bab iii metode penelitian a. jenis...

21 Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah jenis penelitian eksperimen.

Termasuk jenis penelitian ekperimen karena observasi di bawah kondisi

buatan (artificial condition), dan kondisi tersebut dibuat dan diatur.

Penelitian ini dilakukan dengan mengadakan manipulasi objek penelitian

serta adanya kontrol sebagai perbandingan dalam eksperimen (Nazir,

2003:63)

Objek dalam penelitian ini adalah produksi pigmen yang dihasilkan

oleh M. purpureus yang dinyatakan dalam satuan Unit Absorbansi per

gram substrat. Kontrol dalam penelitian ini yaitu substrat tepung biji

durian yang tidak diberikan inokulum spora M. purpureus.

B. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan adalah desain Rancangan Acak

lengkap (RAL). Pada penelitian terdapat tiga variabel penelitian yaitu

variabel bebas, variabel terikat dan variabel kontrol. Variabel bebasnya

yaitu konsentrasi inokulum spora M. purpureus. Sedangkan variabel

terikatnya yaitu produksi pigmen M. purpureus. Kemudian untuk variabel

kontrolnya adalah Jenis substrat, jenis organisme yang digunakan, pH

substrat, waktu dan suhu inkubasi.

Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan yaitu inokulum spora M.

purpureusdengan konsentrasi 0%, 5%, 10%, 15%. Setiap perlakuan akan

dilakukan pengulangan dengan mengikuti rumus (t) (r) – 1 ≥ 20 (Gomez,

1995). Dimana t adalah perlakuan (treatment), sedangkan r adalah

pengulangan (replication).

22

Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Dengan demikian: (t) (r − 1) ≥ 20

(4) (r − 1) ≥ 20

(r − 1) ≥ 5

r ≥ 6

Berdasarkan perhitungan di atas, maka banyaknya pengulangan yang

harus dilakukan adalah minimal enam kali. Maka terdapat 24 unit

percobaan. 24 unit percobaan ini diletakkan secara acak, mengikuti aturan

bilangan acak yang diperoleh dengan menggunakan pengocokan secara

manual.Unit percobaan disusun seperti Tabel 3.1 dan untuk penempatan

botol dalam inkubator tersaji dalam Gambar 3.1.

Tabel 3.1. Desain Rancangan Acak Lengkap

91 66 65 9 162 158 105 24 114 112 17 42

31 142 23 150 85 133 27 40 100 68 161 73

52 14 16 8 156 34 26 144 90 148 94 97

13 87 54 25 145 55 113 67 77 63 15 82

110 81 12 20 125 19 123 10 152 136 107 39

121 32 28 1 137 62 108 56 69 99 57 102

72 38 45 103 129 11 134 92 79 75 126 61

50 109 118 37 60 166 131 143 30 153 78 95

43 5 80 46 146 111 44 155 104 76 70 164

117 151 93 101 89 98 160 124 84 21 159 140

53 147 106 59 128 4 7 127 29 41 83 48

2 139 88 74 33 132 122 115 138 71 119 49

141 22 6 58 130 47 154 3 51 36 167 120

135 35 151 168 165 116 86 149 96 18 163 64

23


Keterangan:

1. Konsentrasi inokulum 0% 2. Konsentrasi inokulum 5%

a. Hari ke 1: botol nomor 1-6 a. Hari ke 1: botol nomor 43-48

b. Hari ke 3 : botol nomor 7-12 b. Hari ke 3: botol nomor 49-54

c. Hari ke 5 : botol nomor 13-18 c. Hari ke 5: botol nomor 55-60

d. Hari ke 7 : botol nomor 19-24 d. Hari ke 7: botol nomor 61-66

e. Hari ke 9 : botol nomor 25-30 e. Hari ke 9: botol nomor 67-72

f. Hari ke 11: botol nomor 31-36 f. Hari ke 11:botol nomor 73-78

g. Hari ke 13: botol nomor 37-42 g. Hari ke 13: botol nomor 79-84

3. Konsentrasi inokulum 10% 4. Konsentrasi inokulum 15%

a. Hari ke 1: botol nomor 85-90 a. Hari ke 1 : botol nomor 127-132

b. Hari ke 3: botol nomor 91-96 b. Hari ke 3 : botol nomor 133-138

c. Hari ke 5: botol nomor 97-102 c. Hari ke 5 : botol nomor 139-144

d. Hari ke 7: botol nomor 103-108 d. Hari ke 7 : botol nomor 145-150

e. Hari ke 9: botol nomor 109-114 e. Hari ke 9 : botol nomor 151-156

f. Hari ke 11: botol nomor 115-120 f. Hari ke 11 : botol nomor 157-162

g. Hari ke 13: botol nomor 121-126 g. Hari ke 13 : botol nomor 163-168

24


Gambar 3.1 Penempatan botol fermentasi

(Sumber: Dokumentasi Pribadi )

C. Populasi dan Sampel

Populasi : Seluruh substrat tepung biji durian yang berada dalam

botol fermentor.

Sampel : 1 gram substrat tepung biji durian yang diambil dari botol

fermentor untuk pengukuran produksi pigmen M.

purpureus.

D. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Februari 2013 sampai dengan bulan

Juli 2013.Serta dilakukan di Laboratorium Jurusan Pendidikan Biologi

FPMIPA UPI.

25


E. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai

berikut:

1. Alat

Tabel 3.2 Alat Penelitian

No. Alat Spesifikasi Jumlah

1. Autoclave HL36AE 1 unit

2. Jarum inokulasi 3 unit

3. Tabung reaksi Pyrex 10 unit

4. Timbangan digital PT25.221.03.018BF 1 unit

5. Gelas ukur Pyrex, 250 mL 3 unit

6. Vorteks homogenizer PT25.221.03.044BM 1 unit

7. Shaker bath PT25.2221.03004 BM 1 unit

8. Spektrofotometer PT25-221-

03021BF(2/2) 1 unit

9. Alumunium foil 1 pack

10. Plastik tahan panas Ukuran ½ kg 40 lembar

11. Karet gelang 200 unit

13. pH indikator 50 lembar

14. Kain sumbat 60 unit

15. Haemocytometer 1 unit

16. Inkubator 1 unit

17. Erlenmayer Pyrex 500 mL 20 unit

18. Erlenmayer Pyrex 100 mL 25 unit

19. Termometer 0-100˚C 2 unit

20. Wadah plastik 168 unit

21. Mikroskop Listrik Shimadzu BI-71-16126 1 unit

26


22. Spatula 4 unit

23. Pembakar spirtus 1 unit

24. Korek api 1 kotak

25. Batang pengaduk 1 unit

26. Botol gelas ukuran 1 L 1 unit

27. Papan miring 1 unit

28. Hot plate & magnetic

stireer

PT25.221.03.023 BM

(1/2) 1 unit

29. Oven 1 unit

30. Loyang 1 unit

31. Pisau 1 unit

2. Bahan

No. Bahan Spesifikasi Jumlah

1. Monascus purpureus Kapang 18 isolat

2. Tepung biji durian Serbuk 1680 gram

4. Medium PDA Serbuk 10,4 gram

5. Ethanol 95% Cairan 840 mL

6. Aquades steril Cairan 500 mL

7. KH2PO4 Serbuk 2 gram

8. NH4NO3 Serbuk 5 gram

9. NaCl Serbuk 1 gram

10. MgSO47H2O Serbuk 1 gram

11. Spirtus Cairan Secukupnya

27


F. Prosedur Kerja

1. Tahap Persiapan

a. Pembuatan Medium PDA

Medium yang digunakan untuk menumbuhkan M.

purpureusadalah PDA (Potato Dekstrose Agar). Medium dibuat

dengan mencampurkan serbuk PDA dengan aquades dengan

takaran tertentu. Standar pembuatannya yaitu untuk 1 liter medium

PDA, dibutuhkan 39 gram serbuk PDA.Setelah dicampurkan

dengan aquades dan diaduk hingga homogen, medium dipanaskan

di hot plate dan magnetic stirer hingga mendidih.

b. Sterilisasi

Mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Semuanya

disterilkan di autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah

selesai, semua alat dan bahan disimpan di tempat yang aman. Alat-

alat yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan

alkohol.

2. Tahap Pra Penelitian

a. Identifikasi Monascus purpureus

Isolat kapang M. purpureus yang diperoleh dari Laboratorium

Mikrobiologi ITB selanjutnya dibiakan dalam medium kultur PDA

di laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FPMIPA UPI.

Penyimpanan dilakukan di suhu ruang.

Identifikasi M. purpureus dilakuakan melalui pengamatan

morfologi secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan

makroskopis dilakuakan dengan mengawati warna miselia dan

bentuk koloni M. purpureus. Sedangkan pengamatan mikroskopis

dilakukan dengan pembuatan slide culture lalu mengamati bentuk

spora, hifa, kleistotesia dan aleurokonidia M. purpureus di bawah

28


mikroskopdengan perbesaran 400x. Identifikasi mengacu pada

Chairoite et al. (2008) dan Pattangul et al. (2007).

b. Pemeliharaan dan Perbanyakan Monascus purpureus

Stok biakan disimpan pada suhu 40C. Sedangkan kapang yang

digunakan untuk penelitian dikultur pada inkubator suhu 30-310C.

Berikut kultur M. purpureus yang dibiakan dalam tabung reaksi

yang disajikan pada Gambar 3.2.

Gambar 3.2 Monascus purpureus Usia Kultur Enam Hari pada

Tabung Reaksi


c. Pembuatan Kurva Produksi Spora Monascus purpureus

Pembuatan kurva produksi spora M. purpureus bertujuan untuk

mengetahui jumlah spora yang diproduksi oleh M. purpureus.

Adapun cara yang dilakukan yaitu dengan mengambil koloni M.

Purpureus yang tumbuh di cawan Petri menggunakan pelubang

gabus berdiameter 0,6 mm. Potongan miselium M. Purpureus dari

koloni yang tumbuh pada cawan Petri ini kemudian diinokulasikan

29


pada medium PDA miring dalam tabung reaksi dan diinkubasi

pada suhu 30-31oC. Jumlah spora diamati setiapa hari dengan cara

memasukkan 9 ml aquades ke dalam PDA miring (Tim QC APH

golongan jamur, 2009). Melepaskan spora dengan cara mengeruk

secara perlahan suspensi spora dengan menggunakan jarum ose

sampel dihomogenkan dengan vortex dan dipindahkan ke dalam

tabung reaksi kosong, kemudian diteteskan satu tetes pada bidang

hitung haemocytometer, lalu menutupnya dengan gelas penutup,

Selanjutnya menghitung spora M. Purpureus di bawah mikroskop.

Kemudian dengan perbesaran 400x, hingga didapatkan bidang

hitung pada haemocytometer.Spora yang dihitung hanya yang

terletak pada kotak hitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5) dengan perbesaran

400x. penghitungan spora hanya di daerah bertanda kotak seperti

yang tersaji dalam Gambar 3.3.

Gambar 3.3 Haemocytometer

(Sumber: http://toolboxes.flexiblelearning.net.au/)

Dalam daerah yang diberi tanda kotak itu, terdapat 25 persegi

seperti Gambar 3.4.dari ke-25 persegi itu, dipilih lima kotak saja

untuk dijadikan tempat menghitung spora, yaitu kotak 1, 2, 3, 4, 5.

30


Gambar 3.4 Kotak Penghitungan Spora M. purpureus

(Sumber: Henderson, 2010)

Setiap kotak 1, 2, 3, 4, 5 memiliki empat kotak kecil.

Perhitungan spora mengikuti aturan seperti yang dijelaskan dalam

Gambar 3.5.

Gambar 3.5 Alur Penghitungan Spora M. purpureus

(Sumber: http://b110-wiki.dkfz.de/)

Setelah didapatkan jumlah spora M. Purpureus pada kotak

hitung 1, 2, 3, 4 dan 5, lalu dihitung jumlah spora/ml pada bidang

hitung dengan rumus sebagai berikut:

31


(mm2) t (mm) dx 10

3

Keterangan:

S: Jumlah spora/ml

X: Jumlah spora yang dihitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5)

L: Luas kotak hitung (0,04 x 5 = 0,2 mm2)

t: Kedalaman bidang hitung (0,1 mm)

d: Faktor pengenceran

103: Volume suspense yang diambil (1 ml = 10

3 mm

3)

(Sumber: Modifikasi dari Tim QC APH Golongan jamur)

d. Persiapan Tepung Biji Durian Sebagai Subtrat

Biji durian yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji

durian yang berasar dari durian lokal dengan jenis perwira yang

diperoleh dari penjual durian di daerah Sinampeul Majalengka,

Jawa Barat.Seperti yang tersaji dalam Gambar 3.6.

Gambar 3.6 Biji dan Buah Durian Jenis Perwira


Biji durian dicuci, kemudian merebusnya selama 10 menit

dalam air mendidih, ditiriskan, selanjutnya kulit biji durian

dikupas. Memotong biji durian dengan ketebalan 1 cm (Srianta,

2012). Selanjutnya ditaburi dengan garam untuk menghilangkan

lendir, dicampurkan, selanjutnya diaduk-aduk dibawah air

mengalir sampai mengeluarkan busa, kemudian mencuci potongan

biji durian dengan air mengalir sampai lendir berkurang dan

32


ditiriskan, mengoven sampai kering. Menghaluskan hasil

pengeringan dengan mesin penggiling dan mengayaknya hingga

diperoleh tepung biji durian. Seperti yang tersaji dalam gambar 3.7.

Gambar 3.7 Tepung Biji Durian

(Sumber: Dokumentasi Pribadi)

e. Persiapan Medium Fermentasi

Substrat yang digunakan sebanyak 10 gram tepung biji durian.

Kemudian dimasukan ke dalam botol fermentasi.kemudian

diautoklaf pada 1210C selama 15 menit. Lalu didinginkan sampai

suhu kamar.Kemudian ditambahkan 4 ml larutan nutrisi yang

mengandung (dalam gr/L): 2 g KH2PO4, 5 gr NH4NO3, 1 gr NaCl,

dan 1 gr MgSO4.7H2O. dilarutkan dengan aquades, ditambahkan

ke dalam subkultur lalu kelembaban substrat ini diatur hingga di

mencapai 65% dengan menambahkan sejumlah aquades dan

tingkat keasaman sebesar pH 6,5. Setelah semua proses telah

selesai lalu botol fermentasi tersebut di tutup dengan alumunium

foil. Kemudian di autoclave pada 1210C selama 20 menit dan

dinginkan sampai suhu kamar (Babitha et al., 2007)

33


f. Persiapan Inokulum Spora Monascus purpureus

Inokulum spora M. purpureus dibuat dengan cara mengikis

koloni M. purpureusdari permukaan PDA yang berusia 6 hari

dengan menggunakan 10 ml aquades steril. Kegiatan ini dilakukan

secara aseptik. Lalu suspensi spora yang telah dibuat kemudian

divorteks hingga homogen dan dihitung jumlah sporanya

menggunakan haemocytometer. Untuk mendapatkan banyaknya

suspensi spora yang diinokulasikan maka digunakan rumus sebagai

berikut.

Keterangan :

x : Banyaknya suspensi spora yang digunakan

n : Konsentrasi yang digunakan

10 : 10 gram substrat yang digunakan

Untuk konsentrasi inokulum 0% substrat tepung biji durian

tidak diinokulasikan dengan suspensi spora M. purpureus. Untuk

konsentrasi 5% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram

diinokulasikan dengan 0,5 ml suspensi spora. Untuk konsentrasi

10% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram

diinokulasikan dengan 1 ml suspensi spora. Kemudian untuk

konsentrasi 15% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10

gram diinokulasikan dengan 1,5 ml suspensi spora (Babitha, 2007).

g. Analisis Kandungan Amilum, Protein Tepung Biji Durian

Verietas Sinampeul

Analisis kandungan amilum (pati) dilakukan di Laboratorium

Teknologi Industri Pangan UNPAD dengan menggunakan metode

Met Luff School. Sedangkan analisis kandungan protein pada

34


tepung biji durian dilakukan di Laboratorium Teknologi Pangan

UNPAS dengan menggunakan metode Kjeldahl.

3. Tahap Penelitian

a. Fermentasi Substrat dengan Kapang Monascus purpureus

Medium fermentasi yang telah disterilkan tadi dibiarkan hingga

suhunya turun hingga ke suhu ruangan. Lalu diinokulasikan

dengan suspensi spora kapang M. Purpureus yang jumlah sporanya

106 spora/mL dengan konsentrasi inokulum yang terdiri dari 0%,

5%, 10%, 15% (v/b). Botol fermentasi ditutup dengan alumunium

foil steril agar tidak terjadi kontaminasi. Fermentasi akan

dilakukan pada suhu 30-32˚C selama 14 hari dalam kondisi statis

(Carvalho,2007).

b. Sampling Pengambilan Substrat

Sampling pengambilan substrat tepung biji durian yang telah

difermentasi oleh Monascus purpureus diambil mulai hari ke-1

hingga hari ke-14 (Carvalho,2007).

c. Penghitungan Absorbansi Pigmen M. purpureus

Penghitungan asorbansi pigmen merah dilakukan dengan cara

mengambil 1 gram sampel yang telah difermentasi dan

dikeringkan. Lalu ditambahkan dengan 5 ml ethanol 90%, lalu

dishaker dengan kecepatan 200 rpm selama 1 jam. Setelah itu,

pisahkan larutan hasil campuran ethanol dan sampel dengan

memasukannya ke dalam tabung 1,5 ml, kemudian disentrifuge

selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan lalu

dimasukkan ke dalam tabung cuvet dan diukur dengan

menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 500

nm (pigmen merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen

35


jingga). Spektrofotometer terlebih dahulu dikalibrasi menggunakan

ethanol 95% sebagai blanko (Pattanagul, 2007).

d. Analisis Data

Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa nilai absorbansi

pigmen M. purpureus pada panjang gelombang 500 nm (pigmen

merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen jingga).

Data yang diperoleh dianalisis menggunakan program SPSS versi

16.0 for window. Setelah dilakukan uji normalitas (Skewness-

Kurtosis) dan homogenitas (Levene test), didapatkan hasil bahwa

data produksi pigmen M. purpureus pada angkak tepung biji durian

berdistribusi normal tetapi tidak homogen, oleh karena itu

dilakukan analisis data secara non-parametrik menggunakan uji

Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.

36


G. Alur Penelitian

Alur penelitian yang dilakukan yaitu sebagai berikut:

Gambar 3.8 Diagram alir penelitian

Tahap Persiapan

a. Pembuatan medium PDA

b. Sterilisasi

Tahap Pra Penelitian

a. Identifikasi Monascus purpureus

b. Pemeliharaan dan perbanyakan Monascus purpureus

c. Pembuatan kurva produksi spora Monascus purpureus

d. Persiapan tepung biji durian sebagai substrat

e. Persiapan medium fermentasi

f. Persiapan inokulum spora Monascus purpureus

Tahap Penelitian

a. Fermentasi substrat dengan kapang Monascus purpureus

b. Penghitungan absorbansi pigmen Monascus purpureus

Analisis Data dan Penarikan Kesimpulan

Penulisan Skripsi

bab iii metode penelitian a. jenis...

Documents