1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Gelatin merupakan salah satu jenis protein konversi yang diperoleh

melalui proses hidrolisis kolagen dari kulit, tulang dan jaringan serat putih (white

fibrous) hewan. Gelatin termasuk protein yang unik karena mampu membentuk

gel yang thermo-reversible dengan suhu leleh yang dekat dengan suhu tubuh,

serta larut dalam air. Dalam industri makanan, gelatin berfungsi sebagai penstabil,

pengental (tickenner), pengemulsi (emulsifier), pembentuk jeli, pengikat air,

pengendap dan pembungkus makanan (edible coating) (Damanik, 2005). Di

bidang farmasi dan medis, gelatin digunakan sebagai matriks untuk implan pada

pemberian injeksi mikrosfer dan infus intravena (Pollack, 1990). Dalam industri

farmasi, gelatin digunakan pada pembuatan cangkang kapsul keras maupun lunak,

pengembang plasma dan perawatan luka. Gelatin yang rendah kalori digunakan

dalam bahan makanan untuk meningkatkan kadar protein. Gelatin juga digunakan

untuk mengurangi kadar karbohidrat dalam makanan dan diformulasikan untuk

pasien diabetes (Karim dan Bhat, 2009).

Sumber utama gelatin adalah dari tulang dan kulit sapi serta babi. Produksi

gelatin dari bahan baku kulit babi mencapai 44%, kulit sapi 28%, tulang sapi 27%

dan porsi lainnya 1%, dengan total produksi dunia mencapai 326.000 ton (GME,

2009). Penggunaan gelatin dari sumber mamalia memiliki beberapa keterbatasan

dan halangan dari aspek religi, sosial dan kesehatan. Masyarakat Yahudi dan

2

Islam memiliki pantangan untuk mengonsumsi bahan-bahan dari babi, sedangkan

masyarakat Hindu tidak mengonsumsi bahan-bahan dari sapi. Adanya penyakit

Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) atau dikenal sapi gila (mad cow) juga

merupakan kendala pemakaian gelatin dari sapi. Oleh karenanya, pencarian

gelatin alternatif yang tidak bersumber dari babi dan sapi sangat dibutuhkan

(Karim dan Bhat, 2009). Dalam hal tersebut, gelatin ikan merupakan alternatif

yang potensial untuk mengganti peranan gelatin mamalia (babi dan sapi) dalam

beberapa penggunaan.

Gelatin ikan berbeda dengan gelatin mamalia berdasarkan pada suhu leleh,

suhu pembentukan gel dan kekuatan gel. Perbedaan tersebut disebabkan oleh

perbedaan kandungan asam amino, terutama prolin dan hidroksiprolin.

Hidroksiprolin adalah asam amino turunan prolin. Keduanya bertanggung jawab

pada stabilitas struktur kolagen (Norziah, 2009). Salah satu tulang ikan yang

berpotensi digunakan sebagai bahan baku gelatin ikan adalah tulang ikan lele

dumbo (Clarias gariepinus), karena lele dumbo merupakan jenis ikan yang

banyak dibudidayakan di Indonesia. Produksi ikan lele di Indonesia mencapai

162.000 ton pada tahun 2008, dengan proporsi tulang ikan terhadap tubuh ikan

mencapai 12,4% (Abdullah, 2005). Pembuatan gelatin dari tulang ikan sangat

membantu meningkatkan nilai ekonomis limbah ikan yang selama ini belum

termanfaatkan secara optimal dan membantu pemenuhan gelatin halal dalam

negeri.

Untuk diaplikasikan pada industri makanan dan farmasi, gelatin ikan harus

diproses untuk mendapatkan karakteristik yang sesuai. Jumlah bahan baku harus

3

banyak dan murah sehingga dapat diproduksi terus menerus secara efisien oleh

industri (Junianto, 2006). Berbagai penelitian menunjukkan bahwa gelatin yang

dihasilkan dari tulang ikan memiliki kualitas yang lebih rendah dibandingkan

dengan gelatin dari sapi dan babi. Salah satu sebab utamanya adalah gelatin ikan

memiliki nilai kekuatan gel yang rendah. Sementara itu, cerminan kualitas gelatin

yang baik dan dapat digunakan untuk sediaan farmasi adalah gelatin yang

memiliki nilai kekuatan gel tinggi. Oleh karena itu sangat diperlukan penelitian

lebih lanjut sebagai upaya menjawab dan memberikan solusi terhadap

permasalahan yang ada.

Penelitian telah dilakukan untuk memodifikasi gelatin ikan agar lebih

berkualitas. Pencampuran gelatin ikan dengan biopolimer lain seperti karagenan,

kitosan dan pektin merupakan salah satu usaha yang dapat meningkatkan

karakeristik gelatin ikan (Chen dkk, 2003; Uresti dkk, 2003; Haug dkk, 2004a).

Penelitian lebih lanjut dengan penambahan plasticizers seperti gliserol, sorbitol,

sukrosa, polietilen glikol (Tanaka dkk, 2001; Vanin dkk, 2005) dan agen garam

(Fernandez-Diaz dkk, 2001; Ramirez dkk, 2002; Haug dkk, 2004b) dapat

meningkatkan karakteristik film atau gel. Penambahan senyawa kimia yang dapat

membentuk ikatan silang seperti glutaraldehid, formaldehid dan glioksal (Bigi

dkk, 2001; de Carvalho dan Grosso 2004) atau enzim seperti transglutaminase

juga dapat meningkatkan sifat gelatin ikan. Transglutaminase merupakan enzim

yang mengkatalisis polimerisasi dan membentuk ikatan silang protein melalui

pembentukan ikatan kovalen antar molekul (Motoki dkk, 1998). Transglutaminase

yang lazim digunakan adalah enzim yang berasal dari mikrobia atau disebut

4

MTGase dan secara komersial telah dipasarkan oleh beberapa produsen (Puruhita,

2011).

Penggunaan gelatin cukup luas dalam berbagai aplikasi, tetapi masih

terdapat berbagai kendala terkait halal atau tidaknya gelatin mamalia bagi

konsumen. Berdasarkan kenyataan tersebut, maka pencarian sumber gelatin

alternatif seperti dari ikan serta peningkatan produksinya mutlak diperlukan.

B. Perumusan Masalah

Berdasarkan pada latar belakang masalah yang telah diuraikan tersebut,

maka dapat dibuat rumusan permasalahan sebagai berikut:

1. Seperti apakah karakteristik proksimat, fisikokimia dan spektra inframerah

gelatin hasil ekstraksi tulang ikan lele dumbo (Clarias gariepinus)?

2. Apakah enzim transglutaminase dapat meningkatkan viskositas dan kekuatan

gel gelatin ikan lele dumbo (Clarias gariepinus)?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan umum penelitian adalah memproduksi gelatin ikan dari

pemanfaatan limbah tulang ikan lele dumbo (Clarias gariepinus). Secara khusus

penelitian bertujuan untuk:

1. Melakukan analisis proksimat, fisikokimia, dan penentuan spektra inframerah

gelatin hasil ekstraksi tulang ikan lele dumbo (Clarias gariepinus).

2. Mengoptimalisasi gelatin ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) dengan enzim

tranglutaminase untuk meningkatkan viskositas dan kekuatan gelnya.

5

D. Tinjauan Pustaka

1. Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus)

Menurut Bachtiar (2006), lele dumbo merupakan spesies baru yang

diperkenalkan pada tahun 1984. Lele bertubuh besar tersebut adalah hasil

persilangan antara induk betina lele asli Taiwan dan induk pejantan yang berasal

dari Afrika. Lele tersebut masuk ke Indonesia pertama kali pada tahun 1986, yang

diimpor dari Taiwan. Saat ini, penyebaran lele dumbo di Indonesia sudah sangat

luas. Sejak tahun 2002, dapat dipastikan bahwa di setiap wilayah Indonesia dapat

dijumpai kolam lele dumbo. Di Indonesia dikenal banyak jenis lele, diantaranya

lele lokal, lele dumbo, lele phiton dan lele babon (lele Kalimantan). Namun, yang

dibudidayakan hanya lele lokal (Clarius barracus) dan lele dumbo (Clarias

gariepinus). Jenis yang kedua lebih banyak dikembangkan karena

pertumbuhannya lebih cepat dan ukurannya lebih besar daripada lele lokal.

Berdasarkan hasil penelitian, lele dumbo memiliki kandungan gizi yang

cukup tinggi. Setiap 100 gram dagingnya mengandung 18,2 gram protein. Lele

dumbo berukuran kecil dengan bobot 500 gram dan mengandung 12 gram protein,

energi 149 kalori, lemak 8,4 gram dan karbohidrat 6,4 gram. Komposisi gizi

sebesar ini jarang dimiliki oleh daging-daging sumber protein lainnya. Saat ini

lele dumbo juga sudah banyak dijual di rumah makan, restoran, hotel dan warung

kaki lima dalam berbagai olahan (Khairuman dan Amri, 2008). Berdasarkan

taksonominya, lele dumbo diklasifikasikan ke dalam:

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

6

Klas : Pisces

Ordo : Ostariophysi

Famili : Clariidae

Genus : Clarias

Spesies : Clarias gariepinus (Sutrisno, 2006).

Gambar 1 menunjukkan bahwa ikan lele dumbo memiliki kulit yang licin,

berlendir dan sama sekali tidak memiliki sisik. Warnanya hitam keunguan atau

kemerahan dengan loreng-loreng seperti baju tentara. Warna kulit akan berubah

menjadi mozaik hitam putih jika lele sedang dalam kondisi stres, dan akan

menjadi pucat jika terkena sinar matahari langsung. Lele dumbo memiliki kepala

yang panjang, hampir seperempat dari panjang tubuhnya. Tanda yang khas dari

lele dumbo adalah tumbuhnya empat pasang sungut seperti kumis di dekat

mulutnya. Sungut berfungsi sebagai alat penciuman serta alat peraba saat mencari

makanan. Lele dumbo memiliki 3 buah sirip tunggal, yaitu sirip punggung yang

berfungsi sebagai alat berenang, sirip subur dan sirip ekor yang berfungsi sebagai

alat bantu untuk mempercepat dan memperlambat gerakan. Selain itu, lele dumbo

juga mempunyai dua sirip berpasangan, yaitu sirip dada dan sirip perut. Sirip dada

Gambar 1. Ikan Lele Dumbo (Sumber: www.commons.wikimedia.com)

7

mempunyai jari-jari yang keras dan runcing yang biasa disebut patil. Alat tersebut

berfungsi sebagai senjata sekaligus alat bantu gerak ke kanan dan ke kiri.

Walaupun berfungsi sebagai senjata, patil ini tidak memiliki racun (Bachtiar,

2006).

2. Kolagen

Kolagen merupakan komponen struktural utama dari jaringan ikat putih

(white connetive tissue) yang meliputi hampir 30% dari total protein pada jaringan

dan organ tubuh vertebrata dan invertebrata. Pada mamalia, kolagen terdapat di

kulit, tendon, tulang rawan dan jaringan ikat. Demikian juga pada burung dan

ikan, sedangkan pada invertebrata kolagen terdapat pada dinding sel (Bailey dan

Light, 1989). Kolagen mengandung sekitar 33% glisin, 21% prolin, dan 14%

hidroksiprolin, suatu asam amino yang dihasilkan melalui modifikasi

pascatranslasi residu prolin (Smith dkk, 2000). Kolagen murni sangat sensitif

terhadap reaksi enzimatis dan kimiawi. Perlakuan alkali menyebabkan kolagen

mengembang dan menyebar, yang sering dikonversi menjadi gelatin. Disamping

pelarut alkali, kolagen juga larut dalam pelarut asam (Bennion, 1980).

Molekul dasar pembentuk kolagen disebut tropokolagen dengan BM

300.000, yang di dalamnya terdapat tiga rantai polipeptida yang sama panjang dan

bersama-sama membentuk struktur heliks (Gambar 2). Masing-masing rantai

polipeptida mengandung sekitar 1.000 residu asam amino. Sewaktu ketiga rantai

polipeptida tersebut saling melilit satu sama lain, maka terbentuk supercoil yang

merupakan tropokolagen (Smith dkk, 2000).

8

Setiap tiga rantai polipeptida dalam unit tropokolagen membentuk struktur

heliks tersendiri, bersama-sama dengan ikatan hidrogen antara gugus NH dari

residu glisin pada rantai yang satu dengan gugus CO pada rantai lainnya. Cincin

pirolidin, prolin, dan hidroksiprolin membantu pembentukan rantai polipeptida

dan memperkuat tripel heliks (Wong, 1989). Setiap belokan tripel heliks

mengandung 3 residu asam amino, sehingga setiap asam amino ketiga berkontak

erat dengan dua untai yang lain di bagian tengah struktur. Hanya glisin, yang tidak

memiliki rantai samping yang cocok dengan posisi tersebut. Setiap residu asam

amino ketiga pada tropokolagen adalah glisin. Dalam urutan, residu prolin sering

mengikuti residu glisin, sehingga urutannya dapat digambarkan sebagai Gly-X-Y,

yang mana X sering berupa prolin dan Y adalah semua asam amino yang dijumpai

pada kolagen (Smith dkk, 2000).

Tropokolagen adalah salah satu contoh protein yang mengalami modifikasi

pascatranslasi ekstensif. Reaksi hidroksilasi menghasilkan residu hidroksiprolin

dari residu prolin, dan hidroksilisin dari residu lisin. Reaksi tersebut terjadi setelah

sintesis protein (Gambar 3) dan memerlukan vitamin C (asam askorbat). Residu

hidroksiprolin terlibat dalam pembentukan ikatan hidrogen yang membantu

menstabilkan tripel heliks (Smith dkk, 2000).

Gambar 2. Heliks Tropokolagen (Sumber: Smith dkk, 2000)

9

Konversi kolagen yang bersifat tidak larut dalam air menjadi gelatin yang

larut dalam air merupakan transformasi penting dalam pembuatan gelatin. Tulang

atau kulit agar dapat diesktraksi kolagennya harus diberi perlakuan awal.

Ekstraksi tersebut dapat menyebabkan pemutusan ikatan hidrogen diantara ketiga

rantai tropokolagen menjadi tiga rantai bebas, dua rantai saling berikatan, dan satu

rantai bebas, serta tiga rantai yang masih berikatan (Poppe, 1977). Perlakuan

pemanasan atau penambahan zat seperti asam, basa, urea, kalsium dan

permanganat dapat menyebabkan larutan tropokolagen terdenaturasi.

Tropokolagen yang terdenaturasi akan terdisosiasi menjadi tiga komponen, yaitu

Gambar 3. Hidroksilasi Residu Prolin dan Lisin dalam Kolagen (Sumber: Martianingsih dan Atmaja, 2009)

10

α, β dan γ. Komponen α merupakan rantai tunggal polipeptida dengan bobot

molekul kurang lebih sepertiga dari bobot molekul tropokolagen, sementara

komponen β dan γ merupakan dimer dan trimer yang dibentuk dari ikatan silang

(Parker, 1982).

Kemampuan pembentukan gel tergantung pada karakteristik spesies ikan.

Kandungan NaCl yang rendah berpengaruh nyata terhadap kekuatan gel kolagen

dari kulit ikan, tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap kemampuan gel kolagen

dari tulang (Montero dan Borderias, 1991). Kolagen diaplikasikan di berbagai

bidang seperti kosmetik, biomedis, farmasi dan lain-lain. Soluble kolagen

memiliki kegunaan yang lebih luas di berbagai bidang karena memiliki

karakteristik yang khusus, termasuk biodegradabilitas dan antigenisitasnya yang

lemah. Kolagen yang berasal dari mamalia memiliki perbedaan dengan kolagen

yang terbuat dari ikan. Menurut Fernandez-Diaz dkk (2001), kolagen kulit ikan

lebih mudah hancur daripada kolagen kulit hewan, yang mana kedua jenis kolagen

tersebut akan hancur oleh proses pemanasan.

3. Gelatin

Gelatin adalah protein yang diperoleh dari jaringan kolagen hewan yang

terdapat pada kulit, tulang dan jaringan ikat. Gelatin yang ada di pasaran

umumnya diproduksi dari kulit dan tulang sapi atau babi. Di Indonesia, kebutuhan

industri terhadap gelatin dipenuhi dengan impor dari Prancis, Jerman, Jepang dan

India. Data impor gelatin yang tercatat dalam BPS (2006) diberikan pada Tabel 1.

11

Tabel 1. Data Impor Gelatin Tahun 2002-2006

Tahun Bobot (Kg) Nilai (US$) Januari-Mei 2006 1.213.111 4.215.779

2005 2.630.692 8.603.802 2004 2.145.916 8.001.714 2003 2.144.372 6.801.882 2002 4.291.579 10.749.199

(Sumber: BPS, 2006)

Susunan asam amino gelatin hampir mirip dengan asam amino kolagen,

yang mana glisin merupakan asam amino utama dan berkontribusi sebesar 2/3 dari

seluruh asam amino yang menyusunnya, sementara itu 1/3 asam amino yang

tersisa diisi oleh prolin dan hidroksiprolin (Chaplin, 2005).

C N C

H2C N

H2C

H2C

CH2

CH

C

HN

CH

R

C NH

H2C

C

HN

CH

R

C

N

H2C

H2C

CH2

CH

C

O O O O O

O

O

Bobot molekul gelatin secara umum berkisar antara 20.000-250.000.

Secara fisika dan kimia, gelatin berwarna kuning cerah atau transparan, berbentuk

serpihan atau tepung, berbau dan mempunyai rasa, larut dalam air panas, gliserol

dan asam asetat, serta tidak larut dalam pelarut organik. Gelatin dapat

mengembang dan menyerap air 5-10 kali bobot asalnya. Disamping itu, gelatin

dapat menjendal dalam air dingin. Menurut Norland (1997), gelatin mudah larut

dalam air pada suhu 71,1°C dan cenderung membentuk gel pada suhu 48,9°C.

Gambar 4. Struktur Gelatin (Sumber: Poppe, 1992)

12

Sedangkan menurut Montero dkk (2000), suhu pemanasan yang dilakukan untuk

melarutkan gelatin sekurang-kurangnya 49°C atau biasanya pada suhu 60–70°C.

Menurut de Man (1997), proses pengubahan kolagen menjadi gelatin

melibatkan tiga perubahan, sebagai berikut:

a. Pemutusan sejumlah ikatan peptida untuk memperpendek rantai.

b. Pemutusan atau pengacauan sejumlah ikatan samping antar rantai.

c. Perubahan konfigurasi rantai.

Gelatin terbagi menjadi dua tipe berdasarkan perbedaan proses

pengolahannya, yaitu tipe A dan tipe B. Dalam pembuatan gelatin tipe A, bahan

baku diberi perlakuan perendaman dalam larutan asam yang akan mempunyai titik

isoeletrik antara pH 6 dan 9, sehingga proses tersebut dikenal dengan sebutan

proses asam. Dalam pembuatan gelatin tipe B, perlakuan yang diaplikasikan

adalah perlakuan basa yang akan mempunyai titik isoelektrik pada pH antara 4,7

hingga 5. Proses tersebut disebut proses alkali (Utama, 1997).

Tabel 2. Sifat Gelatin Berdasarkan Tipenya

Sifat Tipe A Tipe B Kekuatan gel (gram Bloom) 50,0-300,0 50,0-300,0

Viskositas (cP) 1,50-7,50 2,00-7,50 Kadar abu (%) 0,30-2,00 0,50-2,00

pH 3,80-6,00 5,00-7,10 Titik isoelektrik 7,00-9,00 4,70-5,40

(Sumber: GMIA, 2007)

Sifat gelatin berdasarkan tipenya diberikan pada Tabel 2. Gelatin Tipe A

biasanya secara khusus diproduksi dari kulit babi, sedangkan gelatin Tipe B

diproduksi dari kulit sapi, kambing dan kerbau atau dari tulang binatang yang

13

sudah dihilangkan mineralnya (demineralised bones). Menurut Wiyono (2001),

gelatin ikan dikatagorikan sebagai gelatin tipe A.

Proses asam secara ekonomis lebih disukai dibandingkan proses basa

karena perendaman yang dilakukan dalam proses asam relatif lebih singkat

dibandingkan proses basa (Wiyono, 2001). Asam mampu mengubah serat kolagen

tripel heliks menjadi rantai tunggal, sedangkan larutan perendam basa hanya

mampu menghasilkan rantai ganda. Hal tersebut menyebabkan, pada waktu yang

sama, jumlah kolagen yang dihidrolisis oleh larutan asam lebih banyak daripada

larutan basa (Ward dan Court, 1977). Proses produksi utama gelatin dibagi dalam

tiga tahap, pertama persiapan bahan baku antara lain penghilangan kornponen non

kolagen dari bahan baku dengan atau tanpa pengurangan ikatan antara komponen

kolagen, kedua konversi kolagen menjadi gelatin, dan ketiga pemurnian serta

perolehan gelatin dalarn bentuk kering (Junianto, 2006).

Pada tahap persiapan dilakukan pencucian pada kulit atau tulang agar

bersih dari sisa daging, sisik dan lapisan luar yang mengandung deposit lemak

tinggi. Proses tersebut dinamakan degreasing dan dilakukan pada suhu antara titik

cair lemak dan suhu koagulasi albumin tulang yaitu 32-80°C (Ward dan Court,

1977). Pada tulang, perlu dilakukan proses demineralisasi yang bertujuan untuk

menghilangkan garam kalsium dan garam lainnya dalam tulang, sehingga

diperoleh tulang yang sudah lumer yang disebut dengan ossein (Utama, 1997).

Selanjutnya pada kulit atau ossein dilakukan tahap penggembungan (swelling),

yang bertujuan untuk menghilangkan kotoran dan mengubah kolagen menjadi

gelatin (Surono dkk., 1994). Pada tahap tersebut, perendaman dapat dilakukan

14

dengan larutan asam organik seperti asam asetat, sitrat, fumarat, askorbat, malat,

suksinat, tartrat dan asam lainnya yang aman dan tidak menusuk hidung (Choi dan

Regenstein, 2000). Untuk mendapatkan konsentrasi yang diharapkan, larutan

asam organik dapat dibuat dengan pengenceran, seperti larutan asam asetat 4%

yang diperoleh dari pengenceran larutan asam asetat glasial. Tahapan tersebut

harus dilakukan dengan tepat (waktu dan konsentrasinya), karena jika tidak tepat

akan terjadi kelarutan kolagen dalam pelarut yang akan menyebabkan penurunan

rendemen gelatin yang dihasilkan (Utama 1997).

Pada tahap selanjutnya, kulit atau ossein diesktraksi dengan air yang

dipanaskan. Ekstraksi bertujuan untuk mengubah kolagen menjadi gelatin. Suhu

minimum dalam proses ekstraksi adalah 40-50°C (Choi dan Regenstein, 2000)

hingga suhu 100°C (Viro, 1992). Ekstraksi kolagen tulang dilakukan dalam

suasana asam pada pH 4-5, karena umumnya pH tersebut merupakan titik

isoelektrik dari komponen-komponen protein non kolagen, sehingga mudah

terkoagulasi dan dihilangkan (Hinterwaldner, 1997). Kemudian ekstrak

dikeringkan untuk mengurangi airnya dengan menggunakan freeze dryer atau

oven bersuhu 30-60°C (Viro, 1992).

Sifat fisik gelatin yang menentukan mutunya adalah kemampuannya untuk

membentuk gel atau kekuatan gel. Kekuatan gel dipengaruhi oleh pH, adanya

komponen elektrolit dan non elektrolit serta bahan tambahan lainnya. Sifat fisik

lainnya adalah titik pembuatan gel, warna, kapasitas emulsi dan stabilitas emulsi

(Glicksman, 1969). Selain itu, viskositas juga merupakan sifat fisik yang penting

bagi mutu gelatin. Viskositas dipengaruhi oleh interaksi hidrodinamik antar

15

molekul gelatin, suhu, pH dan konsentrasi. Standar mutu gelatin untuk industri,

pangan dan farmasi dapat dilihat berturut-turut di dalam Tabel 3, 4 dan 5.

Tabel 3. Standar Mutu Gelatin Menurut SNI No. 06-3735 Tahun 1995 dan British Standard: 757 Tahun 1975

Karakteristik SNI No. 06-3735a British Standard 757b Warna Tidak berwarna sampai kekuningan Kuning pucat

Bau, rasa Normal - Kadar air Maksimum 16% - Kadar abu Maksimum 3,25% -

Kekuatan gel - 50-300 gram Bloom Viskositas - 15-70 mps atau 1,5-7 cP

pH - 4,5-6,5 Logam berat Maksimum 50 mg/kg -

Arsen Maksimum 2 mg/kg - Tembaga Maksimum 30 mg/kg -

Seng Maksimum 100 mg/kg - Sulfit Maksimum 1000 mg/kg -

(Sumber: SNI dan British Standar)

Tabel 4. Standar Gelatin Berdasarkan FAO

Parameter Persyaratan Kadar abu Tidak lebih dari 2 % Kadar air Tidak lebih dari 18 %

Belerang dioksida tidak lebih dari 40 mg/kg Arsen Tidak lebih dari 1 mg/kg

Logam berat Tidak lebih dari 50 mg/kg Timah hitam Tidak lebih dari 5 mg/kg

Standard plate count < 104/g E.coli < 10/g

Streptococci < 102/g (Sumber: JECFA, 2003)

16

Tabel 5. Spesifikasi Gelatin Farmasi

Parameter Kelas Khusus Kelas 1 Kelas 2 Kelas 3 Kadar air (%) 14,0 14,0 14,0 14,0

Kekuatan gel (gram Bloom) 240 200 160 140 Viskositas (cP) 20 20 20 20 Kadar abu (%) 1,0 1,0 2,0 2,0

pH 5,5-7,0 5,5-7,0 5,5-7,0 5,5-7,0 Arsen (ppm) 0,8 0,8 0,8 0,8

Logam berat (ppm) 50 50 50 50 Mikrobiologi (per g) 1000 1000 1000 1000

E.coli (per 100 g) Negatif Negatif Negatif Negatif Salomonella Negatif Negatif Negatif Negatif

(Sumber: Norland Product, 2003)

4. Enzim Transglutaminase

Enzim adalah protein yang berperan sebagai katalis dalam proses

metabolisme makhluk hidup. Enzim terdiri atas apoenzim yang tersusun dari

protein dan gugus prostetik yang tidak tersusun dari protein. Gugus prostetik

dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu koenzim (tersusun dari bahan organik)

dan kofaktor (tersusun dari bahan anorganik) (Lehninger, 1982). Enzim memiliki

beberapa sifat, diantaranya adalah termolabil (mudah rusak bila dipanaskan

dengan suhu tertentu), merupakan senyawa protein, bekerja secara spesifik (satu

jenis enzim bekerja khusus hanya pada satu jenis substrat). Dalam aktivitasnya,

enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu suhu, pH, kadar air, konsentrasi

substrat, konsentrasi enzim, aktivator, dan adanya inhibitor (Karmana, 2008).

Transglutaminase adalah enzim yang mengkatalis pembentukan ikatan

silang antar molekul protein (pembentukan polimer antar molekul protein). Pada

awalnya, transglutaminase dikenal sebagai faktor XIIIa di bidang kedokteran,

yang berperan pada proses penggumpalan darah. Transglutaminase dapat

17

ditemukan pada berbagai organ, jaringan dan cairan tubuh hewan (darat maupun

air) dan tanaman. Enzim tersebut terlibat pada berbagai fungsi biologis mulai dari

penggumpalan darah sampai diferensiasi sel. Transglutaminase telah berhasil

diisolasi dari beberapa sumber, dimurnikan dan dikarakterisasi dari

Streptoverticillium mobaraenese (Ando dkk, 1989) dan Streptovercillium

ladakannum (Tsai dkk, 1996). Salah satu produk transglutaminase yang telah

dipasarkan secara komersial adalah serial ActivaTM Transglutaminase dari

Ajinomoto Jepang. Strain yang digunakan adalah Streptoverticillium mobaraense,

sehingga transglutaminase yang dihasilkan sering disebut sebagai microbial

transglutaminase (MTGase) (Puruhita, 2011).

Transglutaminase memiliki pH optimum berkisar antara 5-8, tetapi pada

pH 4 atau 9, transglutaminase masih menunjukkan aktivitas enzimatik. Suhu

optimum untuk aktivitas enzimatik adalah 50-55°C dan dapat melakukan aktivitas

enzimatik terus menerus secara penuh meski berlangsung pada suhu 50°C selama

10 menit. Transglutaminase kehilangan aktivitas enzimatik dalam beberapa menit

pada pemanasan mencapai 70°C. Transglutaminase masih mengeluarkan aktivitas

enzimatik pada suhu 10°C, dan masih menunjukkan beberapa aktivitas pada suhu

sedikit di atas titik beku (Motoki dkk, 1998).

Meskipun transglutaminase dapat membentuk ikatan silang yang dapat

meningkatkan kekuatan gel, pembentukan ikatan silang yang berlebihan juga

dapat menyebabkan perubahan bentuk (deformable), sehingga gel yang terbentuk

menjadi lebih rapuh. Hal tersebut hampir sama efeknya dengan pembentukan

ikatan silang alami yang terbentuk pada molekul kolagen dan terjadi pada tendon

18

tulang dan kulit binatang. Sejalan dengan bertambahnya umur, akumulasi ikatan

silang membuat kolagen menjadi lebih mudah mengalami perubahan bentuk dan

lebih rapuh, sebagai akibatnya tulang dan tendon menjadi lebih mudah rapuh dan

kulit menjadi tidak elastis (Park, 2005).

Protein-protein mengalami perubahan sifat fungsional setelah

dipolimerisasi menggunakan transglutaminase. Terbentuknya polimer antar

molekul protein tersebut dideteksi menggunakan metode elektroforesis dan

kromatografi. Pada metode elektroforesis, terbentuknya polimer protein

ditunjukkan oleh adanya pita berbobot molekul tinggi pada gel elektroforesis,

sedangkan pada metode kromatografi, terbentuknya polimer ditunjukkan oleh

adanya fraksi dengan waktu retensi yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan

protein aslinya (Srianta, 2000).

Secara alami, transglutaminase juga terdapat dalam ikan dan jumlahnya

bervariasi dalam ikan segar (Whitehusrt dan Law, 2002). Enzim tersebut

merupakan jenis enzim yang tergantung pada ketersediaan kalsium. Untuk dapat

aktif, transglutaminase endogen membutuhkan kalsium dalam jumlah yang cukup.

Pada jenis ikan yang berbeda, dan pada individu yang berbeda dalam satu jenis

ikan, terdapat kandungan transglutaminase endogen yang bervariasi, yang mana

hal tersebut dipengaruhi oleh habitat, makanan dan kondisi fisiologi ikan (Park

dkk, 2005).

19

Gln C

O

NH2 + RNH2 Gln C

O

NHR + NH3(a)

Gln C

O

NH2 + NH2 Gln C

O

HN(b) Lys Lys + NH3

Gln C

O

NH2 + HOH Gln C

O

OH + NH3(c)

Gambar 5. Reaksi yang dikatalisis oleh Transglutaminase. (a) Reaksi Transfer Asil, (b) Ikatan Silang antara Gln dan Lys dan (c) Deaminasi. (Sumber: Motoki dkk, 1998)

Pada Gambar 5 terlihat reaksi transglutaminase yang mengkatalisis

pembentukan ikatan silang dengan pembentukan ikatan silang, penggabungan

amin, dan deaminasi.

a. Pembentukan Ikatan Silang

Transglutaminase mengkatalisis pembentukan ikatan silang

kebanyakan protein makanan melalui pembentukan ikatan ε-(γ-glutamil) lisin.

Ikatan yang terbentuk merupakan ikatan silang ε-(γ-glutamil) lisin antara

kelompok γ-karboksiamid pada residu glutamin (Gln) dan kelompok ε-amino

residu lisin (Lys). Pada awalnya, kelompok γ-karboksiamid akan berinteraksi

dengan transglutaminase, dan berikutnya kelompok ε-amino residu lisin akan

terlibat dalam pembentukan ikatan kovalen baru. Ikatan silang yang terbentuk

dapat terjadi pada intra dan intermolekul protein dan mengarah pada

terbentuknya polimerisasi. Reaktivitas dari residu glutamin bergantung pada

jenis transglutaminase dan substrat protein yang digunakan. Reaksi tersebut

20

telah digunakan pada proses pangan dan dapat memperbaiki sifat fisik dan

tekstur makanan yang dihasilkan (Shimba dkk, 2002). Pembentukan ikatan

silang tersebut tidak mengurangi nilai gizi makanan, karena residu lisin tetap

dapat dicerna. Transglutaminase tidak hanya dapat digunakan untuk

membentuk ikatan silang pada satu jenis protein saja, tetapi juga dapat

digunakan pada residu glutamin dan lisin dari 2 jenis protein yang berbeda,

sehingga membentuk heteropolimer (Motoki dkk, 1998).

b. Penggabungan Amin

Transglutaminase mengkatalisis reaksi transfer asil antara kelompok

γ-karboksiamid dari ikatan peptida residu glutamin (berperan sebagai donor

asil) dengan berbagai amin utama (berperan sebagai akseptor asil). Beberapa

penelitian menunjukkan bahwa reaksi yang dikatalisis transglutaminase baik

penggabungan amin dan deaminasi dipengaruhi oleh mekanisme

pengontrolan kation tunggal. Mekanisme penggabungan amin terjadi ketika

kation berfungsi untuk mengaktivasi transglutaminase dengan mengikat

protein enzim pada dua tempat terpisah. Pada bagian yang disebut sisi

katalitik (catalytic site) yang mana tingkat kation yang dibutuhkan lebih

sedikit, transglutaminase tidak dapat mengkatalisis penggabungan amin pada

substrat glutamin. Pada sisi lain yang disebut dengan sisi pengikatan (binding

site), transglutaminase membutuhkan tingkat kation yang lebih tinggi untuk

aktivasi fungsinya dan merupakan bagian penting yang akan bergabung

dengan sisi katalitik untuk mengkatalisis penggabungan amin (Folk dkk,

1967).

21

c. Deaminasi

Ketika dalam substrat tidak terdapat amin utama, transglutaminase

mengkatalisis deaminasi residu glutamin dari protein, dan molekul air

berperan sebagai reseptor asil (Motoki dkk, 1998). Deaminasi

berkepanjangan seperti yang disebabkan oleh suhu tinggi dan pH rendah,

dapat membuat protein-protein terdenaturasi. Protein-protein tersebut

mengalami peningkatan kelarutan dikarenakan adanya tegangan pada sisi

rantai asam karboksilat yang diproduksi pada proses deaminasi dan

peningkatan jumlah daerah permukaan yang kurang terpolarisasi, sebagai

akibat terpaparnya daerah hidrofobik (Robinson dan Robinson, 2004).

Transglutaminase dilaporkan memiliki aktivitas deaminasi yang rendah

(Nonaka dkk, 1996), dan hanya dapat mendeaminasi 7,7% residu glutamin

pada citraconylated as1-casein.

Secara umum, transglutaminase bereaksi melalui ikatan ε-(γ-glutamil) lisin

isopeptida yang menghasilkan penggabungan ikatan kovalen inter atau

intramolekuler yang berikatan silang dengan protein makanan. Hal tersebut dapat

meningkatkan sifat fisika dan bentuk makanan seperti tahu, pasta ikan rebus dan

sosis (Seguro dkk, 1995; Soeda dkk, 1995; Nonaka dkk, 1996; Ni dkk, 1998;

Sharma dkk, 2002; Shimba dkk, 2002; Benjakul dkk., 2004). de Jong dan

Koppelman (2002) menyatakan bahwa transglutaminase mengkatalisis reaksi

transfer asil antara gugus γ-karboksiamid dari residu glutamin (donor asil) dan

gugus ε-amino dari residu lisin (akseptor asil), menghasilkan pembentukan ikatan

22

silang protein ε-(γ-glutaminil) lisin intra dan intermolekular. Reaksi yang

dikatalisis oleh glutamiltransferase terlihat pada Gambar 6.

Protein 1 Gln C

O

NH2 + NH2 Lys Protein 2

NH3

Protein 1 Gln C

O

HN Lys Protein 2

Polimerase yang disebabkan oleh enzim transglutaminase sudah diteliti

pada berbagai sumber protein termasuk α-kasein, protein kedelai dan gelatin, dan

terdapat perbedaan hasil dalam nilai kekuatan gel yang tergantung pada kondisi

reaksi dan sumber protein (Sakamoto dkk, 1994). Peningkatan nilai kekuatan gel

protein oleh transglutaminase tergantung dari intensitas enzim yang menghasilkan

ikatan silang. Selain itu, banyaknya ikatan kovalen baru yang menghambat secara

fisik ikatan silang selama renaturasi dan pembentukan tripel heliks juga

mempengaruhi peningkatan nilai kekuatan gel protein (Babin dan Dickinson,

2001).

Hingga saat ini, banyak penelitian yang meneliti karakter dasar dan

aplikasi gelatin ikan yang ditambahkan transglutaminase (Ramirez dkk, 2000;

Fernandez-Diaz dkk, 2001; Uresti dkk, 2003; Kolodzlejska dkk, 2004; Uresti dkk,

2004a, 2004b). Efek transglutaminase pada gelatin tergantung oleh konsentrasi

enzim, suhu inkubasi dan bahan baku gelatin (de Carvalho dan Grosso, 2004;

Jongjareonrak dkk., 2006; Kolodzicjska dkk., 2004; Sakamoto dkk., 1994).

Gambar 6. Reaksi Katalisis oleh Glutamiltransferase (Sumber: Martianingsih dan Atmaja, 2009)

23

Protein yang ditambahkan dengan enzim transglutaminase tetap memiliki nilai

nutrisi karena residu lisin tetap tersedia untuk pencernaan (Seguro dkk, 1996;

Yokoyama dkk, 2004). Modifikasi kimia dan enzimatik gelatin menyebabkan

perubahan suhu endotermik pada masa transisi pelelehan, dibandingkan dengan

suhu endotermik pelelehan gelatin asli dan gelatin dari lapisan film yang

menandakan adanya ikatan silang karena senyawa kimia dan enzim seperti

transglutaminase (Norziah dkk, 2009).

Berbagai penelitian menunjukkan bahwa gelatin yang dihasilkan dari

tulang ikan memiliki nilai kekuatan gel dan viskositas yang lebih rendah

dibandingkan dengan gelatin mamalia. Enzim transglutaminase dapat

meningkatkan nilai kekuatan gel dan viskositas pada gelatin. Transglutaminase

pada konsentrasi 1U/g yang ditambahkan pada gelatin babi mampu meningkatkan

nilai viskositasnya. Seperti yang terlihat pada Gambar 7, semakin tinggi

konsentrasi transglutaminase yang ditambahkan, semakin tinggi nilai viskositas

gelatin yang dihasilkan (Zhu dkk, 2009).

Transglutaminase pada jumlah yang tepat dapat meningkatkan nilai

kekuatan gel pada gelatin ikan dari Tenualosa ilisha seperti yang terlihat di

Gambar 8. Kekuatan gel meningkat secara signifikan dengan nilai 101,10 gram

Bloom pada konsentrasi transglutaminase 1,0 mg/g. Sampel tanpa penambahan

enzim memiliki nilai kekuatan gel sebesar 59,03 gram Bloom. Konsentrasi enzim

di atas 1,0 mg/g dapat menurunkan nilai kekuatan gel dikarenakan ikatan silang

yang berlebihan (Norziah dkk, 2009).

24

Gambar 7. Pengaruh Transglutaminase pada Viskositas Gelatin Babi (Sumber: Zhu dkk, 2009)

Gambar 8. Pengaruh Transglutaminase pada Kekuatan Gel Gelatin Ikan Tenualosa ilisha (Sumber: Norziah dkk, 2009)

5. Rendemen

Rendemen merupakan perbandingan antara bobot awal bahan baku

sebelum produksi dibandingkan dengan bobot akhir setelah produksi dan

dinyatakan dalam persen (%). Rendemen memberikan gambaran seberapa efisien

25

proses produksi untuk menghasilkan produk dengan jumlah yang diharapkan

(Amiruldin, 2007).

6. Analisis Proksimat

Analisis proksimat adalah suatu metode analisis kimia untuk

mengidentifikasi kandungan zat makanan dari suatu bahan. Istilah proksimat

mempunyai pengertian bahwa hasil analisis dari metode tersebut menunjukkan

nilai yang mendekati dengan nilai yang sebenarnya. Hal tersebut disebabkan

dalam satu fraksi hasil analisis masih terdapat zat lain yang berbeda sifatnya

dalam jumlah yang sedikit. Analisis proksimat bermanfaat untuk mengidentifikasi

kandungan zat makanan yang belum diketahui sebelumnya, menguji kualitas

bahan yang telah diketahui dibandingkan dengan standarnya, serta mengevaluasi

hasil formula ransum yang telah dibuat. Analisis proksimat merupakan dasar

untuk analisis lebih lanjut (Hafes, 2000).

a. Kadar Air

Kadar air merupakan presentasi jumlah air yang terdapat dalam

bahan terhadap bobot kering. Kadar air memberikan gambaran

banyaknya air yang terikat oleh komponen padatan bahan. Selain itu,

kandungan air suatu bahan dapat menentukan penampakan, tekstur dan

kemampuan bertahan bahan terhadap serangan mikroorganisme yang

dinyatakan dalam aw, yaitu jumlah air bebas yang dapat dimanfaatkan

oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya (Sudarmadji, 1995).

26

b. Kadar Abu

Kadar abu merupakan jumlah bahan anorganik yang terdapat

dalam bahan organik. Abu menunjukkan jumlah bahan anorganik yang

tersisa selama proses pembakaran tinggi (suhu sekitar 600°C) selama dua

jam. Jumlah abu dipengaruhi oleh jumlah ion-ion anorganik yang

terdapat dalam bahan selama proses berlangsung (Amiruldin, 2007).

7. Analisis Fisikokimia

a. Derajad Keasaman (pH)

Pengukuran pH dilakukan untuk menentukan kondisi dan jenis

muatan yang terdapat pada gelatin. Gelatin merupakan rantai polipeptida

yang terdiri atas berbagai macam asam amino. Asam amino mempunyai

sifat zwitter ion atau dipolar karena dalam struktur kimianya mempunyai

gugus fungsi negatif (COO-) dan gugus fungsi positif (NH3+). Asam

amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat asam, netral atau basa

sesuai dengan kondisi lingkungannya (Winarno, 2002).

b. Kekuatan Gel

Kekuatan gel gelatin adalah besarnya kekuatan yang diperlukan

oleh probe untuk menekan gel sedalam 4 mm sampai gel pecah. Satuan

untuk menunjukkan kekuatan gel yang dihasilkan dari suatu konsentrasi

tertentu disebut Gram Bloom (Hermanianto dkk, 2000). Pembentukan gel

merupakan fenomena penggabungan atau pengikatan silang rantai-rantai

polimer membentuk jalinan tiga dimensi yang kontinyu, sehingga dapat

27

menangkap air di dalamnya menjadi suatu struktur yang kompak dan

kaku yang tahan terhadap aliran di bawah tekanan. Pada waktu sol dari

gelatin mendingin, konsistensinya menjadi lebih kental dan selanjutnya

akan berbentuk gel. (Fardiaz, 1989).

c. Viskositas

Viskositas adalah daya aliran molekul dalam suatu larutan baik

dalam air, cairan organik sederhana dan suspensi, serta emulsi encer (de

Man, 1997). Untuk stabilitas emulsi gelatin diperlukan viskositas yang

tinggi (Leiner, 2006).

8. Analisis secara Spektrofotometri Inframerah

Spektroskopi inframerah merupakan teknik yang sangat berguna untuk

identifikasi senyawa-senyawa yang tidak dikenal. Spektroskopi inframerah dapat

mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada

daerah panjang gelombang 0,75-1.000 µm atau pada bilangan gelombang 13.000-

10 cm-1. Metode spektroskopi inframerah merupakan suatu metode yang meliputi

teknik serapan, emisi dan fluoresensi. Penyerapan gelombang elektromagnetik

dapat menyebabkan terjadinya eksitasi tingkat-tingkat energi dalam molekul, yang

dapat berupa eksitasi elektronik, vibrasi atau rotasi (Stuart, 2004).

Radiasi inframerah tidak memiliki cukup energi untuk menyebabkan

transisi elektronik. Bila radiasi inframerah dilewatkan melalui suatu cuplikan,

maka molekul akan menyerap energi sehingga terjadi vibrasi. Panjang gelombang

serapan oleh suatu ikatan bergantung pada jenis getaran ikatan antar atom. Oleh

28

karena itu, tipe ikatan yang berlainan akan menyerap radiasi inframerah pada

panjang gelombang yang berbeda (Fessenden dan Fessenden, 1986). Vibrasi yang

terjadi meliputi vibrasi ulur dan tekuk yang dikenal dengan istilah rocking,

twisting, scissoring dan waging (Hollas, 2004).

Ikatan-ikatan tunggal (contohnya, O-H, N-H dan C-H) menyerap pada

bagian spektrum berfrekuensi tinggi (kira-kita 4.000-2.100 cm-1). Hal tersebut

disebabkan oleh rendahnya massa atom hidrogen yang menyebabkan getaran

terjadi pada frekuensi tinggi. Ikatan rangkap tiga (contohnya, CN-) menyerap pada

frekuensi kira-kita 2.100-1900 cm-1. Sementara itu, ikatan rangkap dua

(contohnya, C=O dan C=C) menyerap pada frekuensi kira-kira 1.900-1.500 cm-1.

Daerah spektrum inframerah pada bilangan gelombang kurang dari 1.500 cm-1

disebut daerah sidik jari, karena pola puncak yang terjadi pada daerah tersebut

khas bagi senyawa yang diujikan dan tidak ada senyawa lain yang memilikinya

(Cairns, 2008).

Senyawa kimia tertentu mempunyai kemampuan menyerap radiasi

elektromagnetik dalam daerah spektrum inframerah. Absorpsi radiasi inframerah

pada material tertentu berkaitan dengan fenomena bergetarnya molekul atau

ikatan atom. Metode tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu

senyawa yang belum diketahui, karena spektrum yang dihasilkan spesifik untuk

senyawa tersebut. Metode tersebut banyak digunakan karena:

a. Cepat dan relatif murah

b. Dapat digunakan untuk identifikasi gugus fungsional dalam molekul

29

c. Spektrum inframerah yang dihasilkan oleh suatu senyawa adalah khas dan

oleh karena itu dapat menyajikan sebuah fingerprint (sidik jari) untuk

senyawa tersebut (Stuart, 2004).

Bila radiasi inframerah dilewatkan melalui suatu cuplikan, maka molekul-

molekulnya dapat mengabsorpsi energi dan terjadilah transisi antara tingkat

vibrasi dasar (ground state) dan tingkat vibrasi tereksitasi (exited state). Absorbsi

energi pada berbagai frekuensi dapat dideteksi oleh spektrofotometer inframerah,

yang merajahkan jumlah radiasi inframerah yang diteruskan melalui suatu

cuplikan sebagai fungsi frekuensi (atau bilangan gelombang) radiasi. Plot tersebut

disebut spektrum inframerah yang akan memberikan informasi penting tentang

gugus fungsional suatu molekul (Stuart, 2004).

E. Landasan Teori

Ikan lele dumbo merupakan jenis ikan yang banyak dibudidayakan di

Indonesia. Kolagen yang terdapat dari tulang ikan lele dumbo dapat diubah

menjadi gelatin. Penambahan enzim transglutaminase dapat meningkatkan

kualitas gelatin ikan, khususnya nilai viskositas dan kekuatan gelnya. Enzim

tersebut mampu mengkatalisis polimerisasi dan membentuk ikatan silang protein

melalui pembentukan ikatan kovalen antar molekul.

Gelatin yang didapatkan kemudian dikenai analisis proksimat (kadar air

dan kadar abu), analisis fisikokimia (derajad keasaman, viskositas dan kekuatan

gel) dan penentuan spektra inframerah. Kemudian dilihat perbandingan antara

nilai kekuatan gel dan viskositas sebelum serta sesudah penambahan enzim

30

transglutaminase. Hasil tersebut dianalisis statistik dengan metode paired t-test

untuk melihat ada atau tidaknya perbedaan yang signifikan.

F. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori, maka hipotesis penelitian adalah sebagai

berikut:

1. Gelatin hasil ekstraksi dari tulang ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) dapat

dikenai analisis proksimat, analisis fisikokimia dan penentuan spektra

inframerah.

2. Gelatin jika ditambahkan enzim transglutaminase dapat meningkatkan

kualitas gelatin khususnya kekuatan gel dan viskositasnya.