2012_ review spektro uv-vis

UV-VIS 2012

SpectrofotometriSpectrofotometri

E-mail: sudib_kekes@yahoo.co.id

1

2UV-VIS 2012

SpektrofotometriSpektrofotometri

Teknik analisis yang berhubungan dengan

penggunaan cahaya untuk

- melihat pola spektrum senyawa- mengukur konsentrasi bahan

kimia

3UV-VIS 2012

Alat apa yang digunakan ?

Spektrofotometer

Instrumen/AlatInstrumen/Alat

4UV-VIS 2012

5UV-VIS 2012

Conventional Spectrophotometer

Optical system of a double-beam spectrophotometer

7UV-VIS 2012

Radiasi ElektromagnetikRadiasi Elektromagnetik

Energi Energi vs

9UV-VIS 2012

10UV-VIS 2012

11UV-VIS 2012

SpektrofotometriSpektrofotometri

Ultraviolet:

: 190 - 400 nm

Visibel (sinar tampak):

: 400 - 700 nm

12UV-VIS 2012

13UV-VIS 2012

Spektrofotometri UVSpektrofotometri UV

Dasar analisis:- senyawa harus memiliki kromofor dan

auksokrom yang memadai

- kromofor adalah bagian molekul yang bertanggung jawab pada penyerapan cahaya

- auksokrom adalah gugus fungsi yang memiliki hetero atom dan menempel

langsung pada sistem kromofor

14UV-VIS 2012

Spektrofotometri VisibelSpektrofotometri Visibel

Dasar analisis:- Senyawa asli/asal harus berwarna - Bila senyawa asli tidak berwarna,

dapat diubah menjadi senyawa berwarna dengan cara:

a. pembentukan senyawa komplekb. memperpanjang kromofor

15UV-VIS 2012

Colors of Visible lightColors of Visible light

16UV-VIS 2012

17UV-VIS 2012

Penyerapan warna yang berbeda

Penyerapan warna yang berbeda

UV-VIS 2012

Absorption of visible light

Where has the energy that was within the photons gone to ?

18

Transmission and Color

The human eye sees the complementary color to that which is absorbed

20UV-VIS 2012

UV-VIS 2012

Lycophene [ dalam Tomat ]Lycophene [ dalam Tomat ]

21

UV-VIS 2012

Zeaxanthin [ dalam Jagung ]

Zeaxanthin [ dalam Jagung ]

22

UV-VIS 2012 23

UV-VIS 2012

Senyawa berwarnaSenyawa berwarna

Karena

Senyawa Kompleks

24

Kompleks logam berwarna dikarenakan:

Charge transfer transition

Perpindahan elektron (e-) dari: ion logam ke ligan

atau sebaliknya

UV-VIS 2012

Senyawa kompleksSenyawa kompleks

Fe(CNS)3

Ferri salisilat

Protein-Biuret

ungu

ungu

merah darah

26

Reaksi Biuret

ungu, 546 nm

NHO

NH

O

R

R

O

NH

O

R

R

Cu

peptidapeptida

NHNHO

NH

O

peptida

R

R

Cu2+

OH+2

ligan

ion logam

Papaverin HClPapaverin HCl

N

CH2

OCH3

OCH3

H3CO

H3CO .HCl

UV-VIS 2012

Kunang-kunang

29

30UV-VIS 2012

UV-VIS 2012 31

32UV-VIS 2012

UV-VIS 2012

Asam salisilatAsam salisilat

C

O

OH

H

O

33

UV-VIS 2012

Absorpsi UV-VISAbsorpsi UV-VIS

akan mempromosikan (mentransisikan)

elektron

* (!)n *n * *

34

36UV-VIS 2012

Diagram Energi ElektronDiagram Energi Elektron

ENERGI

* [ anti ikatan ]

* [ anti ikatan ]

n [ tak terikat ]

[ ikatan ]

[ ikatan ]

UV-VIS 2012

Transisi n π*Transisi n π*

Jenis transisi ini memiliki nilai ε kecil

Forbidden transition

38

UV Excitation of 1,3-butadiene

1,3-butadiene

Transisi *

*

Benzen kromoforBenzen kromofor

A1%1 cm

Electronic TransitionElectronic Transition

UV-VIS 2012

PustakaPustaka

Moffat, A.C., 1986, Clarke’s Isolation and iden- tification of drugs in pharmaceuticals,

body fluids, and post-mortem material, Second edition,

Pharmaceutical Press London.

Informasi Yang Diperoleh:- Kelarutan - Tes warna

- pKa - logP - Gas Chromatogr.- UV Spectrum - Infra Red Spectr.

- TLC - HPLC42

PustakaPustaka

Galichet, L.Y., (Managing Editor), (2005) Clarke’s

Analysis of Drug and Poisons, Pharmaceu- tical Press, London.

Informasi Yang Diperoleh:- Kelarutan - Tes warna

- pKa - logP - Gas Chromatogr.- UV Spectrum - Infra Red Spectr.

- TLC - HPLC

UV-VIS 2012 43

44UV-VIS 2012

SpektrofotometriSpektrofotometri

Analisis Kualitatif

45UV-VIS 2012

FenobarbitalFenobarbital

C

H3C-H2CC

C

NH

NH

C O

O

O

C

H3C-H2CC

C

NH

N

C O

O

O

_

Ultraviolet Spectrum

C

H3C-H2CC

C

NH

N

C O

O

O

_

47UV-VIS 2012

Fenobarbital dalam larutan bufer pH 9,2

Fenobarbital dalam larutan bufer pH 9,2

C

H3C-H2CC

C

NH

N

C O

O

O

_

Kromofor

Auksokrom

48UV-VIS 2012

Spektrum propil barbitalSpektrum propil barbital

49UV-VIS 2012

Spektrum propil barbitalSpektrum propil barbitalSpektrum propil barbitalSpektrum propil barbital

C

H3C-H2CC

C

NH

NH

C O

O

O

Fenobarbital

Propil barbital

UV-VIS 2012

Spektrum propil barbitalSpektrum propil barbitalSpektrum propil barbitalSpektrum propil barbital

C

H3C-H2CC

C

NH

NH

C O

O

O

Fenobarbital

Propil barbital

C

C

NH

NH

C O

O

O

H2C=CH-CH2

H2C=CH-CH2

C

239254

241256

max [ nm ]

50

51UV-VIS 2012

Sulfadiazin

N

N

H2N S

O

O

NH

N

N

H2N S

O

O

NH

H2N S

O

O

NH

N

N

CH3

N

N

H2N S

O

O

NH

CH3

CH3

Sulfadiazin

Sulfamerazin

Sulfamezatin

max [ nm ]

242254

242255

243258

53UV-VIS 2012

Procain (dalam: asam, basa)Procain (dalam: asam, basa)

54UV-VIS 2012

Phenylephrine (dalam: asam, basa)

Phenylephrine (dalam: asam, basa)

55UV-VIS 2012

SpektrofotometriSpektrofotometri

Analisis Kuantitatif

56UV-VIS 2012

Syarat Analisis Kuantitatif Secara Spektrofotometri

Suatu Zat

Syarat Analisis Kuantitatif Secara Spektrofotometri

Suatu Zat

Zat yang akan dianalisis harus memiliki kromofor yang mencukupi [ Amati dari nilai

koefisien ekstingsi Molar-nya ( ) harus lebih dari 1000 M-1.cm-1].

Larutan akhir sebelum diukur absorbannya harus jernih. Bila tidat jernih Terjadi penghamburan sinar oleh partikel yang tidak larut tersebut. Bgmn dengan nilai Abs. ?

57UV-VIS 2012

Dasar Analisis Dasar Analisis KuantitatifKuantitatif

Dasar Analisis Dasar Analisis KuantitatifKuantitatif

Hukum Lambert-Beer

A = logTP

Plog 0

10

A = b c

58UV-VIS 2012

59UV-VIS 2012

Mana yang lebih disenangi

pembacaan Absorban atau Transmitan

Mana yang lebih disenangi

pembacaan Absorban atau Transmitan

60UV-VIS 2012

Mengapa pembacaan Absorban tidak boleh lebih dari

satu

Mengapa pembacaan Absorban tidak boleh lebih dari

satu

61UV-VIS 2012

62UV-VIS 2012

Absorban vs indeks biasAbsorban vs indeks bias

22 2n

ncbεA

A = Absorbanε = koefisien ekstingsi molar (M-1.cm-1)

b = tebal larutan (kuvet) (cm)C = konsentrasi larutan (Molar, M)

n = indeks bias larutan

UV-VIS 2012

The Magnitude of Molar absorptivity is 0 to around 105

= 0.87 x 1020 x P x a

P: transition probability (0 to 1) a: cross sectional target area in square centimeters (for organic molecules, this number is around 10-15 cm2).

Forbidden transition, P = 0.01; < 103

Allowed transition, P = 0.1 to 1 Weak absorption, = 103 L/ (mol*cm)Strong absorption, = 104 to 105 L/ (mol*cm)

63

UV-VIS 2012

Untuk Analisis KuantitatifUntuk Analisis Kuantitatif

Senyawa yang

memiliki nilai koefisien ekstingsi molar [ ]

mudah dianalisis secara spektrofotommetri

≥ 1000 M -1. cm -1

64

Rumus Pendekatan

Pada pelarut dan tertentu

1%1cmA

Rumus Pendekatan

A = b c

= x 10

BM1%1cmA

= M-1. cm-1

67UV-VIS 2012

PK. Ibuprofen, Spektro-UVPK. Ibuprofen, Spektro-UV

COOH

CH3

CH3

H3C

BM = 206,3

68UV-VIS 2012

PK. Ibuprofen Spektro UV

PK. Ibuprofen Spektro UV

Pelarut ( 265

nm )

Air-basa 18,5

1%1cmA

69UV-VIS 2012

PK. Clonidin, Spektro-UVPK. Clonidin, Spektro-UV

BM = 230,1

70UV-VIS 2012

PK. Clonidin, Spektro-UVPK. Clonidin, Spektro-UV

71UV-VIS 2012

PK. Difenilhidantoin, Spektro-UV

PK. Difenilhidantoin, Spektro-UV

NH

HN

O

O

BM = 252,3

72UV-VIS 2012

PK. Difenilhidantoin Spektro UV

PK. Difenilhidantoin Spektro UV

Pelarut

Metanol

258 nm 264 nm

27 16

1%1cmA

73UV-VIS 2012

PK. Clotrimazol, Spektro-UVPK. Clotrimazol, Spektro-UV

BM = 344,8BM = 344,8

74UV-VIS 2012

PK. Clotrimazol, Spektro-UVPK. Clotrimazol, Spektro-UV

75UV-VIS 2012

PK. Ampisilin, Spektro-UVPK. Ampisilin, Spektro-UV

BM = 349,4

76UV-VIS 2012

PK. Ampisilin, Spektro-UVPK. Ampisilin, Spektro-UV

77UV-VIS 2012

PK. Amoksisilin, Spektro-UVPK. Amoksisilin, Spektro-UV

BM = 365,4

78UV-VIS 2012

PK. Amoksisilin, Spektro-UVPK. Amoksisilin, Spektro-UV

79UV-VIS 2012

PK. Metampiron, Spektro-UVPK. Metampiron, Spektro-UV

NN

ON-CH2-SO3

CH3

CH3

CH3

Na+

BM = 351,4

80UV-VIS 2012

PK. Metampiron Spektro UV

PK. Metampiron Spektro UV

Pelarut ( 258

nm )

Air-asam 266

1%1cmA

81UV-VIS 2012

PK. Cortison, Spektro-UVPK. Cortison, Spektro-UV

BM = 360,4

82UV-VIS 2012

PK. Cortison, Spektro-UVPK. Cortison, Spektro-UV

83UV-VIS 2012

Apa Manfaat

Untuk Analisis Kuantitatif

???

Apa Manfaat

Untuk Analisis Kuantitatif

???

1%1cmA

84UV-VIS 2012

SulfadiazinSulfadiazin

1%1cmA

Dalam etanol p.a, Sulfadiazin

memiliki

maks 270 nm dengan

Nilai = 8441%1cmA

85UV-VIS 2012

Perkiraan Nilai AbsorbanPerkiraan Nilai Absorban

Berdasarkan Perhitungan Teorits Dari Nilai

dalam literatur

1%1cmA

86UV-VIS 2012

Larutan induk Sulfadiazin 100 mg/100 mL (= 1 µg/µL)

Larutan induk Sulfadiazin 100 mg/100 mL (= 1 µg/µL)

Dipipet …. µL larutan induk, masukkan ke labu 25,0 mL. Tambahkan etanol ad 25,0 mL.

No. Li (µL) Tambahan etanol

(mL)

Kadar

(mg/25mL)

Absorban

teoritis

1 50 24,950 0,05 0,1692 100 24,900 0,10 0,3383 150 24,850 0,15 0,5064 200 24,800 0,20 0,6755 250 24,750 0,25 0,844

Y = b X + a r = …… ?

87UV-VIS 2012

Nilai Absorban NyataNilai Absorban Nyata

Berdasarkan Hasil Pengukuran Pada Spektrofofometer

pada Nilai maks

88UV-VIS 2012

Larutan induk Sulfadiazin 100 mg/100 mL (= 1 µg/µL)

Larutan induk Sulfadiazin 100 mg/100 mL (= 1 µg/µL)

Dipipet …. µL larutan induk, masukkan ke labu 25,0 mL. Tambahkan etanol ad 25,0 mL.

No. Li (µL) Tambahan etanol

(mL)

Kadar

(mg/25mL)

Absorban

nyata

1 50 24,95 0,05 0,1702 100 24,90 0,10 0,3373 150 24,85 0,15 0,5124 200 24,80 0,20 0,6795 250 24,75 0,25 0,850

Y = 3,404 X - 0,001 r = 0,9999

89UV-VIS 2012

Setujukah Anda Dengan Teknik

Perhitungan Kadar

Obat

Tanpa Menggunakan

Standar

???

UV-VIS 2012

CTMCTM

N CH(CH2)2N

Cl

CH3

CH3

OH

OH

H

H

O

O

.

90

UV-VIS 2012

PK. CTM PK. CTM

Chinese Pharmacopoeia, Vol.II, 2005 [ p.185 ]Assay:

Measure the absorbance of the solution containing 20 g per mL in hydrochloric acid

solution ( 1 100 ) at 264 nm.Calculate the content of C16H19ClN2.C4H4O4,

taking 217 as the value of A ( 1%, 1 cm )

91

UV-VIS 2012

CTMCTM

1%1cmA

Dalam larutan HCl ( 1 100 ), CTM memiliki

maks 264 nm dengan

Nilai = 2171%1cmA

92

UV-VIS 2012

PK. Tablet AminofilinPK. Tablet AminofilinBritish Pharmacopoeia, Vol.III, 2007 [ p.2313 ]

Tablet Aminofilin:mengandung teofilin 80,6 – 90,8 % dan

etilendiamin tidak kurang dari 10,9 %.

Hitung kadar teofilin menggunakan nilai A 1% 1cm Teofilin dalam larutan NaOH 0,1 M pada 275 nm = 650.

Untuk Etilendiamin, ditetapkan secara titri-metri dengan larutan baku H2SO4 0,05 M, indi-kator larutan bromcresol green.

93

94UV-VIS 2012

TeofilinTeofilin

95UV-VIS 2012

Teofilin [ UV Spektrum ]Teofilin [ UV Spektrum ]

96UV-VIS 2012

Moffat, A.C., 1986, [ Editor ] Clarke’s Isolation and Identification of Drugs

Second Edition, p.308

Moffat, A.C., 1986, [ Editor ] Clarke’s Isolation and Identification of Drugs

Second Edition, p.308

The divided into 3 category:Category 1:

The letter a after figure indicates that the value is a mean value based on several

reported figures all of which lie within a range of

+ 10% of the mean

1%1cmA

97UV-VIS 2012

Moffat, A.C., 1986, [ Editor ] Clarke’s Isolation and Identification of Drugs

Second Edition, p.308

Moffat, A.C., 1986, [ Editor ] Clarke’s Isolation and Identification of Drugs

Second Edition, p.308

Category 2:

The letter b after a figure indicates that the value is a single reported value of

unknown reliability

1%1cmA

98UV-VIS 2012

Moffat, A.C., 1986, [ Editor ]Clarke’s Isolation and Identification of Drugs

Second Edition, p.308

Moffat, A.C., 1986, [ Editor ]Clarke’s Isolation and Identification of Drugs

Second Edition, p.308

Category 3:

The letter c after a figure indicates that the value is a mean value based on

several reported figures some of which lie outside + 10%

of the mean

1%1cmA

99UV-VIS 2012

Teknik Kuantifikasi AnalitMenggunakan

Standar

100UV-VIS 2012

Plot Standar Untuk KuantitasiPlot Standar Untuk Kuantitasi

Dalam beberapa contoh di inndustri farmasi, produk obat dibuat dengan berbagai kadar, misal:

Tablet levotiroksin dengan kadar:

50, 100, 150, 200, 500, dan 750 g

Untuk keperluan mengembangkan dan memvalidasi metode

penetapan kadarnya, dapat ditempuh tiga strategi:

101UV-VIS 2012

1. Single-Point Calibration1. Single-Point Calibration

Digunakan satu macam konsentrasi standarPlot stndar yang dibuat, digunakan untuk

menetapkan semua kadar tabletHal yang perlu diperhatikan adalah:

- metode ini perlu skema pengenceran dan ekstraksi yang berbeda untuk kadar obat yang bermacam-macam tersebut, dengan target:

Mendapatkan konsentrasi akhir serupa

Yang mendekati konsentarsi standar yang dibuat[ Respon Berdekatan ]

UV-VIS 2012

Perbandingan AbsorbanPerbandingan Absorban

Absorban sampel

Absorban baku x Kadar baku = Kadar sampel

Syarat:

Nilai Abs.baku dan Nilai Abs.sampel

berdekatan

102Chan dkk., 2004, p.14.

103UV-VIS 2012

2. Multiple-Point Calibration2. Multiple-Point Calibration

Digunakan seri konsentrasi standar yang dapat mengkover semua kadar produk obat tersebut.

Pda rentang konsentrasi tersebut, responnya harus linear.

Respon seluruh kadar obat (larutan akhir yang akan dibaca) berada pada rentang respon kurva kalibrasi.

Syarat:Tidak diperbolehkan adanya Ekstrapolasi

104UV-VIS 2012

105UV-VIS 2012

3. One Standard Calibration for Each Strength

3. One Standard Calibration for Each Strength

Digunaka satu konsentrasistandar untuk

setiap kadar obat

Kapan Metode ini dipilih ?

Apabila analit tidak menunjukkan linearitas pada rentang konsentrasi yang layak

106UV-VIS 2012

Bagaimana Menghitung KadarBagaimana Menghitung Kadar

Denngan perbandingan nilai absorban sampel terhadap nilai absorban baku [yang sudah diketahui kadarnya]

Dengan menggunakan kurva baku/persamaan garis regresi linear.

Apa yang harus diperhatikan ?

Apa yang harus diperhatikan ?

107UV-VIS 2012

Linearitas [ Menurut ICH, Q2(R1) ]Linearitas [ Menurut ICH, Q2(R1) ]

Linearitas suatu metode analisis:

adalah kemampuan metode tersebut (pada rentang tertentu)

untuk mencapai hasil uji yang berupa variasi data

(misal: absorban, luas area kromatogram) yang secara langsung proporsional terhadap

konsentrasi analit dalam sampel

Chan dkk., 2004, p.14.

108UV-VIS 2012

Linearitas (lanjutan)Linearitas (lanjutan)

Variasi data yang dapat untuk meng-kuantifikasi analit dapat berupa:

- luas area kromatogram- tinggi puncak kromatogram- rasio antara luas area (tinggi puncak)

kromatogram analit terhadap luas area (tinggi puncak) kromatogram standar internal

109UV-VIS 2012

Kuatitasi AnalitKuatitasi Analit

Tergantung pada kepatuhan pemenuhan hukum Beer

Tergantung linearitas pada rentang konsen-trasi tertentu

Oleh karenanya:- konsentrasi sampel kerja dan sampel

yang diuji untuk akurasi harus pada rentang yang linear

.

110UV-VIS 2012

LinearitasLinearitas

Biasanya ditunjukkan langsung dengan pengenceran larutan baku stock.

Disarankan linearitas dikerjakan dengan seri pengenceran larutan stock.

Tidak disarankan mempersiapkan seri konsen-trasi larutan baku dengan seri penimbangan zat standar, karena:

Terjadi kesalahan penimbangan

Tidak menjamin diperolehnya linearitas yang baik

111UV-VIS 2012

Evaluasi LinearitasEvaluasi Linearitas

Paling baik dilakukan dengan pengamatan secara visual plot respon (signal) sebagai fungsi konsentrasi analit.

Selanjutnya, variasi data umumnya digunakan untuk menghitung persamaan garis regresi dengan metode kuadrat terkecil ( Y = b X + a )

Syarat Linearitas:

Coeffcient of determination ( r2 ) ≥ 0.997

112UV-VIS 2012

Rentang Linearitas [ ICH ]Rentang Linearitas [ ICH ]

Penetapan bahan obat atau produk obat:

± 20 % target atau konsentrasi nominal

Penetapan keragaman kandungan:

± 20 % target atau konsentrasi nominal

Pada rentang tersebut:

Paling tidak digunakan 5 (lima) macam tingkatan konsentrasi

113UV-VIS 2012

Persamaan Garis RegresiPersamaan Garis Regresi

114UV-VIS 2012

115UV-VIS 2012

116UV-VIS 2012

Bagaimana Cara

Mengalisis Campuran

Dua Senyawa

? ? ?

Bagaimana Cara

Mengalisis Campuran

Dua Senyawa

? ? ?

117UV-VIS 2012

Two-Component MixtureTwo-Component Mixture

Example of a two-component mixture with little spectral overlap

X Y

X + Y

118UV-VIS 2012

Two-Component MixtureTwo-Component Mixture

Example of a two-component mixture with significant spectral overlap

X

Y

X + Y

119UV-VIS 2012

120UV-VIS 2012

121UV-VIS 2012

122UV-VIS 2012

123UV-VIS 2012

UV-VIS 2012

Terima KasihTerima Kasih

E-mail: sudib_kekes@yahoo.co.id

124

125UV-VIS 2012