda yang mempunyai polaritas yang berbeda. Oleh karena itu proses replikasi pada kedua untai DNA dibagi menjadi dua yaitu (Gambar 8.7): replikasi b. Sintesa DNA untai lagging, yang terjadi secara diskontinu dengan arah berlawanan dengan garpu replikasi. Fragmen DNA yang terbentuk disebut fragmen okazaki. 5 3 5 Arah pergerakan a. Sintesa DNA untai leading, yang terjadi secara kontinyu searah garpu garpu replikasi

Fragmen Okazaki 3 5 untaian pengantara 96

3 5 untaian pengawal

Gambar 8.7. Replikasi yang terputus-putus pada salah satu untaian DNA da potongan pendek DNA polimerase melakukan sintesis DNA dengan sangat akurat, dengan tingkat kesalahan satu per 107 pasang nukleotida yang dikopi. Pasangan A-T dan GC merupakan basa yang paling stabil, tetapi pasangan basa lain yang kurang stabil, seperti G-T dan C-A juga dapat terbentuk. Meskipun jarang terjadi, jika telah terjadi akumulasi, maka pasangan basa yang tidak stabil tersebut jika tidak dikoreksi dapat merusak atau membunuh sel. Kesalahan ini dapat dikoreksi oleh DNA polimerase (5 ke 3) karena enzim ini disamping mempunyai aktivitas proofreading (eksonuklease 3 ke 5) sebelum enzim memasukkan nukleotida baru, enzim akan memeriksa apakah nukleotida yang dimasukkan sebelumnya sudah tepat atau belum (Gambar 8.8). Jika nukleotida yang masuk tidak cocok, maka enzim akan menghidrolisis ikatan fosfodiester yang baru terbentuk dan mencoba lagi memasukkan nukleotida yang cocok. Hidrolisis site 3 ke 5 5 3 exonuclease activity T..A

97

T..A T..A T..A T..A C 3 HO A A A 5 Gambar 8.8. Aktivitas proofreading DNA polimerase selama replikasi Pembukaan gulungan sulur ganda dan pemisahan dua untaian sehingga dapat direplikasikan, dimungkinkan oleh beberapa protein khusus ( Gambar 8.9). Enzim yang diperlukan untuk membuka gulungan potongan-potongan pendek DNA pada daerah sebelum garpu replikasi adalah helikase. Protein ini memerlukan energi dari hidrolisis ATP untuk berjalan sepanjang DNA dan membuka helix ganda sepanjang perjalanannya. Begitu sebuah rangkaian pendek telah dibuka gulungannya, beberapa molekul protein pengikat DNA ( DNA Binding Protein atau BDP) mengikat setiap untaian yang terpisah tersebut secara kuat, yang mencegah untaian tersebut untuk kembali bersama-sama menjadi pasanganpasangan basa semula. DNA polimerase langsung dapat memperpanjang untai pengawal dengan menambahkan nukleotida pada ujung 3 untaian pengawal. Untuk memulai sintesis untai DNA baru diperlukan enzim lain yaitu primase. Primase berfungsi untuk membuat primer yang merupakan RNA dengan panjang kurang lebih 10 nukleotida. Primer ini akan membentuk pasangan basa dengan untai cetakan. Penambahan nukleotida baru terjadi melalui pembentukan ikatan fosfodiester antara 3OH (Gambar 8.10) dari primer dengan -fosfat pada nukleotida baru

98

Gambar 8.9. Ringkasan dari tahapan utama dalam replikasi DNA .

Gambar 8.10. Perpanjangan rantai DNA oleh DNA polimerase Untuk untai pengawal, satu primer RNA dipelukan untuk memulai untai cetakan. Tetapi pada ujung replikasi. Setelah pembentukan garpu replikasi, DNA polimerase akan melakukan reaksi sintesis secara kontinu sepanjang pengantara, sintesis DNA berlangsung secara diskontinu. Ketika gerakan garpu replikasi sampai pada bagian yang tidak membentuk pasangan basa, primer RNA baru akan dibuat lagi pada interval sepanjang untai pengantara. DNA polimerase akan menambahkan nukleotida baru pada ujung 3primer. Untuk dapat menghasilkan untai DNA yang kontinu (tidak terputus-putus) diperlukan 3 macaam aktivitas enzim lain. Enzim DNA polimerase I akan

99

memutuskan primer RNA (aktivitas 5 ke 3 eksonuklease) yang menggantikannya dengan DNA (aktivitas polimerase). Dua fragmen okazaki yang berdekatan akan disambung oleh enzim DNA ligase. Enzim ini akan menyambung ujung 5-fosfat dengan ujung 3-hidroksil. Tempat terjadinya terminasi pada kromosom E. coli merupakan daerah dengan 350.000 pb yang terdiri dari enam tempat yang disebut TerE, TerD,TerA,TerF, TerB, TerC (Gambar 8.11). Garpu replikasi yang berjalan berlawanan arah jarum jam akan melewati TerF, TerB dan TerC dan akan berhenti ketika sampai pad TerA,TerD atau TerC (TerD dan TerE diduga berfungsi untuk mem-back up TerA). Jika garpu replikasi searah jarum jam, replikasi akan berhenti pada TerC, TerB atau TerF. Untuk menghentikan gerakan garpu replikasi pada posisi Ter, diperlukan Tus protein. Tus protein terdiri 309 residu asam amino yang merupakan produk dari gen Tus (terminator utilization substance) berfungsi untuk menghambat aktivitas helikase sehingga dapat mengakhiri gerakan garpu replikasi.

Gambar 11. Tempat terjadinya terminasi replikasi pada kromosom E.coli TRANSKRIPSI DNA tidak mengarahkan sintesis protein secara langsung, tetapi bertidak sebagai menejeri mendelegasikan berbagai tugas kepada tim pekerjanya. Jika sel memerlukan protein tertentu, gen yang terdapat pada DNA kromosom akan dikopi menjadi asam nukleat RNA. RNA selanjutnya yang akan mengarahkan sintesis protein. Setiap gen dapat diekspresi menjadi RNA dan atau protein dengan efisiensi yang berbeda-beda(Gambar 8.12) gene A Transcription gene B DNA Transcription

100

RNA translation A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A B

RNA translation

Gambar 8.12. Gen dapat diekspresikan dengan efisiensi yang berbeda. Proes transkripsi mirip dengan proses replikasi dimana DNA harus terbuka dan sebagian basa-basa DNA akan terekspos kepermukaan. Salah satu dari kedua untai DNA templat. Enzim yang mengkatalisis sitesis RNA adalah RNA polimerase. Transkripsi mempunyai beberapa dengan replikasi. Pertama RNA mempunyai panjang yang jauh lebih pendek dibanding molekul DNA karena RNA dikopi dari daerah DNA tertentu. Molekul DNA pada kromosom manusia dapat mempunyai panjang kurang lebih 250 juta pasang basa, sedangkan kebanyakan RNA hanya mempunyai panjang kurang lebih rubuan nukleotida. Perbedaan yang ketiga, RNA polimerase dapat memulai reaksi polimerisasi tanpa primer. Keempat, RNA tidak mempunyai aktivitas proofreading sehingga RNA polimerase tidak dapat membuat kesalahan lebih sering daripada DNA polimerase, yaitu satu nukleotida dalam 104 nukleotida yang dikopi menjadia RNA. Dalam sintesisi RNA diperlukan utas DNA sebagai model cetakan dan polimerase RNA sebagai enzim pengkatalisis. Dalam satu ruas gen dari kedua utasan helix ganda hanya satu utasan yang digunakan sebagai model cetakan dalam sintesis RNA. Alasan para peneliti mempunyai anggapan seperti ini muncul dari diterimanya bukti genetic bahwa tiap gen hanya mengendalikan satu protein. Jadi dari satu gen hanya ada satu RNA yang dihasilkan, dan bila kedua utasan tersebut digunakan sebagai model cetakan dalam sintesis protein. Polimerase RNA dapat membedakan utas cetakan dan utas pendamping yang terdapat pada DNA utas ganda melalui arah pergerakan polimerase RNA saat membaca basa-basa pada utasan DNA .Pembacaan utasan DNA dimulai pada maka harus ada dua cetakan yang dihasilkan

101

daerah yang disebut promotor dan berakhir pada terminator. Promotor merupakan rangkaian nukleotida yang tersusun sedemikian rupa sehingga dapat menjadi isyarat bagi RNA polimerase untuk mulai bekerja mensintesis RNA. Terminator juga merupakan rangkaian basa dengan susunan tertentu sehingga dapat memberi tanda polimerase RNA untuk menghentikan sintesis RNA. Promotor dan terminator akan mempunyai makna seperti diatas seandainya dibaca dari arah tertentu, dan tidak dari arah sebaliknya. Rantai RNA disintesis dengan pertumbuhan 5-3, seperti yang berlaku da sintesis DNA , yaitu nukleotida baru ditambahkan pada ujung 3OH pada fragmen yang sedang tumbuh. Karena kaedah antiparalel juga berlaku dalam perpasangan antara utas DNA dengan utas RNA, maka sebagai akibat pertumbuhan RNA 5-3, polimerase RNA harus membaca utas DNA dari ujung 3OH menuju 5P. dengan begitu setelah menemukan promotor, polimerase RNA akan memilih utasan DNA yang mempunyai arah pembacaan 3-5 dan utasan ini menjadi utas cetakan, sedangkan utas yang lain menjadi utas pendamping (Gambar 8.13) RNA polimerase dari Escheresia coli merupakan molekul sangat besar (500 kd) dan terdiri dari empat macam subunit. Komposisi subunit pada enzim yang disebut holoenzyme adalah 2. Subunit akan mencari/mengenal promotor dan membantu inisiasi sintesis RNA dan sigma ini selanjutnya terdisosiasi dari enzim. RNA polimerase tanpa subunit disebut core enzym. (a) DNA RNA 5- AGTACGTAACCTTGAGCCGTGATG.3OH untas pendamping 3OH - TCATGCATTGAACTCGGCACTAC3OH untas cetakan 5P AGUACGUAACUUGAGCCGUGAUG.3OH (b) Gen 1 P DNA 3 5 T RNA 5 3 3 5 P T 5 3 3 5 P T Gen 2 Gen 3 P Gen 4 T

102

Gambar 8.13. Pada saat sintesis RNA hanya satu utasan DNA yang dimanfaatkan oleh polimerase RNA sebagai model cetakan RNA polimerase melakukan beberapa fungsi: 1. mencari tempat inisiasi DNA E. coli mempunyai 2000 promotor pada kromosomnya ( 4x 10pb). 2. membuka DNA heliks ganda untuk menghasilkan templat DNA untai tunggal. 3. memilih ribonukleotida yang cocok dan mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan setiap nukleotida dan membentuk kerangka gula-fosfat. 4. mendekati signal terminasi yang menspesifikasi tempat berakhirnya transkripsi. 5. Berinteraksi dengan protein activator dan repressor yang mengendalikan kecepatan transkripsi. Proses Transkripsi Promotor dan proses awal transkripsi Promotor merupakan rangkaian nukleotida tempat transkriptase mengenali dan melekat pada DNA , dan selanjutnya mengawali proses transkripsi (Gambar 8.14). Promotor E. coli terdiri dari sekitar 40 pasang nukleotida dengan tiga titik penting Transkriptase kotak- 35 kotak- 10

titik awal transkripsi

Pilinan DNA terbuka

103

PPP (a) promotor utas cetakan Utas pendamping ACAACTGT TGTTGACA -35 Titik awal

RNA

ATATAA TATAAT -10 1 RNA

5 3

Hasil transkripsi (b) Gambar 8.14. Skema proses inisiasi transkripsi dan skema promotor E. coli

yaitu kotak 35, kotak 10 dan titik awal transkripsi. Kotak 35 dan kotak-10 terdiri dari beberapa pasang basa, dan urutannya merupakan urutan konsensus, atau hampir sama untuk berbagai organisme, sedangkan bagian lain dari promotor mempunyai urutan yang berbeda-beda. Titik awal transkripsi merupakan basa pertama utas DNA yang ditranskripsikan ke dalam basa RNA. Mulai dari titik tersebut ke arah bagian hilir (ujung 5P pada utas cetakan) diberi koordinat positif, sebaliknya nukleotida bagian hulu diberi tanda negatif. Kontak 35 mempunyai makna bahwa pada sebagian besar organisme titik tengah kotak tersebut terdapat pada basa yang berjarak 35 pasang basa ke arah hulu dari titik awal transkripsi. Penjelasan yang sama berlaku untuk kotak 10. Kotak 35 mempunyai fungsi sebagai isyarat menempel buat enzim transkriptase pada DNA . Isyarat ini dikenali oleh factor sigma, salah satu subunit dari transkriptase yang akan menggiring. Transkriptase agar dapat menempel pada

104

tempat yang tepat. Kotak ini mempunyai rangkaian consensus 5TGTTGACA3. Kotak 10 juga disebut kotak Pribnow dengan rangkaian consensus 5TATAAT3 merupakan tempat awal transkriptase menguraikan pilinan helix ganda DNA . Terbentuknya utas tunggal merupakan syarat untuk dapat dilakukannya proses transkripsi, karena itu penguraian helix ganda menjadi utas tunggal merupakan pekerjaan pertama dari transkriptase. Kotak Pribnow disusun oleh rangakaian pasangan AT, yang merupakan pasangan basa yang mempunyai ikatan hydrogen yang lemah, sehingga pada wilayah ini utas ganda paling mudah dipisahkan. Antara kotak 35 dengan kotak Pribnow dipisahkan (dalam 90% kasus) oleh 16 dan 18 pasang nukleotida. Yang terakhir yaitu awal transkripsi yang merupakan basa pertama yang ditranskripsikan menjadi RNA. Sebagian besar dari gen menunjukkan bahwa titik awal merupakan basa purin pertama yang mempunyai jarak sekitar tujuh basa dari kotak Pribnow. Cukup sering ditemui bahwa titik awal merupakan titik tengah rangkaian awal. tiga basa CAT. Tetapi belum cukup data untuk dapat menarik kesimpulan bahwa rangkaian CAT merupakan rangkaian consensus untuk titik

Proses sintesis perpanjangan RNA Setelah transkripsi mengenali isyarat awal dan beberapa ribonukleotida dirangkaikan maka selanjutnya akan berlangsung proses perpanjangan RNA. Dalam perpanjangan ini factor sigma tidak diperlukan lagi dan akan terlepas dari enzim inti, dan kemungkinan diganti oleh protein lain yaitu nusA. Dengan adanya tidak adanya factor sigma, yang kerjanya memeriksa nukleotida satu persatu, enzim inti polimerase RNA akan berjalan lebih cepat, yaitu (1) membuka pilinan helix DNA memisahkan utas cetakan dari utas pendamping, (2) melakukan sintesis RNA dengan menggunakan (Gambar 8.15) Arah transkripsi utas pendamping DNA sebagai model cetakan, dan memulihkan kembali pilinan helix DNA yang telah digunakan dalam sintesis RNA

105

Utas pendamping

utas cetakan

situs utas pendamping

Situs penguraian heliks RNA situs pemulihan heliks situs hybrid DNA-RNA

Situs penguraian heliks RNA polimerase Gambar 8.15. Skema polimerase RNA dan situs-situsnya. Terminator dan proses akhir transkripsi Terminator merupakan rangkaian nukleotida DNA yang merupakan isyarat bagi transkriptase untuk mengakhiri proses transkripsi. Terdapat dua jenis terminator, yaitu terminator yang memerlukan factor rho dan terminator tanpa factor rho. Semua terminator yang dipelajari pada prokariot mengandung dua rangkaian ulang balik, dan khusus untuk terminator tanpa factor rho selain kedua ruas ulang balik juga satu rangkaian penutup. Yang dimaksud dengan rangkaian ulang balik ialah rangkaian pasangan nukleotida yang urutannya merupakan kebalikan dari urutan rangkaian yang lain. Dalam satu utas DNA , satu rangkaian merupakan pasangan antiparalel dari rangkaian yang lain seandainya dibaca dari arah yang berlawanan sehingga kedua untaian tersebut dapat berpasangan. Rangkaian penutup terdiri dari pasangan poli AT dengan adenin terletak pada utas cetakan. Antara dua rangkaian ulak balik dipisahkan oleh beberapa pasangan nukleotida, sedangkan rangkaian penutup langsung menyambung dengan rangkaian ulang balik yang terdapat sebelah hilir (Gambar 8.16) Rangkaian ulang balik Utas cetakan T C G G G C G AGCCCGC CGCCCGAAAAAA GCGGGCTTT T T T

106

TCGGGCG AGCCCGC

RNA Transkriptase (a)

CGCCCGAAAAAA GC UUUUU TU G-C TTTTT CG CG CG struktur jepit rambut GC CG

RNA

Struktur jepit rambut

(b) Gambar 8.16. Pada terminator terdapat dua rangkaian ulang balik yang dapat menghasilkan struktur. Struktur jepit rambut akan merupakan isyarat bagi transkriptase untuk mengakhiri proses aktivitasnya Basa-basa terminator akan ditranskripsikan ke dalam RNA. Karena adanya rangkaian ulang balik maka pada RNA akan terdapat ruas yang berpasangan, dan bila hal ini terjadi maka akan ditemukan adanya struktur jempit rambut.Rangkaian penutup akan ditranskripsikan menjadi poli U yang menyambung dengan struktur jempit rambut. Struktur jempit rambut akan memberi isyarat kepada transkriptase ntuk mengakhiri pekerjaannya dalam sintesis RNA. Isyarat tersebut mungkin dapat berupa memeperlambat atau menghentikan pergerakan transkriptase sepanjang utas DNA . Pada terminator dengan factor rho misalnya pada E. coli selain struktur jempit untuk mengakhiri proses transkripsi atau untuk memudahkan RNA dari utas DNA ,juga diperlukan peranan factor rho, yaitu suatu protein yang berhubungan dengan transkriptase. Tetapi pada terminator tanpa factor rho, dengan adanya ruas penutup poli AT maka setelah terbentuk struktur jempitb rambut pada RNA akan terbentuk poli U yang berpasangan dengan poli A pada utas DNA cetakan.

107

Pasangan poli AU merupakan pasangan yang lemah, sehingga RNA dan DNA mudah terlepas. Kontrol transkripsi RNA polimerase akan terus menerus dibuat oleh sel karena diperlukan untuk transkripsi. Gen pengkode protein selalu dibuat oleh sel disebut housekeeping gene. Tetapi banyak gen lain yang mempunyai peranan yang lebih spesifik dan diperlukan pada waktu-waktu tertentu, maka organisme mempunyai system kontrol tertentu. Salah satu cara organisme mengatur transkripsi adalah dengan mensintesis protein repressor yang akan mengikat operator sehingga dapat menghambat kerja RNA polimerase. Adanya zat penginduksi, biasanya merupakan senyawa dengan BM rendah atau dapat juga melalui perubahan temperatur. Molekul repressor dapat dinonaktifkan sehingga transkripsi dapat berlangsung. Salah satu contoh system pengendalian ekspresi gen adalah sistem Lac Operon, yaitu pengendalian sintesis enzim yang terlibat dalam metabolisme laktosa. sistem Lac Operon terdiri dari lacI, LacZ, lacY dan LacA. LacI disebut gen pengendali karena mempunyai fungsi untuk mengontrol ekspresi gen lain (Gambar 8.17). LacZ, lacY dan LacA disebut gen structural karena mempunyai peranan enzimatis/structural. LacZ, mengkode protein -galaktosidase; lacy mengkode protein permease, dan lacA mengkode protein tiogalaktosida transasetilase. Represor yang dihasilkan oleh gen lacI akan mengikat bagian DNA yang disebut operator sehingga dapat menghambat akses promotor terhadap RNA polimerase. Interaksi dapat terjadi melalui ikatan hydrogen, ikatan ionic atau interaksi hidrofobik karena permukaan protein repressor mempunyai bentuk yang cocok dengan struktur helix ganda pada daerah operator. Jika tidak ada laktosa sel akan mensintesis lima milekul enzim. Jika di dalam medium diberi zat penginduksi laktosa atau senyawa yang mirip, seperti isopropiltiogalaktosida (IPTG), maka sel akan mensintesis 5000 molekul enzim. Penginduksi ini akan berinteraksi dengan protein repressor menstimulasi transkripsi LacZ, lacY dan LacA karena disosiasi kompleks repressor-penginduksi dari operator akan menghilangkan halangan sterik untuk pengikatan RNA polimerase.

108

Gambar

8.17. Sistem pengendalian ekspresi lac operon (Dalam gambar tidak Translasi Informasi Genetik (Biosintesis Protein)

ditunjukkan lacA yang seharusnya terdapat setelah lacY) Translasi merupakan proses yang lebih kompleks disbanding transkripsi dan replikasi. Translasi melibatkan beberapa komponen yaitu mRNA, tRNA dan ribosom. Tahap aktivasi Tahap pertama biosintasis protein adalah aktivasi tRNA dengan asan amino yang dikatalisis oleh aminoasil tRNA sintetase. Enzim aminoasil tRNA sitetase bekerja spesifik ntuk menjamin agar hanya asam amino yang tepat yangakan diikat oleh tRNA yang spesifik. E. coli mempunyai kurang lebih 20 macam aminoasil P P tRNA sintetase. Tahap-tahap reaksi aktivasi adalah sebagai berikut (Gambar 8.18): O Adenocine ATP P P P +

C CH O P P R

-

NH3

Amino acid

P

P

P

P 109

1

Pyrophosphate O C CH-

NH3

Adenosine C C A OH OH tRNA C C A OH OHC CH O R 3-aminoacyl tRNA+

P

O

R aminoacyl adenylate

2AMP C C A OC CH+

NH3

NH3

OH O

R

2- aminoacyl tRNA

Gambar 8.18. Tahap aktivasi tRNA dengan asam amino 1. asam amino diaktivasi oleh ATP membentuk amino asil adenilat. 2. pembentukan ikatankovalen/ester antara amino asil adenilat dengan tRNA. Reaksi terjadi pada gugus hidroksil pada posisi 2 atau 3. Pada prokariot, asam amino pertama pada biosintesis protein adalah metionin yang dimodifikasi oleh formil. Fmet yang terbentuk menyebabkan gugus amino terblok dan pembentukan ikatan peptida terjadi satu arah ( ke arah gugus karboksil). Fmet dibawa oleh tRNAFmet yang spesifik dan berbeda dari tRNA yang membawa metionin. Tahap inisiasi biosintesis protein diperlukan tiga protein factor inisiasi (IF1,IF-2, IF-3, IF, initiation factor). Pengikatan IF-3 pada ribosom sub-unit 30S terjadi pemula (tRNAFmet). Pengikatan mRNA pada ribosom sub unit kecil 30S terjadi melalui pembentukan pasangan basa anatara urutan Shine-Dalgarno yang biasanya merupakan daerah yang kaya dengan basa purin pada mRNA dengan komplemennya yang terdapat pada 16S rRNA (Gambar 8.19). Urutan SD terdapat kurang lebih 10 nukleotida sebelum kodon inisiasi metionin. Setelah terjadi pengikatan mRNA dan masuknya tRNA pemula yang mengenal kodon AUG yang

110

mengkode metionin, maka selanjutnya terjadi pelepasan IF-3. selanjutnya, terjadi hidrolisis GTP menjadi GDP dan Pi serta pelepasan IF-2 dan IF-1 dan penggabungan ribosom sub unit besar 50S. penggabungan subunit 50S menghasilkan kompleks 70S yang siap untuk menerima tRNA berikutnya. Sub unit 50S mempunyai dua tempatuntuk pengikatan tRNA, yaitu peptidyl site (P) dan aminoacyl site (A). Exite site (E) adalah tempat untuk tRNA yang sudah kosong. Kodon inisiasi AUG mengikat tRNAFmet pada P site. (Gambar 8.20)

Translational initiation region (TIR) Ribosome binding site Start -30 5 SD region 5 3 HO 16s rRNA (3-end) Gambar 8.19. Interaksi mRNA dengan 16S rRNA AGGAGGU A U U C C U C C A C UAG AUG GUG UUG 20 10 AUG 3

111

Gambar 8.20. Tahap inisiasi biosintesis protein Kecepatan posisisi awal sintesis protein merupakan tahap yang sangat penting, karena tempat ini menentukan bentuk polipeptida yang akan dihasilkan. Keadaan pembacaan satu nukleotida di awal dapat menyebabkan kesalahan protein yang dihasilkan. Pergeseran satu nukleotida akan mengubah seluruh kodon akan dihasilkan asam amino tyang tidak sesuai. Jadi, translasi suatu protein harus sesuai dengan reading frame protein tersebut Perpanjangan rantai polipeptida Asam amino selanjutnya dibawa oleh factor perpanjang EF-Tu ke sisi A (EF, elongasi factor) (Gambar 8.21). Pengikatan tRNAaa2

ke sisi A disertai dengan

reaksi hidrolisis GTP. Pada tahap berikutnya terjadi pembentukan ikatan peptida antara tRNA aa1 pada sisi P dengan tRNA aa1+n. Asam amino pada sisi P dipindahkan ke aa pada sisi P. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim peptidil transferase yang merupakan bagian dari ribosom sub unit 50S. tRNA deasilase memutuskan ikatan fmet-tRNA. Dalam proses pemindahan tRNAaa

pada sisi A ke sisi P ribosom

bergerak sepanjang mRNA dari arah 5 ke 3 sebanyak satu kodon. Proses

112

translokasi ini memerlukan factor perpanjangan EF-G dan reaksinya disertai dengan hidrolisis GTP. Proses perpanjangan ini berlangsung terus menerus sampai ribosom menemukan kodon terminasi UAA,UAG dan UGA Tahap terminasi Pada prokariot, protein yang berperan dalam tahap terminasi adalah RF-1, RF-2 dan RF-3 (RF = release factor) (Gambar 8.22). RF-1 akan mengenal kodon UAA dan UAG, sedangkan RF-2 akan mengenal kodon UAA dan UAG, sedangkan RF-2 akan mengenal kodon UAA dan UAG. RF-3 berperan dalam pengikatan dan hidrolisis GTP untuk membantu proses pelepasan polipeptida dari ribosom. Setelah RF-1 dan RF-2 terikat pada ribosom, peptidil transferase akan menghidrolisis residu C-terminal rantai polipeptida dari sisi P. selanjutnya terjadi pelepasan RF dan tRNA dari sisi P. Ribosom 70S akan terdisosiasi menjadi 50S dan 30 S

113

Gambar 8.21. Tahap perpanjangan rantai polipeptida

114

Gambar 8.22. Tahap terminasi

Soal: 1. Pasangan basa selama replikasi dan transkripsi a. Tulis deret basa segmen DNA yang direplikasi oleh polimerase DNA ditulis dengan arah 5 3: 5 AGCTTGCAACGTTGCATTAG 3 b. Sekarang tulis deret basa segmen RNA pembawa pesan yang disalin oleh RNA polimerase dari untaian DNA baru yang direplikasi pada bagian a. 2. DNA 3. Untuk tiap enzim berikut, berilah reaksi yang dikatalisa, untuk menunjukkan dengan jelas gugus fungsional yang dipengaruhi dalam reaksi: a. DNA ligase b. RNA polimerase c. Peptidil transferase Buat daftar dan bandingkan prekursor-prekursor dan enzim-enzim yang diperlukan oleh untai pengawal dan untai pengantara selama replikasi dari cetakan DNA berikut ini, dengat mengingat bahwa deret DNA dan RNA

115

116