identifikasi postlarva famili gobiidae dari muara … · di batu hiu ciamis yang berjudul...
Post on 16-Mar-2019
215 Views
Preview:
TRANSCRIPT
i
IDENTIFIKASI POSTLARVA FAMILI GOBIIDAE DARI
MUARA SUNGAI KEDURANG, BENGKULU
MELALUI DNA BARCODE
LILIANI ISNA DEVI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
LILIANI ISNA DEVI. Identifikasi Postlarva Famili Gobiidae dari Muara Sungai Kedurang,
Bengkulu melalui DNA Barcode. Dibimbing oleh Dr. Ir. ACHMAD FARAJALLAH, M.Si dan
Dr. Ir. R. R. DYAH PERWITASARI, M.Sc.
Postlarva ikan famili Gobiidae merupakan salah satu biota migran musiman dalam jumlah
yang sangat besar. Kegiatan untuk mengidentifikasi spesies dari postlarva sulit dilakukan
berdasarkan ciri morfologi karena sebagian besar panduan identifikasi ikan didasarkan pada
karakter dewasa. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komposisi spesies postlarva ikan
gobi dalam kumpulan anakan ikan yang bermigrasi di muara Sungai Kedurang, Bengkulu
menggunakan DNA Barcode. Sebanyak 22 ekor postlarva ikan dari famili Gobiidae yang
diawetkan dalam alkohol dijadikan sebagai sampel. Ruas DNA yang dijadikan barcode yaitu ruas
gen CO1. Amplifikasi gen CO1 berhasil dilakukan dengan ukuran yang berkisar 700-800 pb.
Sampel no 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 dan 22 teridentifikasi sebagai Stiphodon atratus,
sampel no 19 dan 20 teridentifikasi sebagai Amblyeleotris sungami sedangkan sampel no 3
teridentifikasi sebagai Novem Genus (genus baru) dari subfamili Sicydiinae. Berdasarkan hasil
rekonstruksi pohon filogeni dengan menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) bootstrap 1000x
didapatkan dua klad besar, yaitu klad pertama yang terdiri dari Stiphodon atratus dan Novem
Genus, serta klad kedua yang terdiri dari Amblyeleotris sungami.
ABSTRACT
LILIANI ISNA DEVI. Postlarvae Identification of Gobiidae Family from Kedurang Estuary,
Bengkulu through DNA Barcode. Supervised by Dr. Ir. ACHMAD FARAJALLAH, M.Si and Dr.
Ir. R. R. DYAH PERWITASARI, M.Sc.
Gobiidae family fish postlarvae is one of seasonal migrant biota in a very large number. It
is difficult to identify fishes species according to morphological characteristics of postlarvae
because most of the fish identification guide is based on adult characters. The aim of this study
was to identify the species composition of Gobiidae postlarvae that migrated in Kedurang estuary,
Bengkulu through DNA Barcode. A total of 22 tails Gobiidae family postlarvae which were
preserved in alcohol used as sampels. Segment of CO1 gene was used for barcoding purpose.
Amplified of CO1 gene were successfully yielded in 700-800 bp fragment. Sample no 4, 5, 6, 10,
11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 and 22 were identified as Stiphodon atratus, sample no 19 and 20 were
identified as Amblyeleotris sungami while the sample no 3 were identified as of Novem Genus of
subfamily Sicydiinae. Phylogeny tree reconstruction using the Neighbor Joining (NJ) bootstrap
1000x showed two major clades. One clade contains Stiphodon atratus and Novem Genus, other
clades include only Amblyeleotris sungami.
iii
IDENTIFIKASI POSTLARVA FAMILI GOBIIDAE DARI
MUARA SUNGAI KEDURANG, BENGKULU
MELALUI DNA BARCODE
LILIANI ISNA DEVI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul Skripsi : Identifikasi Postlarva Famili Gobiidae dari Muara Sungai
Kedurang, Bengkulu melalui DNA Barcode
Nama : Liliani Isna Devi
NIM : G34080057
Disetujui
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc
Pembimbing I Pembimbing II
Diketahui
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
Ketua Departemen Biologi
Tanggal lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan Februari hingga April 2012 sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains
di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor. Karya ilmiah ini berjudul identifikasi postlarva famili Gobiidae dari muara sungai
Kedurang, provinsi Bengkulu melalui DNA Barcode.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Achmad Farajallah dan Dr. Dyah
Perwitasari selaku pembimbing yang telah memberikan banyak ilmu, dan bimbingannya kepada
penulis. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, terutama
almarhum ayah (Drs. Abiyono, MM), ibu (Dra. Eny Mustafidah), kakak (Mohammad Awaluddin
Annas) atas segala doa yang tiada henti, kasih sayang, dan dukungannya. Penulis mengucapkan
terima kasih kepada semua keluarga besar zoologi (Mbak Kanthi, Pak Bambang, Ibu Taruni, Ibu
Rika, Pak Tri Atmo, Pak Heru, Mas Wildan, Mba Dea, ka Iqbal, ka Bisri, ka Icha, ka Rindi, Mba
Tetri, Mba Puji, Ka Sinyo, Kak Sars, Mba Tini, Mba Ani, Pak Adi yang telah berbagi ilmu serta
segala dukungannya. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Rahmat Hafid dan sahabat
seperjuangan (Ai, Esa, Tyas, Yanti, Delvi, Anas, Dalfit, Adit, Agus) atas segala bantuan, nasehat,
dan semangat yang selalu diberikan selama penelitian. Selain itu, terima kasih kepada teman-
teman Biologi angkatan 45 yang telah memberikan motivasi kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan menambah khasanah ilmu pengetahuan kita
semua. Saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan agar karya ilmiah ini menjadi
lebih baik.
Bogor, September 2012
Liliani Isna Devi
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jepara pada tanggal 03 Februari 1990 dari Bapak Drs. Abiyono, MM
(Alm) dan Ibu Dra. Eny Mustafidah. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Penulis
menyelesaikan pendidikan sekolah dasar di SD Negeri Harapan Baru 03 pada tahun 2002, dan
lulus dari SMP Negeri 1 Bekasi pada tahun 2005. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1
Bekasi dan pada tahun yang sama melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi melalui jalur penerimaan USMI.
Selama mengikuti perkuliahan di IPB, penulis aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah
Vertebrata, Struktur Hewan, dan Botani Umum pada tahun ajaran 2011/2012. Selain aktif di
perkuliahan, penulis juga aktif mengikuti organisasi yaitu sebagai bendahara BioWorld pada
Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) dan sebagai bendahara Pengembangan dan
Pendampingan di Bina Desa FMIPA. Selain itu, penulis juga mengikuti berbagai kepanitiaan acara
seperti BOX, BIOS, BIONIC, Pesta Sains, Program Penghijauan Mahasiswa Biologi, Revolusi
Sains, dan Lomba Cepat Tepat Biologi. Penulis telah melakukan praktik lapangan pada tahun 2011
di Batu Hiu Ciamis yang berjudul pengelolaan dalam penetasan telur penyu di kelompok pelestari
biota laut (KPBL) pantai Batu Hiu, Ciamis.
vii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL .......................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................. viii
PENDAHULUAN ............................................................................................................................ 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan Penelitian .......................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2
Waktu dan Tempat ........................................................................................................................ 2
Bahan ............................................................................................................................................ 2
Identifikasi sampel ................................................................................................................... 2
Ekstraksi DNA ......................................................................................................................... 2
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA ............................................................................. 2
Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing ........................................................... 2
HASIL ............................................................................................................................................... 2
Amplifikasi dan Visualisasi DNA ................................................................................................ 2
Analisis Filogeni ........................................................................................................................... 3
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 6
DNA Barcode ............................................................................................................................... 6
Hubungan filogeni antar famili Gobiidae ..................................................................................... 7
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 8
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 8
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 9
viii
DAFTAR TABEL
1 Tahap, tanggal, dan waktu pengambilan sampel postlarva ikan Gobi ........................................... 3
2 Jumlah perbedaan nukleotida gen CO1 antar sampel postlarva ikan Gobi .................................... 4
3 Jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik gen CO1 beberapa spesies Famili Gobiidae ....... 5
DAFTAR GAMBAR
1 Amplikon gen CO1 ikan Gobi di atas PAGE 6%. ......................................................................... 3
2 Pengelompokan sederhana dari sampel postlarva ikan Gobi. ........................................................ 4
3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni beberapa spesies ikan Gobi berdasarkan ruas CO1 mtDNA. ... 6
DAFTAR LAMPIRAN
1 Gambar postlarva famili Gobiidae yang digunakan dalam penelitian ......................................... 10
2 Tahapan ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid ..................................................... 11
3 Tahapan visualisasi fragmen DNA produk PCR .......................................................................... 13
4 Hasil pensejajaran ruas gen CO1 dari beberapa spesies famili Gobiidae ..................................... 14
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Muara sungai (estuaria) merupakan daerah
pertemuan air tawar dan laut. Estuari dicirikan
dengan kondisi lingkungan yang subur dan
fluktuatif mengikuti pasang-surut laut. Secara
umum estuaria mempunyai peran ekologis
penting, yaitu sebagai tempat berlindung,
mencari makanan, tumbuh dan bereproduksi
bagi sejumlah spesies ikan dan udang
(Subiyanto et al. 2008). Estuaria merupakan
habitat dengan keanekaragaman biota yang
sangat tinggi, baik biota residen maupun
migran. Salah satu biota migran musiman
dalam jumlah yang sangat besar yaitu
postlarva ikan gobi dari famili Gobiidae.
Famili Gobiidae memiliki siklus hidup
unik yang bersifat amphidromi. Ikan gobi
dewasa menetaskan telurnya di sungai, lalu
larva akan terbawa arus ke estuaria dan
selanjutnya menuju ke laut. Larva tersebut
akan tinggal di laut sekitar enam bulan. Larva
akan bermigrasi kembali ke estuaria dalam
bentuk postlarva. Selanjutnya postlarva akan
berubah menjadi juvenil dan akan kembali ke
sungai untuk tumbuh menjadi dewasa dan
bereproduksi (McDowall 2007).
Fenomena kembalinya kumpulan postlarva
ikan Gobi menuju estuaria akan membentuk
gelombang hitam. Gelombang ini sering
disebut sebagai ipun-ipun oleh masyarakat
Bengkulu. Ipun-ipun menjadi sumber makanan
penting bagi penduduk Bengkulu. Di lain
tempat, ikan Gobi juga dimanfaatkan sebagai
makanan yang lezat bagi orang Taiwan dan
Jepang, walaupun dijual dengan harga yang
tinggi. yaitu 20 dolar per kilo (Lin 2007).
Fenomena ipun-ipun tersebut dapat
menggerakkan rantai makanan sehingga
dinamika ekosistem berlangsung dengan baik.
Nutrient tinggi yang terdapat di estuaria
mampu menyebabkan tingginya kelimpahan
fitoplankton. Dengan melimpahnya
keberadaan fitoplankton, maka dapat
mempengaruhi kelimpahan zooplankton dan
ikan kecil termasuk postlarva yang berperan
sebagai konsumennya. Predator utama dari
postlarva ikan Gobi yaitu udang dan kepiting.
Famili Gobiidae dicirikan dengan adanya
sirip ventral yang menyatu dan membentuk
piringan penghisap. Hal ini memungkinkan
ikan dari famili ini tetap pada posisinya di
perairan dengan arus yang deras. Ikan Gobi
yang hidup di batu karang, memiliki sirip
ventral yang pendek, sedangkan ikan Gobi
yang hidup di pasir halus dan bagian dasar
yang tidak stabil akan memiliki sirip ventral
yang besar (Victor et al. 2010). Ikan Gobi
menyumbang angka keanekaragaman ikan
terbesar di Indonesia, yaitu 18 spesies
ditemukan di Sumatera, 17 spesies di
Kalimantan, 19 spesies di Jawa dan 22 spesies
di Sulawesi (Kottelat & Whitten 1993).
Ikan merupakan kelas dari vertebrata yang
memiliki keanekaragaman jenis luar biasa. Hal
ini terjadi karena ikan mempunyai morfologi
dan adaptasi biologi yang sangat
beranekaragam. Dengan kata lain, variasi
intraspesies dan interspesies pada setiap taksa
ikan sangat tinggi (Zhang & Hanner 2011).
Proses untuk mengidentifikasi ikan menjadi
tantangan tersendiri bagi taksonomis. Selain
itu, kegiatan untuk mengidentifikasi spesies
dari postlarva atau anakan ikan sulit dilakukan
berdasarkan ciri morfologi. Sebagian besar
panduan identifikasi ikan didasarkan pada
karakter dewasa. DNA Barcode dapat
menyelesaikan permasalahan ini karena dapat
mengidentifikasi larva ikan (Pegg et al. 2006).
DNA Barcode telah menarik perhatian
dunia sebagai sistem yang dapat
mengidentifikasi spesies secara cepat dan tepat
(Zhang & Hanner 2011). Ruas yang banyak
digunakan pada hewan sebagai barcode sekitar
700 pb di bagian ujung 5’ gen cytochrome
oxidase 1 (COI) genom mitokondria (Ward et
al. 2005). Teknik tersebut tidak hanya
mempunyai kegunaan untuk mengidentifikasi
spesies yang sudah dikenal, tetapi juga dapat
memastikan suatu spesies baru (Hajibabaei et
al. 2005). Selain itu, DNA Barcode dapat pula
mengungkapkan fenomena spesies cryptic,
species sibling, keragaman yang belum
terungkap, hubungan filogeni di antara takson
yang berdekatan dan dapat digunakan pula
untuk memantau asal usul suatu komoditas
laut (Syafrina 2011). Victor et al. (2007),
melaporkan bahwa secara morfologi ikan Gobi
Coryphopterus kuna sama dengan
Coryphopterus spp, namun ketika
diidentifikasi menggunakan DNA Barcode
didapatkan perbedaan runutan nukleotida
sebesar 25%. Taksonomi dan identifikasi
merupakan salah satu dasar yang sangat
penting bagi pelaksanaan konservasi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi komposisi spesies postlarva
ikan gobi dalam kumpulan postlarva ikan yang
bermigrasi di muara Sungai Kedurang,
Bengkulu menggunakan DNA Barcode.
2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan
Februari-April 2012. Analisis DNA dilakukan
di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan,
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Bahan
Sampel yang digunakan pada penelitian ini
adalah 22 sampel postlarva ikan dari famili
Gobiidae. Ikan ini diambil dari muara sungai
Kedurang, Bengkulu dengan lima kali
pengambilan (Tabel 1). Sampel-sampel
tersebut merupakan koleksi Dr. Achmad
Farajallah IPB. Semua sampel disimpan dalam
alkohol 70% yang mengandung EDTA 1 mM.
Identifikasi sampel
Koleksi postlarva ikan dipilih berdasarkan
ada tidaknya sirip cakram ventral sebagai
pembeda utama anggota famili Gobiidae
(Victor et al. 2010) (Lampiran 1).
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dari otot epaksial dilakukan
menggunakan DNA Extraction Kit for animal
tissue (Geneaid Biotech Ltd). Alkohol
pengawet otot dibuang dengan cara merendam
potongan otot yang berjumlah sekitar 50 mg
dalam akuades steril. Otot disuspensikan
dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM,
EDTA 0.1mM, pH 8.0) dan dilisis
menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan
sodium dodesil sulfat 1%. Pemisahan DNA dari
bahan organik lainya dan pemurnian DNA
selanjutnya mengikuti panduan yang dibuat
oleh produsen (Lampiran 2).
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA
Amplifikasi ruas gen CO1 dilakukan
dengan menggunakan primer universal DNA
Barcode ikan (http://ibol.org), yaitu AF282 5’-
TCTACCAACCACAAAGACATCGG dan
AF283 5’TACTTCTGGGTGTCCTAAGAAT
CA. Reaksi PCR dilakukan dengan volume
25µL dengan komposisi sampel DNA, Taq
Polimerase (Kappa Biosystems) beserta sistem
buffernya, campuran dNTP, MgCl2, primer
forward dan reverse, dan ddH2O steril. Kondisi
PCR baku (predenaturasi, [denaturasi-
penempelan primer- pemanjangan] x30 siklus-
pemanjangan akhir) dengan suhu penempelan
primer 55ºC selama 1,5 menit. Kualitas
amplikon diuji dengan polyacrilamide gel
electrophoresis (PAGE) 6% dalam bufer 1x
TBE (10 Mm Tris HCl, IM asam borat, dan
EDTA 0,1 Mm) yang dilanjutkan dengan
pewarnaan sensitif perak (Byun et al. 2009)
(Lampiran 3).
Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA
Sequensing
Amplikon dengan kualitas pita tunggal
dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing
menggunakan primer yang sama dengan
amplifikasi awal. Runutan nukleotida yang
diperoleh diedit berdasarkan grafik
elektroferogram dari hasil pembacaan
sequensing otomatis ABI (Macrogen Inc) dan
dipastikan lebih lanjut berdasarkan asam
amino yang disandikan. Runutan nukleotida
yang sudah diedit selanjutnya dibuat pohon
filogeni berdasarkan pengelompokan
sederhana ke dalam lima kelompok (Gambar
2). Dipilih satu sampel dari setiap kelompok
untuk dijadikan input dalam pencarian
kesamaan runutan menggunakan BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Runutan nukleotida semua sampel dan
yang homolog hasil BLAST saling
disejajarkan menggunakan Clustal W versi 2.0
yang terdapat dalam MEGA versi 5.00 (Larkin
2007). Analisis keragaman nukleotida
berikutnya, yaitu memastikan spesies yang
didasarkan pada model No. of differences dan
membangun pohon filogeni didasarkan pada
jarak genetik Kimura-2-parameter.
Rekonstruksi filogeni selanjutnya
menggunakan metode Neighbour Joining
berdasarkan model subtitusi Kimura-2-
parameter.
HASIL
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
Gen CO1 berhasil diamplifikasi
menggunakan primer AF282-AF283 dengan
ukuran berkisar 700-800 pb pada 22 sampel, 7
sampel diantaranya terlihat tipis (Gambar 1),
sehingga diperoleh 15 sampel yang dapat
dianalisis lebih lanjut.
Dari hasil pensejajaran antar sampel,
diperoleh ruas DNA yang saling sejajar
sepanjang 623 nt (nukleotida) (Lampiran 4).
Dari 623 nt tersebut, terdapat 186 nt yang
berbeda dan 437 nt yang sama antar sampel.
Sampel no 4 dibandingkan dengan no 11
memiliki jumlah perbedaan nukleotida yang
paling kecil yaitu satu nt. Sampel no 3
dibandingkan dengan no 19 memiliki jumlah
perbedaan paling besar yaitu 140 nt (Tabel 2).
Berdasarkan pengelompokan sederhana ke
dalam lima kelompok, didapatkan 159 runutan
3
nukleotida yang homolog dan ruas DNA yang
saling sejajar sepanjang 572 nt.
Jumlah perbedaan nukleotida yang paling
kecil dapat mengidentifikasikan suatu spesies.
Berdasarkan hasil analisis, ke-15 sampel
mempunyai perbedaan nukleotida terkecil
dengan Stiphodon atratus (HQ639080),
Amblyeleotris sungami (FJ582714) dan Novem
Genus (HQ639060). Selanjutnya, keseluruhan
sampel dibandingkan dengan dua spesies dan
satu genus baru tersebut. Berdasarkan hasil
analisis melalui metode No. of differences
pada basa pertama dan kedua, didapatkan hasil
yaitu sampel no 4, 11, 12, 16, 18, 21, 22 dan
23 tidak mempunyai perbedaan nukleotida
dengan Stiphodon atratus, sedangkan sampel
no 5, 6, 10, dan 14 dibandingkan dengan
Stiphodon atratus mempunyai jumlah
perbedaan nukleotida masing-masing 7, 1, 7,
dan 1 nt. Sampel no 19 dan 20 yang
dibandingkan dengan Amblyeleotris sungami
memiliki perbedaan nukleotida masing-masing
sebanyak 9 dan 6 nt. Sampel no 3 yang
dibandingkan dengan Novem Genus
memberikan jumlah perbedaan nukleotida
sebanyak 1 nt (Tabel 3).
Analisis Filogeni
Hasil rekonstruksi pohon filogeni
menggunakan metode Neighbor Joining (NJ)
dengan bootstrap 1000x didapatkan dua klad
besar (Gambar 3). Kekerabatan dari sampel
no 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 dan
23 menunjukkan bahwa sampel-sampel
tersebut mengelompok dalam satu klad,
sedangkan sampel no 19 dan 20 berada di luar
percabangan klad. Sampel no 19 dan 20
mempunyai cabang nodus yang paling panjang
dibandingkan dengan sampel lainnya,
sedangkan sampel no 4 dan 11 tidak
mempunyai cabang nodus. Berdasarkan hasil
pengujian, didapatkan probabilitas dengan
nilai yang tinggi yaitu sebesar 100% pada
nodus nenek moyang di dalam percabangan
klad.
Tabel 1 Tahap, tanggal, dan waktu pengambilan sampel postlarva ikan Gobi
Tahap Pengambilan Tanggal Pengambilan Waktu Pengambilan
Pertama 10 Juni 2011 15.00 WIB
Kedua 07 Juli 2011 14.10 WIB
Ketiga 08 Juli 2011 14.30 WIB
Keempat 10 Juli 2011 15.00 WIB
Kelima 11 Juli 2011 15.00 WIB
Gambar 1 Amplikon gen CO1 ikan Gobi di atas PAGE 6%. Keterangan: M=Marker atau penanda,
3-23=Nomor Sampel.
4
Tabel 2 Jumlah perbedaan nukleotida gen CO1 antar sampel postlarva ikan Gobi
Keterangan: Angka di bawah diagonal merupakan jumlah perbedaan nukleotida pada triplet basa,
angka di atas diagonal merupakan jumlah perbedaan nukleotida pada basa pertama
dan kedua
Gambar 2 Pengelompokan sederhana dari sampel postlarva ikan Gobi. Keterangan : nomor 1-5
merupakan nomor kelompok.
No.
Sampel 3 4 5 6 10 11 12 14 16 18 19 20 21 22 23
3 2 10 3 9 3 4 4 3 3 16 14 3 5 3
4 67 8 1 7 1 2 2 1 1 14 12 1 3 1
5 78 12 9 13 9 10 10 9 9 20 20 9 11 9
6 76 26 36 6 2 3 3 2 2 15 13 2 4 2
10 77 14 20 35
8 9 9 8 8 21 19 8 10 8
11 68 1 13 27 15
1 1 0 0 15 11 2 2 1
12 71 4 16 30 18 3
2 1 1 15 11 1 1 2
14 70 3 15 29 17 2 3
1 1 16 12 3 3 2
16 71 42 54 39 56 41 42 43
0 15 11 2 2 1
18 71 39 51 36 53 38 39 40 7
15 11 2 2 1
19 140 126 133 132 138 127 125 127 125 127
4 14 16 15
20 138 124 133 128 136 123 121 123 117 119 9
12 12 12
21 70 38 50 35 52 39 38 41 8 3 126 120
2 2
22 74 42 54 39 56 41 38 41 10 5 127 119 4
3
23 69 39 50 37 52 39 40 41 9 4 127 120 4 7
1
1
1 2
3
4
5
5
Tabel 3 Jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik gen CO1 beberapa spesies Famili Gobiidae
No.
Sampel 3 4 5 6 10 11 12 14 16 18 19 20 21 22 23
A.
sungami
Novem
Genus
S.
atratus
3
0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,04 0,03 0,01 0,01 0,01 0,02 0,00 0,01
4 2
0,02 0,00 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
5 8 7
0,02 0,03 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,05 0,05 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0,02
6 3 1 8
0,02 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,04 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00
10 9 7 12 6
0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,05 0,05 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0,02
11 2 0 7 1 7
0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
12 2 0 7 1 7 0
0,00 0,00 0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
14 3 1 8 2 8 1 1
0,00 0,00 0,04 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00
16 2 0 7 1 7 0 0 1
0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
18 2 0 7 1 7 0 0 1 0
0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
19 14 13 18 14 20 13 13 14 13 13
0,01 0,03 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03
20 12 10 17 11 17 10 10 11 10 10 3
0,03 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03
21 2 0 7 1 7 0 0 1 0 0 13 10
0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
22 2 0 7 1 7 0 0 1 0 0 13 10 0
0,00 0,01 0,00 0,00
23 2 0 7 1 7 0 0 1 0 0 13 10 0 0
0,01 0,00 0,00
A. sungami1)
6 4 11 5 11 4 4 5 4 4 9 6 4 4 4
0,01 0,01
Novem Genus2)
1 1 7 2 8 1 1 2 1 1 13 11 1 1 1 5
0,00
S.atratus3)
2 0 7 1 7 0 0 1 0 0 13 10 0 0 0 4 1
Keterangan : Angka di bawah diagonal merupakan jumlah perbedaan nukleotida pada basa pertama dan kedua yang didasarkan pada metode
No. of differences, sedangkan angka di atas diagonal merupakan perbedaan jarak genetik pada basa pertama dan kedua yang
didasarkan pada metode Kimura-2-parameter 1)
GenBank Accession Number FJ582714 2)
GenBank Accession Number HQ639060 3)
GenBank Accession Number HQ639080
6
Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni beberapa spesies ikan Gobi berdasarkan ruas CO1
mtDNA.
PEMBAHASAN
DNA Barcode
Amplikon gen CO1 ikan Gobi mempunyai
ukuran pita yang berbeda-beda dengan kisaran
700-800 pb. Perbedaan ukuran pita yang
terlihat pada gel poliakrilamid memperlihatkan
bahwa sampel-sampel tersebut mempunyai
panjang runutan nukleotida yang berbeda-
beda. Perbedaan panjang runutan nukleotida
sebagai identifikasi awal perbedaan spesies.
Pada gambar 1, sampel no 3 (Novem Genus)
memiliki ukuran pita yang paling pendek.
Elektroforesis dengan menggunakan gel
poliakrilamid mampu memisahkan DNA lebih
akurat dibandingkan dengan gel agarosa,
terutama untuk ruas DNA yang berukuran
kurang dari 3000 pb. Pewarnaan sensitif perak
lebih sensitif karena mampu mendeteksi DNA
dengan kandungan yang lebih kecil dari 10 pg
DNA/ mm2 (Allen et al. 1984).
Berdasarkan penelitian ini, pada spesies
yang sama memperlihatkan bahwa jumlah
perbedaan nukleotida antar sampel mencapai 9
nukleotida. Jumlah perbedaan nukleotida
tersebut dianalisis dengan menggunakan
metode No. of differences pada basa pertama
dan kedua. Jika metode yang digunakan adalah
metode Kimura-2-parameter pada basa
pertama dan kedua, maka jumlah perbedaan
jarak genetik antar sampel mencapai 0,02 atau
2% (Tabel 3). Avise (1998) mengemukakan
bahwa jarak genetik pada spesies ikan yang
sama kurang dari 2% dan kurang dari 0.1%
dari taksa lain.
Stiphodon atratus masuk ke dalam
subfamili Sicydiinae. Subfamili ini memiliki
delapan genus yang terdiri dari 80 hingga 90
spesies. Kedelapan genus tersebut yaitu
Stiphodon, Sicyopus, Lentipes, Cotylopus,
Sicyopterus, Sicydium, Akihito, dan
Parasicydium. Setiap genus mempunyai
daerah distribusi yang spesifik. Stiphodon
atratus dapat ditemukan di Samudera Hindia
bagian Timur hingga Samudera Pasifik bagian
timur (Keith et al. 2010). Proses adaptasi
dengan keadaan sekitar merupakan faktor yang
sangat penting bagi siklus hidup ikan Gobi.
Habitat ikan Gobi selalu berganti-ganti yaitu
diantara air tawar, estuaria dan laut. Menurut
Iida et al. (2010), tingkat salinitas dan suhu
sangat berperan penting bagi pertumbuhan dan
perpindahan (migrasi) Sicyopterus japonicus
(Gobiidae).
Keith et al. (2010) menemukan spesies
Gobi yang belum terdeskripsikan dan hanya
terdapat di samudera Hindia. Spesies Gobi ini
merupakan genus baru (Novem Genus) dari
subfamili Sicydiinae yang juga ditemukan
dalam penelitian ini. Ikan genus Amblyeleotis
merupakan jenis ikan dari famili Gobiidae
yang bersimbiosis mutualisme dengan udang
genus Alpheus. Dengan adanya hubungan
mutualisme tersebut, ikan Gobi ini sering
7
disebut sebagai Gobi udang. Dalam simbiosis
ini, satu atau dua ikan Gobi akan bekerja sama
dengan satu atau dua udang. Dengan adanya
interaksi yang stabil di antara kedua spesies
tersebut, maka memberikan kemampuan untuk
hidup yang lebih tinggi bagi keduanya. Selain
itu, terdapat interaksi yang membutuhkan
morfologi dan tingkah laku yang kompleks
sehingga pada akhirnya akan menyebabkan
ikan Gobi berevolusi dua kali dibandingkan
dengan jenis Gobi yang tidak mempunyai
hubungan mutualisme (Thacker et al. 2011).
Hubungan filogeni antar famili Gobiidae
Sekuen DNA mitokondria banyak
digunakan dalam analisis pohon filogeni
karena memiliki laju evolusi yang cepat
(Bargelloni et al. 1994). Topologi pohon
filogeni Neighbour Joining (NJ) digunakan
untuk melihat kekerabatan antar spesies
berdasarkan jarak genetik pada dua atau lebih
nodus (Page & Holmes 1998). Suatu klad
disebut pula sebagai suatu kelompok
monofiletik. Menurut Zein & Sulandari
(2009), suatu kelompok dikatakan bersifat
monofiletik apabila keseluruh nodus yang
dikelompokkan lebih dekat satu sama lain
secara genealogis jika dibandingkan dengan
kelompok lain yang berbeda garis keturunan.
Berdasarkan hasil rekonstruksi pohon
filogeni, didapatkan hasil yaitu terbentuk dua
klad besar. Sampel no 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14,
16, 18, 21, 22 dan 23 mengelompok menjadi
satu klad yang terdapat di dalam percabangan
klad. Sekelompok taksa ini diduga berasal dari
nenek moyang yang sama. Sampel no 19 dan
20 berada di luar percabangan klad. Taksa ini
diduga berasal dari nenek moyang yang
berbeda namun saling berkerabat dekat.
Pohon filogeni terdiri dari sejumlah nodus
(nodes) yang dihubungkan dengan cabang
(branches). Nodus-nodus tersebut mewakili
unit-unit taksonomi sedangkan cabang-cabang
mewakili hubungan antar unit yang
menggambarkan hubungan keturunan dengan
leluhur (Zein & Sulandari 2009). Terdapat tiga
macam nodus yaitu nodus terminal, nodus
internal dan nodus nenek moyang. Nodus
terminal disebut dengan OTU (Operational
Taxonomic Units) merupakan organisme yang
datanya akan digunakan untuk analisis
filogeni. Nodus internal merupakan nenek
moyang yang diperkirakan, sedangkan nodus
nenek moyang merupakan nenek moyang dari
semua organisme dan berada di pangkal
percabangan atau akar (Page & Holmes 1998).
Berdasarkan hasil rekonstruksi pohon
filogeni, terlihat bahwa sampel no 19 dan 20
mempunyai cabang yang paling panjang
dibandingkan dengan sampel lainnya. Hal ini
menunjukkan bahwa kedua sampel tersebut
mengalami proses evolusi yang lama. Menurut
Whelan et al. (2001) panjang cabang
menggambarkan jumlah perubahan
evolusioner yang terjadi. Keadaan yang
berbeda terjadi pada sampel no 4 dan 11.
Kedua sampel tersebut tidak mempunyai
cabang. Hal ini dapat terjadi karena sampel no
4 dan 11 masuk ke dalam spesies yang sama
dan hanya mempunyai perbedaan satu
nukleotida. Berdasarkan pembahasan sebelumnya,
dikatakan bahwa sampel no 3 dibandingkan
dengan sampel no 19 memiliki jumlah
perbedaan nukleotida yang paling besar. Hal
ini dapat dilihat dari rekonstruksi pohon
filogeni. Sampel no 19 memiliki cabang yang
paling panjang, begitu pula dengan sampel no
3 yang memiliki cabang nodus yang relatif
panjang. Perbedaan nukleotida yang besar ini
menyebabkan sampel no 3 berada di dalam
percabangan klad sedangkan sampel no 19
berada di luar percabangan klad. Panjang
cabang dapat menunjukkan jarak genetik.
Semakin panjang cabang maka semakin jauh
jarak genetiknya dan mengartikan semakin
jauh pula hubungan kekerabatannya (Zein &
Sulandari 2009).
Pohon filogeni yang telah direkonstruksi
dengan metode Neighbor Joining dapat diuji
tingkat kepercayaannya dengan menggunakan
bootstrap. Dalam penelitian ini, dilakukan
pengujian dengan bootstrap 1000X.
Berdasarkan hasil pengujian, didapatkan
probabilitas dengan nilai yang tinggi yaitu
sebesar 100% pada nodus nenek moyang di
dalam percabangan klad. Semakin tinggi nilai
pengujian dengan bootstrap, maka data akan
semakin valid (Zein & Sulandari 2009).
Ipun-ipun menjadi sumber makanan yang
penting bagi masyarakat Bengkulu. Dalam
ipun-ipun, selain ditemukan kedua spesies dan
satu genus baru tersebut, sering pula
ditemukan spesies yang mempunyai nilai
ekonomi tinggi yaitu sidat (Anguilla sp).
Karena minimnya pengetahuan tentang ikan,
banyak masyarakat menduga larva ikan sidat
sebagai cacing yang tidak dapat dimakan,
sehingga mereka membuang larva-larva
tersebut ke tanah (Sipri 28 Juni 2012,
komunikasi pribadi). Perlu dilakukan
sosialisasi agar masyarakat tidak mengambil
ipun-ipun secara berlebihan, agar ikan dewasa
dari spesies-spesies tersebut dapat dipanen dan
dimanfaatkan oleh masyarakat sekitar.
8
SIMPULAN
Pada kumpulan postlarva ikan Gobi
ditemukan dua spesies dan satu genus baru
ikan gobi. Sampel no 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14,
16, 18, 21, 22 dan 22 teridentifikasi sebagai
Stiphodon atratus, sampel no 19 dan 20
teridentifikasi sebagai Amblyeleotris sungami
sedangkan sampel no 3 teridentifikasi sebagai
Novem Genus (genus baru) dari subfamili
Sicydiinae.
DAFTAR PUSTAKA
Allen RC, Saravis CA, Murer HR. 1984. Gel
Electrophoresis and Isoelectric Focusing
of Protein. New York: Walter de Gruyter.
Avise JC, Walker D, Johns GC. 1998.
Speciation durations and pleistocene
effects on vertebrate phylogeography. The
Royal Society 265: 1707-1712.
Bargelloni et al. 1994. Molecular evolution at
subzero temperatures: mitochondrial and
nuclear phylogenies of fishes from
Antarctica (suborder Notothenioidei), and
the evolution of antifreeze glycopeptides.
Molecular Biology and Evolution 11: 854-
863.
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH.
2009. An effective method for silver-
staining DNA in large numbers of
polyacrylamide gels. Analytical
Biochemistry 385: 174-175.
Hajibabaei et al. 2005. DNA barcode
distinguish species of tropical Lepidoptera.
PNAS 103: 968-971
Iida et al. 2010. Survival and behavioral
characteristics of amphidromous goby
larvae of Sicyopterus japonicus during
their downstream migration. Journal of
Experimental Marine Biology and Ecology
383: 17-22
Larkin et al. 2007. Clustal W and Clustal X
version 2.0. Bioinformatics 23: 2947-2948.
Lin CC. 2007. A Field Guide to Freshwater
Fish and Shrimps in Taiwan. Taiwan:
Commonwealth publishing.
Keith et al. 2010. Phylogeny and
biogeography of Sicydiinae (Teleostei:
Gobiidae) inferred from mitochondrial and
nuclear genes. Marine Biology 158: 311-
326.
Kottelat M, Whitten AJ. 1993. Freshwater
Fishes of Western Indonesia and Sulawesi.
Germany: Zoologische Staatssammlung.
McDowall RM. 2007. On amphidromy, a
distinct form of diadromy in aquatic
organism. Fish and Fisheries 8: 1-13.
Page RDM, Holmes EC. 1998. Molecular
Evolution: A phylogenetic Approach.
United Kingdom: Blackwell Science.
Pegg GG, Sinclair B, Briskey L, Aspden W.
2006. MtDNA barcode identification of
fish larvae in the southern Great Barrier
Reef Australia. Scientia Marina 70: 7-12.
Subiyanto, Ruswahyuni, Cahyono DG. 2008.
Komposisi dan distribusi ikan pelagis di
estuaria Pelawangan Timur, Segera
Anakan, Cilacap. Saintek Perikanan 4:62-
68.
Syafrina RA. 2011. Penggunaan DNA barcode
sebagai alternatif identifikasi spesies udang
mantis [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Thacker CE, Thompson AR, Roje DM. 2011.
Phylogeny and evolution of Indo-pacific
shrimps-associated gobies (Gobiiformes:
Gobiidae). Molecular Phylogenetics and
Evolution 59: 168-176.
Victor BC. 2007. Coryphopterus kuna, a new
goby (Perciformes: Gobiidae: Gobiinae)
from the western Caribbean, with the
identification of the late larval stage and an
estimate of the pelagic larval duration.
Zootaxa 1526: 51-61.
Victor et al. 2010. The larval, juvenil and adult
stages of the Caribbean goby,
Coryphopterus kuna (Teleostei: Gobiidae):
a reef fish with a pelagic larval duration
longer than the post-settlement lifespan.
Zootaxa 2346: 53-61.
Ward RD, Zemlak TS, Innes B, Last P. 2005.
DNA barcoding Australia’s fish species.
Philosophical Transactions of The Royal
Society 360: 1847-185.
Whelan S, Lio P, Goldman N. 2001.
Molecular phylogenetics: state-of-the-art
methods for looking into the past. Trends
in Genetics 17: 262-272.
Zhang JB, Hanner R. 2011. DNA barcoding is
a useful tool for the identification of
marine fishes from Japan. Biochemical
Systematics And Ecology 39: 31-42.
Zein MS, Sulandari S. 2009. Investigasi asal
usul ayam Indonesia menggunakan
sekuens hypervariable-1 d-loop DNA
mitokondria. Veteriner Maret 10: 41-49.
9
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Gambar postlarva famili Gobiidae yang digunakan dalam penelitian.
Keterangan : No 1-23 = No sampel.
28Gambar sampel
11
Lampiran 2 Tahapan Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid
Ambil otot epaksial ±50 gram,
masukkan ke tube 1,5 ml
Cuci dengan air destilata,
2 kali pengulangan
Homogenasi dengan grinder,
tambahkan 200 µl buffer STE
Tambahkan 20 µl proteinase K
ke dalam tabung
Inkubasi pada suhu 600C selama
30 menit (bolak balik tiap 5 menit)
Tambahkan 200 µl buffer GB dan
vortex selama 5 detik
Inkubasi pada suhu 700C selama
20 menit (bolak balik tiap 5 menit)
Pindahkan sampel ke kolom GD
pada tube 2 ml
Homogenasi dengan grinder,
tambahkan 200 µl buffer STE
Sentrifugasi 13.000 rpm selama 2
menit
Pindahkan kolom GD ke tabung
koleksi baru, buang supernatan
Tambahkan 400 µl buffer W1 ke
dalam tabung
Sentrifugasi 13.000 rpm selama
30 detik
Tambahkan 600 µl wash buffer ke
dalam kolom GD
Sentrifugasi 13.000 rpm selama
30 detik
Buang supernatant, letakkan
kembali kolom GD ke tabung
Sentrifugasi 13.000 rpm selama
3 menit
Di saat yang bersamaan, inkubasi
buffer elusi pada suhu 700C
Tambahkan 200 µl etanol dan
vortex selama 10 detik
Buang supernatan, letakkan kolom
GD kembali ke dalam tabung
12
Pindahkan kolom GD ke tube
1,5 ml yang baru
Tambahkan 100 µl buffer elusi ke
dalam kolom GD
Diamkan selama 5 menit
Sentrifugasi 13.000 rpm selama
30 detik
Buang kolom GD dan didapatkan
DNA yang telah berhasil
diekstraksi
13
Lampiran 3 Tahapan visualisasi fragmen DNA produk PCR
Gel yang telah dielektroforesis
dikeluarkan dari kaca gel
Bilas dengan air destilata ±200 ml
Buang air destilata dengan alat
vakum penyedot
Rendam gel dalam larutan A (DW
200 ml, AgNO3 0,2 gram, NaOH
10N 80 µl, amonia 0,8 ml) selama
8 menit
Di saat yang bersamaan, panaskan
larutan B (DW 200 ml, NaOH 6
gram, pada suhu 550C)
Buang larutan A ke dalam botol
khusus Ag
Bilas dengan air destilata ±200 ml
Rendam gel dalam larutan B yang
telah ditambahkan formaldehid
Buang air destilata dengan alat
vakum penyedot
Rendam gel direndam dalam
larutan C (DW 100 ml,
Asetat 100 µl) selama 2 menit
14
Lampiran 4 Hasil pensejajaran ruas gen CO1 dari beberapa spesies famili Gobiidae
1 3-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTGATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATAATTGGAGGCTTTGGAAACTGGCTCATCCCCC 160
2 4-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC
3 5-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC
4 6-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC
5 10-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGAAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC
6 11-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC
7 12-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC
8 14-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC
9 16-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC
10 18-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGATTTGGAAACTGACTAATCCCAC
11 19-AF_282.ab1 CACCGCCCACGCATTTGTTATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGGTTTGGGAATTGACTAATTCCAC
12 20-AF_282.ab1 CACCGCCCACGCATTTGTTATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGGTTTGGGAATTGACTAATTCCAC
1 3-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAATTAAGTCAACCTGGAGCCCTTCTAGGAGATGACCAGATTTATAATGTAATTGT 80
2 4-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
3 5-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
4 6-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
5 10-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
6 11-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
7 12-AF_282.ab1 GCCATAAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
8 14-AF_282.ab1 GCCCTAAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT
9 16-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTACTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT
10 18-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT
11 19-AF_282.ab1 GCTTTAAGCCTCCTAATCCGGGCTGAGCTAAGTCAACCTGGCGCCTTATTAGGTGATGACCAAATCTATAACGTTATTGT
12 20-AF_282.ab1 GCTTTAAGCCTCCTAATCCGGGCTGAGCTAAGTCAACCTGGCGCCTTATTAGGTGATGACCAAATCTATAACGTTATTGT
13 21-AF_282.ab1 GCCATTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT
14 22-AF_282.ab1 GCCATAAGCCAACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT
15 23-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT
15
13 21-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC
14 22-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC
15 23-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC
1 3-AF_282.ab1 TAATGATCGGAGCCCCTGACATGGCCTTCCCTCGTATGAACAACATGAGCTTTTGGCTCCTCCCTCCCTCATTCCTGCTC 240
2 4-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT
3 5-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT
4 6-AF_282.ab1 TAATGATTGGTGCCCCCGACATGGCTTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGGCTGCTTCCTCCATCATTCCTTCTT
5 10-AF_282.ab1 TAATGATCGGGGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT
6 11-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT
7 12-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT
8 14-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT
9 16-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT
10 18-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT
11 19-AF_282.ab1 TAATAATTGGCGCCCCTGATATGGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGCTTTTGACTGTTGCCTCCTTCCTTCCTCCTG
12 20-AF_282.ab1 TAATAATTGGCGCCCCTGATATGGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGCTTTTGACTGTTGCCTCCTTCCTTCCTCCTG
13 21-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT
14 22-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT
15 23-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT
1 3-AF_282.ab1 CTCCTGGCATCTTCAGGCGTCGAGGCAGGAGCTGGCACTGGTTGAACAGTTTACCCCCCTCTGGCAGGAAACCTTGCTCA 320
2 4-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA
3 5-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA
4 6-AF_282.ab1 CTTCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTATCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCTCA
5 10-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA
6 11-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA
7 12-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA
8 14-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA
9 16-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGTTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA
16
10 18-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA
11 19-AF_282.ab1 CTACTTTCTTCTTCTTGAGTCGAGGCAGGAGCCGGGACAGGATGAACGGTCTACCCCCCGCTAGCAGGGAACCTTGCACA
12 20-AF_282.ab1 CTACTTTCTTCTTCTTGAGTCGAGGCAGGAGCCGGGACAGGATGAACTGTCTACCCTCCGCTAGCAGGGAACCTTGCACA
13 21-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA
14 22-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA
15 23-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA
1 3-AF_282.ab1 TGCCGGAGCTTCTGTCGACCTGACAATTTTCTCACTTCACTTAGCCGGGATTTCGTCTATCTTAGGTGCAATTAATTTTA 400
2 4-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
3 5-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
4 6-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
5 10-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCGATTAACTTTA
6 11-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
7 12-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
8 14-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
9 16-AF_282.ab1 CGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCGGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
10 18-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
11 19-AF_282.ab1 CGCTGGGGCATCAGTAGACCTCACTATTTTCTCCTTACATCTCGCTGGTATTTCCTCAATTCTTGGGGCTATCAATTTTA
12 20-AF_282.ab1 CGCTGGGGCATCAGTAGACCTCACTATTTTCTCCTTACATCTCGCTGGTATTTCCTCAATTCTTGGGGCTATTAATTTTA
13 21-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
14 22-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
15 23-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA
1 3-AF_282.ab1 TTACAACCATCCTAAATATGAAACCCCCTGCAATCTCGCAATACCAGACACCATTGTTTGTCTGGGCTGTCCTCATTACA 480
2 4-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA
3 5-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA
4 6-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTCCTTATTACA
5 10-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCGTGCAATCTCACGATACCAGACACCACTGTGTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA
17
6 11-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA
7 12-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA
8 14-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCACACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA
9 16-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATCACA
10 18-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATTACA
11 19-AF_282.ab1 TCACCACAATTCTAAATATGAAACCCCCGGCCATTTCTCAGTACCAGACGCCCCTGTTCGTATGAGCAGTACTAATCACC
12 20-AF_282.ab1 TCACCACAATTCTAAATATGAAACCCCCGGCCATTTCTCAGTACCAAACGCCCCTGTTCGTATGAGCAGTACTAATCACC
13 21-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATTACA
14 22-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATTACA
15 23-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTATGAGCTGTACTTATTACA
1 3-AF_282.ab1 GCAGTTCTTCTGCTTCTTTCCCTCCCAGTACTTGCAGCCGGTATTACAATACTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC 560
2 4-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC
3 5-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCCAAATCTGTACACAAC
4 6-AF_282.ab1 GCAGTCCTACTGCTTCTCTCCCTACCTGTCCTTGCAGCTAGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC
5 10-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTAGCATTACGATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC
6 11-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC
7 12-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC
8 14-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC
9 16-AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC
10 18-AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC
11 19-AF_282.ab1 GCCGTGCTTTTACTTCTCTCACGGCCAGTACTTGCTGCCGGCATTACAATGCTTCTCACAGACCGAAATCTAAATACAAC
12 20-AF_282.ab1 GCCGTGCTTTTACTTCTCTCACTGCCAGTACTTGCTGCCGGCATTACAATGCTTCTCACAGACCGAAATCTAAATACAAC
13 21-AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC
14 22-AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC
15 23-AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC
18
1 3-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGTGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTGGG 623
2 4-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTCGA
3 5-AF_282.ab1 CTTCTGTGACCCCTCAGGAGGCGCAGACCCAAATCTTAACCAACACGTATCCTGAGTCTTTGT
4 6-AF_282.ab1 CTTCTTTGATCCCTCAGGAGGCGGTGATCCAATTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTCGA
5 10-AF_282.ab1 CTTCTGTGACCCCTCAGGAGGCGGTGACCCAGTTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTTGG
6 11-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
7 12-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
8 14-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
9 16-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGA
10 18-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
11 19-AF_282.ab1 ATTCTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCCATTCTTTACCAACGGGTATCTTGATTCTTCGG
12 20-AF_282.ab1 ATTCTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCCATTCTTTACCAACACCTATTTTGATTCTTCGG
13 21-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATCCTGATTCTTCGG
14 22-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCGTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
15 23-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATGCTGATTCTTGGA
top related