kuliah pakar kbk 2010.ppt2.ppt
Post on 28-Oct-2015
63 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
TEKNIK BIOLOGI MOLEKULERAPLIKASINYA DI KLINIK
Paramasari Dirgahayu
Kuliah MKK Peminatan BIOMEDIKMK Biomedik Biomolekuler
14 Agustus 2010
ISOLASI DNA
• .
• B. Tujuan Pembelajaran Setelah melakukan praktikum isolasi DNA,
mahasiswa diharapkan mampu• 1. Menjelaskan struktur dan fungsi materi
genetik• 2. Mengenali dasar-dasar teknik rekayasa
genetika
Separation of nucleic acids from other cell components
Chloroform Iso Amyl Alcohol (CIAA)
• Phenol CIAA
• Phenol
Two phases: ‘phenol’ phase + aqueous phase
Proteins
DNAaqueous phase
‘phenol’ phaseCAUTION
• Taking to much aqueous phase
will result in impure DNA !!
debris
ISOLASI DNA/RNA/PROTEIN SECARA KLASIK
isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleatdengan Metode Collum
Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi
Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses :
1. Penghancuran dinding sel2. Penghilangan komponen seluler
seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel
3. Pengendapan DNA/RNA4. Purifikasi
PRINSIP
1. Berikatan dengan “glass fleece”
2. Garam kaotropik
3. Wash and spin
4. Pelarutan DNA
5. Analisa selanjutnya/ Simpan
Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleatdengan Metode Collum
Measurement of genomic DNA quality and quantity
Absorption measurement by spectrophotmeter
Measurement of optical density (OD) at a wavelength of 260 nm
Polymerase Chain Reaction
2007
Apakah Metoda PCR ?Metoda PCR adalah suatu teknologi yang dibuat
dengan tujuan dapat membuat tiruan berlipat ganda secara in-vitro enzymatic amplification dari suatu segmen DNA spesifik.
Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.
Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi
• Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik
• Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.
Tahapan Proses PCR
Pre – PCR : Preparasi reagensia
Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA
PCR : proses amplifikasiDenaturasi (pemisahan rantai DNA)
Annealing (penempelan primer)
Extension (pemanjangan oleh enzim)
Post – PCR :Deteksi/ Analisa Hasil PCR
Sekuen Target Target Sequence
DNA StrandDouble HelixDNA StrandSupercoiled
DNA Strand
Chromosome
DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme
Sekuen NukleotidaHydrogen Bonds
Cytosine (C)
Adenine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
Deoxyribose(Sugar molecule)
Phosphoric Acid(Phosphate molecule)
Cytosine (C)
Adenine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
PROSES PCRMaster Mix + target DNA/ RNA
Mg2+
Mn2+
Taq DNA Polymerase
rTth DNA Polymerase
AmpErase®
BiotinylatedPrimer
Target RNAor DNA
dCTP
dTTP
dGTP
dUTP
dATP
and
OR
and
Polymerase Chain Reaction
Mg2+
AmpErase®
Taq DNAPolymerase
BiotinylatedPrimers
Target DNA
PCR
dCTP
dTTP
dGTPdUTP
dATP
BiotinylatedAmplicon
BiotinylatedAmplicon
PROSES PCR : Amplifikasi 1 – Denaturasi oleh panas
Target Sequence
Target Sequence
2 – Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung
Sekuen TargetTarget Sequence
Target Sequence
Primer 1Primer 2
Biotin
Biotin
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
3 - Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai
Komplemen NukleotidaTarget Sequence
Target Sequence
Primer 1
Primer 2
Biotin
Biotin
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNAPolymerase
Akhir Siklus PCR ke-1Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target
Target Sequence
Target Sequence
Biotin
Biotin
PCRPolymerase
Chain Reaction)
Cara kerjaPCR REACTION
MIXTUREAdd Add
2xPCR Mix
Template DNA
Primer
DDW
10 µl
1 µl
1 µl
8 µl
25 µl
2 µl
2 µl
21 µl
Total Reaksi 20 µl 50 µlTAMBAHKAN 40 µL MINERAL OIL UNTUK MENUTUPI PERMUKAAN CAIRAN MENCEGAH PENGUAPAN SAAT PCR
SETTING: DENATURASI 94-95 °C ANNEALING: 50-65 °C DAN EXTENSI 72 °C
Deteksi/ Analisa Hasil PCR
Elektroforesis gel agarosa (horizontal)
Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)
Enzym labelling oligonucleotide
Biotin-labelled oligonucleotide
Digoxigenin-labelled oligonucleotide
Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.
Definisi
Agarose gel elektophoresis adalah suatu metode untuk memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan besar molekulnya (BM) Pemisahan molekul tersebut dapat terjadi melalui pergerakan asam nukleat yang “negatively charged “menembus matriks agarose dalam tank electrophoresis.
Molekul dengan berat molekul (BM) rendah akan bergerak lebih cepat daripada molekul yang BM nya besar.
AGAROSE GEL ELEKTROPHORESIS
Aplikasi penggunaan teknik elektrophoresis:
1. Untuk memperkirakan ukuran molekul DNA setelah dilakukan restriksi dengan enzim digesti tertentu
(misal restriction mapping dari clone DNA)
2. Analisis produk PCR, misal untuk kepentingan Analysis of PCR molecular genetic diagnosis atau
genetic fingerprinting
KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN
Keuntungan:sampel dapat dipisahkan dan divisualisasi, akan tetapi karena agarose gel tidak bersifat mendenaturasi protein, maka sampel yang sudah di “running” tersebut dapat di purifikasi kembali untuk kepentingan pembuatan plasmid
Gel sangat mudah dibuat dan secara praktis hanya dituangkan ke dalam tank
Kerugian: Gel tersebut dapat meleleh pada saat elektrophoresis
The DNA fragments will separate according to size. To see the DNA bands one must stain the gel with ethidium bromide, a fluorescent dye that intercalates DNA, and excite and view the fluorescence by U.V. transillumination.
The gel may also be photographed. Unknown bands may be sized by comparison to molecular weight standards.
The standards should be used to generate a standard curve for interpolation.
PRINSIP
PRINSIP PROTOKOL KERJA
PROTOKOL KERJA
D1. Persiapan Agar
- TBE buffer + Agarose + SybrSafe/EtBromide
loading sampelGlycerol & bromophenol blue (6x) 3ml glycerol (30%) 25mg bromophenol blue (0.25%) dH2O to 10mL
Schematic drawing of the electrophoresis process, see text for description of steps
Deteksi Produk PCR: Elektroforesis Gel agarosa
PRAKTIKUM BIOMOL MAHASISWA KBK PBL
Beberapa alternative alamat untuk mencari jurnal
• Ebsco: Google ketik ebsco ketik ebscohost (baris pertama. Username: ns003857. Pasword: Password. Lalu untuk artikel pilih
EBSCOhost Research Database. Klik Medline with fulltext. Pilih Basic Search dan ketik artikel yang dicari
Alternative: Ketik Highwire, bmjjournals, freemedicaljournals, nejm pada
googlePROQUEST:http://www.fk.uns.ac.id lalu ketik proquest atau langsung ketik
www.proquest.com/pqdweb. User: 00C7TQWTJJ; Password: pw pquns
top related