analisa komponen bioaktif pangan fungsional · pdf filesebagai metabolit sekunder ......

27/06/2013

1

ANALISA KOMPONEN BIOAKTIF PANGAN FUNGSIONAL

Kompetensi yang diharapkan : • Mahasiswa mampu menjelaskan

metode pengujian komponen bioaktif pangan fungsional

METODE ANALISIS

Tipe Analisis Ruang Lingkup

Metode Parameter

Micro of trace Konstituen mikro

Kromatografi dan Spektroskopi

Sifat kimia dari komponen

Macro Konstituen Major

Fisiko-kimia, analisis termal

Sifat kimia, perilaku termal

Bulk Produk Reologi Tekstur, viskositas

Pengembangan Metode

Analisis sesuai Metode

Dokumentasi

Kontrol Mutu secara Statistik

Jaminan Mutu

Tidak diperlukan pengulangan setiap kali analisis dilakukan

Variasi dari satu lab dengan lab yang lain harus dihindari dan hasilnya harus dapat diulang

Dapat dilakukan pengembangan dengan perubahan sesuai kebutuhan

Korelasi fungsi dan konstituen kimia dikembangkan

Memberi keuntungan bagi konsumen

We Do So that ANALISIS MIKRO

• Langkah-langkah yang harus dikerjakan adalah :

– Defenisi masalah

– Persiapan sampel yang mewakili

– Persiapan sampel atau ekstraksi

– Seleksi alat dan kondisi analisis

– Analisis berdasarkan metode yang dipilih

– Kompilasi hasil

– Metode

Pengembangan metode : Cara-cara ekstraksi :

Presipitasi Ekstraksi Solvent Ekstraksi fase padat

Hati-hati dalam memilih : Pelarut yang benar Filter yang sesuai

27/06/2013

2

Ekstraksi Analit dari Matriks

Sistem Metodologi Relefansi Keterangan

Cair Pemisahan Cair-cair

Isolasi komponen dari matriks

Pemecahan emulsi dengan cara presipitasi atau desalting

Padat Ekstraksi Soxhlet

Jangan ada kebocoran untuk mencegah kehilangan

KOMPONEN FENOLIK TANAMAN • Fenoilk : komponen yang memiliki 1 atau lebih cincin

aromatik dengan 1 atau lebih gugus hidroksil. • Terdistribusi secara luas pada hampir semua jenis tanaman

sebagai metabolit sekunder • Saat ini lebih dari 8000 struktur fenolik yang dikenal, dari

mulai molekul yang sederhana seperti asam fenolat hingga struktur polimer seperti tanin.

• Fenoiik tanaman biasanya terbentuk untuk melawan radiasi matahari, patogen, parasit dan ppredator, juga berkontribusi terhadap warna pada tanaman.

• Terdapat pada hampir semua bagian tanaman merupakan bagian dari diet manusia

• Berkontribusi terhadap karakteristik organoleptik, misalnya rasa pahit, astrigen (sepat) yang disebabkan interaksi

• Bereaksi dengan oksigen dan merupakan faktor kritis pada pengawetan, pematangan dan aging dari anggur (wine)

FENOLIK TANAMAN

• Asam fenolat

• Flavonoid

• Tanin

• Stilbenes

• lignan

FLAVONOID

• Struktur : inti flavon tdd 15 atom C dengan 3 cincin (C6-C3-C6) yang disebut dengan A,B,C

• Tdd 6 sub kelompok :

1. Flavone

2. Flavonol

3. Flavanol

4. Flavanon

5. Isovlavon

6. Antosianin

Tergantung pada kondisi oksidasi cincin C pusat

27/06/2013

3

FLAVONOID

• Quercitin adalah flavonol terdapat pada bawang, brokoli, apel

• Katekin adalah flavanol yang terdapat pada beberapa jenis buah

• Naringin flavanon yang terdapat pada grapefruit (jeruk besar)

• Cyanindin-glikosida antosianin yang terdapat pada buah2 beri seperti black currant, rasberi, blackberry dll

• Daidzein, genistein dan glisitin isoflavon pada kedelai

ASAM FENOLAT

• Tdd 2 kelas :

1. Turunan asam benzoat : asam galat

2. Turunan asam sinamat : asam kumarat, asam kafeat dan asam ferulat

• Asam kafeat :

Diesterifikasi dengan asam quinat asam klorogenat yaitu komponen fenolik pada kopi

• Asam ferulat :

Terdapat pada serealia

Diesterifikasi menjadi hemiselulosa pada dinding sel

TANIN

• Tdd atas 2 kelompok :

1. Hydrolyzable tannin

2. Condensed tannin

• Hydrolyzable Tannin :

Komponen yang terdiri dari gugus inti glukosa atau poliol teresterifikasi lain dengan asam galat disebut gallotannin

Jika dengan hexahydoxilpenat disebut elagitannin

• Condensed Tannin :

Oligomer atau polimer dari flavon 3-ol yang berikatan dengan ikatan karbon interflavon

Dikenal sebagai asam proantosianin didekomposisi membentuk antosianin melalui reaksi oksidasi yang dikatalis asam melalui pemanasan larutan alkohol asam

Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin

27/06/2013

4

Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin

Gambar. Struktur Stilbenes dan Lignan

EKSTRAKSI FENOLIK

• Dapat diekstrak dari sampel segar, beku atau yang dikeringkan

• Perlakuan sebelum ekstraksi : Milling, grinding, homogenisasi didahului dengan pengeringan duara atau freeze drying

• Metode ekstraski yang banyak digunakan solvent rendemen tergantung pada :

Polaritas pelarut

Waktu ekstraksi

Suhu

Rasio sampel : pelarut

Komposisi kimia dan sifat fisik sampel

EKSTRAKSI FENOLIK (2)

• Jenis pelarut :

Metanol

Etanol

Aseton

Etil asetat

Kombinasi pelarut

Kombinasi dengan air pada berbagai proporsi

• Metanol efisien untuk komponen polifenol dengan BM rendah

• Aseton aqueous untuk flavanol dengan BM tinggi

• Etanol baik untuk ekstrak polifenol dan aman untuk konsumsi manusia

27/06/2013

5


• Ekstraksi fenolik dari tanaman yang kaya akan antosianin :

Pelarut organik yang diasamkan

Sistem pelarut akan mendenaturasi membran sel melarutkan antosianin dan menstabilkannya

Penambahan asam harus hati-hati karena kelebihan asam akan menghidrolisis antosianin

Asam yang digunakan : asam organik lemah : asam formiat, asam asetat, asam sitrat, asam tartarat dan asam posporik, atau asam kuat dengan konsentrasi rendah misalnya asam trifluroasetat 0.5-3%, HCl <1%

Air yang disulfurisasi dapat digunakan untuk mengurangi pelarut organik dan biaya ekstraksi


• Ekstraksi fenolik dari tanaman yang kaya akan antosianin :

Pelarut organik yang diasamkan

Sistem pelarut akan mendenaturasi membran sel melarutkan antosianin dan menstabilkannya

Penambahan asam harus hati-hati karena kelebihan asam akan menghidrolisis antosianin

Asam yang digunakan : asam organik lemah : asam formiat, asam asetat, asam sitrat, asam tartarat dan asam posporik, atau asam kuat dengan konsentrasi rendah misalnya asam trifluroasetat 0.5-3%, HCl <1%

Air yang disulfurisasi dapat digunakan untuk mengurangi pelarut organik dan biaya ekstraksi


• Suhu ekstraksi : 20-50oC, suhu diatas 70oC akan mendegradasi antosianin

• Metode ekstraksi :

Soxhlet

Maserasi

Mikrowave

Ultrasound-assisted extraction (UAE)

Subcritical water extraction (SWE)

Pressurized Fluid Extraction (PFE)

Accelerated Solvent Extraction (ASE)

Efisiensi rendah dan berpotensi mencemari lingkungan

Ultrasound-Assisted Extraction (UAE)

• Berpotensi dikembangkan tidak membutuhkan peralatan yang

kompleks dan relatif murah

• Dapat digunakan untuk skala kecil maupun besar

• Mekanisme :

Gaya geser akan timbul akibat kavitasi gelembung oleh

propagasi gelombang akustik.

Gelembung akan kolaps melalui pengaruh fisik, kimia dan

mekanis yang mengakibatkan rusaknya membran bo=iologis

memudahkan ekstraksi komponen dan penetrasi pelarut ke

dalam sel serta meningkatkan laju pindah massa.

• Digunakan secara luas untuk ekstraski komponen fenolik dari

bagian2 tanaman baik daun, batang, buah, dan biji.

27/06/2013

6

Pressurized Liquid Extraction (PLE)

• Istilah dalam industri Accelerated solvent extraction (ASE) • Teknologi yang realtif baru dengan suhu dan tekanan tinggi • Tekanan diaplikasikan untuk meningkatkan ekstraski pelarut

ekstraksi pelarut > jika digunakan suhu yang lebih tinggi dari titik didih normal.

• Kombinasi tekanan tinggi (3.3-20.3 MPa) dan suhu tinggi (40-200°C) mempercepat proses dan membutuhkan sedikit pelarut (contoh : 20 menit menggunakan 10–50 mL pelarut jika dibandingkan ekstraksi tradisional yang butuh waktu 10–48 jam dan > 200 ml pelarut.

• Suhu dan tekanan tinggi meningkatkan kelarutan analit dan kinetika desporpsi dari matriks.

Subcritical Water Extraction (SWE)

• Sama dengan PLE tapi pelarut yang digunakan adalah air • Air dipanaskan hingga suhu200°C dan terjadi perubahan

konstanta dielektrik air sehingga air bersifat sebagaimana pelarut organik.

• Contoh konstanta dielektrik air pada suhu 200°C = 36 yang mendekati konstanta dielektrik metanol.

• PLE (80–100°C) menggunakan air yang diasamkan asam efektifnya dengan metanol 60% yang diasamkan untuk mengekstraksi antosianin dari kulit anggur.

• Komponen fenolik lebih mudah teroksidasi pada suhu tinggi, sehingga perlu dicegah degradasi pada kondisi PLE.

• PLE efektif digunakan untuk ekstraksi komponen fenolok pada biji anggur, apel, bayam, terung dan tepung barley.

Microwave Assited Extraction (MAE)

• Ekstraksi dengan menggunakan energi gelombang mikro untuk memudahkan pemisahan analit dari matriks sampel ke dalam pelarut.

• Keuntungan : mengurangi waktu ekstraksi dan volume pelarut jika dibandingkan metode ekstraksi konvensional.

• Digunakan untuk ekstraski fenolik : asam galatm elagat, quersitin, isoflavon dan trans-resveratrol menggunakan mikrowave pada suhu 100 °C selama 20 menit.

• Komponen fenolik yang dihasilkan memiliki susbtituen hydroksil dengan jumlah tinggi (misal tanin) dan sensitif terhadap kenaikan suhu antosianin tidak dapat diekstraksi dengan MAE

Extraction of Extraction of phlorotanninsphlorotannins

Bubuk Bubuk AlgalAlgal (0.5 g)(0.5 g)

Pengadukan dengan Pengadukan dengan shaker shaker menggunakan menggunakan methanol (2 ml) methanol (2 ml) pada suhu ruang selama 2 jampada suhu ruang selama 2 jam

Penambahan Penambahan CHClCHCl3 3 (4 ml) (4 ml) pengadukan dengan tangan selama 5 menitpengadukan dengan tangan selama 5 menit

FiltratraFiltratrasi menggunakan kapas bebas lemaksi menggunakan kapas bebas lemak

Penambahan air bebas ion Penambahan air bebas ion 1.5 ml 1.5 ml dan pengadukan dengan tangan selama 5 menitdan pengadukan dengan tangan selama 5 menit

Pemisahan campuran antara bagian atas dan bagian bawah, lapisan atas merupakan fraksi non Pemisahan campuran antara bagian atas dan bagian bawah, lapisan atas merupakan fraksi non

lemak dikumpulkanlemak dikumpulkan

Diekstraksi 2 kali menggunakan Diekstraksi 2 kali menggunakan ehylehyl ether (3 ml) ether (3 ml) dan ambil lapisan atas (2 kali)dan ambil lapisan atas (2 kali)

Fraksi Fraksi ethyl ether ethyl ether dievaporasi menggunakan blower dievaporasi menggunakan blower nitrogennitrogen

PPhlorotanninshlorotannins kasarkasar

27/06/2013

7

Pemurnian Pemurnian phlorotanninsphlorotannins

•• Analisa secara quantitatif menggunakan Analisa secara quantitatif menggunakan HPLCHPLC

•• Sistem Sistem HPLC HPLC tdd tdd Waters 600 pump, Waters 600 pump, detektor detektor UV dan kolom UV dan kolom and C 18.and C 18.

•• Laju aliran Laju aliran 1.0 1.0 mLmL/m/menitenit

•• Gradien linier Gradien linier 3030--100% methanol100% methanol

•• Detektor Detektor UV UV diatur pada diatur pada 290 nm290 nm

2525

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

• Dilakukan dengan kombinasi beberapa teknik kromatografi yaitu TLC (Thin Layer Chromaography) dan kromatografi kolom (Column Chromaography).

KROMATOGRAFI KOLOM

• Terdiri dari fase stasioner (fase diam) dan fase mobil (fase bergerak).

• Fase diam berupa adsorben berbentuk bubuk yang dimasukkan ke dalam kolom gelas vertikal. Sampel yang akan dianalisa dimasukkan di bagian atas dari kolom ini.

• Fase bergerak adalah pelarut yang dialirkan dari atas ke kolom sehingga komponen dari bahan akan terdistribusi di antara adsorben dan pelarut dan terjadi pemisahan komponen, sedangkan pelarut akan mengalir ke bagian bawah kolom.

• Pada pemisahan ini ada komponen yang lebih cepat terelusi dan ada yang lebih lambat.

• Prinsip dasar kromatografi adalah komponen yang berbeda akan mempunyai kelaurtan dan adsorpsi yang berbeda di antara 2 fase sehingga dapat dipisahkan. Fase mobil kemudian dipaksa melalui sebuah fase sasioner yang tidak bergerak dan tidak dapat bersatu.

KROMATOGRAFI KOLOM

• Pemilihan fase didasarkan pada kelarutan komponen pada tiap fase.

• Komponen yang sangat mudah larut di dalam fase stasioner akan membutuhkan waktu lebih lama untuk melewatkannya daripada komponen yang sangat tidak larut pada fase stasioner tapi larut pada fase mobil komponen sampel akan terpisah satu sama lain ketika lewat pada fase stasioner.

27/06/2013

8

THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)

• Teknik pemisahan padat-cairan dimana fase stasioner berupa bahan padat sedangkan fase bergeraknya adalah cair.

• Bahan padat yang biasa digunakan dalam kromatografi adalah silika gel (SiO2xH2O) dan alumina (AL2O3xH2O). Kedua adsorben ini merupakan adsorben yang bersifat polar, tetapi alumina lebih polar dibandingkan silika gel.

• Silika bersifat asam, sedangkan alumina terdapa dalam bentuk netral, basa atau asam.

• TLC merupakan teknik kromatografi yang sensitif, cepat, sederhana, murah, membutuhkan sampel dalam jumlah kecil (1-20 mg/ml), dan dengan visualisasi kimia yaitu mengekspos plate agar terjadi reaksi kimia dengan komponen akan terbentuk warna yang dapat dilihat dengan sinar ultraviole pada panjang gelombang tertentu.

THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)

• Digunakan untuk menentukan : banyaknya komponen di dalam campuran idenifikasi dua substansi/komponen memonitor terjadinya reaksi Efektivitas proses pemurnian Kondisi yang sesuai untuk pemisahan dengan kolom

kromatografi Memonitor kromatografi kolom

Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe

• Bahan-Bahan : bubuk kedele kering, tempe pelarut (hexan, etanol) pelarut/eluen untuk kromatografi kolom (hexan, etil

asetat, metanol) eluen untuk TLC (hexan, eil asetat, dikloromettan,

metanol) silika gel Reagen untuk visualisasi (larutan sulfur atau

pospomolibdat dalam etanol) TLC


• Alat-alat : Vacuum filter funnel Kromatografi kolom Lampu UV (254, 365 nm) Botol Sprayer Hotplate/oven Rotary evaporator

27/06/2013

9


• Cara kerja : Sampel dalam bentuk bubuk diekstraksi/maserasi dengan

hexan dan etanol sebanyak 3 kali. Hasil ekstraksi dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar Siapkan TLC yang dilengkapi dengan indikator fluorescense

yang akan bervisualisasi dengan lampu ulraviolet pada panjang gelombang 254 nm, dengan dua atau lebih pelarut untuk menentukan pelarut yang terbaik.

Teteskan hasil ekstraksi/maserasi pada TLC Ambil 3 ml pelarut (MeOH, etil asetat, hexan dan lain-lain) Masukkan ke dalam beaker glass Letakkan TLC di dalamnya, tutup dan tunggu. Jika pelarut

sudah sampai 0.5 cm di bagian atas TLC, angkat TLC. Beri anda dengan pensil, kemudian dikering anginkan. Lihat di bawah lampu UV

SolventDepan

Origin

SolventDepan

Origin

Hexan:EtOAc Hexan:DOM

1 : 1 1 : 2

Gambar. Penentuan pelarut terbaik

Metode Analisa Antioksidan

• Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan secara bertahap sebagai berikut :bertahap sebagai berikut :

1. Uji in vitro menggunakan reaksi kimia misalnya metil-linoleat, DPPH (1,1-diphenyl -2- pycrylhydrazyl)

2. Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya mengukur viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan dien terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dll

3. Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya aktifitas enzim antioksidan, kadar TBARS

4. Uji in vivo pada manusia

Metode Analisa Antioksidan (2)

Pengujian in vitro menggunakan reaksi DPPH atau ABTS

• DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang

relatif stabil.

• DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi

oleh suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan

intensitas warna ungu (memudar). • Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol

(tanpa penambahan antioksidan) menunjukkan semakin tingginya aktivitas antioksidan senyawa uji.aktivitas

27/06/2013

10


Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia Dien Terkonjugasi

Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi.

Konfigurasi-konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer UV langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra absorpsi.

Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut diinkubasi bersama-sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.


Pengujian in vitro menggunakan materi biologis Teknik Kultur Sel

Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari hewan atau

manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel hewan atau manusia,

tersebut setelah masa inkubasi tertentu.

Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun diberi stres

oksidatif menggunakan senyawa oksidator (misalnya H2O2), dan

sebagai kontrol adalah model tanpa penambahan senyawa uji.

Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berpoliferasi, sel harus

memiliki membran utuh. Adanya oksidasi pada lipid penyusun struktur

membran sel, mengakibatkan sel tidak dapat merespon sinyal sehingga tingkat proliferasi sel menurun.

Dengan kultur sel dapat juga diukur TBARS sebagai indikator

peroksidasi lipid


Pengujian in vitro menggunakan materi biologis LDL Teroksidasi

Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari hewan atau manusia.

Senyawa uji diinkubasi bersama-sama dengan LDL, kemudian

dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm

setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga

membentuk kurva LDL teroksidasi.

Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin

panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi. Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun tanpa

penambahan senyawa uji


Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)

Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan lainnya)

Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.

Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres oksidatif.

27/06/2013

11


Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)

Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan lainnya)

Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.

Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres oksidatif.

Metode Uji Aktivitas Antimikroba

Metode Dilusi cair atau dilusi padat • Pada prinsipnya, antibiotik diencerkan hingga

diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi senyawa bioaktif ditambah suspensi kuman dalam media. Pada dilusi padat, tiap konsentrasi senyawa bioaktif dicampur dengan media agar, lalu ditanami kuman.

Metode Difusi • Cara Kirby Bauer • Cara Sumuran (Cup Plate) • Cara Pour Plate

•Skema penyiapan suspensi bakteri

Diambil 1 koloni bakteri dari stok bakteri

(Staphylococcus aureus atau Escherichia coli)

Dimasukkan dalam BHI 1 ml

Diinkubasi 18-24 jam pada suhu 37ºC

Diambil 100 µl, dimasukkan dalam 1 ml BHI

Diinkubasi 4-8 jam pada suhu 37ºC

Diencerkan dengan NaCl 0,9% sampai konsentrasi bakteri 108 CFU/ml

(Kekeruhan disamakan dengan Standar Mc Farland)

Diencerkan sampai 106 CFU/ml dengan BHI DS

(diperoleh suspensi bakteri dg konsentrasi 106 CFU/ml)

CONTOH

1 2 3 4 K1 K4 K3 K2

Tabung uji

+ suspensi bakteri 106 CFU/ml

Tabung kontrol

K1 : Kontrol media

K2 : Kontrol pelarut

K3 : Kontrol sampel

K4 : Kontrol suspensi bakteri

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

Diamati kejernihan dalam tabung uji (Menentukan KHM)

Digores ke media padat

Agar darah (Staphylococcus aureus) atau Agar Mc.Conkey ( Escherichia coli)


Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar (Menentukan KBM)

Metode Dilusi Cair

27/06/2013

12

No

Tabung

Perlakuan

% b/v

(kadar akhir)

HASIL

PENGAMATAN

Kejernihan Koloni

1. 0,6125% K +

2. 1,25% J -

3. 2,5% J -

4. 5 % J -

5. K -

6. K -

7. K.I J -

8. K.II J -

9. K.III K -

10. K.IV K +

Contoh Hasil Uji Aktivitas

Keterangan : KK = Kekeruhan + = Ada koloni bakteri

J = Jernih - = Tidak ada koloni bakteri K = Keruh

Kadar akhir = kadar ekstrak awal dibagi 2 Jadi, KHM = 1,25% b/v

KBM = 1,25% b/v

Kontrol (data dan gambar belum ditampilkan) K.I (Kontrol media)

K.II (Kontrol pelarut) K.III (Kontrol sampel)

K.IV (Kontrol bakteri)

1 2 3 4

1 2

3 4

KHM

KBM

8 4 0 2 1

Tetracycline (μg/ml)

MIC = 2 μg/ml

Determination of MIC

1 2 3 4 K1 K4 K3 K2

Petri uji

suspensi bakteri 106 CFU/ml

Dg cara spread plate

Petri

kontrol

K1 : Kontrol media

K2 : Kontrol pelarut

K3 : Kontrol sampel

K4 : Kontrol suspensi

bakteri


Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar

(Menentukan KHM/KBM)

Metode Dilusi Padat

+ media

padat

+ media

padat METODE METODE DIFUSIDIFUSI a. Kirbya. Kirby--BauerBauer

27/06/2013

13

No No

growthgrowth

KirbyKirby--BauerBauer

SusceptibleSusceptible Not susceptibleNot susceptible

BacterialBacterial

lawnlawn

GrowthGrowth

Antibiotic diskAntibiotic disk

Chl Amp

Ery

Str

Tet

Disk Diffusion Test

Size of zone of inhibition depends on

sensitivity, solubility, rate of diffusion. Compare

results to MIC tables generated using

standards.

Disk Diffusion Zone Diameter Standards for Disk Diffusion

Tests

Antimicrobial Agent (amt.per disk) and organism

Zone Diameter (mm) Approx.MIC (g/L) for

R I MS S R S

Ampisilin (10 g/disk)

Enterobacteriaciae <11 12-13 >14 >32 <8

Harmophillus <19 >20 >4 <2

Enterococci <16 >17 >16

Tetracycline <14 15-18 >19 > 16 <4

27/06/2013

14

Measuring Antimicrobial Sensitivity

• MIC: Minimal inhibitory concentration

E-Test method

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya

• Bahan : kulit buah manggis matang dari pasar

• Perlakuan terhadap kulit buah manggis :

Pencucian dengan air bersih

Dikeringanginkan

Dikeringkan pada pengering vakum suhu 50oC tekanan 62 cm Hg, 4 jam

Penghancuran dengan blender bubuk kulit biah manggis

• Kultur mikroba uji : Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus plantarum penyebab kerusakan nira

Kultur ditumbuhkan pada media MRS broth, suhu 30oC, 24 jam

Diatur densitasnya dengan aquades hingga mencapai OD = 0.1 pada panjang gelombang 625 nm

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya (1)

• Ekstraksi :

20 g bubuk kulit manggis kering diekstrak dengan 100 ml metanol dengan metode maserasi disertai pengadukan dengan magnetic stirer pada suhu kamar selama 3 jam.

Campuran disaring berturut-turut dengan kertas whatman no.4 dan no.1 Filtrat I

Residu diekstrak kembali dengan 100 ml etanol Filtrat II

Filtrat I dan II dicampur dan dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator suhu 45oC

Ekstrak kering yang diperoleh dilarutkan kembali dengan metanol ekstrak metanol kulit buah manggis 5% (50g/L)


• Fraksinasi :

Menggunakan metode partisi

20 ml ekstrak metanol kulit buah manggis dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator suhu 45oC

Disuspensikan dengan aquades sampai volumenya 100 ml

Suspensi ekstrak dipartisi berturut-turut dengan heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol fraksi dari masing2 pelarut dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator pada suhu 45oC

Fraksi kering yang diperoleh selanjutnya dilarutkan kembali dengan pelarut masing2 diperoleh fraksi dengan konsentrasi 5% (50g/L)

27/06/2013

15


• Pengujian Aktivitas Antimikroba:

Menggunakan uji difusi cakram

20 L esktrak diteteskan apda cakram kertas saring dikeringkan pada laminar flow selama 60 menit

Cakram yang mengandung ekstrak ditempelkan pada media agar yang telah diinokulasi dengan suspensi mikroba 250L/cawan.

Media diinkubasikan pada suhu 30oC selama 24 jam

Kontrol : cakram kertas saring yang ditetesi 20 L pelarut.

Pengamatan : zona bening di sekitar cakram (mm) zona penghambatan


• Analisis GC-MS

Dilakukan terhadap fraksi ekstrak yang positif menunjukkan aktivitas antimikroba

Gas pembawa : helium dengan laju aliran 30 ml/menit.

Suhu GC : suhu injektor 300oC, suhu awal oven 100oC dengan laju kenaikan suhu 10oC/menit, suhu akhir oven 300oC

Identifikasi Senyawa Ekstrak Kloroform

27/06/2013

16

Identifikasi Senyawa Ekstrak Kloroform

Penentuan Glisemik Indeks Pangan (Miller, 1996)

• Pangan tunggal yang akan ditentukan GI-nya (yang mengandung 50 gram karbohidrat) diberikan kepada relawan yang telah menjalani puasa penuh (kecuali air). Sebagai contoh, untuk menentukan GI kentang rebus diperlukan 250 gram kentang untuk menyediakan karbohidrat sebanyak 50 gram (setara dengan 3 sendok makan bubuk glukosa murni).

• Selama dua jam pasca pemberian (atau tiga jam apabila relawan menderita diabetes), sampel darah diambil untuk setiap 15 menit pada jam pertama kemudian setiap 30 menit pada jam kedua untuk diukur kadar glukosanya.

• Pada waktu yang berlainan hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 gram glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada relawan. Hal ini dilakukan sebanyak 2 kali untuk mengurangi efek ragam hari-ke-hari respon gula darah.

• Kadar gula darah (pada setiap waktu pengambilan sampel) ditebarkan pada dua sumbu, yaitu sumbu waktu dan kadar glukosa darah.

• GI ditentukan dengan cara membandingkan luas daerah di bawah kurva antara pangan yang diukur GInya dengan pangan acuan.

27/06/2013

17

Kategori Pangan menurut Rentang Indeks Glisemik

Perhitungan GI Makanan Campuran Pengujian Efek Hipoglikemik (Antidiabetes)

• Pengujian Secara In vivo (menggunakan hewan percobaan)

24 ekor tikus wistar dimasukkan ke dalam kandang kolektif dengan suhu ruang 20-25oC

Tikus diberi pakan dan minum secara ad libitum

Tikus diadaptasikan selama 1 minggu sebelum perlakuan

Berat badan tikus ditimbang setiap 3 hari sekali

Kadar gula darah diukur setiap minggu

Tikus dibagi menjadi kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol

Induksi aloksan (untuk menginduksi tikus menjadi hiperglikemia) dilakukan 3 hari sebelum diberi perlakuan, kemudian kadar gula darahnya diukur memastikan bahwa tikus sudah hiperglikemik. Tikus yang digunakan adalah tikus dengan kadar gula darah >126 mg/dl

Masing-masing kelompok diberi ransum standard, tetapi pada kelompok perlakuan diberi tambahan makanan berupa perlakuan yang ingin diuji.

Tikus dipuasakan selama 16 jam, dan kadar gula darah diukur

27/06/2013

18

Uji Aktivitas Antidiabetes Secara In Vitro

Dengan Uji aktivitas -Glukosidase

Pembuatan Kurva Standar 4-nitrofenol

Menggunakan 6 deret standar (15,30,45,60,75 dan 90 M), dengan cara melarutkan 4-nitrofenol dalam larutan buffer fosfat pH 7. Blanko = buffer fosfat pH 7. Diukur absorbansinya pada 400 nm

Uji inhibisi -Glukosidase

Menggunakan substrat p-nitrofenil--Dglukopiranosida (p-NPG) dan enzim -Glukosidase.

Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0 mg enzim -Glukosidase dalam larutan buffer fosfat (pH 7) yang mengandung serum bovin albumin, kemudian diencerkan 25 kali dengan puffer fosfat pH 7.

Ekstrak sampel dilarutkan dalam DMSO.

Penghentian reaksi enzim substrat dilakukan dengan penambahan Na2CO3 200 mM. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 400 nm.

Uji Aktivitas Antikanker

Preparasi kultur sel mieloma mencit

• Sel mieloma mencit di thawing setelah dibekukan pada suhu -80°C. Hasil thawing diinisiasi pada inkubator 5% CO2 pada suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7 di dalam media RPMI 1640 dan FBS 10%, 100µg/ml streptomisin, 100 unit/ml penisilin. Bila kepadatan sel hasil inisiasi telah mencapai 105 – 2.106 maka suspensi sel tersebut dapat digunakan lebih lanjut untuk uji antikanker dan induksi apoptosis.

Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode viabilitas sel dengan pewarnaan tripan biru.

• Sebanyak 0,2 mL dari masing -masing larutan baku kerja dengan konsentrasi 1 25, 250, 500, 750, 1000 µg/mL, kontrol positif dan kontrol negatif dimasukkan ke dalam sumuran microplate. Tiap konsentrasi dilakukan 3 pengulangan (3 lubang sumuran).

• Setelah itu, ke dalam masing -masing lubang sumuran di tambahkan suspensi sel mieloma seb anyak 0,8 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan uji 25, 50,100, 150 , 200 dan 300 µg/ml serta kontrol positif etoposida sebesar 10 µg/ml. Bersama-sama kemudian diinkubasi pada inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7. dilakukan panen sel dan diamati persentase viabilitasnya menggunakan pewarnaan laru tan tripan biru 0,4% dengan perbandingan susp ensi sel : tripan biru = 1:1 dihitung dengan menggunakan hemositometer, di mana sel mati akan terwarnai biru sedangkan sel hidup akan berwarna jernih.

Uji Aktivitas Antikanker (2)

27/06/2013

19

Pendekatan terbaru studi pencernaan

• Secara In vivo :

Uji pernafasan

Scintigraf

USG

MRI (Magnetic Resonance Imaging)

• Secara in vitro :

Gastrointestinal model (GIM) static dan dinamyc

Human Gastrointestinal Simulator (HGS) UC Davis

analisa komponen bioaktif pangan fungsional · pdf filesebagai metabolit sekunder ......

Documents