aktivitas antikanker pada bakteri endofit dari daun pepaya
Post on 08-Dec-2015
245 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
ISOLASI BAKTERI ENDOFIT DAN UJI AKTIVITAS ANTIKANKER
DARI DAUN PEPAYA (Carica papaya L) TERHADAP
SEL KANKER PAYUDARA T47D
OUTLINE PENELITIAN TUGAS RISET
Disusun oleh :
Qisthy Hanifati Hazrina
NIM 24030111130066
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
November, 2014
HALAMAN PENGESAHAN OUTLINE PENELITIAN
1. a. Judul Penelitian
b. Bidang Ilmu
:
:
Isolasi Bakteri Endofit dan Uji Aktivitas
Antikanker dari Daun Pepaya (Carica Papaya L)
terhadap Sel Kanker Payudara T47D
Biokimia2. Pelaksana Penelitian
a. Nama Lengkapb. Jenis Kelaminc. NIMd. Fakultas/Jurusan
::::
Qisthy Hanifati HazrinaPerempuan24030111130066Sains dan Matematika/Kimia
3. Lokasi Penelitian : Laboratorium Terpadu4. Lama Penelitian : 6 Bulan5. Tanggal Seminar : 28 November 2014
Semarang, 15 Desember 2014 Menyetujui,
Pembimbing I
Purbowatiningrum Ria S . , M.Si NIP 197303141999032002
Pembimbing II,
Dra. Nies S. Mulyani, M.SNIP 195705181986022001
Mengetahui,Koordinator TR Jurusan,
Didik Set i yo Widodo, M.Si NIP 197005211999031001
Kepala Laboratorium,
Dra. Wuryanti, M.SiNIP 195705111987032001
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
Setiap tahun terdapat 100 penderita kanker baru dari 100.000 penduduk di
Indonesia. Kanker merupakan segolongan penyakit yang ditandai dengan
pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk
menyerang jaringan biologis lainnya yang bersebelahan (invasi) atau dengan
migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis) (Krishna dan Hayasi, 2000).
Manajemen kanker umumnya menggabungkan pembedahan dan radiasi dengan
pengobatan kemoterapi (Katzung,1995).
Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber obat-obatan kemoterapi
yang potensial. Banyak tanaman Indonesia yang saat ini telah digunakan secara
luas untuk berbagai tujuan pengobatan, selain dikonsumsi sebagai sayur. Salah
satunya adalah daun pepaya (Carica papaya L) yang termasuk ke dalam suku
Caricaceae dan marga Carica. Ekstrak akuades dari daun pepaya menunjukkan
kemampuan aktivitas antikanker dan menghambat perkembangbiakan sel pada
kanker (Moritomo, 2008). Daun pepaya mengandung metabolit sekunder jenis
alkaloid, pseudokarpen kolin, karposida, dan dehidrokarpen (Sheikh dan
Krishnamurthy, 2013). Penelitian Sukardiman 2000 menunjukkan bahwa ekstrak
metanol daun pepaya (Carica papaya L) memiliki aktivitas inhibisi terhadap
enzim DNA Topoisomerase II, yaitu suatu enzim yang berperan penting dalam
proses replikasi, transkripsi, rekombinasi DNA, dan poliferasi dari sel kanker.
Meningkatnya jumlah dan aktivitas enzim tersebut pada sel kanker maka proses
replikasi, transkripsi, dan poliferasi sel kanker juga meningkat, kemudian
menghambat aktivitas enzim tersebut menyebabkan ikatan antara enzim dengan
DNA semakin lama sehingga terjadi Protein Linked DNA Brake (PLDB) dan
kematian secara apoptosis (Hsiag, 1998; Cotran, 1998).
Metabolit sekunder alkaloid dapat di isolasi dari tumbuhan maupun
mikroba endofit yang bersimbiosis dengan tumbuhan pepaya (Dian dkk, 2006).
Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman, diantara sel
tumbuhan dan bersimbiosis mutualisme dengan inangnya (Kumala dkk, 2006).
Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai
dengan tanaman inangnya merupakan peluang besar yang dapat diandalkan untuk
memproduksi metabolit sekunder skala besar. Pemanfaatan mikroba endofit
dalam memproduksi senyawa aktif memiliki beberapa kelebihan, antara lain (1)
lebih cepat menghasilkan senyawa dengan mutu yang seragam, (2) dapat
diproduksi dalam skala besar dan (3) kemungkinan diperoleh komponen bioaktif
baru dengan memberikan kondisi yang berbeda (Stierle et al, 1995). Penelitian ini
diharapkan dapat memperoleh data aktivitas antikanker dari metabolit sekunder
yang dihasilkan bakteri endofit asal daun pepaya (Carica papaya L) terhadap
kanker payudara T47D.
1.2. Keaslian Penelitian
Beberapa peneliti sebelumnya telah melakukan uji aktivitas antikanker
dari daun pepaya (Carica Papaya L) diantaranya penelitian yang dilakukan oleh
Sukardiman pada tahun 2006 menguji ekstrak kloroform daun pepaya (Carica
Papaya L) menunjukkan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas antikanker
terhadap sel mieloma (Sukardiman, 2006).
Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah ekstrak
yang diuji menggunakan metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit yang di
isolasi dari daun pepaya, dilanjutkan menguji aktivitas antikankernya terhadap sel
kanker payudara T47D.
II. Perumusan Masalah
Carica Papaya L merupakan tanaman yang memiliki banyak kegunaan.
Sukardiman et al, 2006 meneliti bahwa ekstrak kloroform daun pepaya
mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel kanker mieloma. Oleh karena itu
pada penelitian ini akan dilakukan pengujian aktivitas antikanker menggunakan
metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit yang di isolasi dari daun pepaya
(Carica Papaya L) terhadap sel kanker payudara T47D.
III. Tujuan Penelitian
III.1. Memperoleh isolat bakteri endofit yang bersimbiosis dengan tanaman
pepaya (Carica Papaya L).
III.2.Memperoleh metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit.
III.3.Memperoleh data kualitatif penapisan fitokimia senyawa metabolit sekunder
hasil produksi bakteri endofit daun pepaya (Carica Papaya L).
III.4.Memperoleh data aktivitas antikanker dari metabolit sekunder hasil produksi
bakteri endofit daun pepaya (Carica Papaya L) terhadap sel kanker
payudara T47D melalui melalui metode apoptosis (Staining Double).
IV.Metode Penelitian
Pada penelitian ini bahan yang dibutuhkan adalah sampel daun pepaya
(Carica Papaya L). Media miikrobiologi yang digunakan adalah media PDA
(Potato Dextrose Agar). Bahan sterilisasi yang digunakan adalah alkohol 70% dan
Kaporit teknis. Pewarna gram yang digunakan adalah kristal violet, lugol, iodin,
alkohol aseton, safranin. Reagen dan bahan kimia untuk uji fitokimia yang
digunakan adalah amonia 25%, kloroform, asam klorida, amil-alkohol, natrium
hidroksida, FeCl 1%, eter, asam sulfat, asam asetat anhidrat, reagen dragendorff,
pereaksi mayer, serbuk Mg. Bahan yang digunakan untuk uji BSLT adalah telur
udang, air laut, DMSO. Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antikanker
adalah larutan baku sel kanker payudara T47D, MK (DMEM/RPMI), PBS, tripsin
EDTA dan DMSO.
Alat yang digunakan adalah sumuran-24, inkubator, shaker, inkas,
Spektrofotometer UV, sentrifuge, autoklaf dan alat-alat standar laboratorium.
Tahapan yang dilakukan pada penelitian ini yaitu, antara lain
Preparasi dan Sterilisasi Sampel : Sampel disterilisasi permukaannya dengan
cara direndam dalam akuades steril, alkohol 70%, dicuci dengan akuades steril
kemudian direndam dalam CaOCl 5,25% dan dibilas dengan akuades steril. Daun
pepaya yang telah steril kemudian ditumbuk untuk mendapatkan ekstraknya.
Isolasi Bakteri Endofit : Ekstrak daun pepaya ditanam pada permukaan media
PDA secara aseptik dan diiinkubasi pada suhu ruang selama tiga hari. Koloni
bakteri yang umbuh kemudian dipisahkan menurut kenampakan morfologisnya
dengan pewarnaan gram.
Pewarnaan Gram : Isolat bakteri endofit di suspensi ke dalam akuades steril,
dioleskan pada kaca steril dan ditetesi pewarana kristal violet, lugol iodin, alkohol
aseton dan safranin. Isolat bakteri yang telah dipisahkan selanjutnya di ukur
pertumbuhannya untuk menentukann waktu panennya.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan : Isolat bakteri di inokulasi ke dalam akuades
steril, kemudian dipindahkan dalam Nutrient Brooth (NB), dibagi ke dalam
beberapa botol vial dan disimpan dalam inkubator suhu kamar. Jumlah sel bakteri
dihitung setiap beberapa jam per satu botol vial dengan mengamati kekeruhannya
menggunakan alat spektrofotometer. Jumlah sel kemudian dibuat kurva
pertumbuhan bakteri untuk dipanen pada saat fase akhir stasionernya.
Produksi Metabolit Sekunder : Isolat bakteri endofit diinokulasi pada Nutrient
Brooth (NB) dan di vibrate incubation pada suhu ruang dengan kecepatan 75 rpm
selama 7 hari. Setelah didapatkan kultur isolat bakteri endofit, di sentrifuge pada
suhu 40C selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Setelah didapatkan
supernatan, di freeze dry dan diperoleh metabolit sekunder padat.
Penapisan Fitokimia : Uji kualitatif senyawa Alkaloid, Saponin, Flavonoid,
Kuinon, Tanin dan Steroid/Triterpenoid dilakukan sesuai prosedur di
Laboratorium Terpadu Undip.
Uji BSLT : Metode yang digunakan adalah metode Meyer. Air laut dituangkan
dalam plat, kemudian dimasukkan telur udang dan diletakkan dibawah lampu UV.
Setelah 48 jam telur menetas menjadi larva. Larva dimasukkan ke dalam larutan
baku sampel dan ditentukan konsentrasi letalitas terbaiknya. Ekstrak aktif dengan
nilai LC50 terbaik siap digunakan untuk uji antikanker.
Uji Aktivitas Antikanker : Kultur sel hasil pembiakan di panen kemudian di
inkubasi dalam sumuran-24. Sel yang tertanam dalam sumuran di cuci dengan
PBS dan dimasukkan sampel stok metabolit sekunder dengan beberapa variasi
konsentrasi, penambahan media, DMSO, dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah
10 jam, sel dicuci dengan PBS pada masing-masing cover slip dan ditetesi etidium
bromida-etidin orange. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan uji
positif sel kanker berwarna hijau dan sel apoptosis berwarna orange.
V.DAFTAR PUSTAKA
Cotran RS, Kumar V, Collin T. 1999. Neoplasia in Robbins Pathologic Basic of
Disease, Sixth Edition, Philadelphia : W.B.Saunders Company, pp 260-
325.
Dian, N., Ruth, M., Apridah, C., Harmastini, S., 2006. Pengkajian Bakteri Endofit
Penghasil Senyawa Bioaktif untuk Proteksi Tanaman. Biodiversitas. Vol.
7, No. 3. Hal 221-224.
Hsiang, Y.H. 1989. Arrest of Replication Fork by Drug-stabilized Topoisomerase
I-DNA Cleavable Complexes as a Mechanism of Cell Killing by
Campthothecin, Cancer Research, 49, 5077-5082.
Katzung, B.G., 1995. Basic and Clinical Pharmacology, 7th edition, Prentice Hall
International, pp. 881.
Krishna, G., Hayasi, M., 2000. In Vivo Rodent Micronucleus Assay : Protocol,
Conduct and Data Interpretation. Journal of Elsevier Science. Vol. 455.
Pages 155-166.
Kumala, S., Utji R., Sudarmono P., Kardono L., B.S., 2006. Isolation of
Endophye from Brucea Javanica L (Merr) and Cytotoxic Evaluation of
their n-butanol from Fermentation Broth. Pakistan Journal of Biologycal
Science Vol. 9, No.5, 825-832.
Moritomo, C., Dang, N. H., Dang, N., 2008. Cancer Prevention and Treating
Composition for Preventing, Ameliorating, or Treating Solid Cancers, e.g.
Lung, or Blood ancer, e.g. Lymphoma, Comprises Components Extracted
from Brewing Papaya, YS Therapeutic Co Ltd .
Sukardiman, Poernomo H., 2000. Penapisan Senyawa Antikanker dari Tanaman
Obat Indonesia dengan Molekul Target Enzim Topoisomerase, Penelitian
DCRG, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya.
Sukardiman, Wiwied, E., Putri, P., 2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Fraksi
Kloroform Daun Pepaya (Carica Papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker
Mieloma. Media Kedokteran hewan. Fakultas Farmasi Universitas
Airlangga, Surabaya, Vol.22, No.2.
Tietze, H.W., 2002. Terapi Pepaya, PT. Prestasi Pustaka Raya, Jakarta.
- Penanaman pada media padat PDA- Inkubasi 3 hari pada suhu ruang dan pengamatan
- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan
- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan morfologis
- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan
- Penggerusan dengan mortar aseptik- Penambahan akuades steril 1 ml- Penggerusan sampai halus
- Pencucian dengan akuades steril- Perendaman dalam alkohol 70% selama 1 menit- Pembilasan dengan akuades steril- Perendaman dengan CaOCl 5,25% selama 5 menit- Pembilasan dengan akuades steril- Perendaman dalam alkohol 70% selama 1 menit- Pembilasan dengan akuades steril
LAMPIRAN
Skema Penelitian
5.1. Preparasi dan Sterilisasi Sampel
5.2. Isolasi Endofit
Daun Pepaya
Sampel daun pepaya steril
Endapan Filtrat (ekstrak)
Isolat bakteri Endofit tunggal
Koloni Endofit
Ekstrak daun pepaya
- Pengamatan melalui mikroskop dengan perbesaran 1000x
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan safranin- Pendiaman 2 menit
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan safranin- Pendiaman 2 menit
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan safranin- Pendiaman 2 menit
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan safranin- Pendiaman 2 menit
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan safranin- Pendiaman 2 menit
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Pencucian isolat dengan alkohol aseton - Pendiaman 30 detik
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan 2-3 tetes pewarna iodin dan pendiaman 1
menit
- Pensuspensian pada akuades steril- Pengolesan pada kaca preparat- Penambahan 2-3 tetes pewarna kristal violet dan
pendiaman 1 menit
5.3. Pewarnaan Gram Isolat
Perubahan warna isolat (ungu)
Isolat Bakteri Endofit tunggal
Perubahan warna isolat (ungu)
Perubahan warna (-) bening (+) ungu
Perubahan warna (-) merah (+) ungu
Preparat
Penampakan mikroskopik isolat
Bakteri gram negatif (Merah)
Bakteri gram positif(Ungu)
- Penanaman pada media cair NB- Penginkubasian pada suhu ruang dengan shaker
kecepatan 75 rpm selama 2 hari
- Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang maksimum setiap 2 hingga 4 jam selama 48 jam
- Penginokulasian pada media cair- Penginkubasian dengan inkubator shaker pada
kecepatan 75 rpm selama 7 hari pada suhu 30oC
- Sentrifugasi 4000 rpm pada 4oC selama 15 menit- Pengukuran panjang gelombang maksimum
- Pengeringan dengan freeze dryer
5.4. Kurva Pertumbuhan Endofit
5.5. Produksi Metabolit sekunder
Data Kurva Pertumbuhan
Isolat Endofit Tunggal
Media PDA
Ekstrak kasar
Isolat Endofit Tunggal
Tabung reaksi
Endapan Filtrat
Padatan metabolit sekunder
Isolat endofit tunggal
- Pelembaban dengan 5 ml NH3 25%- Penggerusan- Penambahan 20 ml Kloroform- Penggerusan- Penyaringan
- Pengekstrasian dengan HCl 2N sebanyak 2 kali
- Penambahan reagen Dragendorff
- Penambahan pereaksi Mayer
- Pendidihan dalam 100 ml air selama 5 menit- Penyaringan dalam air panas
- Pengocokan- Pengamatan busa- Penambahan 1 tetes HCl 2N
5.6. Penapisan Fitokimia Metabolit Sekunder
5.6.1. Uji Alkaloid
5.6.2. Uji Saponin
Endapan 10 ml Filtrat
Lapisan HCl Lapisan Kloroform
5 ml Lapisan HCl
Tabung reaksi
5 ml Lapisan HCl
Tabung reaksi
Perubahan warna (merah bata) Perubahan warna (putih)
Padatan Metabolit Sekunder
Tabung reaksi
Endapan 10 ml Filtrat
Padatan Metabolit Sekunder
Mortar
Sampel Busa
- Penambahan NaOH 1M
- Pendidihan dalam 10 ml air selama 5 menit- Pendinginan dan penyaringan
- Penambahan serbuk Mg- Penambahan 1 mL HCl pekat dan 2 ml amilalkohol- Pengocokan kuat- Pendiaman- Pengamatan
- Pendidihan dalam 10 ml air selama 5 menit- Pendinginan dan penyaringan
- Penambahan FeCl3 1%
5.6.3. Uji Flavonoid
5.6.4. Uji Tanin
5.6.5. Uji Kuinon
Perubahan warna (merah)
5 ml filtrat dari saponin
Tabung reaksi
Padatan Metabolit Sekunder
Tabung reaksi
Endapan Filtrat
Perubahan warna (hijau kehitaman)
Padatan Metabolit Sekunder
Tabung reaksi
Endapan Filtrat
Perubahan warna (merah)
- Penambahan 10 butir telur udang- Peletakkan di bawah lampu UV- Pendiaman 48 jam - Pengamatan
- Pengenceran konsentrasi 20, 10 dan 2 g/mL
- Penambahan DMSO- Pendiaman 48 jam - Pengamatan
- Perubahan konsentrasi menjadi 10, 5 dan 1 g/mL
- Inkubasi 24 jam dan pengamatan
- Perhitungan LC50
- Perubahan konsentrasi menjadi 10, 5 dan 1 g/mL
- Inkubasi 24 jam dan pengamatan
5.6.6.Uji Triterpenoid/Steroid
5.7. Uji BSLT
Larva Udang
Metabolit Sekunder
Metanol
Larutan Uji
Larva dan metabolit sekunder
Botol Vial
Larva Mati dan Hidup
Nilai LC50
100 mL Air Laut
Plat
- Maserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam - Penyaringan
Endapan5 mL Filtrat
Steroid membentuk warna (ungu-biru)
Padatan Metabolit Sekunder
- Penguapan hingga kering
Endapan
Triterpenoid membentuk warna (merah)
- Penambahan 2 tetes CH3COOH anhidrat - Penambahan 1 tetes H2SO4 - Pengamatan warna
- Penambahan 50ml DMSO- Pengocokan dengan vortex mixer
- Pengenceran bertingkat hingga mendapatkan satu seri larutan uji dengan konsentrasi 25, 50, 100, 15, 200 dan 300 mg/ml
- Penambahan tripsin EDTA dan inkubasi 3 menit- Penambahan media- Pemindahan ke plat cover slip
- Perhitungan sel dengan mikroskop cahaya - Penambahan media- Pemindahan ke Conical
- Pemindahan sel ke atas cover slip secara merata ke dalam sumuran
- Inkubasi 30 menit- Penambahan MK / RPMI ke dalam sumuran
5.8. Uji Aktivitas Antikanker
5.8.1. Pembuatan Larutan Stok
5.8.2. Preparasi sel kanker payudara T47D
Isolat homogen
5 mg ekstrak kasar
Eppendorf
Isolat homogenIsolat homogen
Larutan stok
Isolat homogen
Sel kanker payudara T47D
Tabung reaksi
Sel kanker payudara T47D
Tabung reaksi
Sel kanker terpanen
Plat cover slip
Sel tertanam pada cover slip
Sel kanker terpanen
Conical
Sel kanker payudara T47D
Tabung reaksi
Sel kanker payudara T47D
Tabung reaksi
- Pembuangan MK dari sumuran- Pencucian dengan PBS- Pemasukan larutan stok sampel- Pemasukan kontrol media DMSO- Inkubasi pada inkubator 5% CO2 selama 10 jam pada
suhu 37oC dan pH 7,4 – 7,7- Panen sel
- Pembuangan MK dari sumuran- Pencucian dengan PBS- Pengangkatan cover slip- Penetesan etidiumbromida-etidin orange- Pengamatan mikroskop
5.8.3. Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode staining double
Apoptisis sel kanker
Sel tertanam
Cover slip sumuran
Apoptisis sel kanker
Perubahan warna hijau menjadi orange
top related