Antimicrobial agent production by fungi isolates from petroleum product contaminated soil

M. RIFQI EFENDI1421012015

Program Studi Paca SarjanaUniversitas Andalas

Padang 2015

ABSTRACTEkstrak kasar dari delapan 8 isolat jamur yang diperoleh dari tanah yang terkontaminasi oleh limbah minyak di Calabar, sepanjang sungai yang melintasi Nigeria, diuji aktivitas antimikroba nya terhadap bakteri pendegradasi hidrokarbon (spesies Bacillus, spesies Micrococcus) dan beberapa isolat klinis (pseudomonas aeroginosa, Escherichia coli dan staphylococcus aureus), menggunakan teknik difusi agar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tiga dari isolat yang diperoleh (Penicillium sp, Aspergillus sp., dan Cladosporium) menunjukkan aktivitas anti-mikroba terhadap beberapa mikroba yang diuji (80%), dengan diameter zona inhibisi mulai dari 20mm-34mm. Ekstrak kasar Penicillium sp (F2) menunjukkan aktivitas terhadap dua bakteri uji yang mendegradasi hidrokarbon (Bacillus sp., dan Micrococcus sp.), sedangkan Aspergillus sp. (F8) menunjukkan aktivitas spektrum yang luas di salah satu bakteri pendegradasi hidrokarbon (Micrococcus sp) dan dua isolat klinis (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa), staphylococcus aureus resisten terhadap semua ekstrak. Hasil ini merupakan rangkaian uji pendahuluan untuk pekerjaan lebih lanjut untuk menyelidiki efek represif metabolit ini karena mempengaruhi bioremediasi yang melibatkan organisme.

Pendahuluan• Ditemukanlah teori yang menunjukkan bahwa terhambatnya

pertumbuhan mikroorganisme dimediasi oleh sekresi metabolit toxin oleh organisme lain

• senyawa ini sebagian besar dibiosintesa oleh bakteri, jamur, ganggang, karang, spons, tumbuhan dan hewan tingkat rendah (Demain et al.,).

• Suatu mikroorganisme harus bersaing memenuhi kebutuhan carbon, nitrogen, dan phosfat untuk pertumbuhan mereka.

• Tingginya kejadian penyakit infeksi dan resistensi mikroba pencarian antibiotik baru

Tujuan

Pencarian dan pengembangan antibiotik baru dari sampel tanah yang

terkontaminasi petrolium

MATERIAL DAN METODE

Material

Dextrose Agar, Malt Extract- Yeast Extract Agar, Bushnell Hass,

Brain Heart Infusion medium, Nutrient Broth) yang diperoleh dari

hardy Diagnostic USA dan Titan Biotech, India.

Reagents

Alcohol analitycal grade, Asam clorida encer (HCl), dan

Lactophenol cotton blue procured from Sigma Aldrich, USA.

Metode

Pengumpulan Sampel

Sampel tanah yang terkontaminasi petrolium dikumpulkan dari

mechanic workshops di Etta Agbo Calabar selatan sepanjang sungai

yang melintasi Nigeria, sampel dimasukkan dalam kantong plastik

steril dan dibawa ke Laboratorium mikrobiologi untuk dianalisis.

Analisis mikroba dilakukan dalam waktu dua puluh empat jam setelah

pengumpulan sampel. Isolat bakteri klinis diperoleh dari

Laboratorium Mikrobiologi, Rumah Sakit Umum Mary Slessor,

Calabar. Identitas bakteri dikonfirmasi sebelum digunakan dengan

pemeriksaan mikroskopis dan tes biokimia. Bakterinya adalah

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Escherichia

coli.

Menghitung Kultur Jamur Heterotrophic

10 gram sampel tanah diencerkan dalam 90 mL dalam air destilasi

steril. Lakukan 10 serial pengenceran ambil 0,1 mL pada pengenceran

10-3 dan 10-4 kemudian tanamkan dalam Sabouraud Dextrose Agar

dan Malt Extract-Yeast Ekstrak Agar menggunakan teknik pelat yang

dilengkapi dengan 50 mg/ml streptomisin untuk menghambat

pertumbuhan bakteri, juga Ph medium diatur sampai pH 5,8 untuk

mendorong pertumbuhan jamur. Plate diinkubasi pada temperaur

ruangan (28°C) selama 96 jam. Pada akhir masa inkubasi, tentukan

jumlah koloni yang muncul pada setiap lempeng dan jumlah rata-

ratanya.

Menghitung Kultur Jamur Pendegradasi Hydrocarbon

Bushnell Hass Agar dilengkapi dengan 50 µg /ml streptomisin disiapkan dan atur pH 5,8, ambil 0.1 ml dari pengenceran 10-3 dan 10-4 diinokulasi pada media, pada saat yang sama saring 1 mL minyak mentah menggunakan kertas saring whattman steril No 1 dan letakkan secara aseptik pada tutup pelat inokulasi (Atlas dan Bartha). Plate direkat dengan selotip. Hal ini dilakukan untuk memberikan minyak mentah sebagai sumber karbon dan energi untuk pertumbuhan organisme di permukaan melalui transfer fase uap. Pelat kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari setelah penghitungan jamur pulih.

Isolasi dan Pemurnian Jamur IsolatKoloni jamur yang dikembangkan diisolasi dan dimurnikan dengan berulang-ulang ke sebuah plate Sabouraud Dextrose Agar segar yang dilengkapi dengan agen antibakteri (50 ug / ml streptomacin) tanpa penyesuaian pH.   Karakterisasi dan Identifikasi Isolat JamurIsolat murni dari jamur dugaan diidentifikasi makroskopik berdasarkan kulturnya, karakteristik morfologi dan fisiologi, dan mikroskopik menggunakn teknik pewarnaan lactophenol. Identifikasi isolat dilakukan menggunakan kunci dichotonomous dan gambar kunci dari kelas jamur yang diketahui.

Skrining untuk Produksi Senyawa Antimikroba

Isolat yang dipilih diuji kemampuannya untuk menghasilkan antimikroba, dalam kultur broat dan dengan inokulasi langsung. Inokulan padat dari strain yaang dipilih diinokulasi ke dalam test tube yang berisi 10 ml Brain Heart infusion Broat dengan pH 5,8; media inokulasi diinkubasi pada temperatur 28°C selama 7 hari dengan agitasi konstan. Pada akhir inkubasi, kultur dicuci dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 30 mins (Kanlayani et al) supermatant diuji menggunakan teknik sumur difusi Agar. Seluruh permukaan plat Mueller-Hinton diinokulasi menggunakan teknik spread plate menggunakan steril Swab, tabung precipitin steril digunakan untuk bore media dan 0.5ml bagian dari supermatant mentah segera dimasukkan ke dalam sumur dan kemudian diinkubasi pada 37°C selama 24 jam.

Karakterisasi dan identifikasi isolat

Spectrum Antimicroba

KesimpulanDi tanah di mana mikroorganisme yang menghasilkan senyawa antimikroba terbanyak ditemukan, hidup adalah kompetitif dan perubahan dalam komposisi komunitas mikroba menyebabkan pelaporan metabolit sekunder (Lancini dan Perenti, 1982). Jadi 66,7% dari senyawa antimikroba dihasilkan oleh isolat jamur (Penicillium sp dan Aspergillus sp) dan isolat uji (Bacillus sp dan Micrococcus sp) merupakan bakteri pendegradasi hidrokarbon yang efisien (Amadi et al .. 1991). Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian ini, menunjukkan bahwa banyak aktivitas antagonis terjadi antara bakteri hidrokarbon degrader karena mikroorganisme tersebut harus bersaing untuk memperoleh karbon, nitrogen dan fosfat yang diperlukan untuk pertumbuhan mereka.