LAPORAN PRAKTIKUM ANALISA PANGAN

ANALISA KUANTITATIF MIKROBA(METODE TPC DAN MPN)

DISUSUN OLEH:

FAHRUDIN YUDA KARTIKA

PROGRAM PENDIDIKAN

CALON PENDIDIK AKADEMI KOMUNITAS

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN

POLITEKNIK NEGERI LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2013

I. PENDAHULUAN

A. Teori

Suatu jenis koloni mikroba yang terpisah dari koloni campurannya akan

lebih mudah untuk diamati. Selain itu teknik untuk memisahkan dan

mendapatkan koloni tunggal serta pemeliharannya terdapat beberapa jenis.

Teknik-teknik tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Beberapa cara

dapat dilakukan untuk menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan

pemeriksaan. Cara yang paling sering digunakan adalah cara penghitungan

koloni pada lempeng pembiakan (plate count), atau juga dapat dilakukan

penghitungan langsung secara mikroskopis (Burrows, 2004).

Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan

campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi

terpisahpisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme

pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari

sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni,

yaitu sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan

yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi

medium agar nutrient (nutrien agar) dengan metode cawan gores atau media

cawan tuang, sel-sel mikroorganisme akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah

inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak diri secara cepat sehingga

dalam waktu 18 sampai 24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan

dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni

merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Pelczar dan Chan,

2007).

Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu :

perhitungan pada cawan petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui

pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan

kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN terdiri dari tiga

tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test),

dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan

coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji

ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel (Dwidjoseputro,

1994).

Teknik Pour Plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan

mikroorganisme dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar

cair dengan stok kultur. Teknik ini umumnya digunakan pada metode Total

Plate Count (TPC). Sedangkan teknik streak plate adalah suatu teknik dalam

menumbuhkan mikroorganisme dalam media agar dengan cara menggores

(streak) permukaan agar dengan jarum yang telah diinokulasi dengan kultur

mikroba. Teknik ini menjadikan mikroorganisme tumbuh dan tampak pada

goresan-goresan inokulasi bekas jarum (Radchie, 2008).

Produk pangan mempunyai batas waktu tertentu untuk dapat

dikonsumsi secara aman. Hal ini dikarenakan bahan pangan mengalami

penurunan mutu mikrobiologis ditandai dengan nilai TPC dan MPN melebihi

batas maksimal yang disebabkan oleh aktivitas pertumbuhan mikroorganisme

meningkat selama penyimpanan. Factor-faktor yang menyebabkan

meningkatnya aktivitas petumbuahan mikroba antara lain : nutrient, aktivitas

air, waktu, suhu, nilai pH (Suardana, 2009).

B. Tujuan

1. Mampu melakukan metode hitungan cawan (PCA) dan MPN.

2. Menerapkan cara pelaporan menggunakan standart plate count dan MPN.

II. METODOLOGI

A. Waktu dan Tempat

Praktikum analisa kuantitatif metose TPC dan MPN ini dilaksanakan

pada hari Rabu, 6 Februari 2013. Dimulai pukul 13.00 sampai 16.00 WIB,

bertempat di Laboratorium THP, Politeknik Negeri Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

a. Jarum ose g. Tabung berulir

b. Bunsen h. bulb

c. Cawan petri i. Pipet

d. Autoklaf j. Stick L

e. Pinset k. Tabung Durham

f. Tabung reaksi

2. Bahan

a. Suspensi bakteri, khamir dan kapang

b. Kapas

c. Aquadest

d. Nutrien Broth

e. Plate Count Agar

f. Potato Dextrose Agar

g. NaCl

h. Alkohol

C. Cara Kerja

1. Pembuatan Media

a. Siapkan alat (pinset, jarum ose, pipet volumetrik, cawan petri) dan

bahan (media, aquades) yang akan disterilisasi.

b. Timbang 8,75 g PCA, 4,85 g PDA, 6,5 g LB dan 1,75 g NaCl,

Penimbangan harus dalam keadaan steril

c. Masukkan masing-masing bahan dalam erlenmeyer

d. Tambahkan aquades dingin masing-masing 50 ml ke dalam bahan

panaskan air, kemudian tambahkan ke dalam erlenmyer yang sudah

berisi bahan

e. Masing-masing ke dalam Erlenmeyer tambahkan aquades panas untuk

PCA sampai 500 ml, PDA sampai 150 ml, LB masing-masing (double

sampai 250 ml, dan single sampai 500 ml), NaCl sampai 200 ml.

f. Cek pH, homogenkan larutan yang sudah dibuat

g. Masukkan ke dalam tabung berulir masing-masing media dan

masukkan tabung durham dalam posisi terbalik

h. LB 75 tabung @ 9 ml, larutan pengencer 35 tabung @ 9 ml, PDA ke

dalam Erlenmeyer (ditutup dengan aluminium foil).

i. Sterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 1210C

Angkat masing-masing alat dan media yang sudah disterilisasi

2. TPC

a. Cuci tangan dengan sabun antibakteri dan bilas dengan alkohol.

b. Siapkan sampel yang akan diuji (susu kedelai). Nyalakan bunsen, dan

siapkan pipet untuk masing-masing pengenceran beda pipet.

c. Ambil 1 ml sampel kemudian masukkan kedalam larutan pengencer

d. Homogenkan larutan dan tandai dengan label pengenceran 10-1.

e. Ambil 1 ml dari pengenceran 10-1, kemudian masukkan ke dalam

larutan pengencer. Lakukan prosedur yang sama sampai pengenceran

10-5.

f. Ambil 1 ml dari pengenceran 10-4 dan 10-5, kemudian masukkan ke

dalam cawan petri yang berbeda. Tuang media PCA dan ratakan.

g. Inkubasi selama 2 hari dalam posisi cawan dibalik.

h. Amati dan hitung nilai SPC.

3. MPN

a. Cuci tangan dengan sabun antibakteri dan bilas dengan alkohol.

b. Siapkan 15 tabung berulir yang berisi LB dan tabung durham

c. Beri label 10, 1, dan 0,1 masing-masing sebanyak 5 tabung

d. Ambil masing-masing 10 ml masukkan dalam masing-masing 5

tabung LB label 10.

e. Ambil masing-masing 1ml masukkan dalam masing-masing 5 tabung

LB label 1.

f. Ambil masing-masing 0,1 ml masukkan dalam masing-masing 5

tabung LB label 0.

g. Inkubasi selama 2 hari. Amati dan hitung nilai MPNnya

h. Jika hasil positif lanjutkan dengan uji penguat dalam media BGLBB.

i. Ambil 1 ose dari tabung yang positif kemudian masukkan dalam

media BGLBB. Inkubasi selama 2 hari

j. Amati perubahannya dan catat hasil pengamatan.

III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Tabel. 1 Hasil Pengamatan Nilai SPC Susu KedelaiNO Gambar Pengenceran Perhitungan

1.

10-3

TBUD

2.

10-4TBUD

3.

10-5

240

202

B. Pembahasan

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan

untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam

cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar,

ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Salah satu metode

perhitungan adalah TPC dan MPN (Hastowo, 1992).

Metode total plate count (TPC) merupakan analisis untuk menguji

cemaran mikroba dengan menggunakan metode pengenceran dan metode cawan

tuang. Metode cawan tuang adalah metode per plate. Metode ini dilakukan

dengan mengencerkan sumber isolate yang telah diketahui beratnya ke dalam

larutan garam fisiologis, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril,

dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur untuk makanan mikroba

(dwidjoseputro, 2005).

Prosedur pengenceran populasi mikroba meliputi : ambil 1 ml sampel

dimasukkan dalam 9 ml larutan garam fisiologis yang dibuat dari larutan NaCl

untuk memperoleh pengenceran 1/10 bagian. Sampel yang diamati pada

praktikum kali ini adalah the basi. Dari pengenceran 1/10, selanjutnya diambil 1

ml dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis untuk memperoleh dilusi 1/100

bagian dan seterusnya hingga diperoleh pengenceran yang diinginkan. Tujuan

pengenceran media adalah apabila tiap media pengenceran ditumbuhkan ke

dalam suatu media, maka koloni yang tumbuh dapat dihitung sehingga jumlah

sel mikroba dapat diketahui dengan persamaan :

Pengenceran media sampai diperoleh pengenceran 1/105 bagian. Dan

inokulasi media pengenceran dalam cawan petri menggunakan metode pour

plate diambil 3 pengenceran tertinggi. Dari pengenceran yang akan

diinokulasikan diambil 1 ml dan dituangkan dalam cawan petri kemudian

ditambahkan PCA dan diaduk dengan membentuk angkan delapan atau sampai

merata. Setelah itu media inokulasi diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36 oC.

Dari tabel pengamatan didapatkan pengenceran 1/103 dan 1/104 bagian

terlalu banyak untuk dihitung (TBUD). Pada cawan petri tampak koloni yang

menyebar merata hamper pada semua bagian cawan. Pada pengenceran 1/105

koloni mikroba dapat dihitung. Perhitungan mikroba sebenarnya dapat

dilakukan secara 4 kuadran, 2 kuadran atau dihitung semua. Koloni yang besar

atau kecil tetap dibaca sebagai 1 koloni. Hasilnya pada cawan pertama terhitung

240 koloni dan pada cawan kedua terhitung 202 koloni. Sehingga perhitungan

TPC diperoleh dari rata-rata pengenceran 1/105 bagian.

Metode MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan).

Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada

air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan

kontaminan utama sumber air minum. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung

sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3

tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri (Lay,

1992).

Untuk pengamatan dan perhitungan mikroba dengan metode MPN

Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu tabung

yang ditumbuhi oleh mikroba setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu.

Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya

kekeruhan atau terbentukya gas dalam tabung durham untuk mikroba

pembentuk gas. Pada umumnya, untuk setiap tingkat pengenceran digunakan

3,5 atau 7 seri tabung. Semakin banyak seri pengenceran yang digunakan akan

diperoleh hasil yang lebih akurat.

Perhitungan mikroba dengan metode MPN dilakukan dengan

menggunakan Lactose Brooth double strength dan LB single strength. Lactose

brooth double strength diisi dengan media the basi sebanyak 10 ml pada

masing-masing tabung. LB Single Strength diisi dengan 1 ml the basi dan LB

single strength tabung kecil diisi dengan the basi 0,1 ml. tiap tabung telah

dilengkapi dengan tabung durham dengan posisi terbalik. Masing-masing

Lactose Brooth ada 5 tabung, jadi jumlah keseluruhan adalah 15 tabung.

Kemudian diinkubasi dalam incubator suhu 360C selama 1 hari. Hari berikutnya

dilakukan pengamatan apakah larutan sudah berubah jadi keruh atau sudah

menghasilkan gas hingga ¾ bagian dalam tabung durham.

Hasil yang diperoleh pada LB DS 10 ml larutan menjadi keruh dan gas

yang terbentuk sampai ¾ bagian hanya ada 1 tabung. Pada LB SS 1 ml larutan

menjadi keruh tapi tidak ada tabung yang terbentuk gas sampai ¾ bagian. LB

SS 0,1 ml larutan juga menjadi keruh dan gas yang terbentuk tidak ada yang

mencapai ¾ bagian. Jadi data yang terbaca pada tabel MPN adalah 1-0-0 dengan

nilai MPN 2.0, sehingga perhitungan MPN adalah :

koloni per ml

Selanjutnya dari tabung LB DS 10 ml yang positif atau tabung

durhamnya terisi lebih dari ¾ bagian gas diambil sedikit saja dengan jarum ose.

Jarum ose yang telah dimasukkan dalam LB DS 10 ml positif kemudian

dimasukkan dalam BGLBB dan diinkubasi selama 24 jam untuk diketahui

apakah ada perbahan warna. Hasilnya pada BGLBB berubah warna dari hijau

pekat menjadi sedikit kekuningan. Itu berarti pada teh basi positif terinfeksi

dengan E. Coli atau Coliform.

IV. KESIMPULAN

1. Salah satu metode perhitungan jumlah mikrobiologi adalah TPC dan MPN.

2. Metode total plate count (TPC) merupakan analisis untuk menguji cemaran

mikroba dengan menggunakan metode pengenceran dan metode cawan tuang.

3. Jumlah perhitungan mikroba pada sampel teh basi dengan menggunakan

metode TPC adalah sebesar 2,2 x 107 koloni per mili.

4. Jumlah perhitungan mikroba pada sampel teh basi dengan metode MPN

adalah sebesar 2 x 101 koloni per mili

DAFTAR PUSTAKA

Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2004. Texbook of Microbiology.

W.B. Saunders Company, Philadelphia.

Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Hastowo, Sugyo. 1992 .Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali.

Lay, Bibiana W. 1992. Analisis Mikroba Di Laboratrium. Jakarta: Rajawali.Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book

Company. New York.

Rachdie. 2008. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba.

http://rachdie .blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang

mempengaruhipertumbuhan- mikroba/.

Suardana, IW. Swacita, IBN. 2009. Higiene Food. Udayana University Press:Denpasar