adln perpustakaan universitas airlanggarepository.unair.ac.id/25773/1/mpk 86 - 12 nin p.pdf ·...
Post on 12-Mar-2019
226 Views
Preview:
TRANSCRIPT
PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI
CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica
SKRIPSI
DWI RESTI NINGRUM
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA 2012
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
ii
PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI
CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Bidang Kimia pada Fakultas Sains Dan Teknologi
Universitas Airlangga
Disetujui Oleh :
Pembimbing I
Dr. Afaf Baktir, MS NIP. 19561014 19833 2 001
Pembimbing II
Dr. Purkan, M.Si NIP. 19721116 199702 1 001
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
iii
LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI
Judul : Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Dysgetive Gland Achatina fulica Penyusun : Dwi Resti Ningrum Nim : 080810524 Pembimbing I : Dr. Afaf Baktir, MS Pembimbing II : Dr. Purkan, M.Si Tanggal Seminar : 23 Juli 2012
Disetujui oleh :
Pembimbing I,
Dr. Afaf Baktir, MS NIP. 19561014 19833 2 001
Pembimbing II
Dr. Purkan, M.Si NIP. 19721116 199702 1 001
Mengetahui: Ketua Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga
Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA
NIP. 19671115 199102 2 001
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penyusun dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina fulica”. Penyusun menyadari bahwa penulisan proposal ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, untuk itu penyusun menyampaikan terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Afaf Baktir, MS selaku pembingbing I dan Bapak Dr. Purkan, M.Si selaku pembingbing II yang telah memberikan saran, doa dan bimbingan sampai terselesaikan proposal ini.
2. Bapak Drs. Handoko Darmokoesomo, DEA selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing serta memberikan banyak masukan.
3. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku Ketua Departemen Kimia sekaligus ketua prodi S-1 kimia yang senantiasa memberikan dukungan.
4. Bapak, ibu dan adik-adik yang memberikan kasih sayang, doa, kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi.
5. Teman – teman angkatan 2008 yang senantiasa menemani dalam menuntut ilmu.
Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu biokimia.
Surabaya, Juli 2012 Penyusun
Dwi Resti Ningrum
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
v
Ningrum, Dwi Resti, 2012, Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica, SKRIPSI, dibawah bimbingan Dr. Afaf Baktir, MS dan Dr. Purkan, M.Si, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya
ABSTRAK
Ekstrak enzim dari digestive gland Achatina fulica diketahui mengandung berbagai jenis enzim hidrolase, salah satunya kitinase. Kitinase memiliki banyak kegunaan dalam berbagai bidang industri, diantaranya makanan, medis dan pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemurnian parsial ekstrak enzim kitinase dari digestive gland Achatina fulica menggunakan aseton. Optimasi prosentase aseton dilakukan untuk mendapatkan fraksi dengan aktivitas spesifik tertinggi. Aktivitas spesifik kitinase sesudah fraksinasi dibandingkan dengan ekstrak tanpa fraksinasi. Aktivitas spesifik yang paling banyak terkumpul ada pada fraksi 45-70. Terdapat peningkatan aktivitas spesifik sebesar 6,45 kali dari ekstrak sebelum difraksinasi. Fraksi ini memiliki suhu optimum pada 37o C dan pH optimum 7. Kata kunci: Achatina fulica, kitinase, fraksinasi aseton, pemurnian enzim
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
vi
Ningrum, Dwi Resti, 2012, Partial Purificaton And Characterization Chitinase Enzyme From Digestive Gland Fluids Of Achatina fulica, SKRIPSI, under Guidance Dr. Afaf Baktir, MS and Dr. Purkan, M.Si, Department of Chemistry, Sains and Technology Faculty, Airlangga University, Surabaya
ABSTRACT
The Enzyme from the digestive gland extracts of Achatina fulica is known contain various types of hydrolase enzymes, one of them is chitinase. Chitinase has many benefit for various industries, they are including food, medicine and agriculture. The objective of reseach to perform a partial purification chitinase enzyme of digestive gland extract of Achatina fulica using acetone. Optimization of the percentage acetone carried out to obtain the highest specific activity from each fraction. Chitinase specific activity after fractination is compared to extracts without fractionation. Specific activity of the most collected there in 45-70 fraction. There is an increase of 6.45 times the specific activity of without fractionation. This fraction has a temperature optimum at 37oC and optimum pH 7.
Keyword : Achatina fulica, chitinase, acetone fractionation, purification enzyme
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
vii
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ............................................................................................... iv
ABSTRAK ................................................................................................................. v
ABSTRACT ............................................................................................................... vi
DAFTAR ISI .............................................................................................................. vii
DAFTAR TABEL ...................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………………… x
BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4 1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4 1.4 Manfaat Peneltian..................................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 7 2.1 Enzim ....................................................................................................... 7 2.1.1 Struktur enzim ................................................................................. 8 2.1.2 Mekanisme kerja enzim .................................................................. 8 2.2 Kitinase……………………………………………………………….. .. 9 2.2.1 Tinjauan Umum Kitinase ............................................................... 9 2.2.2 Pengukuran Aktivitas Kitinase ........................................................ 12 2.3 Metode Pemurnian Enzim ........................................................................ 13 2.3.1 Fraksinasi aseton ............................................................................. 13 2.3.2 Fraksinasi Amonium sulfat ............................................................. 15 2.3.3 Kromatografi ................................................................................... 16 2.3.3.1 Kromatografi penukar ion ............................................................ 16 2.3.3.2 Kromatografi afinitas ................................................................... 17 2.3.3.3 Kromatografi filtrasi..................................................................... 17 2.3.3.4 Kromatografi hidrofob ................................................................. 17 2.4 Koloidal Kitin........................................................................................... 18 2.6 Bekicot (Achatina fulica) ......................................................................... 19 2.7 Turbidimetri ............................................................................................. 21
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
viii
BAB III M ETODE PENELTIAN .............................................................................. 22 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................. 22 3.2 Alat dan Bahan Penelitian ........................................................................ 22 3.2.1 Alat-alat penelitian .......................................................................... 22 3.2.2 Bahan-bahan penelitian ................................................................... 22 3.3 Diagram Alir Penelitian ........................................................................... 23 3.4 Prosedur Penelitian................................................................................... 23 3.4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin ................................................... 23 3.4.2 Karantina Achatina fulica ............................................................... 24 3.4.3Panen cairan digestive gland Achatina fulica .................................. 24 3.4.4 Pembuatan Kurva Progres ............................................................... 24 3.4.5 Pembuatan kurva standar koloidal kitin .......................................... 24 3.4.6 Optimasi fraksinasi asteon ekstrak kasar enzim kitinase ................ 25 3.4.7 Penentuan kadar protein .................................................................. 25 3.4.8 Uji Aktivitas setiap fraksi hasil fraksinasi aseton ........................... 26 3.4.9 Karakterisasi enzim kitinase ........................................................... 27 3.4.9.1 Suhu optimum ........................................................................... 27 3.4.9.2 pH optimum .............................................................................. 27 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin ...................................................... 28 4.2 Karantina Achatina fulica .................................................................. 29 4.3 Panen cairan digestive gland Achatina fulica .................................... 30 4.4 Pembuatan Kurva Progres .................................................................. 31 4.5 Pembuatan kurva standar koloidal kitin ............................................. 32 4.6 Optimasi fraksinasi asteon ekstrak kasar enzim kitinase ................... 33 4.7 Penentuan kadar protein ..................................................................... 35 4.8 Uji Aktivitas setiap fraksi hasil fraksinasi aseton .............................. 35 4.9 Karakterisasi enzim kitinase .............................................................. 40 4.9.1 Suhu optimum .............................................................................. 40 4.9.2 pH optimum ................................................................................. 42 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 43 5.2 Saran ................................................................................................... 43 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 44 LAMPIRAN
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
ix
DAFTAR TABEL
Nomor Judul Tabel Halaman
1. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 1 ...... 37
2. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 2 ...... 38
3. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 3 ...... 38
4. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 4 ...... 39
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
x
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Gambar Halaman
1. Struktur protein primer, sekunder, tersier dan kuartener ..................... 7
2. Model Lock and Key ............................................................................ 9
3. Model Induced Fit ................................................................................ 9
4. Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase .................... 10
5. Struktur kitin ....................................................................................... 12
6. Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari protein satu dengan protein lain ......................................................... 14
7. Denaturasi protein akibat pelarut organik .......................................... 15
8. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein ........................ 16
9. Anatomi bekicot ................................................................................. 19
10. Kurva progres ekstrak kitinase .......................................................... 31
11. Kurva standar koloidal kitin ................................................................ 32
12. Mekanisme kerja enzim kitinase
terhadap polimer N-asetilglukosamin ................................................. 36
13. Suhu optimum fraksi 45-70 ................................................................ 41
14. pH optimum fraksi 45-70 .................................................................... 42
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
2221
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman flora dan
fauna. Hal ini disebabkan oleh kondisi iklim Indonesia yang tropis, sehingga
cocok untuk banyak jenis flora dan fauna untuk berkembang biak. Salah satu
hewan yang tingkat perkembangbiakannya tinggi adalah Achatina fulica
(bekicot).
Achatina fulica dianggap sebagai hama yang dapat menurunkan kualitas
produk panen. Meskipun demikian, Achatina fulica dapat dimanfaatkan untuk
makanan dan obat tradisional karena khasiatnya. Namun belum banyak penelitian
yang memanfaatkan cairan kelenjar saluran pencernaan (digestive gland) Achatina
fulica. Wheel (1961) menyatakan bahwa ekstrak kelenjar saluran pencernaan
(digestive gland) Achatina fulica memiliki campuran enzim karbohidrase,
meliputi enzim kitinase, xilanase, selulase, hemiselulase, amilase, maltase, dan
sukrase. Namun sejauh ini, informasi tentang karakteristik tiap enzim tersebut
masih belum dilaporkan, termasuk karakteristik kitinase.
Kitinase adalah salah satu enzim yang menarik untuk dikaji, karena
memilki kemampuan untuk menghidrolisis kitin menjadi oligomernya yang
selama ini dimanfaatkan dalam berbagai bidang. Senyawa oligomer tersebut
banyak dimanfaatkan untuk bidang medis dan makanan (Flach dkk., 1992).
Kitinase menghidrolisis kitin menjadi senyawa oligomer kitin, seperti
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
2
karboksimetil kitin, hidroksietil kitin dan etil kitin. Dalam bidang medis,
senyawa-senyawa tersebut dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan
benang operasi, yang mempunyai keunggulan dapat diserap dalam jaringan tubuh,
tidak toksik dan dapat disimpan dengan waktu yang lama. Monomer lain dari kitin
yaitu N-asetil-D-glukosamin, dapat dimanfaatkan dalam bidang farmasi, obat
pengontrol kadar gula dalam darah, suplemen, anti inflamasi dan sebagainya
(Herdyastuti dkk., 2009).
Dalam bidang lingkungan, kitinase dimanfaatkan untuk penanganan
limbah yang mengandung kitin, seperti pabrik pembekuan udang. Apabila limbah
udang dibiarkan mencemari perairan dapat meningkatkan BOD dan COD yang
menyebabkan pencemaran lingkungan yang lebih luas. Kitinase menjadi perhatian
besar, terutama karena peranannya dalam hidrolisis jamur patogen. Enzim kitinase
banyak digunakan untuk pengendalian hayati (Sahai dan Manocha, 1993).
Kitinase sering dimanfaatkan sebagai agen biokontrol, terutama tanaman yang
terserang jamur patogen. Jamur memiliki komponen utama penyusun dinding sel,
salah satunya adalah kitin yang dapat dihidrolisis oleh kitinase. Dalam dua dekade
terahir banyak dikaji mengenai enzim kitinase sebagai antifungi. Sebagai contoh,
kitinase dari Tricodema banyak digunakan sebagai antifungi yang efektif terhadap
serangan Rhizoctonia solani pada tanaman kapas dan Fusarium pada tanaman
strawberi (Wang dkk., 2003).
Kitinase juga berperan dalam lisisnya biofilm jamur patogen Candida
albicans. Biofilm adalah matriks polimer ekstraseluler yang terbentuk dari suatu
komunitas mikroba terstruktur dan memiliki fenotip yang berbeda dari plantonik
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
3
dan sel bebasnya (Douglas, 2006). Dinding sel Candida albicans mengandung β-
1,3-glukan, β-1,6-glukan dan kitin (Marti´nez dkk., 1998). Berdasarkan penelitian
yang sudah dilakukan Kamiliyah (2011), ekstrak enzim Achatina fulica memiliki
daya hambat yang lebih tinggi terhadap biofilm Candida albicans jika
dibandingkan dengan perlakuan ekstrak kayu manis yaitu sebesar 22,81%. Dari
hasil penelitian tersebut, diketahui bahwa ekstrak enzim Achatina fulica mampu
meningkatkan efektivitas daya antifungi ekstrak kayu manis terhadap Candida
albicans sebesar 75%. Hasil ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak enzim siput
mengandung enzim-enzim yang mampu menghidrolisis biofilm maupun dinding
sel Candida albicans.
Suatu enzim yang diambil dari alam masih bercampur dengan pengotor
lain. Untuk mengurangi atau menghilangkan pengotor tersebut melalui cara
pemurnian. Pemurnian dilakukan untuk meningkatkan aktivitas spesifik dari suatu
enzim. Aseton merupakan salah satu pelarut organik yang biasa digunakan dalam
pemurnian enzim. Di samping pelarut organik, pemurnian juga dapat dilakukan
dengan fraksinasi dengan amonium sulfat. Kelebihan fraksinasi aseton dibanding
dengan fraksinasi amonium sulfat adalah tidak perlu adanya perlakuan yang rumit
untuk menghilangkan garam yang tersisa. Dalam hal ini, fraksinasi aseton
dilakukan pada suhu -20oC (Thermo Fisher Scientific, 2009).
Enzim industri biasanya digunakan dalam keadaan kemurnian parsial.
Enzim kitinase pada penelitian ini akan dimurnikan secara parsial dari ekstrak
enzim Achatina fulica. Enzim ini akan diuji aktivitasnya dan ditentukan suhu dan
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
4
pH optimumnya dalam keadaan murni parsial untuk tujuan aplikasi dalam kondisi
kemurnian parsial.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka dibuat rumusan
masalah sebagai berikut.
1. Pada fraksi manakah aktivitas kitinase pada ekstrak enzim dari
digestive gland Achatina fulica terkumpul pada proses fraksinasi
aseton ?
2. Berapakah peningkatan kemurnian ekstrak enzim kitinase setelah
difraksinasi dengan aseton ?
3. Bagaimana karekteristik terkait dengan pH dan suhu optimum ekstrak
enzim kitinase dari Achatina fulica ?
1.3 Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan pemurnian parsial ekstrak
enzim kitinase digestive gland Achatina fulica menggunakan aseton.
Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Menentukan fraksi aseton yang optimum dari fraksinasi aseton.
2. Menghitung peningkatan kemurnian ekstrak enzim kitinase setelah
fraksinasi aseton.
3. Menentukan karakteristik terkait pH dan suhu optimum enzim
kitinase dari Achatina fulica.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
5
1.2 Manfaat
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang
aktifitas enzim kitinase setelah dimurnikan secara parsial menggunakan fraksinasi
aseton. Selain itu, penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi tentang
karakteristik enzim kitinase terkait pH dan suhu optimum. Dengan enzim kitinase
dari digestive gland Achatina fulica dapat digunakan untuk berbagai macam
kebutuhan industri.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Enzim
Enzim merupakan unit fungsional yang termasuk dalam protein dari
metabolisme sel yang disusun oleh rantai-rantai polipeptida. Enzim berfungsi
untuk mempercepat reaksi spesifik tanpa pembentukan produk samping. Enzim
tidak mengubah titik kesetimbangan reaksi yang dikatalisis. Enzim memilki berat
molekul yang berkisar dari 12.000 sampai lebih dari 1 juta. Enzim memilkiki
spesifitas terhadap substrat. Substrat adalah substansi yang mengalami perubahan
kimia setelah bereaksi dengan enzim, sedangkan produk adalah substansi baru
yang terbentuk setelah setelah reaksi (Voet dan Voet, 2004).
Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim-substrat
yang bersifat sementara, yang terurai membentuk enzim bebas dan produknya.
Enzim menyebabkan berlangsungnya reaksi kimia dengan mengarahkan subtrat
ke sisi katalitik. Aktifitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu pH,
konsentrasi substrat dan enzim, adanya aktivator dan inhibitor (Lehninger, 1998).
Reaksi enzimatis hanya bekerja pada suhu dan pH tertentu (Stryer, 2002).
2.1.1 Struktur enzim
Enzim merupakan protein globular yang memilki struktur primer,
sekunder, tersier, dan kuartener. Struktur primer terbentuk dari ikatan kovalen
antar residu-residu asam amino yang berurutan membentuk ikatan peptida.
Struktur sekunder terbentuk dari ikatan hidrogen antara atom O dari gugus
Struktur primer
6
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
7
karbonil (C=O) dengan atom H (N-H) dalam satu rantai polipeptida. Dalam
struktur sekunder, struktur protein dibagi menjadi dua yaitu β-sheet dan heliks
(Bondanszky, 1998).
Gambar 2.1 Struktur protein primer, sekunder, tersier dan kuartener
Struktur tersier merupakan struktur protein yang paling stabil, karena
terdapat ikatan yang dapat menstabilkan protein itu sendiri. Jenis ikatan-ikatan
tersebut adalah: ikatan hidrogen antara gugus R residu asam amino rantai samping
yang berdekatan, ikatan ion diantara gugus R yang berlawanan, interaksi
hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan kovalen berupa ikatan
disulfida dari sistein (Ottoway dan Apps, 1984)
Struktur kuartener terbentuk karena adanya interaksi beberapa rantai
polipeptida yang membentuk oligomer. Oligomer berinteraksi kembali melalui
ikatan ionik, van der waals dan ikatan hidrofobik (Bodanszky, 1998).
Struktur primer
Asam amino
Struktur sekunder
Ikatan hidrogen Ikatan hidrogen
Struktur tersier
Struktur kuartener
Struktur primer
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
8
2.1.2 Mekanisme kerja enzim
Proses awal katalisis enzim adalah pembentukan kompleks antara enzim
dan substrat. Substrat diikat pada daerah yang dinamakan sisi aktif enzim. Reaksi
kimia yang terjadi dalam kompleks enzim substrat tersebut dapat dilanjutkan
dengan pelepasan produk dan enzim.
Mekanisme katalisis enzim melibatkan gugus fungsi yang terdapat pada
sisi aktif enzim. Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang
mengandung residu asam amino yang berperan dalam pembuatan dan pemutusan
ikatan selama proses katalisis. Ikatan – ikatan yang terjadi antara enzim dan
substrat adalah ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun
interaksi hidrofobik. Gugus yang terlibat dalam proses pengikatan substrat disebut
gugus pengikat (binding group). Gugus yang terlibat dalam proses katalitik antara
enzim dan substrat disebut gugus katalitik (catalytic group). Gugus katalitik
terletak pada gugus samping enzim (Poedjiadi, 1994).
Terdapat dua model interaksi enzim dan substrat, yaitu :
1. Model Lock and Key : dikemukakan oleh Emil Fischer. Pada model ini,
substrat memiliki daerah polar (- dan +) dan non polar (H, hidrofobik)
diletakkan pada sisi aktif yang memiliki muatan komplementer dari substrat
tersebut. Model Lock and Key menerangkan adanya kesesuaian ukuran atau
bentuk substrat terhadap sisi aktif enzim. Substrat yang tidak cocok bentuknya
dengan sisi aktif enzim, baik karena terlalu besar maupun karena terlalu kecil
tidak dapat terikat pada sisi aktif (Marks, 1996).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
9
2. Pada model Induced Fit : dikemukakan oleh Koshland. Pada model ini,
senyawa-senyawa yang lebih besar atau lebih kecil dari substrat yang asli
masih dapat berinteraksi dengan sisi aktif enzim. Sisi aktif yang pada awalnya
belum sesuai dengan bentuk substrat, akan terinduksi dan menyesuaikan
dengan bentuk substrat setelah substrat menempel pada sisi aktif. Sehingga
sisi aktif bersifat fleksibel (Marks, 1996).
Gambar 2.2 Model Lock and Key (Marks, 1996). E merupakan simbol untuk
enzim, S merupakan simbol dari substrat dan P merupakan simbol untuk produk.
Gambar 2.3 Model Induced Fit (Marks, 1996). E merupakan simbol untuk
enzim, S merupakan simbol dari substrat dan P merupakan simbol untuk produk.
2.2 Kitinase
2.2.1 Tinjauan umum kitinase
Kitinase adalah enzim yang penting digunakan untuk produksi
oligosakarida fisiologis aktif dari berbagai kitin dan kitosan (Flach,1992).
Oligomer ini memiliki banyak aplikasi medis, dan juga dapat digunakan sebagai
pengawet makanan (Flach,1992). Nama kimia dari kitinase adalah {Poli [1,4-(N-
acetyl-β-Dglukosamin)] glucanohidrolase}(Fleuri dkk., 2009).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
10
Enzim kitinase dihasilkan oleh bakteri, fungi, tanaman, dan hewan
(Toharisman, 2007). Kitinase juga disintesis oleh protozoa, saluran pencernaan
nematode, polikhaeta dan mollusca. Kitinase juga ditemukan dalam lendir
pencernaan burung-burung pemakan seranga, lendir pencernaan dan pangkreas
ikan, amfibi dan reptil pemakan serangga (Yurnaliza, 2002). Bakteri
mengeluarkan kitinase sebagai sarana memperoleh nutrisi dan agen parasitisme,
sementara fungi, protozoa dan invertebrata mengeluarkan enzim tersebut untuk
proses morfogenesis. Tanaman mengeluarkan kitinase untuk mempertahankan diri
dari serangan patogen (Toharisman, 2007).
Menurut Harman dkk. (1993) dan Manocha (1993) kitinase terbagi dalam
tipe endokitinase dan eksokitinase.
Gambar 2.4 Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase (Sahai & Manocha, 1993).
Aplikasi kitinase yang banyak digunakan adalah sebagai agen biokontrol.
Telah dilaporkan Brurberg dkk. (1996), bahwa ChiA dan ChiB Serratia
marcescens yang telah ditransformasikan ke E.coli memiliki kemampuan untuk
GIcNAc mikrofibril kitin ujung nonreduksi ujung reduksi lokasi hidrolisis
eksokitinase
endokitinase
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
11
mengontrol jamur tanaman yang bersifat patogen, sebagai contoh adalah dapat
mengurangi penyakit dari Rhizoctonia solani yang menyebabkan akar tebu
membusuk.
Senyawa- senyawa hasil degradasi kitinase pada kitin membentuk
oligomernya seperti karboksimetil kitin, hidroksietil kitin dan etil kitin. Dalam
bidang medis, senyawa-senyawa tersebut digunakan sebagai bahan dasar
pembuatan benang operasi yang memilki keunggulan dapat diserap dalam
jaringan tubuh, tidak toksik dan dapat disimpan dengan waktu yang lama.
Monomer kitin, N-asetil-D-glukosamin dapat dimanfaatkan untuk obat pengontrol
darah dan suplemen anti inflamasi. Selain itu, N-asetil-D-glukosamin dapat
membantu mengurangi hiperpigmentasi aktivitas enzim tirosin yang berperan
dalam produksi melanin.
Kitinase menghidrolisis substansi yang mengandung senyawa kitin. Kitin
dibangun oleh unit-unit monomer N-asetilglukosamin (GlcNAc) yang tersusun
liniar dengan ikatan β (1,4). Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya
membentuk ikatan hidrogen antara gugus NH dari satu rantai dan gugus C=O dari
rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini menyebabkan kitin membentuk
formasi serabut (fibril) dan tidak dapat larut dalam air. Berikut merupakan gambar
unit kitin :
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
12
Gambar 2.5 Struktur kitin. Satu unit kitin terdiri dari monomer N-asetilglukosamin
Di alam, kitin banyak ditemukan pada sel jamur dan eksoskeleton dari
serangga dan krustasea (Cohen-Kupiec dan Chet, 1998). Kitin pada jamur
berbentuk mikrofibril yang memiliki panjang yang berbeda tergantung pada
spesies dan lokasi selnya. Mikrofibril merupakan struktur utama dari struktur
dinding sel jamur terdiri atas jalinan rantai-rantai polisakarida yang saling
bersilangan membentuk anyaman. Jalinan ini kuat berikatan pada matriks (Cabib,
1987). Dalam hal ini kitinase berperan sebagai penghidrolisis dinding sel jamur
dan matriks jamur patogen.
2.2.2 Pengukuran aktivitas kitinase
Pengukuran aktivitas kitinase dapat dilakukan dengan beberapa cara
seperti yang disebutkan dalam Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987) :
a. Berdasarkan pengurangan substrat.
1). Metode viskosimetri, yaitu aktivitas kitinase terhadap kitosan, glikol kitin atau
karboksimetilkitin yang diukur berdasarkan terjadinya pengurangan viskositas
substrat.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
13
2). Metode turbidimetri, yaitu mengukur perbedaan turbiditas suspensi koloidal
sebelum dan setelah kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat. Contoh
pada pengukuran aktifitas enzim endokitinase.
b. Berdasarkan pembentukan produk akhir reaksi hidrolilis kitin yaitu GlcNAc.
GlcNAc atau N-asetilglukosamin yang dibebaskan dari kitin ditentukan secara
kolorimetrik dengan p-dimetilaminobenzaldehida. Satu unit aktivitas kitinase
dinyatakan sebagai μmol GlcNAc yang dibebaskan selama 1 jam dalam kondisi
yang ditetapkan.
c. Spectrometer Assay yaitu menggunakan kromogen 3,4, dinitrophenil tetra N-
asetilkhitotetraose.
2.3 Metode Pemurnian Enzim
Ekstrak enzim belum 100 % terdiri atas protein enzim yang diinginkan,
sehingga perlu pemurnian untuk memisahkan dari pengotor. Pemurnian dapat
dilakukan dengan beberapa cara yaitu : pengendapan protein melalui fraksinasi
dengan amonium sulfat atau pelarut organik dan kromatografi (Scopes, 1994).
Adapun metode kromatografi terdapat berbagai macam, diantaranya kromatografi
penukar ion, afinitas, filtrasi, dan hidrofob.
2.3.1 Fraksinasi aseton
Fraksinasi aseton merupakan salah satu metode pemurnian enzim secara
parsial dengan menggunakan pelarut organik. Prinsip pemurnian parsial dengan
pelarut organik adalah molekul hidrofobik pada enzim akan berkurang pada saat
penambahan pelarut organik. Pelarut organik mengimobilisasi parsial molekul air
dari protein. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein digantikan oleh
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
14
molekul pelarut organik. Pada fakta penelitian menggunakan fraksinasi dengan
pelarut organik, disimpulkan bahwa aseton sesuai digunakan untuk pemurnian
protein.
Gambar 2.6 Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari molekul protein satu dengan molekul protein lain
(Scopes, 1994)
Faktor utama penyebab agregasi molekul protein oleh aseton adalah
ikatan elektrostatik dan kekuatan dipolar. Keberadaan aseton dalam larutan
protein menyebabkan agregasi antara muatan yang berlawanan dari permukaan
molekul protein satu dan protein yang lain. Proses presipitasi dengan pelarut
organik terjadi pada keadaan elektrostatik protein. Molekul protein besar akan
lebih mudah beragregasi karena memiliki perbedaan muatan yang tinggi. Molekul
yang besar akan segera teragregasi karena terjadi perubahan yang besar dari
muatan permukaan protein satu dengan protein yang lain.
bagian hidrofob
pelarut organik
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
15
Dalam fraksinasi aseton, suhu harus di bawah 0oC pada saat sampel
preparasi maupun pada saat fraksinasi. Pada suhu di atas 10oC, protein mengalami
denaturasi.
Gambar 2.7 Denaturasi protein akibat pelarut organik (Scopes, 1994)
Pada saat temperatur tinggi, molekul dari pelarut organik masuk ke dalam
protein melalui permukaannya, kemudian berinteraksi dengan residu hidrofobik
dari protein. Interaksi tersebut menyebabkan protein mengalami denaturasi.
2.3.2 Fraksinasi amonium sulfat
Fraksinasi amonium sulfat merupakan salah satu teknik pemurnian protein
yang biasa dilakukan. Pemurnian dengan metode ini menggunakan prinsip
agregasi protein molekul bagian permukaan hidrofobik dari protein.
Molekul pelarut organik berinteraksi dengan residu
hidrofob
Interaksi hidrofob internal
Kestabilan struktur saat suhu naik
Gangguan akibat interaksi hidrofob
Denaturasi
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
16
Gambar 2.8 Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein (Scopes, 1994)
Pada saat ion garam terlarut, akan mengurangi pelarut air yang terdapat di
antara bagian hidrofobik molekul-molekul protein, sehingga molekul air tersebut
menjadi berkurang. Hal ini karena ion garam menarik molekul air yang berada di
sekitar bagian hidrofobik. Bagian permukaan hidrofobik protein satu akan
berikatan dengan bagian permukaan hidrofobik yang lain, kemudian saling
beragregasi dan protein mengendap (Scopes, 1994).
2.3.3 Kromatografi
2.3.3.1 Kromatografi penukar ion
Berdasar muatannya, kromatografi penukar ion dibagi menjadi dua yaitu
penukar kation dan penukar anion. Kromatografi penukar kation menggunakan
penukar kation yang bermuatan negatif, sebagai contoh adalah carboxymethyl-
cellulose (CM-cellulose). Sedangkan penukar anion menggunakan resin penukar
anion yang bermuatan positif, sebagai contoh adalah diethylaminoethyl-cellulose
(DEAE-cellulose). Protein harus memiliki muatan yang berbeda dengan penukar
Bagian hidrofob dari protein
Molekul air
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
17
ionnya. Penambahan Tris-Cl meningkatkan kekuatan ion pada bufer yang
mengalir pada kolom kromatografi (Scopes, 1994).
2.3.3.2 Kromatografi afinitas
Prinsip kromatografi afinitas adalah ligan terimobilisasi pada kolom.
Sampel protein yang dilewatkan pada kolom, akan terjadi interaksi spesifik antara
protein target dengan ligan, yang menyebabkan protein target dapat terpisah dari
protein pengotor. Ligan berikatan kovalen dengan backbone matrix. Hanya enzim
dengan afinitas spesifik yang akan terikat pada adsorben melalui interaksi dengan
ligannya (Scopes, 1994).
2.3.3.3 Kromatografi filtrasi
Pemisahan dengan metode kromatografi filtrasi didasari oleh ukuran
molekul protein dan perbedaan ukuran material pembatas pada matriks. Matriks
yang biasa digunakan adalah selulosa dan dekstran. Molekul protein berukuran
kecil akan terperangkap di dalam matiks, sedangkan molekul yang lebih besar dari
ukuran matriks akan bebas dan keluar dari kolom kromatografi (Scopes, 1994).
2.3.3.4 Kromatografi hidrofob
Interaksi rantai alifatik pada adsorben dan kesamaan bagian hidrofob
permukaan protein. Dalam kromatrografi hidrofobik, agregasi terjadi antara
bagian hidrofob protein dan ligan terimobilisasi pada adsorben. Rantai alifatik
yang cocok digunakan sebagai adsorben adalah C4, C6, C 8, dan C 10, serta rantai
yang mengandung gugus amino terminal.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
18
Interaksi protein dengan adsorben hidrofobik adalah sebuah ikatan
hidrogen atau ikatan elektrostatik. Kekuatan ikatan hidrogen menentukan
kekuatan interaksi hidrofobik. Jika dibandingkan dengan kromatografi penukar
ion, pemisahan protein menggunakan kromatografi hidrofobik akan lebih bagus.
Kolom kromatografi ini terdiri dari selulosa atau dekstran. Kromatografi hidrofob
memiliki kesamaan dengan presipitasi amonium sulfat, yaitu menggunakan
prinsip salting-out (Scopes, 1994).
2.4 Koloidal Kitin
Koloidal kitin adalah kitin yang banyak digunakan sebagai substrat dalam
medium fermentasi. Senyawa ini diperoleh dengan menghidrolisis secara parsial
kitin dengan larutan asam klorida (HCl) 10 N (Chernin dkk., 1995). Untuk
menetralkan kembali kitin yang sudah dihidrolisis dengan HCl 10 N, ditambahkan
NaOH 10 N.
2.5 Achatina fulica
Achatina fulica merupakan bekicot asli dari Afrika Timur. Berbagai nama
sebutan untuk Achatina fulica diantaranya adalah Giant African Snail (GAS),
Agate snail, Schnecke, African snail, African giant, Kalutara, Caracol gigante
africano, Acatina africana, Gran caracol africano, Escargot géant africain,
Achatine de Madagascar (FAO, 1989).
Berikut ini merupakan klasifikasi Achatina fulica (Wallace, 2002)
Kingdom : Animalia
Phylum : Mollusca
Class : Gastropoda
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
19
ginjal
Order : Pulmonata
Family : Achatinidae
Genus : Achatina
Species : Achatina fulica
Achantina fulica merupakan hewan yang tergabung dalam kelas
gastropoda. Bagian tubuhnya terbagi atas empat bagian utama yaitu kepala, leher,
kaki, serta alat-alat dalam. Kepala Achatina fulica memiliki sepasang tentakel
pendek yang berfungsi sebagai indera pembau dan sepasang tentakel panjang
yang berfungsi sebagai indera penglihatan. Di bawah kepalanya terdapat kelenjar
muksosa yang berfungsi menghasilkan lendir. Anatomi Achatina fulica dapat
dilihat pada gambar berikut :
Gambar 2.9 Anatomi Achatina fulica
Cangkang Achatina fulica berfungsi sebagai rumah atau pelindung badan
untuk mempertahankan diri dari musuh (Santoso, 1989). Achatina fulica berjalan
menggunakan otot perutnya. Pada saat kondisi lembab atau basah, Achatina fulica
mata
tentakel
mulut
ganglia otak tali saraf tembolok
hati
lambung insang mata
ginjal
digestive gland
kaki
gonad
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
20
akan aktif. Sedangkan pada kondisi lingkungan yang kering, Achatina fulica
cenderung bersembunyi di bawah permukan tanah atau di dalam cangkangnya.
Hasil panen berupa daun atau bunga merupakan makanan yang cocok bagi
perkembangan Achatina fulica. Achatina fulica hidup di kondisi tanah yang bersih
dari sampah anorganik. Achatina fulica merupakan hewan invertebrata yang
hemaprodit. Achatina fulica bertelur pada saat usia satu tahun. Dalam kondisi
optimum, Achatina fulica dapat bertelur hingga empat kali dalam setahun (Mead,
1979).
Ekstrak enzim merupakan gabungan beberapa enzim yang melakukan
aktivitas bersama akan tetapi masing-masing enzim yang tergabung didalamnya
tetap berdiri sendiri. Achatina fulica yang berasal dari eropa timur (Helix pomatia)
dilaporkan memiliki kandungan ekstrak enzim yang terdiri dari enzim β-1,3-
glukanase, enzim β-1,4-glukanase dan kitinase (Gabriel dan Kopecka, 1987).
Helix pomatia dan Achatina fulica memiliki kesamaan dalam makanan yang
dikonsumsi yaitu berupa dedaunan atau batang pohon yang mengandung glukan,
selulosa, dan kitin (Kay, 1986). Sehingga Achatina fulica juga memiliki enzim
yang terdapat pada Helix pomatia yaitu β-1,3-glukanase, β-1,4-glukanase dan β-
1,4-glukanhidrolase. β-1,3-glukanase. Wheel (1961) menyatakan bahwa ekstrak
kelenjar saluran pencernaan (dygestive gland) Achatina fulica memiliki campuran
enzim karbohidrase yaitu berupa enzim kitinase, xilase, selulase, hemiselulase,
amilase, maltase, dan sukrase. Disamping itu, dygestive gland Achatina fulica
mengandung enzim protease, dan polipeptidase. Enzim kitinase mampu
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
21
menghidrolisis kandungan kitin yang terdapat dalam biofilm maupun dinding sel
jamur patogen.
2.7 Turbidimetri
Teknik spektroskopi dapat digunakan dalam menentukan struktur molekul
suatu senyawa. Terdapat banyak teknik spektroskopi yang sering digunakan
dalam pengukuran aktivitas enzim diantatanya adalah spektrofotometri UV-Vis
dan turbidimetri (Eisenthal, 2002).
Turbidimetri adalah pengukuran analit secara tidak langsung yang
analisisnya berdasarkan berkas sinar yang diteruskan (seperti spektrofotometri
UV-Vis). Turbidimetri mengukur kekeruhan sebagai sebab terjadinya perubahan
sistem OD. Metode ini digunakan untuk mengukur aktivitas enzim yang kerjanya
menghidrolisis polimer. Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya
mengenai larutan, maka cahaya tersebut akan dihamburkan. Sedangkan cahaya
yang tidak mengenai larutan akan diteruskan. Jumlah cahaya yang diteruskan
berbanding lurus dengan transmitan, sedangkan cahaya yang dihamburkan
berbanding terbalik dengan transmitan atau berbanding lurus dengan absorbansi
(Kosim, 2010). Turbidimetri mengukur variasi turbiditas suspensi koloidal kitin
selama kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat, contoh pada
pengukuran aktivitas enzim endokitinase.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
22222
22
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Biokimia Fakultas Sains dan
Teknologi, Universitas Airlangga, mulai bulan Februari 2012 sampai dengan
bulan Juni 2012.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
3.2.1 Alat-alat penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat
gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia, pHmeter dan termometer.
Sedangkan instrumen yang digunakan adalah timbangan analitik (Ohaus), lemari
pendingin (Toshiba Glasio), lemari pendingin -20oC (Royal), sentrifuga
(Universal 320R Zentrifugen), dan spektrofotometer UV-VIS (Pharmaspec UV-
1700 Shimadzu).
3.2.2 Bahan-bahan penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Achatina fulica,
kitin, akuades, aseton, HCl 10N, NaOH 10N, NaH2PO4.2H2O, asam sitrat,
Na2HPO4.2H2O.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
23
3.3 Diagram Alir Penelitian
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin
Sebanyak 5 gram kitin yang diperoleh dari laboratorium Kimia Fisik,
Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga. Kitin dilarutkan dalam 100
ml HCl 10 N lalu didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC, kemudian larutan
disaring. Adapun filtrat ditambahkan 50 ml akuades dingin dan 10 N NaOH
Uji aktivitas
Karakterisasi enzim kitinase
Optimasi fraksinasi aseton
Panen cairan disgestive gland Achatina fulica
Perlakuan terhadap Achatina fulica
Karantina Achatina
fulica
Achatina fulica
Kitinase dengan kemurnian parsial
Ekstrak enzim dygestive gland
Achatina fulica
Penentuan kadar protein
Data uji aktivitas Data kadar protein
Data uji aktivitas
Uji aktivitas Penentuan kadar protein
Data kadar protein
fulica
Suhu optimum enzim kitinase
pH optimum enzim kitinase
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
24
hingga mencapai pH 7. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm
selama 20 menit hingga berbentuk koloid. Selanjutnya, koloid diresuspensi
menggunakan akuades, disentrifugasi selama 15 menit dan disimpan pada suhu
4oC (Rochima, 2006).
3.4.2 Karantina Achatina fulica
Achatina fulica dikarantina dalam kandang yang tidak terkena sinar
matahari langsung. Kelembaban kandang senantiasa dijaga dengan cara memberi
air ke dalam kandang namun tidak terlalu banyak. Achatina fulica diberi makanan
berupa dedaunan dan sayur setiap hari minimal selama satu minggu.
3.4.3 Panen cairan disgetive gland Achatina fulica
Cangkang bagian belakang Achatina fulica dipecah, lalu cairan yang
keluar ditampung. Cairan digestive gland Achatina fulica yang sudah ditampung,
disentrifugasi dengan kecepaatan 4000 rpm. Jika terdapat endapan dan supernatan,
maka supernatan merupakan crude enzim Achatina fulica.
3.4.4 Pembuatan kurva standar koloidal kitin
Koloidal kitin yang sudah tersedia dilarutkan ke dalam bufer fosfat 50 mM
pH 7. Larutan induk dibuat dari koloidal kitin 0,25 % b/v. Untuk kadar koloidal
kitin selanjutnya dibuat dari pengenceran koloidal kitin induk.
3.4.5 Pembuatan kurva progres
Disiapkan enam tabung ependorf yang bersih. Ke dalam masing-masing
tabung, dimasukkan sejumlah 200 μl enzim kitinase dan 800 μl substrat kitin.
Masing-masing tabung diinkubasi dengan waktu yang berbeda. Pada tabung
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
25
pertama diinkubasi selama 10 menit, ke-dua diinkubasi 20 menit dan seterusnya
hingga tabung ke-enam. Setelah diinkubasi, diukur OD (Optical Density) pada
masing-masing sampel.
3.4.6 Optimasi fraksinasi aseton ekstrak kasar enzim kitinase
Fraksinasi aseton dilakukan pada kisaran prosentase 50 hingga 70.
Fraksinasi pertama, ekstrak enzim kitinase sebanyak 20 ml ditambahkan 50%
aseton, kemudian disentrifugasi, sehingga didapatkan residu fraksi 0-50% dan
supernatan. Fraksinasi ke-dua, supernatan diambil dan ditambahkan aseton hingga
70%, kemudian disentrifugasi, sehingga didapatkan residu fraksi 50-70% dan
supernatan.
Setiap endapan yang terbentuk pada masing-masing fraksi selanjutnya
dilakukan pengukuran aktivitas unit dan aktivitas spesifik kitinase. Apabila dalam
tahap fraksinasi ini belum terjadi pemisahan kitinase secara baik, yang ditandai
dengan nilai aktivitas kitinase yang masih menyebar, maka perlu dilakukan
optimasi variasi prosentase aseton pada prosedur fraksinasi.
3.4.7 Penentuan kadar protein
Penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry. Disiapkan larutan
A, B, C dan D. Larutan A dibuat dengan cara menimbang sebanayak 0,5 gram
Cu.SO4.5H2O dan 1 gram Na3C6H5O7.7H2O, kemudian dilarutkan dalam akuades.
Larutan tersebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml dengan akuades. Larutan B
dibuat dengan cara menimbang 20 gram Na2CO3 dan 4 gram NaOH, kemudian
dilarutkan dalam akuades 1 liter. Larutan C dibuat dari 1 ml larutan A ditambah
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
26
dengan 50 ml larutan B. Sedangkan larutan D dibuat dari 10 ml reagen fenol
Folin-Ciocalteu ditambah dengan 10 ml akuades.
Tahap pengukuran kadar protein dari enzim kitinase adalah, sebanyak 0,5
ml sampel enzim ditambah 2,5 ml larutan C. Hasil dari pencampuran keduanya
divortex. Kemudian ditambah dengan 0,25 ml larutan D, setelah itu diinkubasi
selama 20 menit, kemudian OD (Optical Density) dibaca pada λ750.
3.4.8 Uji aktivitas enzim kitinase setiap fraksi hasil fraksinasi aseton
Sejumlah 200 μl enzim kitinase ditambah dengan 800 μl substrat kitin
(0,25% kolodial kitin b/v dalam 50 mM bufer fosfat pH 7). Campuran diinkubasi
pada suhu 37oC selama 20 menit, kemudian dilakukan pengukuran aktivitas
kitinase.
Larutan standar kitin dibuat dari larutan koloidal kitin dengan berbagai
konsentrasi. Larutan standar pertama dibuat 0,25% b/v koloidal kitin yang
dilarutkan dalam bufer fosfat (pH 7) di dalam labu ukur 10 ml. Larutan standar ke
dua dibuat dari 0,25% b/v koloidal kitin yang ditambahkan bufer fosfat dengan
volume dan pH yang sama. Larutan standar dibuat hingga medapatkan tujuh
konsentrasi. Setelah itu, larutan standar diukur dengan spektrofotometer pada λ
660 nm (Kim, 2003).
Satu unit aktivitas adalah jumlah enzim yang menghidrolisis kitin 0,001%
(b/v) permenit permili dalam kondisi percobaan. Aktifitas kitinase diukur
berdasarkan pengukuran substrat yang dihidrolisis dari substrat awal oleh enzim
kitinase. Pengukuran aktivitas menggunakan metode turbidimetri yang
menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. OD (Optical Density) setiap sampel
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
27
diukur pada λ 660 nm (Kim, 2003) dan suhu kamar selama 20 menit. OD (Optical
Density) yang diperoleh dikonversi menjadi konsentrasi. Adapun perhitungannya
adalah,
Sisa koloidal kitin = koloidal kitin awal – koloidal kitin terhidrolisis
3.4.9 Karakterisasi enzim kitinase
3.4.9.1 Suhu optimum
Disiapkan 5 buah tabung bersih dan kering. Pada masing-masing tabung
dimasukkan kitinase kasar sebanyak 200 μl, dan ditambah dengan 800 μl substrat
kitin (0,25% kolodial kitin b/v dalam 50mM bufer fosfat pH 7) dengan volume 4
ml. Masing-masing tabung diinkubasi 20 menit pada suhu yang berbeda-beda,
yaitu 30oC, 37oC, 40oC, dan 50oC selama 20 menit. Rentang suhu yang digunakan
dalam pengukuran suhu optimum didasarkan pada penelitian dari Yong
dkk.(2005), bahwa kitinase stabil pada suhu 25-50oC.
3.4.9.2 pH optimum
Disiapkan 5 buah tabung bersih dan kering. Pada masing-masing tabung
dimasukkan kitinase kasar sebanyak 200 μl, dan ditambah dengan 800 μl substrat
kitin (0,25% kolodial kitin b/vdalam 50mM bufer fosfat pH 7). Masing-masing
tabung diinkubasi 20 menit pada pH yang berbeda-beda, yaitu 4, 5, 6, 7 dan 8
selama 20 menit. Rentang pH yang digunakan dalam pengukuran pH optimum
didasarkan pada penelitian dari Yong dkk.(2005), bahwa kitinase stabil pada pH
3-8.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
28
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pembuatan Substrat Koloidal Kitin
Kitin dibangun oleh unit-unit monomer N-asetilglukosamin (GlcNAc) yang
tergabung secara linier melalui ikatan β (1,4). Rantai kitin yang satu dengan yang
lainnya digabungkan oleh ikatan hidrogen, yaitu antara H pada gugus NH dari satu
rantai dengan O pada gugus C=O dari rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini
menyebabkan kitin membentuk formasi serabut (fibril) dan tidak dapat larut dalam
air. Kitin tidak dapat larut air, pelarut organik, alkali pekat, asam mineral encer, tetapi
larut dalam asam-asam mineral yang pekat (Yurnaliza, 2002).
Substrat koloidal kitin dalam penelitian ini dibuat dari limbah kulit udang sebagai
sumber kitin. Berdasarkan metode Chernin dkk (2003), pembuatan koloidal kitin terdiri
dari dua tahap yang meliputi tahap hidrolisis sebagian kitin dan penetralan. Sebanyak 5
gram kitin dilarutkan dalam 100 ml HCl 10 N. Larutan HCl 10 N termasuk asam
mineral yang pekat, sehingga dapat melarutkan kitin. Larutan kitin tersebut bewarna
kuning pucat, seperti wana kitin pada saat sebelum dilarutkan. Setelah larut, larutan
kitin didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC di lemari es. Tujuan penyimpanan
larutan kitin pada suhu 4oC adalah agar pada saat proses penetralan dengan NaOH 10
N tidak menimbulkan reaksi panas yang berlebih. Setelah penyimpanan, larutan
disaring untuk menghilangkan pengotor yang ada pada larutan kitin. Larutan tersebut
ditambah 50 ml akuades dingin. Hal ini dimaksudkan untuk mengencerkan larutan
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
29
kitin yang sangat asam dan menurunkan suhu dari larutan kitin tersebut. Setelah
ditambah akuades, larutan dinetralkan dengan NaOH 10 N. Penambahan NaOH
dilakukan secara perlahan-lahan supaya pH koloidal kitin yang diinginkan tepat
netral. Dibutuhkan sebanyak 34 ml volume NaOH untuk dapat menetralkan pH
larutan kitin. Pada saat penambahan NaOH pada larutan kitin, terbentuk koloid yang
berwarna putih. Setelah pH netral, koloid disentrifugasi selama 20 menit pada suhu
4oC. Tujuan koloid disentrifugasi adalah untuk mendapatkan endapan yang berupa
pelet koloidal kitin. Dari 184 koloidal kitin didapatkan sebanyak 10,0227 gram pelet
koloidal kitin. Pelet tersebut merupakan sediaan substrat koloidal kitin.
4.2 Karantina Achatina fulica
Achatina fulica dikarantina dalam kandang yang tidak terkena sinar matahari
langsung. Kandang dibuat bagian yang dapat dilalui udara tetapi tetap meminimalkan
sinar matahari masuk kedalam. Kelembaban kandang senantiasa dijaga dengan cara
memberi air ke dalam kandang namun tidak terlalu banyak. Selain itu pelepah pisang
juga berfungsi sebagai hal yang sama. Karantina dilakukan selama minimum satu
minggu. Achatina fulica diberi nutrisi berupa dedaunan dan sayuran seperti kubis,
daun papaya, daun singkong dan lain-lain. Pemberian makanan dilakukan secara rutin
agar kondisi Achatina fulica yang berada dalam kondisi yang homogen.
Kondisi lingkungan dan makanan Achatina fulica mempengaruhi enzim yang
diproduksi oleh digestive gland. Enzim yang dibentuk apabila terdapat induser
disebut enzim induktif. Induser berupa molekul substrat atau turunannya. Dalam hal
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
30
ini substrat dari enzim kitinase adalah senyawa yang terdapat dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari oleh Achatina fulica. Contoh lain enzim induktif adalah
pembentukan enzim beta-galaktosidase pada Escherichia coli yang diinduksi oleh
laktosa sebagai substratnya atau derivatnya.
4.3 Panen Cairan Disgetive Gland Achatina fulica
Cairan disgetive gland dari Achatina fulica merupakan ekstrak enzim yang
dihasilkan oleh Achatina fulica. Produksi ekstrak enzim diperoleh dari cangkang ekor
(apex) Achatina fulica yang dipecah, kemudian cairan yang keluar dari ekor
ditampung dalam beker es agar enzim tidak mengalami perubahan aktivitas. Hasil
ekstrak enzim berwarna biru tua yang masih tercampur dengan partikel padat dan
biomassa sel. Dari 50 ekor Achatina fulica didapatkan sebanyak 30 ml cairan
digestive gland.
Ekstrak enzim disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit,
terdapat endapan yang merupakan pengotor. Kecepatan 4000 rpm pada sentrrifuga
berfungsi mengendapkan pengotor selain protein. Pengotor tersebut adalah partikel
padat dan biomassa yang mempunyai masa dan kerapatan yang lebih besar daripada
cairannya. Sedangkan supernatan merupakan larutan ekstrak enzim, yang selanjutnya
akan dimurnikan secara parsial. Ekstrak enzim disimpan pada suhu dingin dan
tertutup agar tidak mudah rusak.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
31
4.4. Pembuatan Kurva Progres
Kurva progres kitinase dibuat dengan tujuan untuk mengetahui waktu
inkubasi yang sesuai untuk uji aktivitas enzim kitinase dari digestive gland Achatina
fulica.
Gambar 4.1 Kurva progres aktivitas kitinase dari digestive gland Achatina fulica
Kurva progres merupakan kurva perubahan substrat kitin terhadap waktu. Kurva
pada Gambar 4.4 merupakan profil kurva progres dari enzim kitinase. Perubahan
substrat terhadap waktu pada awalnya menunjukkan slope yang tinggi (garis a),
kemudian slope menurun dimulai dari menit ke-22. Pada lima menit pertama masih
sedikit substrat kitin yang dihidrolisis, setelah itu meningkat tajam hingga 20 menit
sehingga slope pada kurva tinggi (garis a) yang berarti memilki kecepatan orde 1.
Dimulai dari menit ke-22 substrat kitin terhidrolisis menurun dan menjadi nol hingga
y = 0.017x + 0.242R² = 0.991
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 20 40 60 80
kada
r ki
tin te
rhid
rolis
is (%
b/v)
waktu (menit)
a
22
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
32
menit ke-60 yang berarti memiliki kecepatan orde 0. Kadar substrat terhidrolisis
menurun karena enzim menjadi jenuh terhadap substrat, pada akhirnya, enzim
dihambat oleh produk yang terbentuk. Berdasarkan kurva progres, maka uji aktivitas
enzim dilakukan selama 20 menit karena reaksi enzimatis bekerja secara optimum.
4.5 Pembuatan Kurva Standar Koloidal Kitin
Koloidal kitin dibuat dengan berbagai kadar untuk diukur OD-nya pada λ660.
Koloidal kitin induk dibuat dengan kadar 0,25%b/v. kadar koloidal kitin berikutnya
dibuat dengan pengenceran induk.
Gambar 4.2 Kurva standar koloidal kitin
Semakin besar kadar koloidal kitin, maka akan semakin besar pula OD yang
didapat. Persamaan kurva koloidal kitin y = 1.422x + 0.060 dibuat untuk
mengkonversi OD dari setiap jumlah kitin yang terhidrolisis karena aktivitas enzim
kitinase.
y = 1.422x + 0.060R² = 0.990
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 0.1 0.2 0.3
OD
λ660
koloidal kitin %b/v
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
33
4.6 Optimasi Fraksinasi Aseton Ekstrak Enzim Kitinase
Pelarut organik untuk fraksinasi protein dipilih berdasarkan pertimbangan
dapat larut dengan air dan memilki efek presipitasi yang bagus. Pelarut organik yang
biasa digunakan adalah etanol dan aseton (Scopes,1994). Dalam penelitian ini dipilih
aseton sebagai pelarut organik untuk fraksinasi, karena aseton lebih mudah untuk
dipisahkan dari protein. Selain itu aseton tidak memiliki efek azeotrop sepeti etanol.
Azeotrop adalah kesetimbangan uap-cair campuran etanol dengan air, sehingga etanol
sulit dipisahkan sempurna, atau hanya dapat dipisahkan melalui destilasi dengan
perlakuan tertentu.
Sebanyak 20 ml ekstrak enzim kitinase digestive gland dari Achatina fulica
ditambahkan ke dalam aseton yang sudah bersuhu -20oC diaduk menggunakan
pengaduk magnet selama 8 menit. Volume aseton yang ditambahkan bergantung pada
prosentase fraksinasi yang diinginkan, sesuai dengan tabel fraksinasi Scopes. Suhu
harus tetap dijaga selama proses fraksinasi agar tidak di atas 0oC. Hal tersebut
dilakukan dengan cara selama proses frakasinasi gelas harus tetap berada di dalam
penangas es. Adapun dry es digunakan sebagai penangas es karena dapat menjaga
suhu hingga -20oC daripada es batu biasa yang hanya dapat menjaga suhu hingga 0oC
dan tidak stabil.
Kemudian campuran ekstrak dan aseton disentrifugasi pada suhu -10oC
selama 20 menit untuk memisahkan endapan dari supernatannya. Sebelum
digunakan, alat sentrifuga di-treatment terlebih dahulu dengan mengeset suhu di
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
34
dalam alat menjadi -10oC selama 20 menit. Hal tersebut dilakukan agar alat dapat
menyesuaikan suhu, sebelum dilakukan proses sentrifugasi. Karena pengondisian
suhu alat butuh waktu cukup lama. Apabila pengondisian suhu terjadi pada saat
campuran ekstrak enzim dan aseton sudah dimasukkan, maka sudah dipastikan enzim
akan rusak. Endapan dan supernatan kemudian dipisahkan. Pada saat aseton diaduk
bersama dengan enzim, molekul air yang berada di sekitar area hidrofob pada
permukaan enzim didesak oleh aseton, sehingga tetapan dielektrik air menurun. Hal
tersebut menyebabkan muatan-muatan molekul enzim berada mendekati permukaan
enzim sehingga terjadi gaya tarik-menarik elektrostatik muatan yang berlawanan
pada permukaan enzim satu dan yang lain. Tarik-menarik muatan yang berbeda
tersebut menyebabkan terjadinya agregasi molekul-molekul enzim. Molekul-molekul
enzim yang mengendap merupakan enzim yang sudah dimurnikan secara parsial.
Supernatan digunakan untuk fraksinasi selanjutnya. Sedangkan endapan
digunakan untuk uji aktivitas kitinase. Sebelum diuji aktivitasnya, endapan harus
benar-benar terbebas dari aseton yang tersisa. Aseton yang tersisa dihilangkan dengan
cara mengangin-anginkan di suhu ruangan, tetapi masih dalam lingkungan yang
steril. Pada permukaan endapan masih terdapat aseton sisa. Untuk
menghilangkannya, diserap dengan kertas saring yang sudah disterilkan.
Penghilangan aseton dimaksudkan untuk meminimalisasi denaturasi enzim pada
permukaan endapan. Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan akuades hingga tepat
larut.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
35
4.7 Penentuan Kadar Protein
Dalam penelitian ini digunakan metode Lowry., yang merupakan salah satu
metode pilihan untuk mementukan kadar protein dalam suatu bahan. Dalam keadaan
basa, ion tembaga divalen (Cu2+) membentuk suatu kompleks dengan ikatan peptida
yang mereduksi Cu2+ menjadi tembaga monovalen Cu+ . Ion Cu+ dan gugus radikal
dari tirosin, triptofan, dan sistein bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteau
membentuk senyawa kompleks yang berwarna. Pembentukan warna tersebut
disebabkan adanya reaksi antara basa tembaga dengan sampel protein yang diuji.
Intensitas warna yang terbentuk tergantung pada jumlah asam aromatik yang berbeda
untuk setiap jenis protein (Bintang,2009)
Data kadar protein diperlukan untuk menentukan besar aktivitas spesifik suatu
enzim. Kadar protein dari ekstrak dan enzim hasil setiap fraksinasi diukur. Semakin
besar kadar protein yang terukur, berbanding dengan jumlah protein selain enzim
yang masih ikut terlarut dalam larutan enzim.
4.8 Uji Aktivitas Enzim Kitinase Aseton Setiap Fraksi Hasil Fraksinasi
Kitinase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis kitin menjadi
monomernya yaitu N-asetilglukosamin. Untuk perhitungan aktivitas kitinase, satu
unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghidrolisis kitin 0,01%
(b/v) per menit per ml dalam kondisi percobaan.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
36
Metode pengukuran yang digunakan adalah menghitung jumlah susbtrat yang
terhidrolisis berdasarkan substrat sisa. Hasil OD (Optical Density) kontrol dikurangi
dengan OD kitin yang tersisa menghasilkan OD (Optical Density) yang kemudian
dikonversi ke dalam persamaan garis y= 1.422x + 0.060 untuk menghitung kadar
kitin.
Jumlah kitin yang terhidrolisis berbanding lurus dengan aktivitas enzim
kitinase. Semakin tinggi aktivitas enzim kitinase, maka semakin banyak jumlah kitin
yang terhidrolisis. Sejumlah 200 μl enzim ditambah 800 μl koloidal kitin, diinkubasi
selama 20 menit pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, enzim dipanaskan. Tujuan
pemanasan adalah untuk menghentikan reaksi enzim. Selama proses inkubasi
tersebut, terjadi reaksi pengikatan sisi katalitik kitinase terhadap kitin sehingga kitin
terhidrolisis. Uji aktivitas kitinase berhubungan erat dengan setiap fraksinasi karena
dapat memberikan informasi seberapa murni enzim yang dihasilkan.
Ekstrak enzim terlebih dahulu diuji aktivitas spesifiknya. Data ini digunakan
untuk mengetahui peningkatan aktivitas spesifik kitinase sebelum dan sesudah
N-asetil-β-glukoamidase Kitinbiosidase
Endokitinase dan lisosim
Gambar 4.3 Mekanisme kerja enzim kitinase terhadap polimer N-asetilglukosamin
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
37
dimurnikan. Untuk mendapatkan fraksi aseton yang dapat terkumpul sebanyak
mungkin aktivitas spesifik kitinase, dilakukan beberapa percobaan fraksinasi.
Percobaan pertama, fraksinasi dilakukan pada prosentase aseton 0-50 dan 50-70.
Dipilih prosentase aseton 0-50 dan 50-70 untuk fraksinasi karena pada umumnya
protein sitoplasma mengendap pada kisaran prosentase aseton tersebut.
Tabel 4.1 Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 1
Aktivitas spesifik banyak terkumpul di fraksi 50-70, yaitu sebesar 6,68.
Namun pada percobaan 1 (Tabel 4.1) aktivitas spesifik kitinase masih menyebar pada
fraksi 0-50, yaitu sebesar 5,37. Dengan harapan aktivitas kitinase dapat dikumpulkan
lebih banyak lagi dalam satu fraksi, Percobaan pertama aktivitas spesifik pada fraksi
0-50 ditarik ke fraksi ke-dua, yaitu dengan menambahkan aseton hingga fraksi kedua
menjadi 40-75 (sesuai dengan tabel Scopes). Data percobaan fraksinasi pertama
digunakan sebagai acuan fraksinasi ke-dua.
Fraksi OD λ660 Kadar kitin terhidrolisis
(%b/v)
Aktivitas (U/ml)
Kadar protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg)
0
0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985
0-50 0,0999 0,0281 1,53 2,8485 x10-1 5,37
50-70 0,2079 0,1041 1,17 1,75129x10-1 6,68
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
38
Tabel 4.2 Uji aktivitas hasil fraksinasi percobaan 2
Pada percobaan ke-dua, fraksinasi dimulai pada prosentase aseton 0-40 dan
dilanjutkan prosentase aseton 40-75. Pada percobaan ini diperoleh aktivitas spesifik
kitinase paling banyak berada pada fraksi 40-75, yaitu sebesar 9,6. Namun masih
tampak ada penyebaran aktivitas spesifik pada fraksi lain. Maka perlu dilakukan
percobaan selanjutnya untuk mencari fraksi terbaik yang dapat mengumpulkan
aktivitas spesifik kitinase.
Tabel 4.3 Uji aktivitas hasil fraksinasi percobaan 3
Fraksi OD λ660 Kadar kitin terhidrolisis
(%b/v)
Aktivitas (U/ml)
Kadar protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg)
0
0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985
0-40 0,2773 0,1528 2,865 3,2642 x10-1 8,8
40-60 0,4872 0,3004 9,39 4,2594 x10-1 22
60-80 0,2926 0,1636 0,818 8,0200 x10-1 10
Fraksi OD λ660 Kadar kitin terhidrolisis
(%b/v)
Aktivitas (U/ml)
Kadar protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg)
0
0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985
0-40 0,0958 0,0252 1,82 2,9435 x10-1 6,1
40-75 0,2558 0,1377 4,13 4,2918 x10-1 9,6
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
39
Pada percobaan ke-tiga dimulai dari fraksi 0-40, didapatkan aktivitas spesifik,
yaitu sebesar 8,8. Fraksinasi dilanjutkan pada fraksi 40-60, didapatkan aktivitas
spesifik, yaitu sebesar 22. Kemudian, fraksinasi berakhir pada fraksi 60-80,
didapatkan aktivitas spesifik, yaitu sebesar 10. Pada percobaan ini, aktivitas spesifik
kitinase terkumpul paling banyak pada fraksi 40-60. Namun, masih tampak aktivitas
spesifik kitinase yang tersebar pada fraksi 0-40 dan 60-80. Maka perlu dilakukan
percobaan selanjutnya untuk mencari prosentase aseton untuk fraksi terbaik yang
dapat mengumpulkan aktivitas spesifik kitinase.
Tabel 4.4 Uji aktivitas hasil fraksinasi percobaan 4
Percobaan ke-empat dilakukan berdasarkan hasil dari percobaan ke-tiga dengan
menaikkan prosentase aseton untuk fraksi ke-dua pada percobaan ini, yaitu 45-70.
Diperoleh aktivitas spesifik kitinase paling banyak terkumpul pada fraksi 45-70, yaitu
sebesar 38,6. Pada fraksi 70-80 aktivitas spesifik kitinase sangat rendah.. Namun
begitu, masih terdapat aktivitas spesifik yang menyebar di fraksi 0-45.
Fraksi OD λ660 Kadar kitin terhidrolisis
(%b/v)
Aktivitas (U/ml)
Kadar protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg)
0
0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985
0-45 0,3114 0,1999 1,8785 1,3634 x10-1 13,7
45-70 0,5275 0,3288 9,864 2,6706x10-1 38,6
70-80 0,0970 0,0260 0,09375 1,0407 x10-1 0,9
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
40
Pada percobaan ke-empat didapat fraksinasi terbaik, akan tetapi aktivitas spesifik
tersebar pada fraksi lain. Hasil ini diduga pada ekstrak enzim kitinase dari Achatina
fulica terdapat isozim. Isozim adalah enzim yang berbeda dalam sifat fisika, transpot
ion dan transpot asam basa dan sejumlah proses metabolisme (Tufts, 2006).
4.9 Karakterisasi Enzim Kitinase
4.9.1 Suhu optimum
Salah satu faktor yang mempengaruhi enzim, dalam hal ini enzim kitinase,
adalah suhu. Pada penelitian, aktivitas enzim kitinase terhadap pengaruh suhu diamati
pada suhu 30oC, 37oC, 45oC, dan 50oC. Suhu mempengaruhi energi yang diperlukan
oleh enzim untuk melakukan reaksi. Peningkatan suhu, akan meningkatan energi
kinetik enzim. Jika suhu rendah, maka enzim tidak memiliki cukup energi untuk
melakukan reaksi, sehingga tidak dapat bekerja secara optimal. Sedangkan jika pada
suhu tinggi, enzim akan terdenaturasi. Pada suhu optimumnya energi yang diperoleh
untuk enzim bereaksi dengan optimal tanpa denaturasi (Champe dan Harvey, 1994).
Gambar 4.3 Suhu optimum fraksi 45-70
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
20 30 40 50 60
Kad
ar k
itin
ter
hid
rolis
is (
%b
/v)
Suhu
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
41
Kadar kitin terhidrolisis bertamabah dimulai dari suhu 30 oC dan 37oC.
Kemudian terjadi penurunan di suhu 45, 50oC.. Hal ini berarti terjadi penurunan
aktivitas dari enzim kitinase. Terjadi penurunan aktivitas karena atom-atom dalam
molekul enzim memiliki energi yang besar untuk bergerak yang disebabkan oleh
perubahan bentuk struktur enzim akibat meningkatnya getaran termal komponen
atom-atomnya, sehingga enzim terdenaturasi (Lehninger, 1997).
Diperoleh suhu optimum enzim kitinase hasil pemurnian parsial fraksi 45-70
yaitu pada suhu 37oC. Pada suhu ini, konformasi enzim dalam keadaan paling sesuai
untuk berikatan dengan substrat, sehingga enzim lebih aktif dalam mengkatalisis
reaksi.
4.9.2 pH optimum
Faktor lain yang penting mempengaruhi aktivitas enzim kitinase adalah pH.
Setiap enzim memiliki pH optimum, karena pH berhubungan dengan struktur enzim
yang berupa asam amino. Profil aktivitas pH enzim menunjukkan pH pada saat gugus
fungsi yang penting pada sisi katalitik berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
42
Gambar 4.4 pH optimum enzim kitinase fraksi 45-70
Nilai pH optimum pada fraksi 45-70 adalah pH 7. Sesuai dengan kurva pada
Gambar 4.4, jumlah kitin terhidrolisis meningkat dari pH 5 hingga pH7. jumlah kitin
terhidrolisis menurun secara signifikan dari pH7 ke pH 8. Dengan adanya perubahan
pH maka akan mempengaruhi perubahan ionisasi gugus fungsi asam amino enzim
ataupun substrat. Sehingga konformasi enzim dapat berubah dan dapat
mengakibatkan penurunan aktivitas enzim yang disebabkan konformasi enzim tidak
sama dengan konformasi substrat (Lehninger, 1997).
0.150.160.170.180.19
0.20.210.220.230.24
5 6 7 8 9
Kit
in t
erh
idro
lisis
(%
b/v
)
pH
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
43
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah diuraikan, dapat disimpulkan.
1. Fraksi aseton 45-70 merupakan fraksi optimum dari fraksinasi aseton,
yang memiliki aktivitas spesifik sebesar 38,6.
2. Peningkatan kemurnian enzim kitinase setelah fraksinasi aseton sebesar
6,45 kali.
3. Enzim kitinase dalam keadaan murni parsial memiliki pH optimum 7 dan
suhu optimum 37 oC.
5.2 Saran
Berdasarkan hasil aktivitas spesifik kitinase yang masih menyebar dalam
pemurnian parsial menggunakan fraksinasi aseton, dimungkinkan adanya isozim
dalam ekstrak enzim kitinase. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut untuk
mengetahui ada tidaknya isozim dalam ekstrak enzim kitinase.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
44
DAFTAR PUSTAKA
A.J. Esbaugh , B.L. Tufts, 2006, The Structure And Function of Carbonic Anhydrase Isozymes In The Respiratory System Of Vertebrate,Respiratory, Physiology & Neurobiology, 154, 185–198
Bartnicki-Garcia, S., 1989, The Biotcheical Cytology of Chitin and Chitosan Synthesis in Fungi, Dalam G. Skjak, B. T. Anthonsen and P.A. Sanford (Eds). Procedings of the 4th International Conferenceon Chitin and Chitosan. Elsevier. Applied Science,Barking-UK
Bintang, Maria, 2010, Teknik Penelitian Biokimia, Erlangga, Bogor Brurberg, May B., Ingolf F., Nesl dan Eijsink, Vincent G.,1996, Comparative studies
of chitinases A and B from Serratia marcescens, Microbiology, 142, 1581-1 589
Bondanzsky M., 1998, Kimia Peptida, Alih bahasa prof. Dr. Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB Bandung, hal 46-47.
Cabib, E. 1987. The Synthesis and Degradation of Chitin. Dalam A. Meister (Ed)
Advances in Enzymology. Vol. An Interscience Publication John Willey and Sons Inc., New York, 59, 59 – 101
Carlile, M. J. dan S.C. Watkinson, 1994, The Fungi, Academis Press, Harcourt Brace
and Company Publishers, London Chernin, L., Z. Ismailo, S. Haran dan I. Chet, 1995, Chitinolytic Enterobacter
Agglomerans Antagonistic to Fungal Plant Pathogens. Appl. Environ.
Microbiol., 61 :1720 – 1726
Champe, P.C and Ricard, A. Harvey, 1994, Biochemistry, Second edition, Lippicott Company, Piladelphia.
Cohen-Kupiec R, Chet I., 1998, The Molecular Biology of Chitin Digestion, Curr Opinion, Biotechnol., 9, 270-277
Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2000, Budidaya Bekicot (Achanita spp.), BPP Teknologi, Jakarta
Douglas, L.J., dan M.A. Al-fattani, 2006, Biofilm Matrix of Candida albicans and Candida tropicalis: Chemical Composition and Role in Drug Resistance, Journal of Medical Microbiology, Glasgow
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
45
Eisenthal, Robert dan Danson, Michael.J., 2002, Enzyme Assays, Second edition, Oxford University Press, New York
FAO, 1989, Data sheet on the Giant African Snail, www.ecoport.org, 21 November 2011
Flach, J., Pilet, P. E., dan Jolles, P., 1992, What’s New in Chitinase Research?,
(Reviews) Experientia, 48, 701-716
Fleuri, Luciana F., Kawaguti, Haroldo Y., Sato, Helia H., 2009, Production, Purification and Application of Extracellular Chitinase from Cellulosimicrobium cellulans, Brazilian journal of Microbiology, Brasil
Gabriel, B., Frankowski, F., dan Bani, H., 1999, Microbiology, University of
Rostock, German Gabriel, Miroslav dan Marie Kopecka, 1987, Studies on Cell Division In
Regenerating Protoplasts of the Yeast Schizosaccharomyces Japonicus,
Department of Biology, Faculty of Medicine, J . E. Purkyne' University, Czechoslovakia
Herdyastuti, Nuniek., Raharjo, Tri Joko dan Mudasir, Matsjeh., Sabirin, 2009,
Chitinase and Chitinolytic Microorganism : Isolation, Characterization and Potential, Indo. J.Chem, 9 (1), 37-47
Harman, G. E., C.K. Hayes, M. Lorito, R. M. Broadway, A. Di Pietro, C. Peterbauer dan A. Tronsmo, 1993, Chitinolytic Enzymes of Trichoderma harzianum : Purification of Chitobiosidase and Endochitinase. Phytopathology, 83, 313-318
Jeaniaux, C, 1966, Chitinases, Dalam E, F. Neufeld and V. Ginburg (Eds.) Complex
Carbohydrates, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Vol. VII, 644 – 650
Kamiliyah, Hikmatul, 2011, Peningkatan Daya Antifungi Ekstrak Kayu Manis
(Cinnamomum Burmannii L.) Terhadap Candida albicans dengan Konsorsium Enzim Siput (Achatina Fulica), Skripsi, Program S-1 Kimia, Universitas Airlangga, Surabaya
Kay, Alison, 1986, The Conversation Biology of Molluscs, IUCN Publishing, Gland, Switzerland
Kosim, Mukhamad dan Putra, Surya Rosa, Pengaruh Suhu Pada Bacillus Subtilis, Prosiding Skripsi Semester Genap 2009-2010, ITS, Surabaya
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
46
Lehninger, Albert, 1998, Dasar-dasar biokimia, jilid 1, Airlangga, Jakarta Marks, B. Dawn, 1996, Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis, alih
Bahasa: Brahm U, EGC, Jakarta Marti´nez, Jose, P. M. Luisa Gil, Jose´ L. Lo´ Pez-Ribot, dan W. Lajean Chaffin3.,
1998, Serologic Response to Cell Wall Mannoproteins and Proteins of Candida albicans, Clinical Microbiology Reviews, American Society for Microbiology
Mead, A.R, 1979, Economic Malacology with Particular Reference to Achatina
fulica. In V. Fretter & Peake, J. (eds.), The Pulmonates, Academic Press, New York, Vol. 2B
Ottoway JH, Appa DK., 1984, Biochemistry, Edisi ke-4 Cambrige: ELBS.
Poedjiadi, Anna, 1994, Dasar-Daasr Biokimia, UI-Press, Jakarta
Rajarathanam, S., M. N. J. Shashirekha dan Z. Bano. 1998. Biodegradative and Biosinthetic Capacities of Mushrooms : Present and Future Strategies. Crit. Rev. in Biotechnol., 18, 91 – 236
Rochima, E., 2006, Pemurnian dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil dari Bacillus papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelauatan universitas Padjajaran, Jatinangor, Bandung 8, 193-209
Sahai , A. S. dan M. S. Manocha, 1993, Chitinases of Fungi and Plants : Their
Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction. FEMS
Microbiol., Rev. 11 : 317 – 338 Santoso, H.B., 1989, Budidaya Bekicot, Kanisisus,Jakarta Scopes, R. K. 1994. Protein Purification, Principles and Practice, Third edition,
Springer-Verlag, New York.
Stryer, Lubert, Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., 2002, Biochemistry, Fifth edition, W. H. Freeman and Company, New York
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
47
Thermo Fisher Scientific, 2009, Pierce Biotechnology, www.thermo.com/pierce 12 November 2011
Toharisman, Aris. 2007. Peluang Pemanfaatan Enzim Kitinase di Industri Gula
Voet, Donald dan Judith G. Voet, 2004, Biochemistry Volume I, J. Wiley and Sons, Canada
Wang, Y., Kausch, A.P., Chandlee, J.M., Luo, H., dan Ruemmele, B.A., 2003, Plant
Sci., 165, 497-506
Wallace, R.L., 2002, Invertebrate Zoology, Prentica Hall. Inc, United State of America
Wheel, B.P. Van, 1961, The Comparative Physiologi of Digestion in Molluscs, AM. Zoologis, Department of Zoology and Entomology, University of Hawaii, USA
Yong, Tao et al .2005. Purification and Characterization Extracellular Chitinase
Produced by Bacterium C4. Annals of Microbiology, 55 (3)
Yurnaliza, 2002, Senyawa Khitin dan Kajian Aktivitas Enzim Mikrobial Pendegradasinya. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Program Studi Biologi Universitas Sumatera Utara
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
Lampiran 1. Pembuatan reagen
A. Pembuatan larutan bufer fosfat
Larutan stok A NaH2PO4 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,12 g NaH2PO4.2H2O,
kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tersebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml
hingga tanda batas. Larutan stok B 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,56 g
Na2HPO4.2H2O, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tercebut diencerkan dalam labu
ukur 100 ml hingga tanda batas. Besarnya pH bufer diukur pada pH-meter. Adapun komposisi
larutan stok A dan B untuk memperoleh bufer fosfat pH 6, 7, dan 8 adalah sebagai berikut :
Larutan stok A (ml) Larutan stok B (ml) Larutan bufer fosfat pH
43,85 6,15 6
19,5 30,5 7
2,65 47,35 8
B. Pembuatan larutan bufer fosfat sitrat
Dibuat larutan stok A asam sitrat 0,1 M dengan cara menimbang 1,9121 gram asam sitrat,
kemudian dilarutkan dalam akuades. Larutan tersebut diencerkan ke dalam labu ukur 100 ml,
hingga tanda batas. Larutan stok B Na2HPO4.2H2O 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,56
gram Na2HPO4.2H2O, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tersebut diencerkan dalam
labu ukur 100 ml hingga tanda batas. Larutan bufer fosfat sitrat memiliki pH 4-7 sebanyak 100
ml. Besarnya pH bufer diukur pada pH-meter. Adapun komposisi larutan stok A dan B untuk
memperoleh larutan bufer fosfat sitrat pH 4, 5, 6, dan 7 sebagai berikut :
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
Larutan stok A Larutan stok B pH
24,3 25,7 5
17,9 32,1 6
6,5 43,6 7
Lampiran 3. Pembuatan larutan NaOH 10 N
Larutan NaOH 10N dibuat dari 40 gram NaOH yang dilarutkan dengan akuades. Setelah
itu, larutan diencerkan dalam labu ukur 100 ml.
Lampiran 4. Pembuatan larutan HCl 10 N
Sebanyak 83,3 ml larutan HCl 12 N, diencerkan dalam labu uku 100 ml.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
Lampiran 5. Tabel prosentase aseton (ml) yang ditambahkan ke dalam 1 liter enzim
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
Lampiran 6. Perhitungan aktivitas kitinase
U = x x x
Percobaan Fraksi Volume yang diperlukan untuk tepat larut
Perhitungan aktivitas unit/ ml
1 0-50
18 ml U = x x = 0,70
50-70
9 ml U = x x x = 20,79
2 0-40
14 ml U = 0.0252 x x x = 0.0260
40-75
24 ml U = 0.1377x x x = 0.0344
3 0-40
15 ml U = 0.1528 x x x = 0.0382
40-60
25 ml U = 0.3004 x x x = 0.0751
60-80
4 ml U = 0.1636 x x x = 0.0409
4 0-45
8,5 ml U =0.1999 x x x = 0.0442
45-70
24 ml U = 0.3288 x x x = 0.0822
70-80
7,5 ml U = 0.0260 x x x = 0.0065
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
Lampiran 7. Data Primer
A. OD koloidal kitin dan OD protein hasil fraksinasi percobaan 1-4
B. ODλ750 BSA (Bovine Serum Albumin)
Konsentrasi BSA (μg/ml)
ODλ750
100 0.4439
200 0.8337
300 1.317
400 1.6609
y = 0.004x + 0.030R² = 0.996
0
0.5
1
1.5
2
0 200 400 600
OD
λ75
0
Kadar protein
Kurva standar BSA
Percobaan Fraksi ODλ660 kontrol ODλ660 kitin OD λ750 protein
0 0 0,6112 0,5123 1,6807 1
0-50 0,6311 0.5312 1,4760
50-70 0,6312 0.4233 1,5867 0-40 0.5330 0.0959 1,7120 2 40-75 0.3754 0.2558 1,4606 0-40 0.6 216 0.3443 1.7709 3 40-60 0.6521 0.1649 1.6370 60-80 0.6358 0.3432 1.3939 4 0-45 0.6557 0.3443 1.3132 45-70 0.6365 0.2090 0.9202
70-80 0.6254 0.5284 1.1401
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum
top related