perakitanmikroba
Post on 16-Feb-2015
46 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
PERAKITAN MIKROBA REKOMBINAN
Irfan D. PrijambadaFak. Pertanian UGM
Mikroba untuk Kegiatan Industri Mengisolasi dari alam Rekayasa genetik untuk
mengubah sifat mikroba yang sudah umum digunakan sehingga dapat memproduksi bahan baru
Mengisolasi Mikroba dari Alamuntuk Kegiatan Industri Hanya sedikit yang dapat ditumbuhkan dalam media pertumbuhan buatan.
Kegiatan mencari mikroba yang berpotensi untuk kegiatan industri disebut “Bioprospecting”.
Lingkungan ekstrem menarik. Pengembangan teknik penumbuhan
yang efektif terhadap beaya.
Rekayasa Genetik Mikroba Tak Terarah untuk Kegiatan Industri Dapat dilakukan melalui mutasi
menggunakan agensia mutagenik atau radiasi UV Contoh: Pengembangan Penicillium penghasil
penicillin yang tinggi Dapat dilakukan melalui fusi protoplas antar
jasad yang secara filogenetik berjauhan hubungannya; sering digunakan pada rekayasa genetik khamir (yeasts) dan jamur
Rekayasa genetik alami Menumbuhkan mikroba dalam keadaan marginal
(“stressful”) dan menapis (selecting) galur mikroba baru dengan kemampuan tumbuh yang lebih baik pada keadaan tersebut.
Muncul karena mutasi spontan.
Melalui penyisipan potongan DNA yang mengandung gen menggunakan teknologi rekombinasi DNA untuk menghasilkan produk protein tertentu.
DNA hasil rekombinasi dapat dipindahkan ke dalam jasad yang lain untuk menghasilkan sifat yang dikehendaki di jasad tersebut.
Gen harus bisa diekspresikan.
Rekayasa Genetik Mikroba Terarahuntuk Kegiatan Industri
Melalui modifikasi pada daerah pengatur transkripsi (transcriptional regulation), memfusikan protein, dan menghilangkan daerah pengatur umpan balik (feedback regulation controls) Cara ini merupakan bagian dari
pengendalian jalur metabolisme untuk mengendalikan atau meningkatkan produksi suatu bahan.
Pengendalian Ekspresi Gen
Vektor Ekspresi
Vektor yang memiliki promoter untuk dapat melakukan transkripsi suatu gen dalam suatu spesies yang dikehendaki.
Sifat-Sifat Inang yang Dikehendaki (untuk memproduksi protein rekombinan) Tumbuh cepat Nutrisi murah Tidak banyak persyaratan Bukan patogen/tidak
menghasilkan toksin
Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein E. coli
Informasi genetiknya sudah sangat dipahami
Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami
Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan
Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi,
Protein intraseluler, Produksi protein rendah
Bacillus Informasi genetiknya sudah sangat
dipahami Kemampuannya dalam fermentasi
telah sangat dipahami Tumbuh sangat cepat dan tidak
banyak persyaratan Produksi protein tinggi Sulit ditransformasi Protein intraseluler Pilihan vektor terbatas
Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein
Streptomyces Kemampuannya dalam fermentasi
telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk
tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Tumbuh lambat Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas
Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein
Saccharomyces Kemampuannya dalam fermentasi
telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk
tumbuh Tumbuh cepat Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas
Khamir Inang untuk Ekspresi Protein
Trichoderma Tidak banyak persyaratan untuk
tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Kemampuannya dalam fermentasi
belum banyak dipahami Sulit ditransformasi Tumbuh lambat Pilihan vektor terbatas
Jamur Inang untuk Ekspresi Protein
DNA Rekombinan
Kombinasi DNA yang berasal dari dua organisme yang berbeda Bakteri dan manusia Bakteri dan tanaman Virus dan manusia
Penggunaan Mikroba Rekombinan
controlcontrol
Produksi protein untuk penelitian Analisis hubungan fungsi
protein alami dan mutannya. Analisis struktur protein.
Penggunaan Mikroba Rekombinan(1A)
Produksi protein komersial Enzim untuk kegiatan industri
Amilase, amiloglukosidase dan ksilosa isomerase untuk industri terkait pati
Protease, selulase dan lipase untuk industri detergen
Protease untuk industri keju Penicillin acylase untuk industri
farmasi
Penggunaan Mikroba Rekombinan (1B)
Industri Keju: Industri keju memerlukan rennet, enzim
protease yang diperoleh dari lambung anak sapi yang masih menyusu dan belum makan rumput.
Pada tahun 1960 FAO memprediksi akan adanya kekurangan rennet karena kebutuhan daging dunia mendorong peternak untuk memelihara sapinya hingga dewasa. Usaha untuk mencari enzim protease pengganti rennet dimulai.
Chymosin (rennet hasil rekayasa genetika) dihasilkan pada awal tahun 1980an dari mikroba (Escherichia coli, Kluyveromyces lactis dan Aspergillus niger) yang direkayasa.
Chymosin telah mengalami pengujian yang ketat untuk menjamin keamanan penggunaannya.
Industri Keju: Chymosin memiliki sifat dan fungsi yang
sama dengan rennet yang diperoleh dari anak sapi. Enzim ini dapat digunakan untuk menghasilkan keju yang kualitasnya sama dengan keju yang dihasilkan menggunakan rennet dari anak sapi yang lebih baik daripada jika menggunakan rennet dari jamur atau hewan selain sapi.
Chymosin pertama kali digunakan untuk pembuatan keju pada tahun 1988. Pada saat ini hampir 90% rennet dihasilkan dari khamir terekayasa.
Penggunaan Chymosin didukung oleh kelompok vegetarian dan kelompok agama yang menolak konsumsi bagian tubuh sapi.
Produksi protein komersial Protein pengobatan
Insulin untuk pengobatan diabetes Interferon-gamma untuk
pengobatan kanker Faktor VIII untuk pengobatan
hemofili Erythropoetin untuk pencairan
gumpalan darah
Penggunaan Mikroba Rekombinan(1C)
Example: Production of recombinant human insulin in E. coli
Pasien diabetes perlu menyuntikkan insulin untuk mengontrol kandungan glukosa dalam darah mereka
Lilly
• Prepronsulin diproduksi oleh se-sel dalam kelenjar pankreas.
• Preproinsulin adalah polipeptida tunggal.
• Preproinsulin diproses oleh enzim proteolitik menjadi Insulin.
• Pada Insulin, rangkaian polipeptida A dan B dihubungkan oleh ikatan disulfida.
A chain
B chain
N
C
C chain
Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (1)
http://members.tripod.com/diabetics_world/lillys_rdna_insulin.htm
Pada Insulin sintetis, polipeptida A dan B diklon secara terpisah ke dalam vektor ekspresi berbasis lac-promoter
Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (2)
Promoter lac, ekspresi diinduksi
Purifikasi dan penghilangan -gal dari
polipeptida insulin
Polipeptida A dan B yang telah dimurnikan
dicampurKondisi campuran dibuat oksidatif agar terbentuk
ikatan disulfida
Humulin
Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (3)
Meningkatkan kemampuan mikroba Meningkatkan kemampuan
penambatan nitrogen Meningkatkan kemampuan melarutkan
fosfat Meningkatkan kemampuan
menggunakan substrat kompleks seperti selulosa ksilosa, dan amilum
Ketahanan terhadap kekeringan, logam berat & senyawa beracun lainnya
Penggunaan Mikroba Rekombinan(2)
legume
rhizobia
Nitrogen tertambat(amonia)
Karbon tertambat(malat, sukrosa)
Penambatan Nitrogen Biologis:
N2 + 8 flavodoxin- + 8H+ + 16 MgATP2- + 18 H2O
+ 2OH- + 8 flavodoxin + 16 MgADP- + 16H2PO4- + H2
nitrogenase
2NH4+
1. Secara stoichiometri jarang terjadi.2. Sangat menghabiskan energi karena
stabilitas N2 yang berikatan rangkap tiga3. Menghasilkan N tertambat (amonium) yang
langsung diasimilasi menjadi biomolekul yang mengandung N (asam amino glutamat)
Gen yang Terlibat dalam Penambatan N2
Pengaruh overekspresi nifH terhadap penambatan nitrogen fixation dan pertumbuhan tanaman
Pertumbuhan P. vulgaris 45 hari setelah inokulasi menggunakan R. etli. 1, Tidak diinokulasi tidak dipupuk; 2, diinokulasi menggunakan CFN42 (wt); 3, diinokulasi menggunakan HP55 (nifHcDK); 4, tidak diinokulasi tetapi dipupuk 10 mM KNO3–2 mMNH4NO3.
Untuk penanganan lingkungan tercemar Mikroba “pemakan” minyak – Prince
William Sound – Alaska Degradasi raksa di lingkungan –
untuk membersihkan lingkungan tercemar
Penggunaan Mikroba Rekombinan(3)
Penggunaan Mikroba untuk Rekayasa Genetika Tanaman
Agrobacterium tumefaciens dan Rekayasa Genetika di Alam
Watak Mikrobanya
A. tumefaciens adalah bakteri Gram-negative, non-sporing, motile, rod-shaped,
Berkerabat sangat dekat dengan Rhizobium yang dapat membentuk bintil penambat nitrogen pada tanaman legume.
Memiliki plasmid yang berukuran besar, disebut Ti.
Agrobacterium tumefaciens
Tertarik kepada luka atau bagian terbuka dari dinding sel tanaman
Menghasilkan asetosiringon yang diinjeksikan ke dalam tanaman yang memungkinkan masuknya plasmid Ti ke dalam tanaman
Plasmid Ti plasmid masuk ke dalam tanaman dan diintegrasikan secara acak dalam kromosom tanaman
Plasmid Ti menyandi opin dan nopalin, dua produk gen yang memacu tumbuhnya tumor pada tanaman terinfeksi
Ti plasmid
Agrobacterium tumefaciens
Gen-Gen dalam Plasmid Ti
tra region — mengendalikan pemindahan plasmid dari bakteri ke sel tanaman
vir – menginduksi pembelahan tak terkendali dari sel tanaman inang
t region (tDNA) – kumpulan gen yang mengendalikan pemindahan tDNA ke dalam kromosom sel tanaman inang
Dari Ti plasmid mengkonstruksi Plasmid Integrasi
Vektor Integrasi
PlasmidPlasmid
ChromosomeChromosome
Rekayasa Genetika Tanaman dan Plasmid Ti
See you ….
top related