ISOLASI DNA BUAH

Oleh :Nama : Boenga Nur Cita NIM: B1J011100 Kelompok: I Rombongan: VII Asisten: Ine Nurmala

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO2013I. PENDAHULUANA. Latar BelakangDNA sebagai materi genetik pada sebagian organisme menurut Jamilah (2005), harus dapat menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini :1. DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi.2. DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang dilaksanakan melalui ekspresi gen.3. DNA sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah.DNA atau asam deoksiribonukleotida merupakan salah satu asam nukleat yang memiliki 2 untai ganda (Double-helix strain). Keberadaan untai ganda pada DNA membuat DNA dapat bereplikasi dan menentukan keberadaan asam nukleat lainnya seperti RNA dan juga jenis protein apa yang akan dibuat. Hal ini menunjukkan bahwa DNA merupakan kodogen dalam pembuatan mRNA dan cara yang mudah dalam menentukan kekerabatan suatu spesies sendiri secara molekuler dapat dilihatt dari DNA. Oleh karena itu, teknik isolasi DNA sangatlah penting untuk mengetahui hubungan kekerabatan spesies (Syafaruddin, 2011).DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosdat, gula deoksiribonukleat, dan basa nitrogen. Unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehinnga DNA tergolong sebagai polinukleotida. Rantai DNA memiliki lebar 22-24 , sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 . DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Orientasi rantai nukleotida dalam satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya pada struktur helis ganda. Hal ini disebut sebagai antiparalel, kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut (Syafaruddin, 2011).

B. TujuanTujuan acara praktikum isolasi DNA buah adalah mahasiswa mampu mengisolasi DNA kromosom buah dan mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom.

II. MATERI DAN METODEA. MateriAlat yang digunakan antara lain kantung plastik, sarung tangan, kain kasa, rak plastik, tabung Falcon, corong plastik, pipet plastik, saringan, erlenmeyer, sendok plastik, dan kamera digital.Bahan yang digunakan adalah strawberry, buah naga, alpukat, mangga, papaya, deterjen cair, NaCl (garam dapur), etanol absolut, akuades dan tenderizer.

B. MetodeIsolasi DNA Kromosom Buah Naga adalah sebagai berikut :1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.2. Buah Naga di potong kecil kecil kemudian dimasukkan ke dalam kantong plastik dan di campur dengan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml akuades, 100 ml deterjen dan 2 sendok teh garam dapur).3. Buah dihancurkan dalam kantung plastik dengan cara meremas-remas.4. Buah yang telah dihancurkan, kemudian saring dan tambahkan tenderizer dan masukan ke dalam tabung Falcon sebanyak 0,5 ml.5. Ekstrak buah yang ada di tabung Falcon ditambahkan etanol absolut hingga 1,5 ml dan diamati kabut putih yang terbentuk.

III. HASIL DAN PEMBAHASANA. HasilA.1 TabelTabel. Data Isolasi DNA Buah Rombongan VIIKelompokBuahKabut Putih

Tabung Effendorf ITabung Effendorf II

1Buah Strawberry++

2Buah Alpukat++

3Buah Pepaya++

4Buah Mangga++

5Buah Naga++

A.2 Gambar

Gambar 1. Isolasi DNA Buah Naga di Tabung Effendorf I

Gambar 2. Isolasi DNA Buah Naga di Tabung Effendorf II

B. PembahasanBerdasarkan hasil praktikum isolasi DNA buah yang dilakukan rombongan VII diperoleh hasil yaitu pada kelompok 1 isolasi pada buah strawberry, kelompok 2 isolasi pada buah alpukat, kelompok 3 isolasi pada buah papaya, kelompok 4 isolasi pada buah mangga, dan kelompok 5 isolasi pada buah naga, semuanya terbentuk kabut putih (+) pada akhir proses isolasi DNA, yang terlihat di atas permukaan tabung eppendorf. Hal ini menunjukkan bahwa perusakan, pembukakan sel dan DNA berhasil dilakukan. Hal ini pun sesuai dengan pernyataan Cespedes (2010), bahwa DNA yang terisolasi dapat terlihat dengan mata akan berbentuk kabut berwarna putih dan melayang di medium. Menurut Istanti (1999), menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit, karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental. Pengaruh keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah akuades yang digunakan, walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air tinggi, tetapi dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental.Isolasi DNA merupakan suatu teknik pemisahan DNA sampel dari materi organik lain seperti RNA, protein dan lain-lain. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA dan mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup. Isolasi DNA kromosom prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Prinsipnya ada dua yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts, 1994).Menurut Kimball (2005), isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu :1. Perusakan dinding sel2. Dinding dan membran sel dilisiskan3. Pembuangan remukan sel4. Pemisahan DNA dari protein dan RNAPraktikum isolasi DNA yang dilakukan oleh kelompok 1, dilakukan isolasi terhadap buah naga. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi pepaya yang ditambahkan dengan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml akuades, 100 ml deterjen cair dan 2 sendok teh NaCl) lalu dihancurkan. Penghancuran ini bertujuan untuk merusak dinding sel secara mekanik sehingga DNA dapat keluar dari dalam sel,selain itu NaCl berfungsi untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati. Garam dapur digunakan untuk pengisolasian DNA dengan tujuan untuk memekatkan DNA, hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negatif pada ikatan fosfat DNA, saaat ion Na+ garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul, serta berperan menjaga pH larutan agar tetap konstan (Alberts, 1994). Tahap selanjutnya adalah penyaringan yang berfungsi agar komponen sel selain DNA tidak mengkontaminasi DNA yang hendak diisolasi. Fungsi dari NaCl yaitu untuk melisiskan dinding sel dan sebagai buffer yakni menjaga pH larutan agar tetap konstan, sehingga diharapkan tidak terjadi denaturasi DNA. Deterjen cair dapat merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA yang diinginkan dapat dikeluarkan dari dalam sel. Akuades ditambahkan sebagai pengencer agar larutan tidak terlalu pekat (Jamilah, 2005). Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada suhu 65C. Detergen seperti sodium dodecil sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untuk proses lisis (Wahyuni, 2009).Tahap selanjutnya, disaring menggunakan kertas saring dan kain kassa kemudian ditambahkan tenderizer seujung sendok dan dimasukkan ke dalam tabung falcon sampai volume ekstrak buah 0,5 ml. Tenderizer berfungsi untuk memecah ikatan protein. Tambahkan etanol absolut hingga volume 1,5 ml dan terakhir amati ada tidaknya kabut putih yang terbentuk (Jamilah, 2005).Isolasi DNA diawali memeperkecil ukuran sampel, perusakan dan pembuangan dinding sel yang dilakukan dengan mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim, dengan cara mengisolasi jaringan yang ingin digunakan. Langkah berikutnya adalah pelisisan dinding dan membran sel, yang dilakukan dengan melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi atau dengan menambahkan detergen cair untuk membebaskan isinya. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buffer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS) dan pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi, setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang, biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan, hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak (Cespedes, 2010).Isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA, yang jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda dan dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Das, 2009).Buah naga mengandung banyak vitamin, protein, kalsium, dan fosfor. Untuk memudahkan penghancuran sampel dari bahan seperti ini, umumnya ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair. Namun, masalah akan muncul bila lokasi penelitian jauh dari pusat industri sehingga sulit mendapatkan nitrogen cair. Oleh karena itu, perlu metode isolasi DNA yang mudah dan tidak memerlukan nitrogen cair, tetapi dapat menghasilkan DNA yang berkualitas tinggi untuk proses amplifikasi. Perusakan DNA berfungsi untuk mendeteksi kandungan dalam buah yang berbahaya bagi kesehatan tubuh seperti oksidan pada buah papaya, sedangkan perusakan DNA merupakan salah satu tahapan dari isolasi DNA (Wahyuni, 2009).Isolasi DNA juga bermanfaat dalam mengetahui struktur senyawa (oksidan) yang berbahaya bagi tubuh serta membantu memutuskan langkah pengobatan yang lebih lanjut, selain itu dapat digunakan dalam kasus kriminal seperti terjadi pembunuhan untuk dapat diketahui keluarga dan pelakunya. Manfaat dari proses isolasi DNA kromosom bukan hanya untuk mengetahui DNA dari buah yang kita teliti namun literatur menunjukkan bahwa proses isolasi dapat untuk mengetahui kandungan dari ekstrak buah (Jamilah, 2005).

IV. KESIMPULAN DAN SARANA. Kesimpulan1. Tahapan dalam isolasi DNA yaitu perusakan dinding sel, lisis dinding dan membran sel, pembuangan remukan sel, dan pemisahan DNA dari protein dan RNA.2. Isolasi DNA kromosom pada prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. 3. Hasil isolasi DNA untuk rombongan VII yaitu terbentuknya kabut-kabut putih yang merupakan hasil dari proses tahapan-tahapan yang dilakukan dengan menggunakan larutan yang digunakan.

B. SaranSaran untuk praktikum isolasi DNA buah adalah kuis yang diberikan hendaknya sesuai dengan materi yang ada di diktat.

DAFTAR PUSTAKAAlberts, B. 1994. Biologi Monokuler Sel Edise Kedua Mengenai Sel. Gramedi Pustaka Utama, Jakarta.

Cespedes, C.L., M.V. Moralea, J.G. Avila, M.E. Hafidi, J. Alacron, O.P. Lopez. 2010. Phytochemical profile and the antioxidant activity of Chilean wild black berry fruits, Aristotelia chilensis (Mol) Stuntz (Elaeocarpaceae). Food Chemistry 119 (2010) 886895.Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.

K. B. Das., Jena R. C. and Samal K.C. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of banana / plantain (Musa spp.). International Journal of Agriculture Sciences, ISSN: 0975-3710, Volume 1, Issue 2, pp-21-25.Kimball, J.W. 2005. Biologi Jilid 1, 2, dan 3. Terjemahan S.S Tritrosomo dan Nawangasari. S.Jakarta: Erlangga.

Syafaruddin dan Tri, J. S. 2011. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (blanco) airy shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 17.

Wahyuni, D. A. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16.