33

BAB 5

HASIL PENELITIAN

5.1 Peremajaan Streptococcus mutans

Peremajaan S. mutans dari stok lama dilakukan dalam media padat TYC,

yang terdiri dari tripton 15g/L, yeast extract 5g/L, L-cystine 0,2g/L, Na2SO3

0,1g/L, NaCl 1g/L, Na2HPO4 0,8g/L, Na2CO3 2g/L, CH3COONa 12g/L, Sukrosa

50g/L, dan Agar 12g/L (Stoppelaar, 1967). S. mutans yang ditanam pada media

agar  yang mengandung sukrosa mempunyai karakteristik sebagai berikut, yaitu

ukuran koloni 0,5-1 mm, berwarna putih, permukaan koloni kasar, melekat erat

pada agar, di sekitar koloni dibasahi produk polimer glukan. S. mutans ini

termasuk anaerob fakultatif tetapi tumbuh optimum pada kondisi anaerob

(Rahardjo dan Kriswandini, 2004).

Pertumbuhan sel S. mutans dalam media padat TYC tampak setelah

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC dalam candle jar, seperti tampak pada

Gambar 5.1.

Gambar 5.1 Pertumbuhan S.mutans dalam media TYC.

33

34

5.2 Pertumbuhan Streptococcus mutans dalam Media BHIB

Pertumbuhan S. mutans dalam media cair BHIB dilakukan dengan

memasukkan koloni tunggal S. mutans dari media padat TYC ke dalam media cair

BHIB 10ml. Media cair BHIB dibuat dengan melarutkan BHIB 37g/l dalam

akuades. Kultur S. mutans diinkubasi pada 37oC selama 24 jam dalam candle jar.

Pertumbuhan sel S. mutans dalam media BHIB dicirikan dengan warna putih

kekuningan, yang sebagian besar menempel di dasar erlenmeyer. S. mutans

tumbuh sangat baik dalam media BHIB pada keadaan anaerob (Nolte, 1982).

Bakteri S. mutans apabila ditanam pada medium yang diperkaya seperti

pada Brain Heart Infusion Broth (BHIB) berbentuk coccus dengan formasi rantai

panjang (Clark, 1924). Pertumbuhan S. mutans pada media BHIB seperti tampak

pada Gambar 5.2.

Gambar 5.2 Pertumbuhan S. mutans dalam media BHIB. (a) Pertumbuhan S. mutans pada media BHIB (b) Pertumbuhan S. mutans

pada dasar tabung erlenmeyer.

35

5.3 Pertumbuhan Biofilm Streptococcus mutans dalam Media BHIBS

Biofilm S. mutans tumbuh menempel pada slide glass setelah diinkubasi

selama 24 jam. Biofilm S. mutans yang menempel pada slide glass berwarna

putih kekuningan. Komposisi biofilm terdiri dari mikroorganisme, produk

tambahan ekstraseluler, polisakarida sebagai bahan pelekat yaitu glukan, dan air

(Watnick, et al., 1999).

Gambar 5.3 Pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS. (a) Pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS (b) Skematik

pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS.

5.4 Lisis Biofilm Streptococcus mutans

Lisis biofilm S. mutans dilakukan menggunakan metode ultrasonikasi

dengan kekuatan 7 x 30s, 40Hz (Cury, et al., 2007) dalam bufer TEM (10mM

Tris-HCl [pH 6,8], 1mM EDTA, 5mg MgSO4) (Welin, et al., 2004). Pada

awalnya, lisis dikerjakan dengan menggunakan kekuatan 10 x 1s, 40Hz (Welin,

2004). Tetapi, setelah dilakukan analisis protein terhadap crude protein hasil lisis

hanya ditemukan sebuah pita protein yang sangat tipis. Sehingga lisis terhadap

36

biofilm dengan kekuatan tersebut dianggap belum mampu memecah secara

keseluruhan komponen penyususn biofilm yang lebih kompak setelah diinkubsi

selama 24 jam.

Selanjutnya lisis dilakukan dengan kekuatan 40Hz selama 7 x 30s. Dengan

pertimbangan bahwa biofilm setelah diinkubasi selama 24 jam memiliki struktur

yang lebih kompak dibandingkan jika biofilm diinkubasi selama 2 jam (Cury, et

al., 2007) . Kekompakan struktur biofilm berbanding lurus dengan lama inkubasi

biofilm (Donlan, 2002). Inkubasi terhadap biofilm selama 24 jam bertujuan untuk

mendapatkan massa biofilm yang lebih banyak. Lisis dianggap berhasil setelah

beberapa pita protein terlihat pada hasil analisis menggunakan SDS-PAGE 12%.

37

5.5 Analisis Profil Protein Biofilm S. mutans dengan SDS-PAGE 12%

Hasil analisis profil protein biofilm S. mutans dengan variasi pengenceran

seperti tampak pada Gambar 5.4.

Gambar 5.4 Profil protein biofilm S. mutans. M: Marker protein, S: Sampel protein biofilm S. mutans (S1: pengenceran 2x;

S2: tanpa pengenceran; S3: pengenceran 1x)

Menurut Rantam 2003, penentuan berat molekul (BM) protein dilakukan

dengan menghitung nilai Rf (Retardation factor) dari masing-masing pita (band)

dengan rumus seperti di bawah.

97,4 kDa

66,3 kDa

55,4 kDa

36,5 kDa

31 kDa

21,5 kDa

14,4 kDa

Jarak pergerakan protein dari tempat awal

Jarak pergerakan warna dari tempat awalRf =

M S1

200 kDa

116,3 kDa

S3S2

6,0 kDa

38

Selanjutnya dicari nilai Rf dari marker, kemudian dibuat kurva standar.

Data untuk pembuatan kurva standar seperti tampak pada Tabel 5.1.

Tabel 5.1 Data pembuatan kurva standar penentuan BM protein.

BM markerMigrasi protein

marker RF (X) Log BM (Y)200.0 0,5 0,01 2,301116.3 9,75 0,17 2,06697.4 11,25 0,20 1,98866.3 20 0,36 1,82255.4 22,5 0,41 1,74436.5 34,25 0,62 1,56231.0 39,25 0,71 1,49121.5 50 0,91 1,33214.4 52 0,94 1,1586.0 54 0,98 0,984

Gambar 5.5 Kurva standar penentuan BM protein.

Berat molekul protein sampel ditentukan dengan cara mengkonversi data

nilai Rf sampel pada persamaan Y = 0,359X2 – 1,422X + 2,294. Dengan X nilai

Rf, sedang Y adalah nilai logaritma berat molekul protein. Nilai Rf sampel seperti

tampak pada Tabel 5.2.

39

Tabel 5.2 Nilai Rf sampel dari gel SDS-PAGE 12%.

Pita ke-Migrasi protein

sampelRF protein sampel

(X)1 0,6 0,012 1 0,023 2 0,034 4 0,075 11 0,206 15 0,277 20 0,368 24 0,439 25,5 0,4610 30 0,5411 31 0,5612 39 0,7113 43 0,7814 46 0,8315 50 0,9116 53 0,9617 54 0,98

Dari perhitungan berat molekul protein masing-masing pita sampel pada

lampiran 2, maka diketahui berat molekul masing-masing pita protein dari sampel

biofilm S. mutans adalah: 181, 176, 172, 154, 108, 90, 70, 58, 53, 43, 41, 28, 22,

19, 16, 14, dan 13 kDa.

5.6 Analisis Protein Antigenik Biofilm S. mutans dengan Western blot

Analisis protein antigenik biofilm S. mutans dilakukan dengan metode

Western blot, menggunakan sampel saliva dari individu karies (sIgA rendah) dan

non karies gigi (sIgA tinggi). Proses analisis protein menghabiskan waktu sekitar

7 jam, dengan rincian proses sebagai berikut: proses transfer protein pada

213 kDa

40

membran nitrocellulose 2,5 jam; inkubasi dengan antibodi primer (saliva) 2 jam;

inkubasi dengan antibodi sekunder (antihuman IgA) 1 jam; inkubasi dengan SA-

HARP selama 1 jam; dan inkubasi dengan substrat TMB 15 menit. Sampel saliva

yang memiliki sIgA rendah (sampel 1,2,3, dan 4) menunjukkan pita protein yang

lebih tipis dibandingkan dengan sampel yang memiliki sIgA tinggi (sampel 5,6,7,

dan 8). Data hasil analisis protein antigenik seperti tampak pada Gambar 5.7.

Gambar 5.6 Hasil analisis protein antigenik biofilm S. mutans. (Sampel 1, 2, 3, dan 4: sIgA rendah; Sampel 5, 6, 7, dan 8: sIgA tinggi).

Penentuan berat molekul protein antigenik dilakukan dengan cara

membandingkan pita protein hasil Western blot dengan profil protein hasil SDS-

PAGE 12% dan marker protein yang digunakan pada proses Western blot. Pita

protein hasil analisis Western blot yang merupakan protein antigenik biofilm

41

S. mutans sebagai biomarker risiko karies gigi sebanyak 4 buah, dengan berat

molekul 108, 43, 41, dan 28 kDa.