bahan kuliah ivf 2013(1)

• Definisi in vitro fertilisasiIn vitro Fertilisasi (IVF) merupakan teknologi reproduksi yang bertujuan membantu proses reproduksi dengan cara mempertemukan spermatozoa dengan oosit, sehingga memungkinkan terjadinya konsepsi diluar tubuh induk atau dalam didalam tabung yang dilengkapi dengan medium kultur

Kebutuhan embrio untuk Transfer embrio yang terbatas

Mengapa IVF itu diperlukanKebutuhan embrio untuk Transfer

embrio yang terbatasBiaya yang terlalu mahal bila

produksi embrio dengan induk donor atau superovulasi

Sebagai terafi gangguan in fertilitas baik pada jantan maupun betina

MANFAAT APLIKASI IVF

• Teknologi IVF dapat meningkatkan daya reproduksi sapi betina, baik semasa maupun setelah habis masa produksinya (diafkir).

• Teknologi IVF dapat memproduksi embrio dalam jumlah besar dengan biaya yang relatif murah

• Teknologi IVF dapat mendorong pengaplikasian teknologi transfer embrio (TE) secara ekstensif pada perusahaan-perusahaan peternakan maju/komersial.

TUJUAN APLIKASI IN VITRO FERTILISASI

• PADA TERNAK– UNTUK MENDAPATKAN EMBRIO

DALAM JUMLAH YANG BANYAK, MURAH DAN SERAGAM

– MENDUKUNG APLIKASI TEKNOLOGI TRANSFER EMBRIO

• PADA MANUSIA– MEMBANTU PASANGAN SUAMI ISTRI

YANG TIDAK MEMPUNYAI ANAK AKIBAT PENYAKIT TERTENTU;

• INFERTILITAS• TERSUMBATNYA SALURAN TUBA FALLOPII

Melalui Teknologi IVF dapat dikembangkan berbagai teknik mikromanipulasi pada embrio

seperti ;

– teknik cloning atau splitting untuk memproduksi anak-anak sapi kembar identik

– teknik rekayasa genetik, seperti teknik transfer gen untuk memproduksi sapi transgenik atau khimera

– pengembangan penelitian-penelitian dasar dan terapan lainnya.

POTENSI TEKNOLOGI FERTILISASI IN VITRO PADA

TERNAK SAPI

• untuk meningkatkan produksi daging (sapi potong)

• untuk meningkatkan produktivitas susu pada sapi perah.

• untuk mengembangkan teknik-teknik mikromanipulasi pada embrio seperti teknik cloning/splitting untuk menghasilkan anak sapi kembar identik, dan lainnya.

SEJARAH PERKEMBANGAN IVF

Sreenan (1970) Salah satu Peneliti I FIV pada Sapi penggunakan yang mengandung enzim amilase

Iritani dan Niwa (1977)

Berhasil memperoleh kelahiran anak sapi pertama dari embrio hasil fertilisasi oosit yang diperoleh dari RPH

Brackett et al., (1981)

Berhasil memperoleh kelahiran anak sapi pertama dari embrio hasil fertilisasi oosit yang diperoleh dari RPH

Brackett et al., (1983)

Berhasil memperoleh kelahiran anak sapi kembar 2 dari embrio hasil fertilisasi oosit yang diperoleh dari RPH

Lambert et al., (1983)

Berhasil memperoleh kelahiran 6 ekor anak sapi dari embrio hasil fertilisasi oosit yang diperoleh dari RPH

TAHAPAN PROSES FERTILISASI IN VITRO

Tahap I : Koleksi Oosit dari Ovarium

Tahap II : Maturasi Oosit in vitro atau in vitro maturation (IVM)

Tahap III : Pencucian dan Kapasitasi

Spermatozoa Tahap IV : Fertilisasi in vitroTahap V : Kultur Embrio in vitro

1.KOLEKSI OOSIT DARI OVARIUM

• Koleksi atau pengambilan oosit dari ovarium merupakan hal yang sangat penting dalam pelaksanaan program FIV.

• Oosit untuk IVF dapat diperoleh melalui;– Melalui metode bedah atau laparoscopy

pada hewan hidup– Donor hidup dengan teknik Ovum pick

up (OPU)– Ovarium dari Rumah Potong Hewan

FAKTOR YANG MEMPENGARUH KUALITAS OOSIT

• Umur induk• Siklus birahi• Bangsa (Spesies)• Nutrisi dan Produksi Susu• Status Kebuntingan • Tehnik Koleksi Oosit

– Aspirasi (Penyedotan)– Diseksi Ovarium– Slicing (Penyayatan) Ovarium

• Media Koleksi Oosit – PBSD; OWS ;TCM 199 dan

Wittingham• Ukuran Follikel ( 2 – 6 mm >> 7

mm)• Waktu Koleksi

UMUR DAN SIKLUS ESTRUS

• Induk sapi yang lebih muda (berumur satu sampai tiga tahun) menghasilkan jumlah blastosis hasil FIV yang lebih tinggi dibandingkan dengan induk sapi yang berumur lebih tua

• jumlah oosit dengan kualitas baik lebih tinggi pada ovaria induk sapi dibandingkan dengan ovaria sapi dara

• Oosit yang diambil dari ovaria sapi pada hari 14 sampai 16 siklus estrus mempunyai potensi perkembangan yang lebih tinggi dari pada oosit yang diambil pada hari ketujuh sampai kesembilan atau fase siklus estrus

Bangsa, Nutrisi dan Variasi Individu

• Sapi-sapi bangsa persilangan Charoiais, Limousin dan Simmental mempunyai jumlah folikel antral yang lebih rendah dibandingkan dengan sapi-sapi persilangan Hereford

• Perbedaan kandungan protein kasar dalam pakan yang sangat besar dapat mempengaruhi perkembangan folikel dan perkembangan embrio taraf selanjutnya

• variasi jumlah embrio yang dihasilkan melalui teknik FIV sebanding dengan variasi jumlah embrio yang dihasilkan melalui perlakuan-perlakuan superovulasi pada sapi

METODE KOLEKSI OOSIT DARI FOLIKEL OVARIUM

• Aspirasi (Penyedotan) – Pengambilan oosit dari folikel vesikuler yang

berdiameter 2 - 6 mm dengan teknik aspirasi biasanya menggunakan pipet atau siringe dan jarum yang sesuai ukuran tertentu ( 18 – 21 G),

• Diseksi Ovarium• Pengambilan oosit dari folikel vesikuler dengan

merusak follikel ovarium.

• Slicing (Penyayatan) Ovarium– Pengambilan oosit dari folikel vesikuler dengan

cara menyayat ovarium dengan scalpel ,

MEDIA KOLEKSI OOSIT

• PBSD (Phosphat Buffer Saline Dubelcus)• TCM 199 (Tissue Culture Medium 199)• OWS (Oocyte Washing Solution) • Whittingham T6

KLAS KRITERIA MORFOLOGI

A Oosit dikelilingi oleh multi lapisan kumulus yang kompak, ooplasma homogen, kompleks oosit-kumulus (KOK) secara keseluruhan terlihat terang da transparan;

B osit dikelilingi oleh multi lapisan kumulus yang kompak, ooplasma homogen tetapi dengan penampilan yang kasar, daerah pinggiran oosit yang lebih gelap dan KOK secara keseluruhan terlihat lebih gelap dan kurang transparan;

C Oosit dikelilingi oleh sel-sel kumulus yang kurang kompak, ooplasma tidak beraturan dengan bercak-bercak hitam dan KOK lebih gelap lagi dari klasifikasi (1) dan (2);

D Sel-sel kumulus yang mengelilingi oosit mengembang, sel-sel kumulus terpencar-pencar membentuk gumpalan-gumpalan gelap yang kental, ooplasma tidak teratur membentuk gumpalan-gumpalan berwarm gelap dan KOK secara keseluruhan menghitam dan tidak teratur.

KLASIFIKASI KUALITAS OOSIT BELUM MATANG (MATURE)

Sumber : Leibfried dan First (1979)

2. PEMATANGAN OOSIT IN VITRO (in vitro

Maturation/IVM) Pematangan atau pendewasaan oosit yang

dilakukan diluar tubuh induk atau dalam media kultur

Pematangan Oosit ditandai dengan perubahan inti disertai dengan perubahan sitoplasma

proses pembelahan inti secara meiosis

fase Germinal Vesicle breakdown (GVBD) – GV - Metafase I- Anafase I - Telofase I – Interfase – profase II – Metafase II

Dr. drh. Dasrul, M.Si, FKH-Unsyiah 2010

FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PEMATANGAN OOSIT IN VITRO

Media dan Komposisi media TCM 199 : Ham’s F-10 dan D-PBS Suplementasi : Protein ; Serum (BSA, ECS, Serum

ovulasi); Glukosa; Hormon (Estrogen, PMSG, LH, FSH )

Kualitas Oosit Oosit kumulus kompleks >> Oosit kumulus

sebagian

Lama waktu inkubasi Sapi : 18 – 24 jam (rataan 22 jam) Kambing : 18 – 28 jam (rataan 24 jam) Kerbau : 20 – 26 jam

Dr. drh. Dasrul, M.Si, FKH-Unsyiah 2006

Suplementasi Serum dalam media pematangan

• Serum foetus sapi• Serum anak sapi• Serum estrus• Serum pre ovulasi

Suplemetasi Hormon dalam media pematangan

• LH dan FSH• PMSG • Estrogen • IGF, TGF dan EGF

Dr. drh. Dasrul, M.Si, FKH-Unsyiah 2006

A. Pencucian Sperma

Suatu proses pemisahan spermatozoa motil dengan spermatozoa im-motil, leukosit, bakteri dan partikel-pertikel yang bersifat toksik terhadap kehidupan spermatozoa

Tujuan Pencucian Spermatozoa untuk mendapatkan spermatozoa yang

baik dan motil meningkatkan daya fertilitas spermatozoa

untuk menghilangkan krioprotektan (Bila memakai semen beku)

3. PENCUCIAN DAN KAPASITASI SPERMATOZOA

Tehnik Pencucian ;1. Sentrifugasi media isotonis2. Sentrifugasi gradien densitas percoll 3. Sedimentasi Sephadeks4. Swim up (renang ke atas)5. Side migration6. Glass woll filtration

Media Pencucian Spermatozoa;- BO (Brackett-Oliphant) + Heparin +

Caffein- Modified Tyrodes (TALP)- EBSS (Earle’s Balance Salt Solution)- BWW (Buffer Whashing- Hank - dll

B. Kapasitasi Spermatozoa

• Adalah proses perubahan fisiologis dan kimiawi pada permukaan membran spermatozoa untuk mempertinggi kemampuan spermatozoa membuahi sel telur.

Medium untuk Kapasitasi Spermatozoa- BO (Brackett-Oliphant) + Heparin +

Caffein- Modified Tyrodes (TALP)- EBSS (Earle’s Balance Salt Solution) +

Calsium- Hank

Perubahan pada Spermatozoa saat kapasitasi

Fluiditas membran plasma spermatozoa Perubahan lipid dan fosfolipid membran plasma Metabolisme sel Spermatozoa Hiperaktivasi

sperma Konsentrasi ion intraselluler Aktivitas adenilsiklase Peningkatan fosforilasi protein kinase

4. FERTILISASI4. FERTILISASI

Proses penggabungan yang kompleks antara sel gamet jantan (spermatozoa) dengan sel gamet betina (ovum) sehingga terbentuk zigot dan dilanjutkan dengan pembelahan dan perkembangan embrio yang terjadi diluar tubuh induk betina atau didalam media in vitro.

Fusi Spermatozoa dengan Sel telur ( Ovum) Reaksi akrosom Penetrasi spermatozoa pada Zona

pellusida Kondensasi kepala spermatozoa dalam sel

telur Pembentukan pronukles jantan dan betina Penyatuan pronukleus jantan dan betina

(Singami) Pembentukan Zigot dan Pembelahan embrio

Tahapan Proses Fertilisasi

Media Kultur

TCM 199; CR1; SOF; MEM

Supplementasi Serum dalam medium biakan

ECS; OCS;

Suplementasi Ko-kultur sel somatik dalam medium biakan

Sel Kumulus; Fibroblas dan Cell line

Growth Factor (IGF; TGF dan EGF)

Pengaruh Sistim Inkubasi

FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KULTUR EMBRIO

IN VITRO

Peralatan untuk IVF• Peralatan Utama (Mayor Equitment)

– Incubator CO2; Mikroskop; Bilik steril (laminar Air Flow)

• Peralatan Penunjang– Meja Penghangat; Penangas air (water bath);

Pengaduk Magnetik; sentrifuge; Refreegerator; Timbangan analitik; Osmometer; pH meter; Fasilitas steril; Heating Block; Peralatan gelas; Pipet; Peralatan aspirasi

• Peralatan Operasional Rutin– Persediaan sterilisasi; Vorteks; Pompa vakum;

Peralatan analisis semen; deterjen dan peralatan disvosible lainya