5

dialirkan secara kontinu melalui kolom dan komponen demi komponen dari campuran yang pada akhirnya keluar dari kolom dapat dikumpulkan dan difraksionasi (Rouessac & Rouessac 1994).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan antara lain peralatan kaca, neraca analitik, oven, cawan porselin, eksikator, penguap putar, penangas air, pengaduk magnet, lempeng pemanas, spektrofotometer Genesys, bejana kromatografi, kolom, dan lampu UV. Bahan-bahan yang digunakan adalah daun salam keenam sampai kesepuluh dari pucuk yang berasal dari Citayam, etanol 96%, akuades, n-heksana, etil asetat, metanol, n-butanol, aseton, asam asetat glasial, dimetil sulfoksida (DMSO), FeCl3 1%, anhidrida asam asetat, kloroform, NH4OH, dietil eter, pereaksi Lieberman-Burchard, serbuk Mg, amil alkohol, H2SO4 2 M, pereaksi Dragendorff, Meyer, dan Wagner, HCl pekat, silika gel G60 (Merck 230-400 mesh), pelat silika gel G60 F254 (Merck), alumunium foil, Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.H2O, NaOH, NaCl, Na2SO3, pati terlarut, kalium natriumtartarat, tablet Glucobay (Bayer), enzim α-amilase tipe VI-B (Sigma Aldrich Inc) dan asam 3,5-dinitrosalisilat (Sigma Aldrich Inc) .

Metode

Metode penelitian mengikuti diagram alir pada Lampiran 1 yang meliputi penyiapan sampel, penentuan kadar air daun salam dan serbuk daun salam, ekstraksi serbuk daun salam, ekstraksi cair-cair, uji aktivitas α-amilase, penentuan eluen terbaik dengan KLT, fraksinasi menggunakan kromatografi kolom, analisis fitokimia dari ekstrak dan fraksi teraktif. Penyiapan Sampel

Daun salam dikumpulkan dari daerah Kampung Baru, Citayam, Bogor. Daun salam yang digunakan adalah daun keenam sampai kesepuluh dari pucuk tanaman. Daun salam dicuci, dipotong kecil-kecil, dikering-udarakan, kemudian digiling hingga diperoleh serbuk daun salam. Serbuk tersebut selanjutnya disimpan dalam wadah kedap udara.

Penentuan Kadar Air Serbuk Daun Salam Cawan porselin dicuci bersih dan dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 °C selama 30 menit. Selanjutnya cawan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, kemudian ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel dimasukkan ke dalam cawan dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 °C selama 2x24 jam. Cawan beserta isinya didinginkan dalam eksikator sekitar 30 menit kemudian ditimbang. Proses pengeringan dan penimbangan diulang kembali sampai diperoleh bobot konstan. Penentuan kadar air dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

Kadar air (%) = A – B × 100% A

Keterangan: A = bobot bahan sebelum dikeringkan (g) B = bobot bahan setelah dikeringkan (g) Ekstraksi

Serbuk daun salam sebanyak 100 g dimaserasi dengan 1 L etanol 96% pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah itu, maserat dipisahkan kemudian residu dimaserasi kembali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Maserasi dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Semua maserat dikumpulkan dan dipekatkan dengan penguap putar. Bobot ekstrak kering yang diperoleh kemudian ditimbang. Rendemen ekstrak dihitung dengan membandingkan bobot ekstrak yang diperoleh terhadap bobot sampel awal, dengan faktor koreksi berupa kadar air sampel yang digunakan. Ekstraksi Cair-Cair Ekstrak Daun Salam

Ekstrak etanol daun salam sebanyak 3 g ditambahkan dengan 100 mL akuades dan dimasukkan ke dalam corong pisah. Larutan kemudian ditambah n-heksana dengan perbandingan 1:1 v/v dan diekstraksi. Fraksi n-heksana dipisahkan dan fraksi air diekstraksi kembali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama sampai diperoleh fraksi n-heksana dari 3 kali pengulangan ekstraksi. Fraksi air yang masih tersisa kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1:1 v/v. Fraksi etil asetat dipisahkan dan ekstraksi diulang kembali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama sampai diperoleh fraksi etil asetat dari 3 kali pengulangan ekstraksi. Ketiga fraksi yang dihasilkan, yaitu fraksi n-heksana, etil asetat,

6

dan air kemudian dipekatkan dengan penguap putar. Rendemen ekstrak dihitung dengan membandingkan bobot ekstrak yang diperoleh terhadap bobot sampel awal.

Pembuatan Larutan untuk Uji Inhibisi α-Amilase

Larutan enzim α-amilase 5U/mL. Enzim α-amilase sebanyak 0.0215 g dilarutkan dalam 100 mL bufer fosfat 20 mM (pH 6.9) yang mengandung NaCl 6.7 mM, diaduk sampai homogen. Larutan substrat 0.5%. Pati terlarut sebanyak 0.5 g dilarutkan dalam 100 mL akuades, dididihkan dengan lempeng pemanas sambil terus diaduk menggunakan pengaduk magnet hingga homogen. Pendidihan dilakukan selama 15 menit sampai diperoleh larutan pati yang jernih. Larutan Asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) 1%. Sebanyak 1 g kristal NaOH dilarutkan dalam 100 mL akuadestilata, diaduk menggunakan pengaduk magnet, ditambahkan 18.2 g kalium natrium tartarat, sambil terus diaduk lalu ditambahkan 1 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 0.15 g Na2SO3, pengadukan dilanjutkan sampai homogen. Uji Inhibisi α-Amilase (Odhav et al. 2010)

Pengujian inhibisi α-amilase dilakukan terhadap ekstrak etanol, fraksi hasil ekstraksi cair-cair, dan fraksi hasil kromatografi kolom. Inhibisi α-amilase ditentukan dengan menghitung gula pereduksi yang dihasilkan pada kondisi percobaan. Inhibisi enzim dihitung sebagai penurunan jumlah maltosa yang terbentuk. Metode asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS), metode kromogenik yang dikembangkan oleh Bernfeld pada tahun 1955, digunakan untuk memperkirakan ekivalen maltosa yang terbentuk. Pengujian dilakukan dengan menyiapkan larutan ekstrak etanol, fraksi hasil ekstraksi cair-cair, dan fraksi hasil kromatografi kolom dengan konsentrasi 0.1% (b/v dalam DMSO). Sebanyak 1 mL larutan sampel ditambahkan 1 mL larutan enzim 5U/mL, dihomogenkan, diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ºC. Setelah itu, ditambahkan 1 mL larutan substrat 0.5% b/v dalam akuades, dihomogenkan, diinkubasi kembali selama 10 menit. Larutan hasil inkubasi, ditambahkan 1 mL larutan DNS 1% lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit sampai terbentuk warna merah kecoklatan. Larutan tersebut didinginkan sampai suhu ruang lalu ditambahkan 10 mL akuades. Sistem reaksi

pengujian enzim untuk satu sampel dapat ditampilkan pada Tabel 1. Tabel 1 Sistem reaksi pengujian enzim α-

amilase untuk satu sampel Larutan Blanko

(mL) Kontrol

(mL) S0

(mL) S1 (mL)

Sampel - - 1 1 DMSO 1 1 - - Bufer 1 - 1 - Enzim - 1 - 1

Inkubasi 37 ºC (30 menit) Substrat 1 1 1 1

Inkubasi 37 ºC (10 menit) DNS 1 1 1 1 Pemanasan dengan penangas air mendidih

(10 menit) Akuades 10 10 10 10

Serapan larutan diukur menggunakan spektrofotometer Genesys pada panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang ini merupakan panjang gelombang maksimum asam 3-amino-5-nitrosalisilat. Serapan larutan yang diukur adalah serapan blanko, serapan kontrol, serapan sampel dengan enzim dan sampel tanpa enzim. Larutan kontrol berisi DMSO, enzim, substrat, dan DNS, sedangkan larutan blanko sama seperti kontrol hanya tidak berisi larutan enzim tetapi bufer. Larutan sampel dengan enzim berisi larutan sampel, enzim, substrat, dan DNS, sedangkan pada larutan sampel tanpa enzim, larutan enzim diganti dengan bufer. Banyaknya maltosa yang terbentuk sebanding dengan asam 3-amino-5-nitrosalisilat yang terukur. Semakin banyak maltosa yang terbentuk, semakin tinggi serapan asam 3-amino-5-nitrosalisilat yang terukur. Persentase inhibisi α-amilase ditentukan menggunakan persamaan berikut : % inhibisi = K B S B S B

K B × 100%

Keterangan : K : Serapan kontrol B : Serapan blanko S1 : Serapan sampel dan produk yang

terbentuk S0 : Serapan sampel Penentuan Eluen Terbaik

Pelat kromatografi lapis tipis (KLT) yang digunakan adalah pelat aluminium jenis silika gel G60 F254 dari Merck dengan ukuran lebar 1 cm dan panjang 10 cm. Sebelum digunakan, pelat KLT dikeringkan terlebih dahulu di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 ºC.

7

Fraksi air daun salam ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 15 kali penotolan. Setelah kering, pelat dielusi dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Elusi dilakukan dengan menggunakan eluen tunggal, yaitu kloroform, etil asetat, n-butanol, etanol, aseton, metanol, asetat glasial, dan air. Noda yang dihasilkan dari proses elusi masing-masing eluen diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluen yang menghasilkan noda terbanyak dan terpisah dipilih sebagai eluen terbaik. Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom

Fraksionasi dilakukan dengan kolom kemas menggunakan silika gel sebanyak 60 g. Diameter kolom yang digunakan sebesar 2.5 cm dengan tinggi adsorben 30 cm. Sampel berupa fraksi air daun salam 1.50 g diaplikasikan ke dalam kolom. Pemisahan komponen dilakukan dengan elusi landaian menggunakan eluen metanol:air dengan perbandingan (100:0) dan (0:100). Eluat ditampung setiap 5 mL dalam tabung reaksi yang telah diberi nomor kemudian diuji dengan KLT menggunakan eluen terbaik. Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV dengan λ 254 dan 366 nm. Eluat dengan nilai Rf dan pola KLT yang hampir sama digabungkan sebagai satu fraksi. Setiap fraksi dipekatkan kemudian dihitung rendemennya. Semua fraksi yang diperoleh digunakan untuk analisis tahap selanjutnya, yaitu uji inhibisi α-amilase untuk menentukan fraksi teraktif. Fraksi teraktif yang diperoleh dianalisis kandungan fitokimia.

Uji Fitokimia

Uji fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol, fraksi teraktif hasil ekstraksi cair-cair, dan fraksi teraktif hasil pemisahan dengan kromatografi kolom. Uji Flavonoid. Sampel sebanyak 0.1 g ditambah 10 mL air panas, dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Filtrat sebanyak 10 ml ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran dikocok kuat. Uji positif ditandai dengan timbulnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Uji Saponin dan Tanin. Sampel sebanyak 0.1 g dilarutkan dengan 10 mL akuadestilata kemudian dididihkan selama 5 menit. Campuran disaring dan filtrat dibagi ke dalam 2 tabung reaksi. Bagian pertama digunakan untuk uji saponin; filtrat didiamkan

sampai agak dingin kemudian dikocok kuat sampai timbul busa. Bila busa stabil dalam 10 menit, maka filtrat positif mengandung saponin. Bagian kedua digunakan untuk uji tanin; filtrat ditambahkan FeCl3 1%. Bila dihasilkan warna hijau, biru, atau hitam, maka filtrat positif mengandung tanin. Uji Alkaloid. Sampel sebanyak 0.1 g dilarutkan dalam 10 mL kloroform dan ditambah beberapa tetes NH4OH kemudian disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi ditambahkan 10 tetes H2SO4 2 M, dikocok kuat kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorff. Uji positif apabila terbentuk endapan dengan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Uji Triterpenoid dan Steroid sebanyak 0.1 g dilarutkan dalam 25 mL etanol panas, disaring, dan residu ditambahkan dietil eter. Filtrat ditambahkan 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan munculnya warna merah atau ungu untuk triterpenoid dan hijau atau biru untuk steroid.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kadar Air Daun Salam

Penetapan kadar air dalam suatu bahan bertujuan mengetahui banyaknya air yang terkandung dalam suatu bahan, mengoreksi rendemen hasil ekstraksi, mengetahui masa simpan bahan serta ketahanan bahan tersebut terhadap mikrob. Dalam penelitian ini, penetapan kadar air dilakukan terhadap daun salam segar dan serbuk daun salam kering. Kadar air daun salam segar yang diperoleh sebesar 60.98% (b/b daun segar) (Lampiran 2). Air yang terkandung dalam daun salam lebih sedikit dibandingkan dengan air yang terkandung dalam kebanyakan daun tumbuhan, yaitu sekitar 90% (Harborne 1987). Serbuk daun salam diperoleh dengan mengeringkan daun salam pada suhu kamar, setelah kering daun lalu dihaluskan. Tujuan pengeringan adalah mengurangi air yang terdapat dalam daun sehingga memperpanjang masa simpan, karena mikrob tidak dapat menggunakan air yang tersisa untuk tumbuh. Selain itu, jika kadar air dalam daun masih