perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id analisis .../analisis...hepatitis b sangat mudah mengalami...
Post on 30-Mar-2019
219 Views
Preview:
TRANSCRIPT
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
ANALISIS MOLEKULER REGIO CORE PROMOTER DAN
PRECORE/CORE ISOLAT VIRUS HEPATITIS B 09IDSKAB-3
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
IBNU YUDISTIRO
G.0009103
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
Surakarta
2012
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iv
ABSTRAK
Ibnu Yudistiro, G0009103, 2012. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan
Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B 09IDSKAB-3. Skripsi. Fakultas
Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Latar belakang: Infeksi Virus Hepatitis B (VHB) menjadi salah satu masalah
utama kesehatan di dunia karena memiliki angka kematian yang tinggi. Virus
hepatitis B sangat mudah mengalami mutasi karena bereplikasi melalui transkripsi
balik. Mutasi VHB sering ditemukan pada regio core promoter dan precore/core.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data molekuler dan variasi genetik pada
regio tersebut dengan isolat VHB 09IDSKAB-3.
Metode: Penelitian yang bersifat eksploratif ini dilaksanakan di Laboratorium
Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Ekstraksi
DNA dilakukan pada sampel dengan HBsAg positif yang diambil dari Komunitas
Man Sex with Man. Proses amplifikasi dengan PCR menggunakan primer KL-28
dan KL-6 kemudian dilakukan penentuan sekuens nukleotida pada regio tersebut.
Analisis molekuler dilakukan dengan aplikasi MEGA 4.0.
Hasil: Berdasarkan hasil analisis BLAST, isolat VHB 09IDSKAB-3 memiliki
skor BLAST tertinggi dengan isolat AP011085 yang berasal dari DKI Jakarta.
Ditemukan variasi genetik A1726C pada regio core promoter, T1860C, C1877T,
dan G1957C pada regio precore/core.
Simpulan: Isolat VHB 09IDSKAB-3 termasuk dalam kategori HBV genotipe B
subgenotipe B3 berdasarkan regio core promoter dan precore/core. Variasi
genetik yang terdapat pada isolat sampel mungkin mempengaruhi proses replikasi
dan produksi HBeAg/HBcAg, sehingga membutuhkan penelitian lebih lanjut.
Kata kunci: regio core promoter dan precore/core, isolat VHB 09IDSKAB-3,
analisis molekuler
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
v
ABSTRACT
Ibnu Yudistiro, G0009103, 2012, Molecular Analysis of Core Promoter and
Precore/Core Regions of 09IDSKAB-3 Hepatitis B Virus Isolate. Mini Thesis,
Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.
Background: Hepatitis B virus (HBV) infection is a major health problem
leading to significant morbidity and mortality worldwide. HBV replicates its
DNA genome through reverse transcription from RNA intermediate. It is
vulnerable to a high number of mutations during such reverse transcription which
are frequently found in core promoter and precore/core regions. This study was
aimed to identify genetic variation of core promoter and precore/core regions of
09IDSKAB-3 HBV isolate.
Methods: This was an explorative experiment. DNA extraction was performed on
09IDSKAB-3 blood sample that was taken from Man Sex with Man Community.
Core promoter and precore/core regions were determined by PCR using KL-28
and KL-6 primers and direct sequencing of the corresponding region. Molecular
analysis was performed using MEGA 4.0.
Result: Based on BLAST result, 09IDSKAB-3 HBV isolate had the highest
similarity to isolate AP011085 from DKI Jakarta. Genetic variations A1726C in
core promoter, and T1860C, C1877T, G1957C in precore/core regions were found
in 09IDSKAB-3 isolate.
Conclusion: 09IDSKAB-3 HBV isolate was classified into genotype B and
subgenotype B3 based on core promoter and precore/core region. The genetic
variations found in this isolate may have influence to the replication efficiency
and HBeAg/HBcAg production, therefore need further study.
Keywords : core promoter and precore/core regions, 09IDSKAB-3 HBV isolate,
molecular analysis
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vi
PRAKATA
Puji syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT karena atas
karuniaNya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul ”Analisis
Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B
09IDSKAB-3”. Penelitian dan penulisan skripsi ini dapat terlaksana dengan baik
berkat bantuan, bimbingan, dan petunjuk dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis
ingin mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Zainal Arifin A, dr., Sp.PD (KR), FINASIM, selaku Dekan Fakultas
Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
2. Muthmainah, dr., M. Kes, selaku Ketua Tim Skripsi FK UNS.
3. Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D selaku Pembimbing Utama atas bimbingan
dalam penyusunan skripsi ini.
4. Yulia Sari, S.Si., M.Si selaku Pembimbing Pendamping atas bimbingan dalam
penyusunan skripsi ini.
5. Hudiyono, Drs., M.Si selaku Penguji Utama yang telah memberikan
bimbingan, kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.
6. Leli Saptawati, dr., Sp.MK selaku Penguji Pendamping yang telah
memberikan bimbingan, kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi
ini.
7. Seluruh Dosen dan Staf Laboratorium Biomedik dan Mikrobiologi FK UNS.
8. Bagian Skripsi FK UNS yang turut memberi kelancaran pembuatan skripsi ini.
9. Ayahanda Suparmo, Ibunda Suharti serta adik-adikku yang sangat kucintai
dan kusayangi Azizah Muthi’ah dan Izzatunnisa Istiqomah. Keluargaku yang
selalu mendoakanku agar menjadi dokter yang baik.
10. Teman-teman Avicenna dan Wienda yang telah memberikan banyak bantuan
demi kelancaran skripsi ini.
11. Teman-teman seperjuangan dalam skripsi, Angga Dwi Prasetyo, Raden
Arteswara, Martinus Nuherwan, yang bahu membahu hingga selesainya
skripsi ini.
12. Teman-teman dan pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang
turut mendukung skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh
dari kata sempurna. Penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun
demi kebaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat
bermanfaat bagi dunia kedokteran umumnya dan pembaca khususnya.
Surakarta, Juni 2012
Ibnu Yudistiro
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vii
DAFTAR ISI
PRAKATA .................................................................................................... vi
DAFTAR ISI .............................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. ix
DAFTAR TABEL ...................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xi
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang .................................................................... 1
B. Perumusan Masalah ............................................................ 3
C. Tujuan Penelitian ................................................................ 3
D. Manfaat Penelitian .............................................................. 3
BAB II LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka ................................................................. 4
1. Virus Hepatitis B ............................................................. 4
2. Gen Core . ........................................................................ 5
3. Regio Core Promoter ...................................................... 7
B. Kerangka Pemikiran ............................................................ 8
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian .................................................................... 9
B. Lokasi Penelitian ................................................................. 9
C. Objek Penelitian .................................................................. 9
D. Rancangan Penelitian .......................................................... 9
E. Instrumen Penelitian ............................................................ 10
1. Alat ................................................................................. 10
2. Bahan .............................................................................. 10
F. Cara Kerja ........................................................................... 11
1. Ekstraksi DNA HBV ........................................................ 11
2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR ........................................ 13
3. Sekuensing dan Analisis Data .......................................... 13
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
viii
BAB IV HASIL PENELITIAN
A. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core 15
B. Variasi Genetik Regio Core promoter dan Precore/Core ...... 18
BAB V PEMBAHASAN
A. Regio Core Promoter Isolat 091DSKAB-3 ........................... 19
B. Regio Precore/Core Isolat 091DSKAB-3 ............................. 20
BAB VI PENUTUP
A. SIMPULAN ........................................................................ 26
B. SARAN .... ........................................................................... 26
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 27
LAMPIRAN
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Virus Hepatitis B (VHB) merupakan salah satu virus penyebab hepatitis
pada manusia. Diperkirakan dua milyar penduduk dunia telah terinfeksi VHB
dan 350 juta jiwa di antaranya menjadi kronis, dan 600 ribu orang
diantaranya meninggal setiap tahun akibat VHB terkait sirosis hepatis dan
atau karsinoma hepatoseluler (WHO, 2009; Yu et al., 2010). Hepatitis B
merupakan penyakit endemik, terutama di negara berkembang dengan
populasi penduduk yang tinggi. Indonesia termasuk negara dengan kategori
intermediate to high endemic region dengan prevalensi HBsAg mencapai
5,1% dari populasi umum (Hasan, 2005). Sebanyak 13 juta penduduk
Indonesia merupakan penderita hepatitis B (Sekretariat Jenderal Kementerian
Kesehatan RI, 2011).
VHB merupakan virus DNA yang bereplikasi melalui transkripsi balik
dari RNA intermediate. Selama proses transkripsi balik tersebut, proses
mutasi genetik sangat rawan terjadi dengan angka mutasi mencapai satu
nukleotida/10.000 basa/tahun infeksi (Alexopoulou, 2009; Hunt et al., 2000).
Mutasi genetik VHB sering terjadi pada regio core promoter dan
precore/core (gen C).
Beberapa mutasi yang terjadi pada core promoter dan precore/core (gen
C) terkait dengan perubahan manifestasi klinis hepatitis B (Lin dan Kao,
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
2
2011). Pasien yang terinfeksi oleh mutan tersebut cenderung mengalami
nekroinflamasi dan fibrosis hati yang lebih parah daripada pasien yang
terinfeksi VHB wild type (Al-Mahtab et al., 2007). Di samping itu, mutasi
genetik pada regio core promoter dan precore/core juga berpengaruh
terhadap proses perjalanan penyakit dan terapi hepatitis (Wang et al., 2005)
Oleh karena itu, analisis molekuler mengenai regio core promoter dan
precore/core diperlukan untuk memperoleh data mengenai variasi genetik
serta pengaruhnya pada penyakit hepatitis B.
Studi yang terkait dengan analisis regio core promoter dan precore/core
telah banyak dilakukan oleh peneliti di seluruh dunia. Publikasi mengenai
analisis molekuler regio core promoter dan precore/core dalam Pubmed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/) mencapai 880 publikasi di seluruh
dunia hingga Juni 2012, namun hanya terdapat lima publikasi yang dilakukan
di Indonesia (Heriyanto et al., 2012; Juniastuti et al., 2010; Utama et al.,
2009a, 2009b, 2011).
Pada penelitian ini kami melakukan analisis molekuler regio core
promoter dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 yang berasal dari Provinsi
Jawa Tengah. Data molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini
diharapkan dapat digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai virulensi,
strategi replikasi, patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi VHB terutama
di Indonesia.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
3
B. Rumusan Masalah
Bagaimanakah analisis molekuler regio core promoter dan precore/core
virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3?
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data molekuler regio core
promoter dan precore/core virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3.
D. Manfaat Penelitian
1. Aspek teoritis
Manfaat penelitian ini adalah untuk mengetahui data molekuler regio
core promoter dan precore/core virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3.
2. Aspek aplikatif
Analisis molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini dapat
digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai strategi replikasi,
patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi VHB terutama di Indonesia.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
4
BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
1. Virus Hepatitis B
Virus hepatitis B merupakan kelompok virus DNA dan termasuk
dalam famili Hepadnaviridae. Virus hepatitis B diklasifikasikan menjadi 8
genotipe (A-H) berdasarkan perbedaan 8% atau lebih dalam urutan
nukleotida genom intergrup atau perbedaan 4% atau lebih dalam urutan
nukleotida gen S. Genotipe A, B, C, D, E, dan F dibagi menjadi
subgenotipe masing-masing berdasarkan perbedaan 4% atau lebih dalam
urutan nukleotida intragenotipe (Kurbanov et al., 2010).
Virion VHB atau disebut juga partikel dane, memiliki struktur
seperti bola dengan diameter 42 nm. Virion terdiri dari partikel genom
(DNA) untai ganda dan kapsid yang tersusun atas protein core
nukleokapsid dengan diameter 27 nm yang disebut dengan antigen core
VHB (HBcAg) (Seeger et al., 2007). HBcAg dikelilingi oleh mantel luar
lipoprotein yang disebut antigen surface (HBsAg) (Patient et al., 2009).
Genom VHB merupakan virus DNA kecil berukuran 3,2 kb yang
terbentuk dari transkripsi balik RNA intermediate (Seeger et al., 2007).
DNA VHB memiliki untai positif dan untai negatif. Untai positif DNA
terletak di sebelah dalam, dengan panjang 2/3 dari panjang genom.
Sedangkan untai negatif merupakan untai penuh yang terletak di sebelah
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
5
luar (Seeger et al., 2007). Untai negatif menyandi empat Open Reading
Frame (ORF) yang letaknya saling tumpang tindih: ORF S untuk gen S
(surface), ORF C untuk gen C (core), ORF X untuk gen X, dan ORF P
untuk gen P (polymerase) (Liang, 2009) (Gambar 2.1). Keempat ORF
pada genom VHB dikontrol oleh empat promoter (promoter pre-S1, pre-
S2, core dan x) dan dua enhancer (Enh1 dan Enh2). Enhancer berfungsi
dalam pengaturan transkripsi RNA dan sinyal poliadenilasi yang
dibutuhkan untuk replikasi DNA (Seeger et al., 2007).
Gambar 2.1 Susunan genom VHB (genotipe A)
2. Gen Core
Gen core terdiri dari dua regio: regio precore (nukleotida 1814-
1900) dan regio core (nukleotida posisi 1901-2449) (Gambar 2.2). ORF C
merupakan penyandi HBcAg dan HBeAg, sehingga memiliki dua kodon
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
6
inisiasi untuk pembentukan dua protein yang memiliki fungsi berbeda
tersebut. Produk translasi dari kodon inisiasi yang pertama menghasilkan
protein precore/core yang merupakan prekursor dari HBeAg, sedangkan
translasi kodon inisiasi yang kedua menghasilkan HBcAg (Alexopoulou,
2009).
HBcAg atau protein core merupakan protein utama nukleokapsid
(Patient et al., 2009). Terbentuknya nukleokapsid diawali oleh ikatan
polimerase virus pada stem loop struktur yang terdapat pada 5’end RNA
pregenomic (Alexopoulou, 2009). Protein core tersusun dari 183-185 asam
amino dengan berat molekul 21 kD (Seeger et al., 2007). Produk kedua
dari gen core adalah HBeAg yang merupakan hasil translasi dari mRNA
precore di lumen retikulum endoplasma. HBeAg memiliki berat molekul
yaitu 15 kD (Seeger et al., 2007). HBeAg merupakan antigen yang
ditampilkan di permukaan hepatosit dan merupakan antigen sasaran dari
imunitas humoral tubuh, dalam hal ini anti-HBe. Sehingga, keberadaan
HBeAg penting untuk diagnosis dan eliminasi virus di dalam tubuh
(Soewignjo, 2008).
Gambar 2.2 Gen core (dengan nomor posisi nukleotida).
core
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
7
3. Regio Core Promoter
Core promoter memiliki peran yang sangat penting dalam proses
replikasi VHB, yaitu sebagai penginisiasi transkripsi untuk pembentukan
precore mRNA dan pregenomic RNA (pgRNA). Aktivitas core promoter
diatur oleh elemen enhancer II (EnII) yang terletak pada nukleotida 1685-
1773 (Alexopoulou, 2009). Core promoter tersusun atas Core Upstream
Regulatory Sequences (CURS) dan Basic Core Promoter (BCP). CURS
terbagi menjadi dua regio, yaitu regio A (nukleotida 1636-1703) dan B
(nukleotida 1704-1743), yang berfungsi menstimulasi aktivitas BCP (Yuh
et al., 1992). Regio BCP (nukleotida 1744-1851) terletak tumpang tindih
dengan 3’end gen X dan 5’end regio precore. Regio BCP memiliki elemen
cis-acting yang berfungsi mengatur reverse transcriptase pgRNA dan
precore mRNA (Alexopoulou, 2009). pgRNA berfungsi sebagai cetakan
untai negatif DNA VHB dan hasil translasinya akan membentuk protein
core (HBcAg) dan protein polimerase. Hasil translasi precore mRNA akan
membentuk HBeAg.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
8
B. Kerangka Pemikiran
Kandidat
diagnostik
Isolat VHB
Sekuensing
Kloning gen penyandi regio core promoter
dan precore/core
Analisis molekuler regio core promoter dan
precore/core
Vaksin Kandidat
diagnostik
Ekspresi mutasi pada
regio core promoter
Fokus Penelitian
Ekspresi mutasi pada
regio precore/core
Vaksin
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
9
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksploratif.
B. Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret.
C. Objek Penelitian
Objek penelitian adalah aliquot sampel HBsAg positif 09IDSKAB-3.
D. Rancangan Penelitian
+
PCR
Sekuensing
Analisis regio core promoter
dan precore/core
Isolasi DNA
Sampel darah dari Komunitas Man Sex with Man.
Tes serologi HBsAg
-
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
10
E. Instrumen Penelitian
1. Alat penelitian:
a. Centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman); b. Thermocycler
(Eppendorf, Hamburg, Jerman); c. Micropipet (P1000, P200, P10)
(Gilson, Wisconsin, USA); d. Vortex (Thermo Fisher Scientific,
Massachusetts, USA); e. Microwave (Panasonic, Osaka, Jepang); f.
Deepfreezer (New Brunswick Scientific, New Jersey, USA ); g.
Tube rack; h. Apparatus elektroforesis (chamber, comb, dan power
supply) (BioRad, California, USA); i. Gel documentation (BioRad,
California, USA); j. Autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang); k.
Refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang); l. Class II safety cabinet
(ESCO, Oregon, USA); m. Digital scale (Mettler Toledo,
Greifensee, Switzerland); n. Magnetic stirrer (Cimarex, Colorado,
USA); o. Glove; p. Masker; q. Tissue
2. Bahan penelitian:
a. 96-100% etanol; b. Sampel untuk isolasi DNA; c. Phosphate
Buffered Saline (PBS); d. Lysozyme dan lysozyme digestion buffer
(25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM EDTA, 1% Triton X-100); e. 3 M
natrium asetat (pH 5-5.5) dan 2.8 ml isopropanol; f. Tabung
microcentrifuge steril; g. Water bath atau heat blocks; h. PureLink™
Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen, California, USA); h.
Proteinase K (20 mg/ml); i. RNase A (20 mg/ml); j. GoTaq® Green
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
11
Master Mix, 2X (Promega, Wisconsin, USA); k. Nuclease-free
water; l. Ethidium Bromide (EtBr).
F. Cara kerja
1. Ekstraksi DNA VHB
Prosedur penggunaan PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit:
a. Lysate dipersiapkan.
b. Binding DNA.
1) PureLink™ spin column dipindahkan ke dalam collection tube.
2) Lysate (~640 μl) dengan lysis/binding buffer dan etanol
dimasukkan ke dalam PureLink™ spin column.
3) Column dipusingkan dengan 10.000 g selama satu menit pada suhu
ruangan.
4) Collection tube dibuang dan spin column ditempatkan ke dalam
collection tube baru.
c. Pembilasan DNA
1) Column dibilas dengan 500 μl wash buffer 1 yang disiapkan
dengan etanol.
2) Column dipusingkan pada 10.000 g selama satu menit pada suhu
ruangan. Kemudian collection tube dibuang dan ditempatkan pada
collection tube baru.
3) Column dicuci dengan menggunakan 500 μl wash buffer 2 yang
disiapkan dengan etanol.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
12
4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama tiga menit
pada suhu ruangan, kemudian collection tube dibuang.
d. Eluting DNA
1) Spin column ditempatkan di dalam 1,5 ml microcentrifuge tube
steril.
2) DNA dielusikan menggunakan 25-200 μl PureLink™ Genomic
elution buffer.
3) Column diinkubasi pada temperatur ruangan selama satu menit.
4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama satu menit
pada suhu ruangan.
2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR
Hasil ekstraksi digunakan sebagai cetakan/template untuk amplifikasi
regio core promoter dan precore/core. Proses amplifikasi dan PCR
menggunakan GoTaq® Green Master Mix.
a. GoTaq® Green Master Mix dicairkan dengan temperatur ruangan.
b. Reaksi campuran disiapkan di es.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
13
Tabel 3.1 Komponen yang digunakan dalam PCR.
Komponen Jumlah
GoTaq® Green Master Mix, 2X 12.5 μl
Upstream primer, 10μM (KL6) 1 μl
Downstream primer, 10μM (KL28) 1 μl
DNA template 5 μl
Nuclease-Free Water 20 μl
Kemudian dilakukan proses preheated pada suhu 94ºC selama 5
menit, selanjutnya dilakukan 40 kali siklus PCR yang terdiri dari :
Tabel 3.2 Tahapan, suhu, dan durasi dalam siklus PCR.
Tahapan Siklus Suhu Durasi
Denaturasi 94ºC Satu menit
Annealing 55ºC Satu menit
Ekstensi 72ºC Dua menit
Regio core promoter dan precore/core diamplifikasi dengan PCR
menggunakan primer KL-28 dan KL-6 (Okamoto et al., 1990). Hasil
dibaca pada gel agarose 2% yang dicat dengan ethidium bromide (Lusida
et al., 2008).
3. Sekuensing dan Analisis Data
Sekuens nukleotida dari hasil amplifikasi ditentukan menggunakan
Big Dye Deoxy Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems,
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
14
Foster City, CA) dan ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin Elmer). Data
sekuens yang diperoleh didaftarkan di National Center for Biotechnology
Information GenBank database dengan accession number JQ965948. Data
tersebut dibandingkan dengan data molekuler VHB di
GenBank/DDBJ/EMBL dan dianalisis menggunakan aplikasi MEGA 4.0
(Tamura et al., 2007). Multiple alignments dilakukan dengan
menggunakan metode CLUSTAL W (Lampiran 3-5). Phylogenetic tree
dibuat menggunakan metode Neighbor-Joining, Kimura Two-Parameter
dan Bootstrap 1000 Replication.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
15
BAB IV
HASIL PENELITIAN
A. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core
Untuk mendapatkan informasi dan data molekuler, isolat 09IDSKAB-3
dibandingkan dengan isolat lain di seluruh dunia yang sudah terdaftar di
dalam GenBank/DDBJ/EMBL. Isolat 09IDSKAB-3 dibandingkan dengan
reference isolates (genotipe A-H) dan isolat hasil analisis BLAST.
Isolat 091DSKAB-3 memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat
AP011085 yang berasal dari DKI Jakarta (Lampiran 2). Sedangkan reference
isolates dari genotipe A-H yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat
pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Daftar reference isolates.
No. Genotipe/
Subgenotipe
Accession
Number No.
Genotipe/
Subgenotipe
Accession
Number
1 A S50225 11 C4 AB04870
2 B1 AB010291 12 C5 AB241110
3 B2 AF 282917 13 C6 AB493841
4 B3 AB033555 14 D1 AY161157
5 B4 AY031267 15 D2 X72702
6 B5 AB219427 16 E X75657
7 B6 DQ463789 17 F X69798
8 C1 AB074756 18 G AF160501
9 C2 AF533983 19 H AY090454
10 C3 X75656
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
16
Berdasarkan sekuens nukleotida regio core promoter dan precore/core,
isolat 09IDSKAB-3 dapat dikategorikan dalam VHB genotipe B dan
subgenotipe B3. Hal tersebut dapat dilihat dalam phylogenetic tree pada
gambar 4.1.
Gambar 4.1 Phylogenetic tree, berdasarkan sekuens nukleotida regio core
promoter dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 dibandingkan
dengan reference isolates genotipe A-H.
Keterangan: : Isolat sampel. : Isolat hasil analisis BLAST.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
17
Analisis isolat 09IDSKAB-3 juga dilakukan pada tingkat asam amino
dan nukleotida. Hal ini diperlukan untuk mengetahui variasi genetik yang
terdapat pada regio core promoter dan precore/core dari isolat tersebut. Hasil
dari multiple alignment pada regio core promoter, precore dan core dapat
dilihat pada gambar 4.2-4.4.
Gambar 4.2 Hasil multiple alignment regio core promoter VHB isolat
09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences (aa
80-146).
Gambar 4.3 Hasil multiple alignment regio precore pada VHB isolat
09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences
yang memiliki genotipe sama (aa 1-29).
Gambar 4.4 Hasil multiple alignment regio core pada VHB isolat
09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences (aa
30-53).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
18
B. Variasi Genetik Regio Core Promoter dan Precore/Core
Berdasarkan hasil multiple alignment isolat 09IDSKAB-3 dengan
reference isolate (isolat AB033555), pada regio core promoter ditemukan
adanya subtitusi basa nukleotida 1726 dari adenine menjadi cytosine
(A1726C). Variasi genetik ini menyebabkan perubahan kodon 118 sehingga
asam amino aspargine berubah menjadi threonine (N118T).
Pada regio precore ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1860
dari thymine menjadi cytosine (T1860C). Variasi ini menyebabkan perubahan
kodon 16 dari asam amino isoleusine menjadi threonine (I16T). Selain itu
ditemukan pula subtitusi basa cytosine menjadi thymine pada nukleotida 1877
(C1877T) pada regio precore. Namun, subtitusi ini tidak menyebabkan
perubahan asam amino pada isolat sampel (silent mutation).
Pada regio core ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1957 dari
guanine menjadi cytosine (G1957C). Variasi genetik ini menyebabkan
perubahan kodon 48 sehingga asam amino leusine berubah menjadi
phenylalanine (L48F).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
19
BAB V
PEMBAHASAN
Berdasarkan phylogenetic tree, sekuens nukleotida regio core promoter
dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 dapat dikategorikan dalam VHB
genotipe B dan subgenotipe B3.
Berdasarkan hasil analisis BLAST, isolat 09IDSKAB-3 memiliki
kemiripan sekuens nukleotida tertinggi dengan isolat AP011085. Isolat
AP011085 merupakan isolat yang berasal dari DKI Jakarta yang juga
dikategorikan dalam VHB genotipe B dan subgenotipe B3. Menurut
Mulyanto et al. (2009) VHB genotipe B subgenotipe B3 merupakan genotipe
yang berasal dari Indonesia. Hingga saat ini belum ada laporan yang
menyatakan adanya penemuan VHB genotipe B subgenotipe B3 di negara
lain selain di Indonesia. Lusida et al. (2008) dalam penelitiannya mengenai
distribusi genotipe dan subgenotipe VHB di Indonesia, mengemukakan
bahwa ternyata VHB genotipe B merupakan kelompok genotipe yang
terdistribusi dominan di wilayah barat Indonesia (Jawa dan Sumatera),
sedangkan yang terdistribusi dominan di wilayah timur Indonesia (Papua)
adalah kelompok genotipe C dan D. Hal tersebut sesuai dengan hasil
penelitian ini, bahwa isolat 09IDSKAB-3 yang berasal dari Jawa Tengah
termasuk dalam kategori VHB genotipe B subgenotipe B3.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
20
A. Regio Core Promoter Isolat 09IDSKAB-3
Core promoter memiliki peran yang sangat penting dalam proses
replikasi VHB, yaitu sebagai penginisiasi transkripsi untuk pembentukan
precore mRNA dan pregenomic RNA (pgRNA). Aktivitas core promoter
diatur oleh elemen enhancer II (EnII) yang terletak pada nukleotida 1685-
1773 (Alexopoulou, 2009). Core promoter tersusun atas Core Upstream
Regulatory Sequences (CURS) dan Basic Core Promoter (BCP). CURS
terbagi menjadi dua regio, yaitu regio A (nukleotida 1636-1703) dan B
(nukleotida 1704-1743), yang berfungsi menstimulasi aktivitas BCP. Regio
BCP (nukleotida 1744-1851) terletak tumpang tindih dengan 3’ end gen X
dan 5’ end regio precore (Yuh et al., 1992). Regio BCP memiliki elemen cis-
acting yang berfungsi mengatur reverse transcriptase pgRNA dan precore
mRNA (Alexopoulou, 2009). pgRNA berfungsi sebagai cetakan untai negatif
DNA VHB dan hasil translasinya akan membentuk protein core (HBcAg) dan
protein polimerase, sedangkan hasil translasi precore mRNA akan
membentuk HBeAg. Oleh sebab itu, mutasi yang terjadi pada regio core
promoter dapat menyebabkan dampak klinis terhadap sel penjamu karena
terjadi perubahan transkripsi precore mRNA dan pgRNA VHB (Tatsukawa et
al., 2011).
Mutasi yang sering terjadi pada regio core promoter adalah mutasi
ganda A1762T/G1764A pada BCP. Mutasi A1762T menyebabkan perubahan
kodon 130 sehingga asam amino lysine berubah menjadi methionine
(K130M), sedangkan mutasi G1764A menyebabkan perubahan kodon 131
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
21
sehingga asam amino valine berubah menjadi isoleusine (V131I) (Juniastuti
et al., 2010). Pengaruh biologis mutasi ganda VHB masih belum diketahui,
tetapi mutasi tersebut sering ditemukan pada berbagai macam keadaan infeksi
VHB. Hingga saat ini pengaruh yang sudah jelas diketahui adalah penurunan
produksi HBeAg dan peningkatan replikasi virus (Buckwold et al., 1996; Li
et al., 1999). Penurunan produksi HBeAg disebabkan penurunan produksi
precore mRNA, yang di sisi lain ternyata menyebabkan peningkatan produksi
pgRNA, proses enkapsidasi, dan protein core yang akan mengakibatkan
peningkatan replikasi virus. Beberapa penelitian melaporkan mutasi ganda ini
dapat menyebabkan terjadinya status HBeAg negatif (Horikita et al., 1994;
Hou et al., 1999; Okamoto et al., 1994). Ditinjau dari manifestasi klinis,
mutasi ini ditemukan secara signifikan pada pasien hepatitis B kronis,
hepatitis fulminan, dan karsinoma hepatoseluler (Baumert et al., 1996;
Buckwold et al., 1996).
Hasil analisis pada isolat 09IDSKAB-3 tidak ditemukan adanya mutasi
ganda BCP, sehingga faktor risiko isolat 09IDSKAB-3 terhadap hepatitis B
kronis, hepatitis fulminan, dan karsinoma hepatoseluler maupun terkait
dengan status HBeAg negatif tidak ada.
Mutasi yang ditemukan pada isolat 09IDSKAB-3 adalah mutasi
A1726C yang menyebabkan perubahan asam amino aspargine menjadi
threonine (N118T). Nukleotida 1726 terletak pada CURS, sehingga mutasi
ini mungkin akan menyebabkan terganggunya aktivitas BCP yang berdampak
pada gangguan proses replikasi virus. Menurut penelitian Yin et al. (2011)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
22
mutasi A1726C spesifik ditemukan pada keadaan klinis sirosis hepatis,
sehingga isolat 09IDSKAB-3 kemungkinan memiliki faktor risiko terhadap
sirosis hepatis dan mengalami perubahan pada proses replikasinya.
B. Regio Precore/Core (Gen Core) Isolat 09IDSKAB-3
Regio precore/core memiliki dua start codon yang menginisiasi
pembentukan dua protein yang berbeda. Inisiasi AUG (start codon) yang
pertama akan membentuk protein protein precore/core yang merupakan
prekursor HBeAg, sedangkan yang kedua akan membentuk protein core
(HBcAg) (Alexopoulou, 2009).
HBeAg merupakan protein VHB yang beredar di dalam darah dan
diproduksi ketika virus dalam fase replikasi, sedangkan HBcAg merupakan
protein penyusun nukleokapsid virus (Liang, 2009). Dalam pembentukan
virion VHB, protein core akan menyelubungi pgRNA dan polimerase yang
dikenal sebagai proses enkapsidasi. Proses enkapsidasi diinisiasi penempelan
polimerase pada sinyal enkapsidasi (ε), yaitu sebuah struktur berbentuk stem
loop yang terletak pada ujung 5’ pgRNA. Selain berfungsi dalam pengepakan
pgRNA, sinyal enkapsidasi berperan dalam menginisisasi proses transkripsi
(Alexopoulou, 2009).
Mutasi regio precore/core yang paling sering ditemukan dan dilaporkan
adalah mutasi G1896A. Mutasi ini menyebabkan perubahan asam amino
tryptophan menjadi stop codon sehingga terjadi kegagalan pembentukan
HBeAg (Okamoto et al., 1990). HBeAg tidak memiliki peran penting dalam
proses replikasi virus, tetapi diyakini bahwa HBeAg merupakan target
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
23
imunitas humoral dan seluler, sehingga kegagalan pembentukan HBeAg
menyebabkan terbentuknya escape mutant yang berkontribusi terhadap
persistensi virus (Carman et al., 1993; Soewignjo, 2008). Mutagenesis dari
wild type menjadi mutan G1896A membutuhkan waktu beberapa tahun dan
prosesnya terjadi selama fase replikasi virus (Okamoto et al., 1990). Mutasi
ini dikaitkan dengan banyak kondisi klinis hepatitis, dari tingkatan ringan
hingga berat (Friedt et al.,1999; Juniastuti et al., 2010; Kao et al., 2000).
Kramvis dan Kew (2005) menyatakan bahwa faktor yang berkontribusi
terhadap frekuensi terjadinya mutasi ini adalah genotipe virus. Mutasi
G1896A dilaporkan hanya ditemukan pada pasien VHB dengan genotipe B,
D, E serta sebagian kecil genotipe C dan F. Genotipe tersebut memiliki basa
thymine pada nukleotida 1858 yang merupakan pasangan nukleotida 1896
pada stem loop pgRNA. Ikatan basa thymine-guanine yang tidak stabil,
memudahkan terjadinya mutasi yang membentuk ikatan basa thymine-
adenine yang lebih stabil yang dibutuhkan untuk membentuk sinyal
enkapsidasi yang lebih kuat. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar 5.1
(Alexopoulou, 2009).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
24
Gambar 5.1 Stem loop structure, perubahan ikatan T-G menjadi T-A
dibutuhkan untuk membentuk sinyal enkapsidasi yang lebih
kuat (Alexopoulou, 2009).
Mutasi lain regio precore yang menyebabkan hilangnya produksi
HBeAg adalah T1815C dan A1846T (Okamoto et al., 1990). Mutasi T1815C
menyebabkan hilangnya start codon karena asam amino methionine berubah
menjadi threonine. Mutasi A1846T tidak menyebabkan perubahan asam
amino (silent mutation). Namun demikian, Chen et al. (2006) dalam
penelitiannya menyatakan bahwa mutasi ini signifikan ditemukan pada pasien
dengan status HBeAg negatif.
Mutasi G1896A, T1815C, dan A1846T tidak ditemukan dalam
penelitian ini. Variasi nukleotida yang ditemukan pada regio precore adalah
subtitusi basa nukleotida 1860 dari thymine menjadi cytosine (T1860C) dan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
25
silent mutation C1877T. Subtitusi T1860C mungkin akan mengganggu proses
pembentukan HBeAg karena nukleotida 1860 terletak pada regio precore
yang hasil translasi akhirnya membetuk HBeAg. Sedangkan pada regio core
ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1957 dari guanine menjadi
cytosine (G1957C). Subtitusi ini mungkin akan mempengaruhi komposisi
nukleokapsid virus karena nukleotida 1957 terletak pada regio core yang
translasi akhirnya membentuk HBcAg.
Hingga saat ini belum ada penelitian yang melaporkan manifestasi dari
mutasi yang ditemukan pada regio precore/core isolat 09IDSKAB-3. Namun
ditinjau dari tidak ditemukannya mutasi G1896A, T1815C, dan A1846T
kemungkinan isolat 09IDSKAB-3 tidak terkait dengan status HBeAg negatif.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
26
BAB VI
PENUTUP
A. Simpulan
Berdasarkan regio core promoter dan precore/core, isolat
09IDSKAB-3 termasuk ke dalam kategori VHB genotipe B dan
subgenotipe B3. Sedangkan berdasarkan analisis BLAST, isolat
09IDSKAB-3 memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat AP11085
yang berasal dari DKI Jakarta dengan genotipe B subgenotipe B3.
Mutasi yang terjadi pada isolat 09IDSKAB-3 mungkin mempengaruhi
proses replikasi serta produksi HBcAg dan HBeAg virus.
B. Saran
Diperlukan penelitian lebih lanjut pada seluruh genom VHB untuk
mengetahui implikasi dari variasi nukeotida maupun asam amino isolat
09IDSKAB-3, terutama yang terkait dengan virulensi, replikasi,
patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi.
top related