pemanfaatan pcr dalam diagnosis

CONTENTS

1. Apa itu metode PCR?

2. Komponen-komponen PCR

3. Prinsip PCR

4. Varian-Varian metode PCR

5. Aplikasi PCR dalam diagnosis &

Apa itu metode

PCR? PCR = Polymerase Chain Reaction

Merupakan teknik amplifikasi DNA in vitro

Ditemukan oleh Karl Mullis pada tahun

1983 → Nobel Prize in Chemistry

1989 = majalah Science menobatkan PCR

sebagai “major scientific development”

1993 = Taq polymerase, enzim esensial

dalam PCR, dinobatkan sebagai “molecule

of the year”

Publikasi yang menggunakan metode PCR

s/d Juli 2012 = 3.240.000

1. Simple

2. Powerful

A. sensitive – sensitivity

B. specific – specificity

C. reliable – reliability; fidelity

3. fast

Kelebihan

metode PCR

Komponen-

Komponen PCR Template (DNA

cetakan)

Primer

DNA polimerase

dNTPs

Larutan buffer (+

Nuclease-free water)

DNA-dye atau Probe

(khusus Real Time

Mesin Thermal

Cycler

Mesin Thermal Cycler Generasi I

Mesin Thermal Cycler Generasi Terbaru

Mesin Real Time PCR

Consumables

Prinsip PCR

Merupakan teknik amplifikasi fragmen

DNA secara enzimatik dan bersifat in vitro

Pada setiap n siklus PCR sempurna akan

diperoleh 2n DNA target

Mis: DNA target (template) awal = 1

molekul, maka setelah 30 siklus, DNA

target akan berjumlah 230 molekul =

1.073.741.824 molekul

Pada umumnya terdiri atas TIGA tahap

utama yaitu

1. Tahap denaturasi DNA (denaturation)

2. Tahap penempelan primer (Annealing)

Sumber: Viljoen et al. 2005, Molecular Diagnostics PCR Handbook, Springer, p.22

DNA Replication

Komponen-Komponen Penting dalam

Replikasi DNA

Komponen-Komponen Penting dalam

Replikasi DNA

a. DNA cetakan : molekul DNA yang akan

direplikasi

b. Molekul deoksi-ribonukleotida: dATP,

dTTP, dCTP, dan dGTP

c. DNA Polymerase: enzim yang mengkatalisis

proses polimerisasi nukleotida menjadi untaian

DNA

d. DNA primase: enzim yang mengkatalisis

sintesis primer untuk memulai replikasi DNA

e. DNA helikase dan DNA girase: enzim yang

membuka ikatan untaian DNA induk &

berperan dalam mencegah aktivitas

supercoiling

f. Single strand binding protein (SSB): molekul

protein yang menstabilkan untaian DNA yang

sudah terbuka

g. DNA ligase: enzim yang menyambung

fragmen-fragmen DNAdATP = Deoxyadenosine triphosphate

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAReplication.html

The Reaction

THERMOCYCLERPCR tube

Denature (heat to

95oC)

Lower temperature to 56oC

Anneal with primers

Increase temperature to

72oC DNA polymerase +

dNTPs

Varian-Varian

PCR Basic PCR

Nested PCR

Multiplex

PCR

Real Time

PCR

RT-PCR

Inverse

PCR

PCR & Gel

Electrophoresi

s

PCR Gel Electrophoresis

Real Time PCR

HRM Analysis

High Resolution Melting Analysis

20

Homoduplexes C or T

Homozygotes represented by a single base change aredifferentiated by a difference in Tm melt.

T

A

C

G

Copyright © 2004 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

Struktur DNA

Gula Pentosa

Basa

Purin/Pirimidin

Fosfat

Ikatan Fosfodiester

Susunan DNA: Double helix, Antiparalel

Ikatan Hidrogen

Chargaff’s Rule: DNA from any cell of all organisms should have a 1:1 ratio (base Pair Rule)of pyrimidine and purine bases and, more specifically, that the amount of guanine is equal to cytosine andthe amount of adenine is equal to thymine

Applications of PCR

Basic Research Applied Research

• Genetic matching

• Detection of pathogens

• Pre-natal diagnosis

• DNA fingerprinting

• Gene therapy

• Mutation screening

• Drug discovery

• Classification of organisms

• Genotyping

• Molecular Archaeology

• Molecular Epidemiology

• Molecular Ecology

• Bioinformatics

• Genomic cloning

• Site-directed mutagenesis

• Gene expression studies

Aplikasi Dalam

Dunia Farmasi

Farmakogenetik

Farmakogenomik

Resistensi Mikroba

Terhadap Obat

Disease Susceptibility

Penyakit Infeksi

Tropis di Indonesia

Demam berdarah

dengue

Malaria

TBC

Demam tifoid

Melioidosis

Dll

Aplikasi PCR dalam

Diagnosis

Penentuan genotipe virus Dengue: DEN

1-4

Penentuan spesies Plasmodium

dalam kasus infeksi malaria

Identifikasi gen Mycobacteriumtuberculosis yang bertanggung

jawab dalam patogenesis

Genotyping Salmonella entericaserovar Typhi sebagai penyebab

demam tifoid

Sumber: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166093405001564

Sumber: http://jcm.asm.org/content/43/5/2435.full.pdf+html

Aplikasi PCR dalam

Pengobatan

Penentuan profil mutasi gen mikroba.

Mis: mutasi gen GyrA menyebabkan

penurunan sensitivitas terhadap

fluorokuinolon

Penentuan aktivitas ekspresi gen yang

bertanggung jawab dalam imunitas

tubuh (mis: gen IL dan MHC) sebagai

gambaran tingkat imunitas seseorang

Identifikasi fragmen DNA tertentu pada

individu sebagai hasil integrasi DNA

virus pada DNA host (Mis: DNA HIV

Sumber: http://aac.asm.org/content/early/2012/02/22/AAC.06414-11.abstract

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576912001488

Suggested Readings