fistum jurnal.docx
Post on 29-Dec-2015
34 Views
Preview:
TRANSCRIPT
IRMA FITRIYANI3415111390PBR’2011
Variasi dalam Ritme dari Respirasi dan Fiksasi Nitrogen pada Anggota uniseluler
Diazotrophic Cyanobacterial Genus Cyanothece
Dalam rangka mengakomodasi proses fisiologi yang tidak cocok dari fotosintesis dan fiksasi
nitrogen dalam sel yang sama, fiksasi nitrogen uniseluler cyanobacteria harus menjaga profil
metabolik yang dinamis dalam kondisi terang maupun gelap dari siklus sel. Transisi dari
fotosintetik ke fase fiksasi nitrogen ini ditandai oleh munculnya berbagai tanggapan biokimia
dan tindakan pengaturan, yang utama bagi lingkungan intraseluler untuk aktivitas
nitrogenase. Respirasi selular memainkan sebuah peran penting selama transisi ini, semisal
oksigen yang dihasilkan oleh fotosintesis dan dengan memberikan energi yang dibutuhkan
untuk proses tersebut. Walaupun prinsip mendasar dari fiksasi nitrogen memprediksi fiksasi
nitrogen unicellular cyanobacteria , untuk berfungsi dengan cara tertentu, variasi yang
signifikan diamati pada perilaku diazotrophic mikroba ini. Dalam upaya untuk memperjelas
perbedaan yang mendasar dan kesamaan yang mengatur kemampuan fiksasi nitrogen dari
uniselular diazotrophic cyanobacteria, kita mengaanalisis enam anggota genus Cyanothece.
Cyanothece sp. ATCC 51142, anggota genus ini, telah memperlihatkan untuk melakukan
efisien fiksasi nitrogen dalam kiondisi aerob dan produksi hidrogen.
Studi kami mengungkapkan perbedaan yang signifikan dalam pola respirasi dan fiksasi
nitrogen antara Cyanothece spp. strain yang tumbuh di bawah kondisi kultur yang sama,
menyarankan bahwa proses ini tidak hanya dikendalikan oleh isyarat dari siklus diurnal tetapi
bahwa ketegangan tertentu oleh sinyal metabolik intraseluler memainkan peran utama.
Meskipun ada perbedaan ini, kemampuan untuk melakukan fiksasi nitrogen aerob dan
produksi hidrogen yang tinggi, menjadi ciri khas dari genus ini.
Fiksasi nitrogen adalah sebuah fenomena global yang penting dalam molekuler
nitrogen, salah satu yang paling banyak komponennya pada atmosfer bumi, diubah bentuknya
dalam bentuk yang direduksi sehingga cocok/sesuai untuk bergabung ke dalam sistem
kehidupan. Sebagian besar fiksasi nitrogen ini dicapai dengan cara biologi melalui aktivitas
mikroorganisme (Burris dan Roberts, 1993; Raymond et al. , 2004; Rubio dan Ludden, 2008).
Proses ini adalah energi intensif, dan nitrogenase, enzim yang kompleks terlibat dalam reaksi
biologis fiksasi nitrogen, adalah pada umumnya sangat sensitif terhadap oksigen (Robson dan
Postgate, tahun 1980 ; Hill et al. , 1981; Berman-Frank et al. , 2005). Oleh karena itu,
sebagian besar mikroba berpartisipasi dalam proses ini fiksasi nitrogen hanya ketika kondisi
anaerob atau kondisi microaerobic dibentuk pada keadaan sebaliknya di lingkungan yang
kaya oksigen. Namun, beberapa pengikat nitrogen (diazotrophic) mikroba memiliki manfaat
yang dapat mengikat nitrogen di lingkungan aerob. Menonjol di antaranya adalah prokaryotes
fotosintetik disebut cyanobacteria, yang berhasil dengan baik pada grup dari mikroba dengan
ciri-ciri seperti tumbuhan. Mikroba ini dianggap sebagai leluhur kloroplas tumbuhan.
Cyanobacteria melakukan keduanya, saat oksigen-berkembang melakukan fotosintesis dan
saat oksigen sedikit melakukan fiksasi nitrogen, dengan demikian memberikan tempat untuk
energi yang paling mahal secara proses metabolik biologis (Simpson dan Burris, 1984)
dengan energi surya.
Di antara pengikatan nitrogen oleh cyanobacteria , dalam bentuk berfilamen telah
dipelajari secara luas untuk kontribusi mereka dalam siklus nitrogen ekosistem laut dan darat
(Mulligan dan Haselkorn, sekitar tahun 1989 ; Kaneko et al. , 2001; Meeks et al. , 2001;
Sañudo-Wilhelmy et al. ,2001; Wong dan Meeks, tahun 2001 ; Gomez et al. , 2005).
Beberapa bentuk berfilamen dikembangkan oleh sel khusus disebut heterocysts yang
memungkinkan pemisahan ruang dari fotosintesis dan fiksasi nitrogen. Heterocysts juga
memiliki tingkat konsumsi respirasi oksigen yang tinggi, yang akan berakibat menghasilkan
lingkungan anoxic untuk enzim nitrogenase (Bergman et al. ,1997). Semua sel heterocyst
diketahui untuk mengikat nitrogen secara aerob. Sebaliknya, sel nonheterocyst cyanobacteria,
kekurangan kompartemen oksigen bebas dan sering memerlukan inkubasi di bawah
microoxic atau kondisi anaerobik untuk fiksasi nitrogen (Rippka dan Waterbury, 1977;
Rippka et al. , 1979; Tembaga et al. , 1992). Namun, beberapa sel nonheterocyst
cyanobacteria dapat memfiksasi nitrogen di bawah kondisi aerob. Termasuk beberapa genus
berfilament (berserabut) seperti Trichodesmium spp., Lyngbya spp., dan Oscillatoria spp.
(Jones, tahun 1990 ; Janson et al., 1994; Finzi-Hart et al., tahun 2009 ) serta genus unicellular
seperti Gloeothece spp. dan Cyanothece spp. (Wyatt dan Silvey, 1969; Rippka dan
Waterbury, 1977; Huang dan Chow, 1988; Van Ni et al. , 1988; Schütz et al. ,2004).
Dalam perbandingan dengan cyanobacteria berfilamen, yang telah lama diakui
kemampuan fiksasi nitrogennya, pentingnya uniseluler cyanobacteria sebagai komponen
kunci dari siklus nitrogen di lingkungan telah terungkap. Studi dalam satu dekade terakhir
telah membuktikan bahwa unicellular seperti Crocosphaera spp., Cyanothece spp., dan
UCYN-sebagai pemain penting dalam siklus nitrogen di laut (Zehr et al., 2001; Montoya et
al., 2004; Zehr, 2011). Sejak unicellular diazotrophic cyanobacteria memanfaatkan
memanfaatkan platform seluler yang sama untuk fotosintesis dan fiksasi nitrogen, mereka
diharuskan untuk menyesuaikan metabolisme selular mereka untuk mengakomodasi dua
proses yang antagonis/berlawanan. Studi tingkat sistem dalam genus uniseluler Cyanothece
telah mengungkapkan pemisahan sementara pada dua proses, fotosintesis yang terjadi selama
siang hari dan fiksasi nitrogen terjadi pada malam hari (Stockel et al., 2008; Toepel et al.,
2008; Welsh et al., 2008). Respirasi seluler memainkan peran penting selama masa transisi
dari satu fase berikutnya, menghasilkan oksigen secara fotosintetik, dibebaskan dengan cepat
ke lingkungan intraseluler dan menerjemahkannya dan menginduksi aktivitas nitrogenase.
Selain itu, respirasi juga menopang proses fiksasi nitrogen, tidak hanya dengan menjaga
lingkungan rendah oksigen yang diperlukan untuk menjalankan enzim nitrogenase tetapi juga
memobilisasi energi matahari yang disimpan untuk bahan bakar proses energi khusus.
Diazotrophs uniseluler menunjukkan keragaman yang besar dalam efisiensi fiksasi
nitrogen serta dalam proses pengaturan fisiologis. Sebagai contoh, anggota genus Gloeothece
mengikat nitrogen secara aerob di siang hari, tetapi pada konsentrasi oksigen terlarut 0%,
fiksasi nitrogen bergeser seluruhnya saat periode gelap (Ortega-Calvo dan Stal, 1991;
Taniuchi et al., 2008). Sebaliknya, beberapa jenis Synechococcus spp. dapat mengikat
nitrogen hanya ketika diinkubasi di bawah kondisi anoxic (lingkungan tanpa oksigen)
(Steunou et al., 2006). Anggota genus Cyanothece telah dilaporkan terlibat fiksasi nitrogen
dalam kondisi baik aerob maupun anaerob, dengan aktivitas nitrogenase memuncak pada
malam hari(Reddy et al., 1993; Bergman et al., 1997; Turner et al., 2001). Hal ini
menunjukkan bahwa, selain pengaturan yang ditetapkan oleh siklus diurnal, isyarat
intraseluler jenis yang spesifik mengatur proses fiksasi nitrogen dalam uniseluler
cyanobacteria, yang mungkin bervariasi menurut genotipe atau ecotipe setiap jenis.
Anggota cyanobacteria uniseluler genus cyanothece yang diazotrophs berkembang di
lingkungan laut maupun terestrial. Genus ini awalnya dikelompokkan bersama-sama dengan
Synechococcus spp. tetapi kemudian dipisahkan berdasarkan perbedaan morfologi dan
biokimia yang berbeda antara dua genus (Komarek, 1976; Rippka dan Cohen-Bazire, 1983).
Beberapa fitur yang mendefinisikan sebagian besar keheterogenan genus Cyanothece adalah
sel-sel oval hingga silindris, ukurannya lebih besar dari 3 µm (diameternya dapat mencapai
24 µm), thylakoid tersusun radial, dan lapisan berlendir sekitar sel (Komarek dan Cepak,
1998; Porta et al., 2000; Liberton et al., 2011).
Baru-baru ini dipertunjukkan bahwa Cyanothece sp. ATCC 51142, salah satu anggota
genus Cyanothece, memiliki kemampuan unik untuk menghasilkan molekul hidrogen dengan
tingkat yang luar biasa di bawah kondisi aerob (Bandyopadhyay et al., 2010). Pengamatan
menarik ini dikaitkan dengan sistem enzim nitrogenase sp. Cyanothece ATCC 51142.
Penelitian kami juga menunjukkan bahwa tingginya tingkat respirasi jenis ini mungkin
berkontribusi terhadap produksi pengolahan nitrogenase hidrogen secara aerob. Gliserol
ditemukan menjadi sumber efisien bagi reduktor dan energi untuk proses ini. Dalam upaya
untuk menyelidiki apakah sifat atipikal cyanobacterial ini adalah karakteristik dari genus
Cyanothece, lima tambahan jenis Cyanothece spp. dari habitat ekologi yang berbeda yang
diurutkan penyempurnaanya. Enam jenis menampilkan lebih dari 90 % identitas dalam urutan
16S ribosom RNA mereka tetapi menunjukkan variabilitas mencolok sehubungan dengan
ukuran genom mereka ( dengan genom terbesar 7.8mb dan terkecil yang 4,4 mb ), jumlah
plasmids, dan persentase pseudogenes ( bandyopadhyay et al. , 2011 ). Selain itu, dua jenis
memiliki unsur-unsur kromosom yang linier, fitur-fitur yang tidak diketahui terjadi dalam
setiap kali mensekuen bakteri fotosintetik lain, yang dapat memberikan spesifik nisia untuk
jenis tersebut. Analisis urutan genom jenis Cyanothece spp. menunjukkan kehadiran gugus
gen nitrogenase di semua lima jenis, dan analisis awal menunjukkan bahwa empat dari lima
jenis mampu memfiksasi nitrogen dalam kondisi aerob dan memproduksi hidrogen
(Bandyopadhyay et al., 2011). Dalam penelitian ini, kita berfokus pada pola fiksasi nitrogen
dan respirasi pada enam jenis Cyanothece spp. yang berbeda dalam upaya untuk menjelaskan
perbedaan dan persamaan yang mendasar dalam proses-proses pada jenis diazotrophic
uniseluler dengan dengan genotip yang sama tetapi bervariasi latar belakang ekologinya.
Penelitian kami menunjukkan perbedaan dalam pengaturan proses-proses ini, yang mungkin
dikendalikan oleh sinyal selular jenis-spesifik. Namun, meskipun perbedaan dalam pola-pola
aktivitas nitrogenase, fiksasi nitrogen aerobik dan produksi hidrogen ditemukan menjadi
karakteristik genus ini, dengan sebagian besar anggota menunjukkan produksi nitrogenase-
dimediasi hidrogen pada tingkat lebih tinggi dari cyanobacteria jenis lain.
HASIL
Berbagai Jenis Cyanothece spp. Menunjukkan Beragam Fenotipe
Enam jenis cyanothece spp. diisolasi dari berbagai daerah geografis menunjukkan
heterogenitas sehubungan dengan ukuran sel, bentuk, dan warna ( fig. 1 ). Keenam jenis
memiliki sel-sel yang lebih besar dari 3 µm (Fig. 2), dan semua jenis kecuali Cyanothece sp.
PCC 7425 memiliki wilayah membran tilakoid yang tersusun radial, sesuai dengan definisi
dari genus Cyanothece (Komarek, 1976; Rippka dan Cohen-Bazire, 1983). Cyanothece sp.
PCC 7822 memiliki sel terbesar (8-10 µm), diikuti oleh Cyanothece sp. PCC 7424 (6-8 µm).
Cyanothece sp. PCC 7425 memiliki ukuran sel terkecil ( 3-4 µm) dan bentuknya lebih kokoid
dibandingkan bentuk oval sel Cyanothece spp. lainnya. Di tingkat, ultrastructural, jenis
cyanothece spp. yang berbeda dalam arsitektur membran thylakoid serta jenis morfologi
tubuh ( fig. 2 ). Tiga jenis yang telah diisolasi dari ecotipe terestrial (Cyanothece sp. PCC
8801, PCC 7424, dan PCC 7822) memiliki pigmen phycoerythrin, yang menanamkan warna
hijau kecoklatan ke sel (Fig. 1, A dan B). Cyanothece sp. ATCC 51142 adalah jenis laut,
sedangkan lainnya jenis Cyanothece spp. telah diisolasi dari sawah. Jenis tersebut
menunjukkan karakteristik pertumbuhan yang berbeda di bawah kondisi azotrophic dan
diazotrophic ( fig. 3 ). Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822, sel-selnya memiliki
kecenderungan untuk membentuk rumpun, dan dua jenis ini tumbuh lebih lambat
dibandingkan dengan jenis lainnya baik dalam kehadiran dan tidak adanya kombinasi
sumber-sumber nitrogen dalam media ( fig. 3A ). Jenis tersebut menunjukkan panjang fase
lag di bawah kondisi fiksasi nitrogen dan panjang fase lag bervariasi di antara setiap jenis.
( Fase lag = Pertumbuhan pada fase ini berjalan lambat, dengan sedikit atau bahkan tidak ada
proses pembelahan sel atau perkembangan sel, organisme beradaptasi terhadap medium
baru). Dari keenam jenis, Cyanothece sp. ATCC 51142 tampaknya yang paling efisien dalam
memfiksasi nitrogen atmosfer diikuti oleh Cyanothece sp. PCC 8802, berkembang pesat di
bawah kondisi saat fiksasi nitrogen ( fig. 3B ). Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7822, dan
PCC 8801 juga tumbuh di media kurang sumber nitrogen tetap, tapi mereka menunjukkan
reduksi dua kali lipat. Sebaliknya, Cyanothece sp. PCC 7425 sel-selnya yang tidak efisien
dalam memfiksasi nitrogen, terjadi perubahan menjadi kuning dalam beberapa hari
pertumbuhan dalam media yang kurang nitrogen ( fig. 3b ).
Analisis Perbandingan Fiksasi Nitrogen dan Produksi Hidrogen pada Berbagai Jenis
Cyanothece spp.
Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa anggota genus Cyanothece dapat terlibat
dalam fiksasi nitrogen anaerobik atau aerobik (Waterbury dan Rippka, 1989; Turner et al.,
2001; Bandyopadhyay et al., 2011). Dua dari lima jenis Cyanothece spp. (PCC 7424 dan PCC
7425) termasuk dalam studi ini dikategorikan sebagai strain fiksasi nitrogen anaerobik
(Bergman et al., 1997). Kami mempelajari enam jenis Cyanothece spp. karena kemampuan
mereka untuk mengikat nitrogen dan menghasilkan hidrogen di bawah variasi pertumbuhan
dan kondisi inkubasi. Berdasarkan uji semua kondisi, Cyanothece sp. ATCC 51142
menunjukkan tingkat aktivitas nitrogenase dan produksi hidrogen tertinggi. Aktivitas
nitrogenase diukur dari reduksi asetilen dan ditunjukkan dengan produksi etilen ( oda et al. ,
2005 ). Produksi etilen atau hidrogen pada sel-sel Cyanothece sp. ATCC 51142 tumbuh di
bawah kondisi fotoautotrof dan diinkubasi di udara adalah sekitar 150 µmol mg-1 klorofil h-1
( Fig. 4; Tabel I dan II ). Kondisi serupa, Cyanothece sp. PCC 8802 nitrogen tetap di sekitar
100 µmol etilen mg-1 klorofil h-1 dan menghasilkan hidrogen sekitar 50 µmol mg-1 klorofil h-1.
Aktivitas nitrogenase terendah (kira-kira 50 µmol mg-1 klorofil h-1) diamati pada Cyanothece
sp. PCC 7424 dan PCC 7822, dan tingkat produksi hidrogen pada dua jenis tersebut sekitar
50 µmol mg-1 klorofil h-1. Cyanothece sp. PCC 8801 menunjukkan tingkat menengah
aktivitas nitrogenase ( sekitar 75 µmol etilen mg-1 klorofil h-1 ), sementara produksi hidrogen
sekitar 40 µmol mg-1 klorofil h-1. Pada Cyanothece sp. PCC 7425 sel diinkubasi di bawah
kondisi aerobik, aktivitas nitrogenase atau hidrogen produksi tidak dapat dideteksi.
Ketika sel-sel yang tumbuh di bawah kondisi fotoautotrof yang diinkubasi dalam
lingkungan anoxic, tingkat tertentu dari fiksasi nitrogen dan produksi hidrogen yang secara
signifikan ditingkatkan. Di bawah inkubasi anaerobik, tingkat kegiatan nitrogenase pada sel-
sel Cyanothece sp. ATCC 51142 lebih dari 230 µmol mg -1 klorofil h-1, dan dibandingkan
dengan ini, tingkat produksi hidrogen secara signifikan lebih tinggi (sekitar 350 µmol mg -1
klorofil h-1). Pada Cyanothece sp. PCC 7425 diinkubasi pada kondisi anoxic, tingkat etilen
dan produksi hidrogen sekitar 40 µmol mg-1 klorofil h-1. Pada semua jenis Cyanothece spp.
yang lain, tingkat spesifik fiksasi nitrogen anaerobik dan produksi hidrogen bervariasi antara
150 dan 200 µmol mg-1 klorofil h-1, dengan tingkat produksi hidrogen lebih tinggi dari atau
sama dengan tingkat produksi etilen. Pertumbuhan photomixotrophic dalam kehadiran
gliserol menunjukkan peningkatan tingkat produksi hidrogen pada Cyanothece sp. ATCC
51142 ( Bandyopadhyay et al. , 2010 ). Kami menguji efek gliserol terhadap fiksasi nitrogen
dan produksi hidrogen pada jenis Cyanothece spp. lainnya. Tidak seperti Cyanothece sp.
ATCC 51142, yang memanfaatkan gliserol untuk produksi biomassa (Feng et al., 2010), jenis
Cyanothece spp. lain tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam tingkat
pertumbuhan ketika tumbuh dengan kehadiran gliserol (data tidak ditampilkan). Namun,
beberapa jenis Cyanothece spp. dapat menggunakan gliserin untuk fiksasi nitrogen dan
produksi hidrogen (Tabel I dan II). Pada Cyanothece sp. ATCC 51142, sel-sel dilengkapi
dengan gliserol nitrogen tetap lebih dari 200 µmol etilen mg -1 klorofil h-1 dan produksi
hidrogen lebih dari 25 µmol mg-1 klorofil h-1 ketika diinkubasi di bawah kondisi aerob.
Diinkubasi pada kondisi anaerobik, sekitar 300 dan 450 µmol mg-1 klorofil h-1, berturut-turut.
Pada Cyanothece sp. PCC 7425, gliserol meningkatkan tingkat fiksasi nitrogen (sekitar 60
µmol etilen mg-1 klorofil h-1) dan produksi hidrogen (sekitar 80 µmol mg-1 klorofil h-1)
sekitar 1.5 sampai 2 kali lipat. Pada Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822, gliserol juga
berkontribusi terhadap tingkat produksi lebih tinggi fiksasi nitrogen dan hidrogen (tabel I dan
II). Sebaliknya, gliserol memiliki efek buruk pada fiksasi nitrogen di Cyanothece sp. PCC
8801 dan PCC 8802, meskipun produksi hidrogen tetap tidak berubah.
Perbedaan Fase pada Siklus Diurnal terhadap aktivitas Nitrogenase Jenis Cyanothece
spp.
Kami menilai irama diurnal pada aktivitas nitrogenase lima dari enam jenis
Cyanothece spp. di mana aktivitas nitrogenase dapat diukur diinkubasi di bawah kondisi
aerob. Sel-sel tumbuh di bawah kondisi diazotrophic dan dikenakan pada siklus cahaya/gelap
12 jam diambil sampel setiap 2 jam selama periode ketiga untuk analisis aktivitas
nitrogenase. Enam jenis berbeda sekali sehubungan dengan batas waktu dalam siklus diurnal
ketika aktivitas nitrogenase diinduksi, periode ketika aktivitas berlangsung, serta aktivitas
spesifik enzim nitrogenase ( Fig. 5 ). Pada cyanothece sp. ATCC 51142, aktivitas nitrogenase
ini diinduksi ke arah setengah kemudian dari fase cahaya, antara L6 dan L10, dan aktivitas
memuncak pada awal fase siklus gelap ( antara D2 dan D6 ). Sebaliknya, aktivitas
nitrogenase empat jenis lainnya Cyanothece spp. diinduksi di awal atau pertengahan fase
gelap dan memuncak antara D6 dan D12. Periode aktivitas nitrogenase yang bisa dideteksi
terpanjang di cyanothece sp. ATCC 51142, dan itu bisa tahan hingga 12 jam. Pada
Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802, aktivitas berlangsung antara 8 dan 10 jam.
Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822 menunjukkan induksi nitrogenase yang tertunda,
dengan aktivitas terdeteksi di D6. Aktivitas ini berlangsung selama 6 jam di kedua jenis
tersebut. Sementara di Cyanothece sp. ATCC 51142, aktivitas nitrogenase tidak terdeteksi
setelah akhir siklus gelap, pada jenis lain Cyanothece spp., aktivitas nitrogenase diperluas ke
fase awal siklus cahaya (L2). Dari lima jenis, aktivitas nitrogenase tertinggi ditemukan di
cyanothece sp. ATCC 51142, diikuti oleh Cyanothece sp. PCC 8802, PCC 8801, dan PCC
7822 ( fig. 5 ).
Sinkronisasi Temporal Respirasi dan Aktivitas Nitrogenase pada Jenis Cyanothece spp.
Kami mempelajari respirasi dan aktivitas nitrogenase di berbagai jenis Cyanothece
spp. tumbuh di bawah 12 jam siklus cahaya / gelap. Tingkat oksigen terlarut dalam biakan
mencerminkan aktivitas respirasi sel, sedangkan aktivitas nitrogenase ditentukan oleh
pengukuran tingkat konversi asetilena ke ethylene. Pengamatan kami mengungkapkan
perbedaan yang signifikan dalam aktivitas respirasi dan fiksasi nitrogen dalam mempelajari
berbagai jenis (Fig. 6). Menariknya, fluktuasi dalam tingkat oksigen terlarut, sesuai dengan
aktivitas fotosintetik dan respirasi sel, bervariasi dalam enam Cyanothece spp. budaya yang
tumbuh di bawah kondisi yang identik. Laju penyerapan respirasi oksigen ini secara
signifikan berbeda pada setiap jenis,i yang dinyatakan oleh perbedaan kemiringan. Tingkat
oksigen terlarut yang menurun sampai hampir menyentuh 0 µm pada puncak respirasi gelap
dalam beberapa kebudayaan, sementara pada yang lain turun hingga hanya 50 % dari
konsentrasi yang dicapai pada puncak fotosintesis. Waktu tingkat minimum oksigen yang
dipertahankan di setiap jenis selama periode gelap juga bervariasi. Ini jelas dalam lebar
lembah pada titik-titik waktu yang sesuai. Pada Cyanothece sp. ATCC 51142, peningkatan
yang tajam pada tingkat oksigen diamati pada awal siklus cahaya, dan konsentrasi oksigen
tertinggi sesuai dengan aktivitas puncak fotosintetik dicapai dalam beberapa jam pertama
siklus ini (Fig. 6A). Setelah mencapai puncak, tingkat oksigen mengalami penurunan 10%
diamati pada tengah hari. Konsentrasi oksigen ini dipertahankan sampai awal periode gelap,
ketika penurunan tajam diamati, membawa oksigen terlarut sekitar 40% dari tingkat puncak.
Konsentrasi oksigen dipertahankan pada tingkat ini (sekitar 175 µM) untuk seluruh periode
gelap.
Berbeda dengan Cyanothece sp. ATCC 51142, Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7822,
PCC 8801 dan PCC 8802 menunjukkan peningkatan tingkat oksigen terlarut untuk hampir
sepanjang periode cahaya, dan konsentrasi mulai turun hanya pada awal periode gelap
(gambar 6, B, D, dan E). Juga berbeda dengan Cyanothece sp. ATCC 51142, penurunan
tingkat oksigen terlarut bertahap pada jenis tersebut, penurunan sepanjang periode gelap.
Konsentrasi oksigen pada akhir periode gelap mendekati 0 µM pada Cyanothece sp. PCC
7424, PCC 7822 dan PCC 8802. Pada Cyanothece sp. PCC 8801, pergeseran diamati dalam
konsentrasi oksigen terlarut selama periode pengujian 72 jam di bioreaktor, dengan
konsentrasi terendah yang tercatat di pertengahan gelap, akhir gelap, dan awal fase cahaya
dari siklus diel. Jenis ini, konsentrasi oksigen terendah dicapai saat puncak respirasi pada 50
µM. Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7822 dan PCC 8801, konsentrasi oksigen terlarut
minimal dipertahankan selama jangka waktu singkat, sedangkan pada Cyanothece sp. PCC
8802, sebuah pola yang mirip dengan Cyanothece sp. ATCC 51142 diamati, dimana kadar
oksigen minimal tetap dipertahankan selama beberapa jam. Respirasi pada cyanothece sp.
Pcc 7425 berbeda dari jenis Cyanothece spp. yang lain, dengan kadar oksigen terlarut
menurun perlahan-lahan di seluruh periode gelap sekitar 30% dari tingkat awal kemudian
meningkat secara bertahap pada seluruh periode cahaya. Sementara sampai batas tertentu ini
menyerupai pola yang diamati pada Cyanothece sp. ATCC 51142, tidak seperti Cyanothece
sp. ATCC 51142, tingkat oksigen dalam Cyanothece sp. PCC 7425 tidak stabil pada
konsentrasi terendah dan menunjukkan kenaikan segera setelah mencapai titik terendah. Hasil
ini menunjukkan bahwa fotosintesis dan respirasi yang diatur berbeda di enam jenis
Cyanothece spp. mengalami isyarat eksterna yang identik, yang menunjukkan perbedaan
dalam status metabolisme sel, yang diterjemahkan ke dalam sinyal pengaturan yang berbeda.
Secara paralel, kami menguji aktivitas nitrogenase dalam enam Cyanothece spp. kultur,
mengambil sampel setiap 2 jam untuk jangka waktu 3 d. Tingkat tertinggi fiksasi nitrogen
terlihat di Cyanothece sp. ATCC 51142 (120 µmol mg-1 klorofil h-1). Pada jenis ini, aktivitas
nitrogenase diinduksi bertepatan dengan penurunan konsentrasi oksigen terlarut sebelum
akhir periode cahaya, mencapai puncaknya dengan dalam beberapa jam pertama periode
gelap, dan berkurang sebelum akhir periode gelap (Fig. 6A). Pada Cyanothece sp. Pcc 7424,
aktivitas nitrogenase diinduksi di tengah siklus gelap dan mencapai puncaknya menjelang
akhir periode gelap, bertepatan dengan puncak respirasi. Aktivitas meluas sampai ke siklus
cahaya dan berkurang ketika konsentrasi oksigen meningkat. Pada Cyanothece sp. PCC 7822,
aktivitas nitrogenase terdeteksi menuju akhir beberapa jam yang periode gelap dan juga
meluas beberapa jam ke dalam siklus cahaya berikutnya. Dengan demikian, di kedua
Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822, periode aktivitas enzim nitrogenase pendek, yang
berlangsung antara 6 sampai 8 jam. Di Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802, aktivitas
nitrogenase diinduksi antara awal gelap ( D2 ) dan akhir fase gelap, tergantung pada
konsentrasi oksigen terlarut. Meskipun puncak aktivitas reda sebelum akhir periode gelap,
rendahnya tingkat aktivitas dapat dideteksi bahkan di tengah periode cahaya di kedua jenis
ini. Pada Cyanothece sp. Pcc 7425, tidak ada aktivitas nitrogenase yang dapat diukur dibawah
pengujian ini.
Penggugusan Kromosom dari Gen-gen Nitrogenase pada Uniseluler, Pengikatan
Nitrogen secara aerob pada Cyanobacteria
Untuk menentukan apakah kemampuan untuk melakukan fiksasi nitrogen aerob dan
produksi hidrogen diberikan oleh ciri yang unik pada gugus gen nitrogenase ( nif ) anggota
genus Cyanothece, kami memeriksa tingkat konservasi seluruh gugus kromosom yang
mengandung gen nif. Analisis mencantumkan ke-12 urutan uniseluler pemfiksasi nitrogen
jenis Cyanobacterial: Cyanothece sp. ATCC 51142, CCY 0110, PCC 7424, PCC 7425, PCC
7822, PCC 8801, dan PCC 8802, Crocosphaera sp. Wh 8501, Cyanobacterium UCYN-A, dan
tiga pemfiksasi nitrogen anaerobik jenis Synechococcus spp. Kami menggunakan Cyanothece
sp. ATCC 51142, jenis dengan gugus gen nif berdekatan terbesar (Welsh et al., 2008;
Bandyopadhyay et al., 2011) dan dengan kemampuan pemfiksasi nitrogen dan menghasilkan
hidrogen tertinggi, sebagai referensi jenis dan membandingkan urutan dengan 11 jenis
lainnya. Kami memilih 28.3-kb satu wilayah yang terletak berdekatan antara posisi 555,439
dan 583,778 di genom Cyanothece sp. ATCC 51142. Wilayah ini terdiri dari 35 gen
pengkode protein ( cce _ 0545-cce _ 0579 ), yang mencakup sebagian gen nif. Gen-gen
berkumpul dalam dua kelompok, berorientasi pada arah yang berlawanan, seperti yang
ditunjukkan dalam Gambar 7.
Jenis Cyanothece sp. laut CCY 0110 menunjukkan tingkat tertinggi homologi untuk
cyanothece sp. Atcc 51142, dengan sekitar 90 % identifikasi di tingkat nukleotida, dan berisi
hampir seluruh urutan referensi ( kecuali 171 bp; berwarna hitam di Gb. 7 ) sebagai daerah
yang berdekatan di genom tersebut. Crocosphaera sp. Wh 8501, jenis laut lain, berikutnya
menunjukkan tingkat konservasi tertinggi, dengan sekitar 82 % secara keseluruhan
mengidentifikasi di daerah selaras. Namun, tidak ada daerah homolog yang sesuai dengan
urutan gen-gen pengkode protein cce _ 0551, cce _ 0556, cce _ 0558, dan cce _ 0577 yang
ditemukan dalam genom ini. Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802 menunjukkan pola
barisan yang sangat mirip, dengan sekitar 80% dan 75% cakupan dari urutan referensi,
berturut-turut. Cyanobacterium laut yang tak berkultur UCYN-A, jenis yang telah mengalami
reduksi genom drastis, mempertahankan gugus gen nif, bagiannya sekitar 65.2% homolog
dengan urutan dari referensi. Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822 menunjukkan sekitar
65% dan 60% homolog dengan urutan referensi, berturut-turut. Analisis kami
mengungkapkan bahwa beberapa Cyanothece sp. ATCC 51142 daerah gugus nif ( diwakili
oleh garis arsir ) yang hadir pada lokasi yang jauh pada genom dari Cyanothece sp. PCC
7424, PCC 7822, pcc 8801, dan PCC 8802 ( Gb. 7 ), menyarankan kemungkinan penataan
ulang dari genom tersebut selama evolusi.
Di antara enam jenis Cyanothece spp., Cyanothece sp. PCC 7425 tampaknya memiliki
gugus gen nif yang paling berbeda, berbagi hanya 42 % identitas dengan urutan referensi.
Gugus nif di jenis ini dibagi menjadi dua segmen besar, yang berada pada posisi yang jauh
dalam genom dipisahkan oleh sebuah fragmen dari lebih dari 2,5 Mb. Di tingkat kromosom,
segmen yang besar dari gugus referensi ditemukan hilang dalam Cyanothece sp. PCC 7425,
seperti yang diwakili oleh segmen hitam dalam gambar 7. Meskipun sebagian besar gen-gen
nif yang hadir dalam jenis pemfiksasi nitrogen aerobik hadir di suatu tempat pada genom
Cyanothece sp. PCC 7425, integritas lingkungan gen pada gugus nif hancur, menunjukkan
bahwa pengaturan fungsi mungkin terganggu.
Tiga jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik Synechococcus spp. termasuk dalam analisis ini
menunjukkan seperti Cyanothece sp. PCC 7425 sejalan dengan jenis referensi, menunjukkan
kurang dari 45% Homologi dengan gugus nif Cyanothece sp. ATCC 51142. Meskipun bagian
dari gugus di semua keempat jenis menunjukkan identitas sekitar 60% sampai 80% di
tingkat nukleotida dengan jenis uniseluler diazotrophic lainnya yang termasuk dalam analisis
ini, lebih dari 50% cluster tidak menunjukkan ada kesamaan di tingkat nukleotida. Kami
membuat pohon filogenetik menggunakan urutan protein nifH dari 103 jenis cyanobacterial
dengan urutan nifH Cyanothece sp. 51142 ATCC sebagai referensi (tambahan Gb. S1).
Semua jenis pemfiksasi nitrogen aerobik yang bercabang dari node yang sama sebagai
Crocosphaera watsonii dan UCYN-A dan berkumpul bersama-sama. Sebaliknya, Cyanothece
sp. PCC 7425 nampaknya telah bercabang secara independen dari titik yang juga
memunculkan beberapa jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik berserabut Oscillatoria spp..
Jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik Synechococcus spp. muncul pada cabang terpisah dari
Cyanothece sp. PCC 7425. Analisis ini mengungkapkan bahwa gugus nif jenis uniseluler di
laut Cyanothece sp. ATCC 51142 dan CCY 0110 dan Crocosphaera sp. WH 8501 hampir
menyerupai satu sama lain dalam hal sintesis gen serta dalam konservasi dari gugus urutan
nukleotida. Gugus nif pada jenis pemfikasi nitrogen anaerobik uniseluler, di sisi lain,
memegang ciri berbeda dari jenis di laut yang menunjukkan sebuah garis evolusi independen.
DISKUSI
Pemfiksasi nitrogen uniseluler Cyanobacteria menunjukkan keragaman yang besar
dalam perilaku diazotrophic mereka, khususnya dalam efisiensi fiksasi nitrogen, induksi
aktivitas nitrogenase, fase siklus diurnal ketika aktivitas nitrogenase puncak, dan kemampuan
mereka untuk melakukan fiksasi nitrogen aerobik versus anaerobik. Perbedaan tersebut dapat
dikaitkan ke keadaan genotyp jenis serta tekanan selektif yang dikenakan pada mereka di
habitat tertentu. Analisis kami terhadap segi morfologi dan metabolik, berbeda dari keenam
anggota genus Cyanothece mengungkapkan bahwa tingkat variasi ini cukup bahkan pada
tingkat intragenus. Namun, meskipun bervariasi, tingkat fiksasi nitrogen aerobik tinggi dan
hidrogen produksi muncul menjadi karakteristik dari genus ini, dengan lima dari enam jenis
menunjukkan tingkat produksi hidrogen aerobik lebih tinggi daripada jenis wild-type
Cyanobacterial lain yang dikenal ( Dutta et al. , 2005 ). Cyanothece sp. PCC 7425 adalah
satu-satunya pengecualian di mana aktivitas nitrogenase atau produksi hidrogen tidak dapat
terdeteksi kecuali disediakan sebuah inkubasi lingkungan anaerobik. Pengamatan ini
menguatkan studi sebelumnya, yang mengindikasikan bahwa Cyanothece sp. PCC 7425 unik
di antara jenis Cyanothece spp. lainnya (Porta et al., 2000; Bandyopadhyay et al., 2011) dan
dalam beberapa hal menyerupai pemfiksasi nitrogen anaerobik, Synechococcus spp. Studi
analisis perbandingan, mengungkapkan perbedaan signifikan antara Cyanothece sp. PCC
7425 dan pemfiksasi nitrogen anaerobik Synechococcus spp. di tingkat genom dan
menunjukkan kedekatan dengan Acaryochloris marina dalam pohon filogenetik
(Bandyopadhyay et al., 2011). Dengan demikian, Cyanothece sp. PCC 7425 tampaknya jenis
yang berkembang secara independen yang mungkin statusnya dianggap di luar genus
Cyanothece. Aktivitas tertentu enzim nitrogenase bervariasi dalam enam jenis Cyanothece
spp., mengakibatkan tingkat yang berbeda pada fiksasi nitrogen dan produksi hidrogen. Rasio
aktivitas nitrogenase dengan produksi hidrogen di bawah kondisi aerobik dan anaerobik juga
bervariasi antara keenam jenis tersebut (Gambar 4). Pengamatan ini bisa disebabkan oleh
perbedaan dalam efisiensi nitrogenase dan penyerapan enzim hydrogenase, perbedaan dalam
tingkat toleransi oksigen dari enzim nitrogenase, serta kontribusi dari sistem dua fungsi
enzim hydrogenase menuju produksi hidrogen. Selain itu, gugus nif berbeda secara signifikan
antara jenis Cyanothece spp., faktor yang mungkin juga berkontribusi untuk mengamati
perbedaan fisiologis. Perbandingan dari gugus ini antara uniseluler Cyanobacteria
mengungkapkan konfigurasi yang berbeda pada jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik, dengan
pengurangan yang signifikan dalam ukuran gugus (gambar 7), menunjukkan kemungkinan
bahwa segmen tertentu dari gugus diperlukan untuk fiksasi secara aerob. Pengamatan
menarik lain adalah kemiripan gugus nif pada jenis di laut yaitu Cyanothece sp. ATCC 51142
dan CCY 0110 dan Crocosphaera spp. memamerkan lebih dari 90% identitas di tingkat
nukleotida. Studi yang berfokus pada kemampuan memfiksasi nitrogen dari tiga jenis tersebut
dapat mengakibatkan kesimpulan penting tentang kepentingan gugus ini dalam fiksasi
nitrogen secara aerob dan produksi hidrogen. Meskipun tak satu pun dari genom Cyanothece
spp. tampaknya mengandung gen untuk fasilitator penyerapan gliserol (GlpF), sebagian besar
jenis Cyanothece spp. mampu memanfaatkan gliserol, menyatakan bahwa transportasi
gliserol ke sel dimediasi oleh difusi pasif (da Silva et al., 2009). Tidak seperti Cyanothece sp.
ATCC 51142, yang memanfaatkan gliserol untuk produksi biomassa serta memediasi
nitrogenase produksi hidrogen, Cyanothece spp. lain itu tidak mampu untuk memanfaatkan
gliserol untuk pertumbuhan mixotrophic. Namun, beberapa jenis ( Tabel I dan II ) secara
signifikan menunjukkan aktivitas nitrogenase jauh lebih besar, menyatakan bahwa gliserol
mengalami metabolisme dalam sel dan dapat digunakan sebagai sumber reductants. Di
catatan yang sama, Feng et al. ( 2010 ) menunjukkan bahwa Cyanothece sp. ATCC 51142
bisa memetabolisme glc, tapi sumber karbon ini tidak berkontribusi terhadap produksi
biomassa. Pada Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802, gliserol berpengaruh kurang baik
terhadap fiksasi nitrogen, menunjukkan perbedaan metabolisme yang melekat pada jenis
tersebut. Anehnya, dua jenis Cyanothece spp. tersebut memiliki gliserol kinase, gen yang
hadir di Cyanothece sp. ATCC 51142, jenis yang menunjukkan peningkatan pertumbuhan
dalam kehadiran gliserol. Ketidakmampuan Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802 untuk
memanfaatkan gliserol bagi pertumbuhan dan produksi hidrogen memungkinkan perbedaan
dalam jalur hilir.
Fiksasi nitrogen dan respirasi, dua proses metabolisme yang terkait erat dalam
diazotrophic Cyanobacteria. Tekanan parsial oksigen dalam sel untuk mengetahui kondisi
efisiensi fiksasi nitrogen, dan beberapa mikroba pemfiksasi nitrogen secara aerob dapat
menyesuaikan tingkat respirasi untuk mencari kelebihan oksigen sebagai strategi untuk
melindungi enzim nitrogenase. Itu menunjukkan bahwa pada Crocosphaera spp., respirasi
gelap memediasi pemasukan konsentrasi oksigen intraseluler adalah prasyarat untuk induksi
aktivitas nitrogenase (Compaor dan Stal, 2010). Respirasi juga menghasilkan energi penting
untuk proses fiksasi nitrogen, yang memerlukan pemeliharaan tingkat respirasi yang stabil
selama periode fiksasi nitrogen (Fay, 1992). Studi di tingkat transkripsi dan translasi di
Cyanothece sp. ATCC 51142 telah menunjukkan bahwa gen yang terlibat dalam respirasi dan
fiksasi nitrogen berkorelasi, dengan kedua kategori gen tersebut diatur naik sepanjang
seluruh periode gelap dan diatur turun sepanjang periode cahaya (St ckel et al., 2008).
Studi kami mengungkapkan hubungan yang dekat antara aktivitas respirasi dan fiksasi
nitrogen dari jenis Cyanothece spp. Konsentrasi oksigen terlarut dalam pertumbuhan media
menunjukkan osilasi kuat atas siklus diurnal, dan pola osilasi bervariasi antara jenis-jenis
Cyanothece spp. Osilasi ini pada oksigen terlarut konsentrasi dalam media terutama timbul
dari kegiatan fotosintetik sel-sel ( yang mengakibatkan oksigen meningkat pada siang hari)
serta dari respirasi gelap ( yang dihasilkan di lembah-lembah ). Selain itu, fotorespirasi dan
reaksi Mehler yang dikenal berkontribusi ke konsentras oksigen bersih ( Kana, 1992 ). Pada
sebagian besar Cyanothece spp. strain, aktivitas respirasi dimulai pada awal masa gelap dan
memuncak menjelang akhir, ketika keadaan puncak, aktivitas nitrogenase ini juga diamati.
Cyanothece sp. ATCC 51142 adalah pengecualian, di mana tingkat fotosintesis yang sangat
tinggi dan awal puncak fotosintetik yang diamati pada periode cahaya diikuti dengan
penurunan konsentrasi oksigen terlarut. Meskipun penurunan konsentrasi oksigen selama
periode cahaya dapat memperlambat atau menghentikan aktivitas fotosintetik, mungkin juga
menunjukkan tingkat basal yang tinggi dari respirasi cahaya sendiri dan konsumsi oksigen
yang simultan oleh proses seperti fotorespirasin dan reaksi Mehler. Tingkat respirasi tinggi
(dianggap tinggi untuk Cyanobacteria), yang meningkat di bawah siklus gelap, telah
dilaporkan untuk Cyanothece sp. ATCC 51142 (Schneegurt et al., 1997). Konsumsi oksigen
secara bebas tersebut terutama dikaitkan dengan reaksi Mehler pada Trichodesmium spp.
( Kana, 1992 ). Karena konsentrasi oksigen dalam Cyanothece sp. ATCC 51142 turun,
permulaan awal kegiatan nitrogenase diamati (Gambar 6). Sebaliknya, Cyanothece sp. PCC
7424 dan PCC 7822 menunjukkan penurunan konsentrasi oksigen terlarut, mulai hanya pada
akhir periode gelap, sementara Cyanothece sp. PCC 7425 dan PCC 8802 menunjukkan
penurunan yang hanya setelah beberapa jam ke periode cahaya. Penundaan pada awal
aktivitas respirasi mungkin menunjukkan tingkat yang lebih lambat awal respirasi pada jenis
tersebut, yang mengambil di L2 di Cyanothece sp. PCC 8802, mengarah ke penurunan yang
terjal. Pada Cyanothece sp. PCC 7425, penurunan konsentrasi oksigen lebih bertahap dan
berlangsung sepanjang periode gelap. Tidak seperti jenis lainnya Cyanothece spp., oksigen
berputar pada Cyanothece sp. PCC 8801 menunjukkan pergeseran fase. Pada siklus diurnal
pertama, konsentrasi oksigen mulai meningkat di pertengahan peroide gelap. Pada periode
diurnal berikutnya, meningkatnya konsentrasi oksigen diamati setelah L9, sedangkan dalam
siklus ketiga, konsentrasi meningkat hanya pada periode cahaya. Anomali ini dalam pola
berputar, sulit untuk menafsirkan dan mungkin menyarankan penghentian awal respirasi dan
mengakibatkan kenaikan atmosfer oksigen terlarut. Hal ini juga menunjukkan bahwa
mungkin ada jeda sebelum jam sirkadian dan diurnal sinkron dengan metabolisme di
Cyanothece sp. PCC 8801 di bawah kondisi bioreaktor.
Sementara kebanyakan jenis menunjukkan tingginya tingkat respirasi selama periode
gelap, pada beberapa jenis, tingkat oksigen terlarut mencapai mendekati nol di puncak
respirasi. Namun, mengherankan, jenis tersebut tidak menunjukkan aktivitas tinggi
nitrogenase. Sebaliknya, Cyanothece sp. ATCC 51142 menunjukkan tingkat awal respirasi
yang sangat tinggi tapi mempertahankan tingkat oksigen terlarut sepanjang periode gelap, dan
kegiatan nitrogenase di jenis ini adalah yang tertinggi. Dengan demikian, menjaga
konsentrasi oksigen di ambang tertentu untuk jangka waktu tampaknya menjadi faktor yang
memberikan kontribusi terhadap tingginya tingkat aktivitas nitrogenase sp. Cyanothece
ATCC 51142. Tingkat respirasi yang stabil sepanjang periode gelap menunjukkan
ketersediaan cukup reduktan dan energi dalam strain ini. Pengamatan ini juga menyarankan
bahwa tingkat toleransi oksigen dari enzim nitrogenase di Cyanothece spp. strain mungkin
berbeda, dengan beberapa jenis yang membutuhkan sebuah lingkungan yang lebih anaerobik
untuk induksi aktivitas nitrogenase. Pada Cyanothece sp. PCC 7425, laju respirasi lebih
lambat dan tekanan parsial oksigen terlarut tinggi tampaknya menjadi hambatan dalam
kemampuannya untuk fiksasi nitrogen secara aerob dan memerlukan induksi nitrogenase oleh
kondisi anaerob buatan. Beberapa komponen dari gugus nif yang hilang dalam Cyanothece
sp. PCC 7425 dan hadir dalam jenis fiksasi nitrogen aerob mungkin juga memainkan
peranan penting dalam fiksasi nitrogen secara aerob. Contoh ini termasuk gen pengkode 4fe-
4s ferredoxin iron-sulfur mengikat protein domain terletak antara nifB dan nifS pada jenis
fiksasi nitrogen secara aerob serta hipotetis gen lain dalam gugus. Selain itu, cysE2, gen
pertama pada salah satu dari dua unit transkripsi pada gugus di Cyanothece sp. ATCC 51142,
tidak terdapat salah satu gugus nif di Cyanothece sp. PCC 7425. Menariknya, coexpression
jaringan analisis studi mengungkapkan konektivitas temporal yang kuat antara cysE2 dan
nifB, gen pertama di unit transkripsi kedua dari gugus ini di Cyanothece sp. ATCC 51142.
Lokasi dua gen ini terpelihara dalam semua pemfiksasi nitrogen aerobik uniseluler jenis
Cyanobacterial dan konektivitas sementara antara gen ini mungkin melibatkan peran mereka
dalam memulai fiksasi nitrogen aerobik. Periode aktivitas nitrogenase berlangsung juga
beragam dalam Cyanothece spp. strain, dengan Cyanothece sp. ATCC 51142 menunjukkan
aktivitas periode terpanjang, menunjukkan perbedaan pada cadangan karbon dari strain ini
dan kemungkinan cadangan yang digunakan untuk jalur yang berbeda.
Cyanobacteria diazotrophic uniseluler mempertahankan profil metabolik yang
dinamis pada seluruh siklus diurnal. Cyanothece sp. ATCC 51142 menjadi sangat aktif
selama fase gelap dari siang dan periode malam, dengan banyaknya transkrip yang tertinggi
di awal periode gelap. Tingkat pergantian protein juga dianggap lebih tinggi pada periode
gelap (St ckel et al., 2008). Aktivitas seluler selama musim gelap proses berupa seperti
respirasi, fiksasi nitrogen, produksi hidrogen dan degradasi glikogen. Jalur biosintesis asam
amino juga diatur meningkat selama gelap periode. Selama fase cahaya, proses seperti
fotosintesis, fiksasi karbon dan sintesis glikogen dominan. Pengaturan proses biokimia yang
dijaga ketat, merupakan kontrol transisi antara fase terang dan gelap. Sifat-sifat tersebut
membuat anggota genus Cyanothece sangat menarik di mana pengaruh siklus sirkadian dan
siklus diurnal pada metabolisme dapat dipelajari. Studi ini menunjukkan bahwa diazotrophic
uniseluler Cyanobacteria dengan latar belakang genotipe yang sama menunjukkan keragaman
pola diurnal dari pusat proses metabolisme. Variasi muncul dikontrol oleh sinyal spesifik
metabolik intraseluler untuk setiap jenis, seperti konsentrasi intraseluler karbon, nitrogen,
atau oksigen, yang pada gilirannya dikontrol kemampuan sel untuk memfiksasi nitrogen.
Tingginya tingkat respirasi, cukup pasokan energi dan reduktan dari efisien fotosintesis, dan
belum diketahui komponen mesin memfiksasi nitrogen yang muncul menjadi faktor yang
menyebabkan kemampuan menghasilkan hidrogen aerobik unik dari genus Cyanothece.
BAHAN DAN METODE
Pertumbuhan Sel
Cyanothece sp. ATCC 51142 sel ditumbuhkan dalam media ASP2 (Reddy et al.,
1993) dalam labu yang digetarkan 30oC di bawah 30 µmol foton m-2 s-1 cahaya putih dan
ambient CO2. Semua Cyanothece spp. strain yang ditumbuhkan dalam media BG11 (Allen,
1968) di bawah kondisi pertumbuhan yang serupa. Studi produksi hidrogen dan aktivitas
nitrogenase, Cyanothece spp. strain yang ditanam di labu yang digetarkan atau bioreaktor di
media ASP2 atau BG11 (Reddy et al., 1993; Halaman et al., 2012), tanpa dilengkapi NaNO3,
pada 30oC di bawah cahaya 12 jam / 12 jam siklus gelap dan 100 µmol foton m -2 s-1 cahaya
putih. Kurva pertumbuhan di bawah kondisi azotrophic dan diazotrophic yang dihasilkan oleh
sampling dan pengukuran kepadatan optik kultur di 730 nm (OD 730) di BioTek µQuant
piring reader pada interval 24 jam untuk 7 d. Cahaya micrograph dan penyerapan spectra dari
strain diperoleh dari 6 - untuk 7-d-old kultur berkembang dalam kehadiran gabungan sumber
nitrogen. Gambar diperoleh dengan menggunakan mikroskop FluoView FV-1000 (Olympus)
dan kamera digital Olympus DP71 warna, dan spektrum yang diperoleh pada
spectrophotometer Olis DW-2000. Pemfiksasi nitrogen Cyanothece spp. kultur digunakan
dalam kajian ini dibuat dengan menyuntikkan volume 0.25 (5-7 d old, O.D. 730 antara 0,5
dan 0.7) tumbuh di media ASP2 atau BG11 (tanpa sumber nitrogen gabungan) di bawah
cahaya terus-menerus (30 µmol foton m-2 s-1 cahaya putih). Kultur ini pada gilirannya dimulai
oleh penyuntikan sepersepuluh volume dari sel (dari 7 - ke 9-d-old kultur, O.D. 730 sekitar
0.8) di bawah 30 µmol foton m-2 s-1 secara terus-menerus cahaya putih. Analisa pertumbuhan
photomixotrophic, kultur telah ditambah dengan 50 mM gliserol.
Mikroskop Elektron
Dalam persiapan untuk mikroskop elektron, Semua Cyanobacterial strain tumbuh secara
terus-menerus pada 30 µmol foton m-2 s-1 cahaya putih di 30oC. Cyanothece sp. PCC 7424,
PCC 7425, PCC 7822, PCC 8801 dan PCC 8802 dipanen setelah 5 d langsung dari piring
berisi media BG11 padat. Sel dikumpulkan dari piring sebagai sel perekat dan ditransfer
langsung ke aluminium planchettes (papan kecil dengan 2 roda) pada sumur sedalam 100
µm. Cyanothece sp. ATCC 51142 panen sebagai kultur cair yang berkembang di media ASP2
setelah 6 d. Sejumlah kultur (25 ml) disentrifugasi, dan butir sel ditutup kembali dalam
volume medium kecil dan dipipetkan ke planchettes sumur sedalam 200 µm. Semua sel
dibius dengan ultra cepat, pembekuan bertekanan tinggi menggunakan Bal-Tec Freezer
tekanan tinggi (Bal - Tec). Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7425, PCC 7822, PCC 8801 dan
PCC 8802 sampel yang membekukan pengganti di 2% (w/v) osmium pada aseton dan
tertanam dalam Epon/Araldite. Cyanothece sp. ATCC 51142 sampel yang membekukan
diganti dalam 1% (v/v) glutaraldehid ditambah asam tannic 0,1% (w/v) dalam aseton dan
tertanam dalam Spurr’sresin. Membekukan substitusi ini dilakukan selama 3 d pada 80oC dan
15 jam di 60oC, diikuti oleh pencairan yang lambat sampai suhu kamar. Bagian tipis yang
diwarnai dengan uranyl asetat dan timah sitrat dan kemudian tergambar menggunakan LEO
912 energi filter mikroskop elektron transmisi dilengkapi dengan kamera digital ProScan.
Pengukuran Produksi hidrogen, Respirasi dan Aktivitas Nitrogenase
Untuk menentukan tingkat fiksasi nitrogen dan produksi hidrogen, 20 mL dari kultur
(dari kultur cahaya/gelap yang berusia 7 d, 12-jam) dipindahkan pada awal periode gelap dari
bioreaktor dan/atau labu getar botol kaca kedap udara (36 mL) dan diinkubasi di udara di
bawah intensitas cahaya dari 100 µmol foton m-2 s-1 untuk 12 jam. Untuk inkubasi anaerobik,
botol kaca yang dibilas dengan argon selama 15 sampai 30 menit. Untuk percobaan yang
dilakukan selama siklus diel, 10-mL sample yang dikumpulkan setiap 2 jam dari bioreaktor
serta labu getar dan diinkubasi di 36-mL botol untuk 1 h di udara di bawah intensitas cahaya
dari 100 µmol foton m-2 s-1. Aktivitas Nitrogenase kultur ditentukan menggunakan assay
reduksi asetilena (Oda et al, 2005), mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Bandyopadhyay
et al. (2010), dan dinyatakan dalam produksi etilen. Etilena dan hidrogen yang terakumulasi
di ruang kepala cawan tertutup itu ditarik dengan jarum suntik kedap udara dan diukur
menggunakan Agilent 6890N gas chromatograph (Bandyopadhyay et al., 2010). Aktivitas
respirasi sel diukur dalam photobioreactors dilengkapi dengan elektroda oksigen Mettler
Toledo Clark-jenis terpadu (Halaman et al., 2012). Lubang bioreaktor dioperasikan dalam
modus pengadukan untuk mengevaluasi perubahan-perubahan dalam konsentrasi oksigen
terlarut kultur dari kegiatan fotosintetik dan respirasi sel. Kultur ditransfer ke bioreaktor pada
permulaan fasa log pertumbuhan dan dipelajari dalam mode batch kultur di bawah kondisi
pengadukan untuk 7 d. Optik kepadatan kultur tidak berubah secara signifikan selama periode
72-h di mana kultur bersikap sama, seperti yang terlihat dari pola respirasi dan fotosintesis.
Setelah 3 d, variasi budaya yang diamati dalam pola siklus dan sel menunjukkan tanda-tanda
stres. Dengan demikian, data yang diperoleh selama periode 3-d yang disajikan di sini. Total
klorofil a diambil oleh metanol dan diukur secara spetrofotometrik menggunakan
spektrofotometer Olis DW2000. Kandungan klorofil Cyanothece sp. ATCC 51142 kultur
yang tumbuh tanpa sumber eksternal karbon berkisar antara 0,5 dan 2 µg mL-1, sedangkan
kultur dilengkapi dengan gliserol memiliki konsentrasi klorofil yang lebih tinggi (2-5 µg mL-
1). Kandungan klorofil spp. Cyanothece strain lain berkisar antara 0.3 dan 2.8 µg mL -1 di
bawah kondisi fototrof dan photomixotrophic.
Perbandingan Tingkat Nukleotida Gugus nif pada uniseluler Pemfiksasi Nitrogen strain
Daerah Konservasi diidentifikasi menggunakan Pusat Nasional untuk Informasi
Bioteknologi nukleotida BLAST versi 2.2.22 (Altschul et al., 1997) dengan parameter
dust:no, word_size:11, gapopen:5, gapextend:2, penalty:-3 dan reward: 2. Dalam gambar 7,
daerah yang dilestarikan di setiap strain selaras dengan urutan referensi dari Cyanothece sp.
ATCC 51142. Daerah berwarna berdasarkan persentase basis identik dalam masing-masing
daerah. Selain itu, kami mengidentifikasi homologs untuk 35 gen pengkodean protein yang
terdapat di wilayah ini menggunakan Pusat Nasional Informasi Bioteknologi protein BLAST.
Dalam analisis ini, dua gen disebut homologs jika timbal balik BLAST mengakibatkan (1)
nilai E yang kurang dari 1E-4, (2) rasio antara panjang BLAST memukul wilayah dan
panjang protein lengkap yang lebih besar dari 2:3, dan (3) rasio antara nilai mentah untuk
dua-protein BLAST dan nilai baku untuk BLAST yang lebih besar dari 1:3.5.
Pohon filogenetik NifH dibuat menggunakan urutan asam amino NifH di Cyanothece
sp. ATCC 51142 sebagai referensi. Urutan gen homolog di 103 Cyanobacterial strain dikenali
dari database genom mikroba yang terintegrasi dari Departemen Energi-Joint Genome
Institute (Markowitz et al., 2010). ClustalX2 versi 2.1 (Larkin et al., 2007) paket perangkat
lunak yang digunakan untuk melakukan jajaran yang lengkap urutan individu, dan pohon
filogenetik dibuat menggunakan algoritma yang bergabung dengan tetangga dengan
parameter default. Pohon resultan diterjemahkan menggunakan fragmen Versi 0.957b
program perangkat lunak (Han dan Zmasek, 2009).
top related