2009yre
Post on 10-Aug-2015
76 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
NIM G351040131
ABSTRACT
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of
Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high
aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant
genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant
must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in
maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim
to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR-
1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial
digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30
minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA :
vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105
plaque forming unit (pfu) per ml was
obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T.
langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the
size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI.
This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding
to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert
DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens
was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family.
By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f =
insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T.
langsdorffiana genom found in genomic library is 17%.
Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage
RINGKASAN
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan
aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al
tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik
tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat
penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu
spesies.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan
yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan
DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA rekombinan,
transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis
pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid,
transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.
Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g
DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan
hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio
molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105
plaque forming unit (pfu)
tiap ml.
Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.
langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan.
Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor
plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang
tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu
pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus
diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran
genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua
spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini,
volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya
adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 103 pfu. Dengan
menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f =
rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh
genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini
berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam
pustaka genom adalah 17%.
Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan
tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis : Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill
Nama : Yasinta Ratna Esti Wulandari
NIM : G351040131
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA. Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Ujian: 27 Juli 2009 Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
“Allah turut bekerja dalam segala sesuatu untuk mendatangkan kebaikan bagi mereka yang mengasihi Dia” Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan kepada...........
Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris yang tidak lelah mendampingi dan memberiku semangat.
Segala jerih payahku takkan pernah terwujud tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan
anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai
Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi
Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler
Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA
selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran
selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris
Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan
yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005
dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in
the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma”
dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir.
Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir.
Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga
berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan
Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam
pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak
Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan
bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam
kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya
memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas
bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama,
Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah
memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh
keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekan-
rekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati,
Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken,
Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.
Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah
ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jayapura pada tanggal 2 Januari 1981 dari ayah Drs.
F.X. Soewarto Citrotaruno, M.S. dan ibu M.G. Soewarti Pujirahayu, S.E., M.M.
Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2005, penulis
menikah dengan Hugo Herdamon Budianto, SP. dan saat ini telah dikaruniai dua
orang buah hati yaitu Alexander Dimas Raditya dan Brigita Michelle Radisti.
Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Stella Duce I Yogyakarta dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan seleksi masuk
IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah menjadi panitia Biologi
Interaktif dalam rangka Dies Natalis IPB ke-36, dan menjadi pengurus Organisasi
Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2001/2002 dan 2002/2003.
Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester
ganjil tahun ajaran 2002/2003 dan semester genap tahun ajaran 2002/2003, mata
kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada semester ganjil tahun ajaran
2002/2003, serta mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada semester genap tahun
ajaran 2002/2003. Pada bulan Juni hingga Juli 2002, penulis melaksanakan
praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian (BB-BIOGEN) Cimanggu, Bogor. Makalah penulis yang merupakan
bagian dari skripsi yang berjudul Growth and Development of Plant Studies in
Mango using Paclobutrazol and KNO3 Application menjadi Supporting Paper
pada Seminar Nasional X PERSADA di Jakarta pada bulan Juli 2003. Pada tahun
2004, penulis melanjutkan pendidikan strata-2 pada Program Studi Biologi, Sub
Program Studi Fisiologi, Genetika dan Biologi Molekuler Tanaman, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa pascasarjana,
penulis juga aktif mengikuti simposium-simposium dan seminar-seminar yang
berkaitan dengan bioteknologi.
x
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR...............................................................................................
PENDAHULUAN
Latar Belakang.................................................................................................
Tujuan...........................................................................................................
KAJIAN PUSTAKA
Karakter Tibouchina......................................................................................
Pustaka Genom.............................................................................................
Bakteriofage Lambda.....................................................................................
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda ...................................................
Pengemasan DNA Lambda...........................................................................
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian...................................................................... 3
Bahan Penelitian........................................................................................... 3
Metode Penelitian............................................................................................
Isolasi DNA total tanaman..................................................................... 3
Pemotongan parsial DNA...................................................................... 4
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA.................................. 4
Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor............................................ 4
Pengemasan fage rekombinan............................................................. 12
Transveksi fage ke dalam E. coli…………......................................... 12
Eksisi plasmid dari fage ......................................................................
Isolasi DNA plasmid rekombinan…...................................................... 12
Transformasi bakteri.............................................................................. 4
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI.............................
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen
DNA............................................................................................................ 19
Konstruksi Fage Rekombinan...................................................................... 20
Ukuran DNA Sisipan................................................................................... 23
Ukuran Pustaka Genom............................................................................... 25
SIMPULAN DAN SARAN..............................................................................
DAFTAR PUSTAKA.........................................................................................
xi
1
2
3
6
7
9
11
12
12
13
14
15
15
15
16
16
16
17
17
18
27
28
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana…….....................................................
2 Peta genetik bakteriofage .............................................................................
3 Penyusunan virus bakteriofage λ....................................................................
4 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1.........................................................
5 BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan…………...........
6 Tahapan konstruksi pustaka genom..............................................................
7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan
Sau3AI...........................................................................................................
8 Seleksi biru-putih terhadap plak....................................................................
9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC, lambda,
EMC dari vektor fage ..................................................................................
10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI......................................
5
8
10
12
12
13
19
21
23
24
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tibouchina langsdorffiana Baill termasuk ke dalam famili
Melastomataceae. Tumbuhan ini berbunga ungu cerah dan merupakan tumbuhan
hutan hujan di Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan (Faravani & Bakar
2007).
T. langsdorffiana toleran terhadap pH rendah dan aluminium (Al) tinggi.
Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada pH 3. Tumbuhan ini juga toleran
terhadap Al hingga konsentrasi 0.8 mM baik pada pH 4 maupun pada pH 3. Pada
1.6 mM Al atau lebih dalam lingkungan pH 4, pertumbuhan panjang akar T.
langsdorffiana terhambat walaupun batang dan tunas tidak terhambat
pertumbuhannya (Muhaemin 2008). Tumbuhan ini memiliki toleransi terhadap
pH rendah dan Al tinggi sehingga tumbuhan ini dapat digunakan sebagai sumber
gen toleransi tumbuhan terhadap pH rendah dan Al tinggi. Selain sebagai sumber
gen, tumbuhan ini juga dapat digunakan sebagai model toleransi terhadap pH
rendah dan Al tinggi. Gen yang diduga bertanggungjawab terhadap toleransi
terhadap pH rendah dan Al tinggi dapat diuji di tumbuhan ini dengan metode gene
silencing.
Analisis akumulasi Al menunjukkan bahwa tumbuhan ini mampu
mengakumulasi 4.5 mg Al tiap gram bobot kering daun dan akar setelah mendapat
perlakuan 3.2 mM Al selama dua bulan (Mutiasari 2008). Kemampuannya dalam
mengakumulasi Al memungkinkan tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
fitoremediasi terutama pada lahan yang mempunyai kandungan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan gen-gen yang mengendalikan toleransi T.
langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al tinggi dan kemampuannya dalam
mengakumulasi Al, maka bahan genetik tumbuhan ini harus disimpan di dalam
pustaka genom. Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA
genom total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung
seluruh sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Pustaka genom
sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh
suatu spesies. Selain sebagai penyimpan bahan genetik, pustaka genom juga
2
sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang mengandung promoter,
terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi gen. Peta fisik suatu
genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka genom merupakan
bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman, baik melalui
teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan konvensional (Suharsono
2002).
Pustaka genom manusia dan beberapa hewan mamalia, ikan, dan
tumbuhan sudah dikonstruksi. Beberapa pustaka genom telah dikonstruksi, seperti
pustaka genom kedelai kultivar Slamet yang toleran Al (Suharsono 2002) dan
kultivar Lumut yang peka terhadap Al (Suharsono 2007) dalam rangka
menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh kedelai lokal Indonesia.
Dari pustaka genom kedelai kultivar Lumut, penapisan dengan pelacak gen
penyandi peroksidase dari Arabidopsis telah dilakukan untuk mendapatkan gen
utuh penyandi peroksidase dari kedelai (Suharsono et al. 2003). Miftahudin et al.
(1998) telah mengkonstruksi pustaka cDNA dari kedelai (MLG3474) melalui
mRNA yang diisolasi dari tanaman yang mendapat cekaman kekeringan. Elvawati
(1999) telah mengkonstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai yang diinduksi
cekaman Al. Kurnia (2005) juga telah berhasil mengisolasi gen penyandi
glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Dari
pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang mengandung
gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh Rachman (2005).
Kurniawan (2005), telah berhasil mengisolasi fragmen DNA yang mengandung
gen penyandi glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar
Lumut. Dari pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang
mengandung gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh
Rahmawati (2005).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana.
KAJIAN PUSTAKA
Karakter Tibouchina
Genus Tibouchina (sinonim dengan Chaetogastra, Hephestionia, Itatiaia,
Lasiandra, Micranthella, Oreocosmus, Pleroma, Purpurella) terdiri dari 300
spesies (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina biasa dikenal dengan nama
“princess flower”, “glory bushes” atau kadang-kadang “glory trees” (Judd et al.
2005; Faravani & Bakar 2007). Tanaman ini merupakan tanaman asli di hutan
hujan Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan, terutama Brazil. Namanya
berasal dari adaptasi tempat asalnya yaitu “Guiana” (Faravani & Bakar 2007).
Tibouchina merupakan anggota famili Melastomaceae (di dalam literatur
biasa ditulis Melastomataceae), merupakan tanaman dikotil berbunga, berbiji
tertutup (angiospermae). Famili melastomataceae terdiri dari 3000 spesies di
neotropika, 1000 di Asia tropis, 240 di Afrika, 225 di Madagaskar (150-166
genus), dan 70 di Thailand (15 genus) (Renner et al. 2001). Melastomataceae
kemudian menyebar di India, Australia, Sri Lanka, Asia Tenggara termasuk
Filipina dan Taiwan, sampai Papua New Guinea, Pulau Pasifik, Mauritius,
Jamaica, dan Amerika Serikat (Renner 1993).
T. langsdorffiana digunakan sebagai tanaman hias karena nilai estetikanya
yaitu warna bunga ungu cerah yang sangat menarik. Sebagian besar
Melastomataceae dan Memecylaceae memiliki warna bunga ungu, bervariasi dari
merah muda sampai magenta. Sebagai contoh, warna bunga ungu umumnya
ditemui pada Dichaetanthera, Meriania, Mouriri, Rhynchanthera dan Tibouchina,
dimana kebanyakan merupakan akumulator Al (Jansen et al. 2002).
Tanaman ini tumbuh dengan baik pada tanah yang bersifat asam. Jika
tanah tidak cukup asam, ujung daun akan seperti terbakar, kemudian menjadi
coklat atau bahkan daun akan mati. Jika hal itu terjadi, keasaman tanah dibuat
dengan menambahkan sulfur ke tanah di sekitar akar, atau menggunakan pupuk
yang bersifat asam. Tanaman ini tidak perlu dipangkas, karena dapat tumbuh
menjadi pohon besar (http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm).
Tibouchina yang berupa semak cantik yang banyak tumbuh di daerah
tropis Amerika latin mirip sekali dengan Dissotis canescens yang masih sekerabat
4
yaitu memiliki ciri-ciri semak berkayu lembut, mencapai tinggi 1.5 m dengan
lebar tajuk 1 m, bunganya yang besar dan berwarna magenta muncul di bulan
Desember sampai April, bunganya unik karena memiliki dua set benang sari yang
berbeda satu dengan yang lain, lima di antaranya panjang berwarna ungu dengan
ujung melengkung sementara lima lainnya lebih pendek dan berwarna kuning
(http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm).
Perbanyakan T. langsdorffiana ini melalui stek secara vegetatif karena
tanaman ini tidak menghasilkan biji. Berbunga melimpah antara bulan Mei
sampai Januari. Spesies T. langsdorffiana biasanya memiliki daun yang berbulu
halus dengan tulang daun yang menonjol dan memperlihatkan warna bunga ungu
menarik sehingga ditanam sebagai hiasan. Nama lokal tanaman ini di kalangan
penjual tanaman hias, dikenal dengan nama violet, tibocina/tebocina (Sunda).
Kedudukan T. langsdorffiana dalam taksonomi adalah sebagai berikut:
Domain : Eukariota
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Viridaeplantae
Filum : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Subkelas : Rosidae
Ordo : Myrtales
Famili : Melastomataceae
Genus : Tibouchina
Spesies : Tibouchina langsdorffiana Baill
T. langsdorffiana merupakan tanaman perennial, termasuk herba, semak,
atau pohon, tegak, dengan tinggi 0.5 m sampai 25 m (Gambar 1a), daun tunggal
(Gambar 1b), bertangkai, duduk daun berhadapan, pertulangan daun menyirip,
ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, bentuk lanset, permukaan bersisik.
Bunga T. langsdorffiana merupakan bunga terbatas tipe malai rata (corymbiform
cyme) dengan jumlah bunga 5-25 kuntum bunga (Gambar 1c), kelopak (sepal)
berjumlah 5 saling bebas, mahkota (petal) berjumlah 5 saling bebas (Gambar 1d),
simetri bunga beraturan (actinomorph), benang sari berjumlah 10 saling bebas
5
(polyandrous) dengan panjang sama, tipe perlekatan tangkai sari dengan kepala
sari yaitu versatile, tipe putik syncarp karena memiliki 5 buah karpel yang
dipisahkan oleh sekat (septum), tipe kepala putik clavate, sedangkan tipe tangkai
putik geneculate (Gambar 1e). Tipe plasentasi bakal buah axial (Gambar 1f), dan
merupakan bakal buah tenggelam (inferior), tetapi dalam perkembangannya,
bakal buah beserta biji di dalamnya akan gugur sehingga tanaman ini tidak
menghasilkan buah dan biji.
Gambar 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana: a. tanaman berupa semak
berkayu; b. daun tunggal; c. tipe malai cabang bunga; d. tipe kelopak
dan mahkota bunga; e. tipe benang sari dan putik bunga; f. plasentasi
bakal buah.
d 2 cm e 1 mm f 1 mm
a 20 cm b 2 cm c 2 cm
6
Pustaka Genom
Suatu pustaka gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuen (urutan)
DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah di klon ke dalam vektor
tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan dan analisisnya. Pada
dasarnya terdapat dua macam pustaka gen yang dapat dikonstruksi, tergantung
sumber DNA yang digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA
genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut pustaka genom.
Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu
populasi mRNA, maka pustaka yang diperoleh dinamakan pustaka
complementary DNA (cDNA).
Hasil pengklonan seluruh DNA total dari spesies tertentu disebut dengan
pustaka genom. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan
karakterisasi suatu gen (Cross et al. 1999; Suharsono et al. 2003), dan juga untuk
pemetaan gen secara fisik.
Pustaka genom dapat dibuat melalui sintesis cDNA dari mRNA atau DNA
genom. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa
bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome
(YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), atau kosmid, bergantung pada
ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Pada penelitian ini dipakai vektor
pengklonan yaitu fage lambda ( BlueSTAR-1 (Novagen 1997). Fage
BlueSTAR-1 adalah vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA
dengan efisiensi kloning fragmen DNA berukuran 7-20 kb. Vektor mengandung
gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan untuk
autosubkloning (Novagen 1997).
Konstruksi pustaka genom diawali dengan isolasi DNA total. DNA total
biasanya dipotong secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3AI atau enzim
lain disesuaikan dengan situs yang terdapat pada vektor yang akan digunakan
dalam konstruksi pustaka agar mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar.
Pemotongan parsial ini menghasilkan fragmen berukuran besar karena tidak
semua situs pengenalan suatu enzim restriksi dalam rantai DNA genom terpotong
oleh enzim restriksi yang bersangkutan. Fragmen DNA berukuran besar ini
kemudian disisipkan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi
7
tertentu sehingga hasil potongannya cocok dengan fragmen DNA. Untuk
menghindari adanya penyatuan kembali (religasi) ujung-ujung potongan biasanya
dimodifikasi dengan penambahan nukleotida tertentu (fill-in).
Dalam mengkonstruksi pustaka genom DNA, DNA umumnya dipotong
dengan enzim restriksi yang mengenali situs yang terdiri dari 4 pasang basa (pb)
(contohnya Sau3AI). Pengenalan dan pemotongan sekuen 4 pb yang spesifik ini
akan terjadi rata-rata sekali setiap 44 = 256 pb. Untuk meningkatkan kemungkinan
semua daerah genom berhasil diklonkan dan terkandung dalam pustaka genom,
DNA genom biasanya dipotong secara parsial untuk menghasilkan fragmen
restriksi yang saling tumpang tindih (overlapping) yang berukuran besar, sekitar
20 kb. Vektor fage dapat menampung sekitar 20 kb.
Bakteriofage Lambda
Bakteriofage (atau fage) adalah virus yang menginfeksi bakteri. Satuan
dasar virus disebut virion. Virion fage memiliki kepala, yang mengandung
genom DNA virus, dan sebuah ekor, yang berfungsi menginfeksi sel inang
Escherichia coli (E. coli). Virus hanya dapat memperbanyak diri jika berada di
dalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada di luar suatu sistem selular, virus
tidak mampu memperbanyak diri karena tidak mempunyai sistem enzim yang
dapat digunakan untuk mensintesis partikel virus baru. Diameter virus bervariasi
dari 20-300 nm sehingga ukurannya lebih kecil dari sel prokariot yang paling
kecil (Yuwono 2008). Bahan genetik virus ada yang berupa molekul DNA dan
ada yang berupa RNA. Molekul DNA dan RNA tersebut ada yang berupa
molekul untai tunggal dan ada yang berupa molekul untai ganda. Ekspresi genetik
virus dilakukan dengan menggunakan sistem enzim yang ada di dalam sel inang.
Salah satu jenis bakteriofage yang biasa digunakan sebagai vektor
pengklonan adalah bakteriofage . Bakteriofage merupakan virus bakterial yang
telah banyak diteliti, dan telah diketahui secara luas mengenai genetika dan
biologi molekulernya. Urutan lengkap basa nukleotida bakteriofage ini sudah
diketahui. Genom bakteriofage berupa DNA untai ganda linier yang terdiri atas
48502 pb (Chauthaiwale et al. 1992). Molekul DNA bakteriofage ini mempunyai
8
struktur yang unik karena pada kedua ujungnya terdapat 12 basa tambahan berupa
molekul DNA untai tunggal. Kedua ujung molekul DNA tersebut dapat
membentuk ikatan komplementer jika terjadi pelingkaran DNA, sehingga ujung-
ujung DNA tersebut disebut sebagai ujung kohesif (cohesive ends, disingkat COS)
(Chauthaiwale et al. 1992).
Fage mempunyai gen-gen penyandi protein yang diperlukan dalam
penyusunan kepala dan ekor dan gen-gen yang menyandikan protein yang
diperlukan dalam siklus litik yang terdapat di bagian kedua ujung genomnya
(Gambar 2). Beberapa daerah di bagian tengah dari genom dapat digantikan oleh
DNA eksogen atau dihilangkan tanpa mempengaruhi kemampuan fage λ dalam
menginfeksi sel inang dan menyusun virus baru. DNA eksogen yang menyisip
diantara gen J dan N bisa berukuran lebih dari 25 kb. Terdapat sekitar 60 gen
yang ada di dalam genom λ (Lodish et al. 2000).
Gambar 2 Peta genetik bakteriofage (Lodish et al. 2000).
Bakteriofage menginfeksi E. coli dengan cara menempel pada suatu
reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel E. coli, kemudian
menginjeksikan DNAnya (Dale 1994). DNA linier utas ganda diubah menjadi
bentuk sirkuler segera setelah terjadi infeksi. Setelah memasuki sel bakteri, ujung
kohesif mengalami perpasangan basa membentuk molekul DNA sirkuler, dimana
masih terdapat 2 buah nick pada tempat perpasangan basa tersebut. Kedua nick ini
ditutup oleh DNA ligase inang sehingga dihasilkan molekul DNA sirkuler
seutuhnya. DNA sirkuler ini berfungsi sebagai cetakan dalam proses transkripsi
selama fase infeksi awal (Sambrook et al. 1989).
Ketika DNA memasuki sitoplasma sel inang setelah menginfeksi,
selanjutnya DNA fage akan mengalami pertumbuhan siklus litik atau lisogenik.
Siklus litik menyebabkan lisisnya sel inang dan menghasilkan partikel fage baru,
sedangkan siklus lisogenik terjadi karena genom bakteriofage terintegrasi dengan
9
genom sel inang sebagai profage. Dalam kondisi cekaman nutrisi dan lingkungan,
DNA yang terintegrasi dapat dikeluarkan dari kromosom inang dan selanjutnya
memasuki siklus litik (Glick & Pasternak 1994). Ketika bakteriofage digunakan
sebagai vektor pengklonan, dia mampu mengalami pertumbuhan litik, tetapi
fungsi virus lainnya menjadi tidak relevan. Sebagai akibatnya, gen-gen yang
terlibat dalam jalur lisogenik dan gen-gen virus lainnya yang tidak penting bagi
jalur litik akan dihilangkan dari DNA virus dan digantikan dengan DNA yang
akan diklonkan. Bakteriofage ini memiliki efisiensi pengemasan sebesar 78-
108% dari ukuran DNA lambda tipe liar (Chauthaiwale et al. 1992). DNA asing
yang berukuran di atas 25 kb dapat disisipkan ke dalam genom , menghasilkan
DNA rekombinan yang dapat dikemas secara in vitro untuk membentuk virus-
virus yang mampu bereplikasi dan membentuk plak di dalam sel inang E. coli
(Lodish et al. 2000).
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda
Bakteriofage merupakan salah satu vektor untuk konstruksi pustaka
genom. Replikasi DNA di dalam sel inang menghasilkan molekul DNA
multimerik, yang disebut concatomers, yang terdiri dari kopi-kopi ganda genom
virus yang bersambungan dari ujung hingga ujung yang dibatasi oleh sekuen
nukleotida spesifik yang disebut situs COS. Dua protein , yaitu Nu 1 dan A,
terikat dengan situs COS dan menyisip secara langsung ke DNA di antara dua
situs COS yang berdekatan kemudian masuk ke dalam kepala yang akan disusun
(Lodish et al. 2000).
Setiap kepala fage mengemas genom tunggal sebesar 50 kb dari
concatomers multimerik. DNA kromosom sel inang tidak menyisip ke dalam
kepala karena tidak mengandung kopi dari sekuen COS. Kepala dan ekor yang
kosong disusun dari kopi-kopi ganda dari beberapa protein λ yang berbeda.
Selama fase akhir, membentuk molekul DNA yang panjang yang disebut
concatomers. Molekul multimerik ini terdiri dari kopi-kopi genom yang
bersambungan dari ujung ke ujung dan dipisahkan oleh situs COS yang
merupakan sebuah sekuen nukleotida yang dapat mengikat protein. Setiap kopi
10
dari genom λ mengandung COS. Protein λ Nu1 dan A yang menempel pada situs
COS memicu penyisipan DNA diantara dua situs COS yang berdekatan ke dalam
kepala yang kosong. Setelah kepala-kepala terisi DNA, ekor yang siap disusun
akan menempel, menghasilkan virus λ lengkap yang mampu menginfeksi sel-sel
E. coli (Gambar 3).
Gambar 3 Penyusunan virus bakteriofage λ (Lodish et al. 2000).
Berbagai vektor pengklonan turunan dari fage telah dikonstruksi untuk
berbagai tujuan berdasarkan ukuran fragmen DNA sisipan dan situs penyisipan
(Singer & Berg 1991).
Fage BlueSTAR-1 merupakan vektor yang didesain untuk membuat
pustaka genom DNA dengan ukuran sisipan sebesar 7-20 kb. Vektor ini
mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan
untuk autosubkloning (Novagen 1997). Seleksi biru-putih diperoleh karena
adanya gen lacZ E. coli lengkap dan daerah kontrol yang terdapat dalam lengan
11
fragmen yang berukuran 13 kb. Lengan vektor akan bereligasi dengan lengan
DNA genom, menghasilkan fage yang dapat menghasilkan β-galaktosidase aktif
di dalam sel-sel yang terinfeksi. Virus rekombinan yang diinfeksikan ke bakteri
ini, yang kemudian ditumbuhkan di cawan petri akan menghasilkan plak-plak
rekombinan dalam jumlah besar. Setiap plak yang muncul dari virus rekombinan
tunggal akan menghasilkan turunan fage yang jika ditumbuhkan akan identik
secara genetik dimana klon yang dibentuk telah membawa insert DNA genomik
khusus. Plak yang berbeda berhubungan dengan klon fage yang dibentuk, setiap
plak membawa DNA insert yang berbeda, dan secara kolektif mereka menyusun
pustaka genom .
Pengemasan DNA Lambda
Untuk menyiapkan virus yang infektif yang membawa DNA
rekombinan, perakitan fage dilakukan secara in vitro dengan melakukan
pengemasan molekul DNA fage . Salah satu metode untuk memproduksi protein
pengemas fage adalah dengan menumbuhkan dua macam fage mutan secara
terpisah. Kedua macam mutan ini hasil dari mutasi pada gen yang berbeda. Mutan
yang satu tidak dapat mensintesis protein kepala A, dan mutan yang lain tidak
mampu mensintesis protein kepala Nu 1. Dengan mencampur kedua ekstrak ini,
fragmen DNA akan dikemas dalam kepala dan ekor fage akan ditempelkan pada
kepala yang sudah mengandung DNA.
Pengemasan dengan ekstrak protein ini menghasilkan virus-virus
rekombinan dalam jumlah besar yang sangat infektif dan secara efisien dapat
menginfeksi sel-sel E. coli. Setiap partikel virus berikatan dengan reseptor pada
permukaan sel inang dan menginjeksikan DNA rekombinan yang telah dikemas
ke dalam sel (Lodish et al. 2000).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2006 sampai dengan Desember
2008 di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Bahan Penelitian
Daun muda T. langsdorffiana digunakan sebagai bahan tanaman. Fage
BlueSTAR-1 (Novagen) digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 4).
Gambar 4 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1.
Fage ini telah dipotong dengan XhoI dan telah mengalami penyisipan (fill-in)
dengan nukleotida dCTP dan dTTP sehingga menghasilkan potongan vektor
dengan ujung menggantung (overhang) TC pada situs penyisipan (Gambar 5).
Gambar 5 BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan.
Kedua lengan dan pengisi tidak cocok
Pengisi lac
Sa
l I
Sfi
I
loxP
No
t I
Ea
g I
Sa
c II
Ba
mH
I
Sm
a I
Eco
R I
Xh
o I
Sa
l I
Hin
d I
II
Xb
a I
Avr
I
Sa
c I
Sa
c I
Avr
II
Xb
a I
Hin
d I
II
Sa
l I
Xh
o I
Eco
R I
Sm
a I
Ba
mH
I
Sa
c II
Ea
g I
No
t I
Ap
Ori
loxP
Sfi
I
Sa
l I
BlueSTAR-1
Pemotongan dengan Xho I
Penambahan dCTP dan dTTP
13
E. coli galur ER1647 digunakan sebagai inang untuk mengamplifikasi fage
rekombinan. E. coli galur BM25.8 digunakan sebagai inang untuk memproses
eksisi dari fage rekombinan menjadi plasmid rekombinan. E. coli galur DH5
digunakan sebagai inang untuk mendukung replikasi plasmid.
Metode Penelitian
Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu:
isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan DNA
T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA rekombinan, transveksi
fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis pustaka genom
meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid, transformasi
genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Tahapan
penelitian ini disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6 Tahapan konstruksi pustaka genom.
Isolasi DNA total
T. langsdorffiana
Pemotongan
parsial DNA Fragmen DNA
T. langsdorffiana Vektor fage
terpotong
Penyisipan DNA T. langsdorffiana ke
dalam fage
DNA fage rekombinan
Pengemasan fage rekombinan
Transveksi fage rekombinan ke
E. coli
Analisis pustaka genom:
Transformasi bakteri
Isolasi DNA plasmid
rekombinan
14
Isolasi DNA total tanaman
Isolasi DNA total tanaman dilakukan dengan mengikuti prosedur Chang et
al. (1993) yang dimodifikasi yaitu dengan penggantian LiCl dengan
isopropranol/etanol absolut. Sampel diambil dari daun segar yang masih muda.
Daun muda tersebut dibuang bagian tulang daunnya, dipotong-potong, dan
ditimbang sebanyak 2 g. Selanjutnya potongan daun tersebut ditambah nitrogen
cair secukupnya, dan digerus dengan mortar hingga halus. Bubuk ini kemudian
dilarutkan dalam 6 ml 2x larutan penyangga cetyltrimethyl-ammonium bromide
(CTAB) (2% CTAB, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2%
PVP) lalu ditambahkan 0.2% merkaptoetanol. Larutan dibolak-balik sampai rata,
kemudian diinkubasikan dalam pemanas bergoyang pada suhu 65oC selama 60
menit. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 6 ml larutan
kloroform:isoamilalkohol (CI) (24:1), dibolak-balik selama 1.5 menit, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm dengan swing-out rotor (Jouan, BR4i)
pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah terpisah, cairan di bagian atas
dipindahkan ke tabung baru dan ditambah isopropanol sebanyak 0.7x volume
awal, kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam.
Campuran disentrifugasi pada 4000 rpm, 4 C, selama 20 menit. Setelah
sentrifugasi, endapan kemudian dibilas dengan alkohol 70% lalu disentrifugasi
kembali pada kecepatan 3000 rpm, 4 C, 10 menit. Endapan yang diperoleh lalu
dikeringkan dengan vakum dan disuspensikan dalam TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA, pH 8.0). Suspensi DNA kemudian ditambah RNAse dengan konsentrasi
akhir 100 g/ml dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama minimal dua jam
untuk menghilangkan RNA. Suspensi DNA dicampur secara merata dengan 1x
volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (PCI) (25:24:1), dan disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm dengan fix-angle rotor (Jouan, BR4i) pada suhu ruang
selama 10 menit. Cairan bagian atas diendapkan dengan menambahkan 0.1x
volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut dingin, dibolak-balik
pelan lalu diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam. Setelah inkubasi lalu
disentrifugasi kembali pada kecepatan 14000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit.
Endapan DNA dibilas dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kembali pada
15
kecepatan 14000 rpm, 4 C, 30 menit. Endapan DNA tersebut dikeringkan,
kemudian disuspensikan di dalam TE pH 8.
Pemotongan parsial DNA
DNA total tanaman dipotong dengan enzim Sau3AI (Takara) pada suhu
37ºC selama 30 menit dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0.01, 0.015, 0.02 dan
0.04 unit tiap µg DNA.
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA
Setelah dipotong secara parsial kedua ujung fragmen DNA disisipi
terlebih dahulu dengan dua nukleotida untuk mencegah terjadinya penyambungan
kembali di antara fragmen-fragmen tersebut sesuai dengan prosedur Novagen
(1997). Sebanyak 20 g fragmen DNA dicampur dengan larutan penyangga yang
mengandung 50 mM Tris-HCl pH 7.3, 10 mM MgCl2, 50 g/ml bovin serum
albumin (BSA), 1 mM deoksiadenosina trifosfat (dATP), 1 mM deoksiguanosina
trifosfat (dGTP) (Novagen), 4 µl 100 mM ditiotreitol (DTT), dan 20 unit Klenow
DNA polimerase (Takara) dalam volume total 400 l. Campuran tersebut
diinkubasikan pada suhu 30oC selama 30 menit. Campuran dipanaskan pada 70
oC
selama 10 menit untuk menghentikan reaksi tersebut. Fragmen DNA yang
berukuran 7-20 kb diisolasi dengan menggunakan kolom Chroma Spin 1000
(Clontech 1999).
Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
Fragmen DNA hasil isolasi disisipkan ke dalam vektor fage dengan cara
mencampur 0.5 g fragmen DNA yang ujungnya telah disisipi (fill-in) nukleotida
dengan 0.5 g BlueSTAR-1 (Novagen), 4.5 unit T4 DNA ligase (Takara), dan
bufer ligasi (30 mM Tris-HCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP,
5% polietilen glikol (PEG) 8000), dalam volume total 10 l. Campuran
diinkubasi pada suhu 4oC selama 24 jam.
16
Pengemasan fage rekombinan
Setelah ligasi, DNA fage rekombinan yang dihasilkan selanjutnya
dikemas dalam protein mantel. Sebanyak 10 l hasil reaksi ligasi dicampur
dengan 50 l protein ekstrak pengemas (Gigapack III, Stratagene) sesuai prosedur
Stratagene (2003). Campuran diinkubasikan pada suhu 22oC selama dua jam.
Reaksi dihentikan dengan menambahkan 440 l bufer SM (5.8 g/l NaCl, 2 g/l
MgSO4 7H2O, 0.01% gelatin, dan 50 mM Tris-HCl, pH 7.5). Jumlah titer
ditentukan dengan melakukan transveksi ke E. coli galur ER1647.
Transveksi fage ke dalam E. coli
Transveksi fage ke dalam E. coli dilakukan mengikuti prosedur
Suharsono (2002). Fage hasil pengemasan diencerkan 100 kali dan 1000 kali
agar memudahkan penghitungan. Sebanyak 100 l E. coli galur ER1647
(OD600=1) dicampur dengan 100 l fage . Campuran diinkubasi dalam balok
pemanas (heat block) pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian ditambah 4 ml
molten top agarose (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l NaCl, 6 g/l agarosa) bersuhu
47oC dan telah ditambah X-gal dengan konsentrasi akhir 500 ppm untuk
mengidentifikasi rekombinan. Campuran tersebut disebar dalam cawan petri
yang mengandung 15 ml media luria bertani (LB) padat (10 g/l bacto-tryptone, 5
g/l ekstrak khamir, 10 g/l NaCl, 15 g/l bacto-agar) sesuai prosedur Novagen
(1997). Setelah agarosa yang berada di atas media LB padat tersebut membeku,
cawan ditutup, kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama satu malam.
Eksisi plasmid dari fage
Transveksi fage juga dilakukan ke dalam E. coli galur BM25.8
(OD600=1) untuk melakukan eksisi dari bentuk fage rekombinan menjadi plasmid
rekombinan. Eksisi dilakukan dengan mencampurkan 100 l E. coli galur
BM25.8 (OD600=1) dengan 100 l fage . Campuran diinkubasikan di dalam
balok pemanas pada suhu 37oC selama 30 menit. Sebanyak 100 l campuran
disebar di atas media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dengan
menggunakan batang kaca bengkok.
17
Isolasi DNA plasmid rekombinan
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menumbuhkan satu koloni bakteri
E. coli galur BM25.8 dan DH5 di dalam 2 ml media LB cair yang mengandung
100 mg/l ampisilin yang diletakkan dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan
250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Bakteri diendapkan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan, BR4i), pada suhu 4oC selama 10
menit. Endapan bakteri selanjutnya disuspensikan dalam 300 l larutan
penyangga suspensi sel (10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5), kemudian
ditambah 300 l larutan penyangga lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Setelah bakteri
tersebut mengalami lisis, ditambah 300 l larutan penyangga netralisasi (1.32 M
Na-asetat pH 4.8). Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm
pada suhu 4oC selama 20 menit. Cairan yang mengandung DNA plasmid
diekstraksi dengan larutan PCI, kemudian divorteks dan disentrifugasi pada
kecepatan 14000 rpm pada suhu 4ºC selama 20 menit. Supernatan diambil dan
diperlakukan dengan RNAse (100 µg/ml) pada suhu 37oC selama semalam.
Protein RNAse dipisahkan dari DNA plasmid dengan menambahkan larutan PCI.
Cairan kemudian dipresipitasikan dengan penambahan 0.1x volume 3 M Na-
asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut, diinkubasikan pada suhu -20oC
selama dua jam. DNA plasmid selanjutnya diendapkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 14000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Endapan DNA plasmid
dibilas dengan etanol 70% dan dikeringkan dengan vakum. DNA plasmid tersebut
disuspensikan di dalam H2O.
Transformasi bakteri
Bakteri kompeten dibuat dengan mengikuti prosedur Nakayama dan
Nishikata (1995) dalam Suharsono (2002). Satu koloni bakteri E. coli galur
DH5 dikulturkan dalam 2 ml media LB cair pada inkubator bergoyang dengan
kecepatan 250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Kemudian bakteri tersebut
disubkultur dalam 100 ml media LB cair dengan kondisi yang sama hingga
OD600=0.6. Bakteri diendapkan dengan disentrifugasikan pada kecepatan 4000
rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri disuspensikan dalam 3.3
ml larutan penyangga transformasi (TFB) (10 mM MES pH 6.3, 45 mM
18
MnCl2.4H2O, 10 mM CaCl2.2H2O, 3 mM [Co(NH3)6]Cl3, 100 mM KCl, gliserol
10%, pH 7.5) dan diinkubasikan di dalam es selama 10 menit. Kemudian
suspensi tersebut disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm. Endapan bakteri
disuspensikan dalam 0.83 ml TFB dan ditambah 58.1 µl DMSO 99.9%, lalu
diinkubasikan di dalam es selama 10 menit sehingga didapat bakteri kompeten.
Sebanyak 50 l bakteri kompeten dicampur dengan 10 l (50-100 ng) DNA
plasmid dan diinkubasikan di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian
diinkubasi pada suhu 42oC selama 45 detik, dimasukkan kembali ke dalam es
selama 5 menit. Campuran ini ditambah 100 l media 2x YT (16 g/l tripton, 10
g/l ekstrak khamir, 5 g/l NaCl, pH 7.0) dan diinkubasikan pada inkubator
bergoyang 250 rpm, 37oC selama 20 menit. Selanjutnya bakteri disebar pada
media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dan diinkubasikan pada
suhu 37oC selama semalam.
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI
Plasmid hasil isolasi dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI pada
suhu 37ºC selama semalam. Komponen restriksi dengan EcoRI adalah 0.5 µl
(5 unit) enzim EcoRI (Fermentas), 1.0 µl (50 ng) DNA, 2.0 µl (10x) bufer
EcoRI (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.02% Triton
X-100, 0.1 mg/ml BSA), 16.5 µl ddH2O sehingga total volume menjadi 20 µl.
Plasmid yang sudah dipotong dengan enzim restriksi dimigrasikan pada
gel agarosa 1% dalam 1x TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA pH 8.0)
bersama dengan penanda 1 kb ladder (Promega).
1500
2000 2000
3000
2000
3000
5000 5000 5000
4000
3000
5000
4000
3000
2000
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen DNA
Konstruksi pustaka genom membutuhkan potongan DNA yang besar.
Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif besar dilakukan
pemotongan parsial dengan cara mengurangi jumlah enzim restriksi atau waktu
pemotongan yang digunakan. Dengan menggunakan jumlah enzim restriksi yang
sedikit, enzim restriksi tidak akan memotong DNA genom pada seluruh situs
pengenalan yang ada dan hanya memotong pada beberapa situs saja sehingga
menghasilkan fragmen-fragmen DNA genom yang relatif panjang.
Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g
DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pada
konsentrasi 0.015, 0.02 dan 0.04 U/µg DNA, DNA genom terpotong menjadi
fragmen DNA yang lebih kecil (Gambar 7). Pada kedelai, pemotongan 1 g
Gambar 7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan
Sau3AI. Lajur 1 = marker 1 kb ladder (Bexel Biotechnology); lajur 2
= DNA/Sau3AI 0.01 U; lajur 3 = DNA/Sau3AI 0.015 U; lajur 4 =
DNA/Sau3AI 0.02 U; lajur 5 = DNA/Sau3AI 0.04 U.
DNA selama 30 menit pada 37oC dengan 0.01 U Sau3AI menghasilkan fragmen
yang berukuran besar (Suharsono 2002, 2007). Hal ini menunjukkan bahwa
pemotongan DNA genom tumbuhan dengan konsentrasi sekitar 0.01 U/µg DNA
pada suhu 37oC selama 30 menit dapat digunakan sebagai acuan untuk
mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar walaupun hasil pemotongan
sangat ditentukan oleh beberapa faktor seperti kemurnian DNA, spesies asal DNA,
15000
10000
9416
pb
1000
1 2 3 4 5
20
keadaan (kemurnian) enzim restriksi (Sau3AI), lama dan suhu inkubasi
(Suharsono 2002, 2007).
DNA genom yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi Sau3AI
tervisualisasi sebagai usapan (smear). Usapan ini merupakan kumpulan fragmen-
fragmen DNA hasil potongan tersebut yang sangat bervariasi ukurannya.
Enzim Sau3AI mengenali situs spesifik 5 -GATC-3 dan memotong situs
tersebut sebelum nukleotida G sehingga pemotongan DNA T. langsdorffiana
menggunakan enzim Sau3AI menghasilkan ujung menggantung GATC. Untuk
menghindari terjadinya penyambungan antarpotongan DNA, ujung-ujungnya telah
diperlakukan dengan penambahan nukleotida dGTP dan dATP sehingga ujung
menggantungnya menjadi GA. Ujung GA dari satu fragmen DNA T.
langsdorffiana tidak dapat menyambung dengan ujung GA dari fragmen DNA T.
langsdorffiana lainnya. Vektor fage yang dipotong dengan XhoI yang mengenali
situs spesifik 5 -CTCGAG-3 dan memotong diantara C dan T pada situs tersebut,
menghasilkan ujung menggantung TCGA. Penambahan nukleotida dCTP dan
dTTP pada ujung situs sisipan (TCGA) dari vektor fage menghasilkan ujung
menggantung TC sehingga tidak akan terjadi penyambungan antar vektor. Ujung
menggantung GA dari fragmen DNA T. langsdorffiana hanya cocok dengan ujung
menggantung TC dari vektor sehingga proses penyambungan akan terjadi antara
DNA T. langsdorffiana dan vektor. Spesifikasi kecocokan antara ujung DNA T.
langsdorffiana dan vektor fage menyebabkan efisiensi perakitan vektor
rekombinan menjadi tinggi.
Konstruksi Fage Rekombinan
Terbentuknya plak pada hamparan putih bakteri menunjukkan bahwa
proses transveksi fage ke dalam E. coli berhasil dengan baik. Ini juga berarti
bahwa proses pengemasan hasil ligasi DNA fage berhasil dengan baik. Jika
bakteriofage menginfeksi suatu biakan cair bakteri, maka suspensi biakan
berwarna jernih. Sedangkan pada bakteri yang disebar di atas permukaan media
padat, fage tidak bisa menginfeksi seluruh bakteri karena tidak dapat berdifusi
secara bebas. Partikel fage yang dibebaskan dari sel bakteri yang sudah lisis hanya
bisa menginfeksi sel bakteri lain yang berdekatan. Akibatnya akan terlihat daerah
21
bening yang disebut dengan plak pada sebaran bakteri. Menurut Dale (1994),
jumlah plak berkorelasi dengan jumlah partikel fage yang ditransveksikan pertama
kali. Oleh sebab itu, agar penghitungan jumlah fage tidak salah maka jumlah
bakteri yang diinfeksi harus sama dengan atau lebih besar daripada jumlah fage.
Pengemasan hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan
BlueSTAR-1 dengan rasio molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105
plaque forming unit (pfu) tiap ml. Fage yang terbentuk pada penelitian ini relatif
tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa proses pengemasan DNA ke dalam protein
mantel berjalan dengan baik.
Untuk mengetahui jumlah klon rekombinan, pustaka genom yang terbentuk
diambil 10 µl dan diencerkan 100 kali dan 1000 kali, kemudian ditransveksikan ke
E. coli galur ER1647 dan diseleksi biru-putih (Gambar 8).
Gambar 8 Seleksi biru-putih terhadap plak.
Terbentuknya plak jernih menunjukkan bahwa bakteriofage mengandung
DNA sisipan untuk membentuk lambda rekombinan. Penggunaan X-gal pada
penelitian ini bertujuan untuk membedakan lambda rekombinan dan bukan
rekombinan. Plasmid pBlueSTAR-1 mengandung gen lacZ yang menyandikan β-
galaktosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah pengklonan ganda.
Pada daerah pengklonan ini, terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim
restriksi. Bila gen lacZ tersisipi DNA asing, gen lacZ tidak diekspresikan sehingga
β-galaktosidase tidak disintesis. Tidak adanya β-galaktosidase menyebabkan X-gal
tidak dapat dihidrolisis. X-gal bersifat kromogen yang akan menghasilkan warna
biru bila dihidrolisis menjadi glukosa dan galaktosa. Warna biru itu sendiri terikat
Plak
rekombinan
plak non
rekombinan
22
pada galaktosa, dan hanya akan kelihatan jika galaktosa terlepas dari X-gal. Plak
yang berwarna jernih menunjukkan bahwa plak tersebut tersusun dari fage
rekombinan karena adanya DNA sisipan pada gen lacZ.
Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.
langsdorffiana yang dikonstruksi pada penelitian ini mengandung rata-rata 8%
fage rekombinan (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil seleksi biru-putih terhadap pustaka genom T. langsdorffiana
Perco-
baan
Pengen-
ceran
Jumlah plak (pfu) Konsentrasi
(pfu/ml)
% Plak
rekombi-
nan Biru (non
rekom-
binan)
Jernih
(rekom-
binan)
Total
I 100 x
1000 x
171
14
6
2
177
16
1.77 x 105
1.6 x 105
3.4
12.5
Rata-rata percobaan I 1.7 x 105 8
II 100 x 249 11 260 2.6 x 105 4
Rata-rata percobaan I dan II 2.2 x 105 6
Walaupun proses pengemasan fage berjalan dengan baik, jumlah fage
rekombinan yang terbentuk relatif kecil dibandingkan dengan pustaka genom
kedelai kultivar Slamet dan Lumut (Suharsono 2002, 2007). Rendahnya jumlah
fage rekombinan yang terbentuk dapat disebabkan oleh proses ligasi yang tidak
berlangsung dengan baik sehingga tidak semua fragmen DNA T. langsdorffiana
dapat menyambung dengan DNA vektor.
Rendahnya efisiensi ligasi ini dapat disebabkan oleh tidak sempurnanya
proses fill-in pada saat pembentukan ujung-ujung fragmen DNA T. langsdorffiana.
Rendahnya efisiensi ligasi dan fill-in sangat dipengaruhi oleh kemurnian DNA.
Isolasi DNA T. langsdorffiana tidak mudah karena mengandung polisakarida.
Polisakarida ini sangat mengganggu dalam isolasi DNA karena mempunyai sifat
fisik yang mirip DNA. Proses isolasi DNA memerlukan pemanasan dalam melisis
sel, dan dalam keadaan panas, polisakarida berbentuk seperti lendir yang
menyerupai DNA. Pada saat DNA diendapkan dengan sentrifugasi, polisakarida
juga mengendap bersama-sama dengan DNA. Meskipun telah diberikan PVP
untuk mengikat polisakarida seperti prosedur Chang et al. (1993), polisakarida
23
yang berbentuk gel tetap terbentuk dan bercampur dengan DNA. Menurut Renner
(2001), ekstraksi dalam proses isolasi DNA seringkali diulang beberapa kali
karena daun melastomataceae mengandung produk sekunder yang menyebabkan
DNA sangat sulit untuk diisolasi. Kemurnian dan keutuhan DNA sangat
menentukan keberhasilan percobaan pada tahap-tahap selanjutnya.
Ukuran DNA Sisipan
Untuk mengetahui ukuran DNA T. langsdorffiana yang tersisip di dalam
vektor, satu plak yang berwarna jernih diambil dengan ujung pipet mikro
berukuran 200 µl yang telah dipotong ujungnya sehingga berukuran sedikit lebih
besar dari ukuran plak. Fage yang terdapat di gel dielusi dalam 500 l bufer SM
selama semalam. Fage ini ditransveksikan ke E. coli galur BM25.8 yang dapat
mensintesis rekombinase cre. Rekombinase cre menginduksi terjadinya proses
rekombinasi pada situs loxP yang dimiliki vektor BlueSTAR-1 (Suharsono
2007) sehingga membentuk plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan yang mengandung
DNA T. langsdorffiana. Proses rekombinasi pada dua situs loxP pada
rekombinan menghasilkan plasmid pBlueSTAR-1 dan DNA T. langsdorffiana
sebagai sisipan (Gambar 9).
Gambar 9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC,
lambda, EMC dari vektor fage .
24
10000 10000
Proses eksisi terbaik terjadi bila suspensi fage hasil elusi diencerkan 100
kali sebelum dilakukan transveksi pada E. coli galur BM25.8 seperti pada hasil
Suharsono (2002, 2007). Pengenceran ini dimaksudkan agar terbentuk plak yang
menyebar dan terpisah satu dengan lainnya. Plasmid yang berada di dalam E. coli
galur BM25.8 tidak efisien dalam melakukan perbanyakan sehingga setelah
diisolasi, plasmid tersebut diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5 .
Keberadaan plasmid di dalam E. coli DH5 diseleksi dengan ampisilin,
sehingga hanya bakteri yang mengandung plasmid rekombinan adalah yang
tumbuh di media tersebut. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik di dalam
plasmid rekombinan memudahkan proses seleksi terhadap klon bakteri yang
membawa plasmid rekombinan. E. coli DH5 yang tidak mengandung plasmid
rekombinan mengalami kematian pada media yang mengandung ampisilin.
Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan
dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. EcoRI adalah suatu enzim restriksi yang
berasal dari E. coli RY 13 yang mengenali dan memotong rangkaian spesifik 6 pb
yaitu 5 -GAATTC-3 dan secara teoritis memotong DNA pada sekuen spesifik
tersebut sekali setiap 4096 pb (46). Ujung potongan yang dihasilkan enzim restriksi
ini adalah ujung kohesif/“sticky” ends (Old & Primrose 1989; Murray et al. 1996).
Pemotongan plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dengan EcoRI menghasilkan dua
fragmen DNA yang masing-masing berukuran sekitar 2.1 kb dan 10 kb (Gambar
10). Fragmen DNA berukuran 2.1 kb adalah vektor plasmid pBlueSTAR-1 dan
fragmen yang berukuran 10 kb adalah DNA T. langsdorffiana yang tersisip di
dalam plasmid pBlueSTAR-1.
Gambar 10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI. Lajur 1 = marker 1
kb ladder (Promega); lajur 2 = vektor rekombinan/EcoRI.
6000
4000
3000 2500
2000
1500
Vektor berukuran
2.1 kb
pb 1 2
Insert berukuran
10000 pb
25
Ukuran DNA sisipan yang relatif besar yaitu 10 kb ini sangat bermanfaat
dalam konstruksi pustaka genom karena pustaka genom hanya membutuhkan titer
rekombinan yang relatif sedikit untuk memuat semua informasi genetik yang
dimiliki oleh suatu organisme. Ukuran yang besar juga sangat bermanfaat dalam
isolasi gen utuh dan pemetaan fisik karena dapat mengandung lebih dari satu gen
(Suharsono 2002, 2007). Gen pada eukariot rata-rata berukuran 1346 pb (Xu et al.
2006). Vektor lain yang dapat digunakan untuk mengklon fragmen-fragmen yang
besar adalah BAC dan YAC, sehingga kedua vektor ini sering digunakan untuk
konstruksi pustaka genom, tetapi kedua vektor ini lebih sulit untuk direkayasa
dibandingkan dengan fage.
Ukuran Pustaka Genom
Konstruksi pustaka genom bertujuan untuk mengoleksi genom dari suatu
organisme di dalam klon-klon rekombinan. Setiap klon rekombinan adalah turunan
yang berasal dari sel tunggal hasil introduksi fage yang membawa molekul DNA
rekombinan yang sama ke sel E. coli.
Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu pustaka genom, maka
informasi ukuran genom dari suatu organisme harus diketahui. Ukuran pustaka
genom dari suatu organisme tergantung dari jumlah DNA dari genom haploid
organisme tersebut. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui,
maka ukuran genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan
derajat kelengkapan pustaka genom karena kedua spesies tersebut termasuk dalam
famili Melastomataceae. Menurut Hanson et al. (2001), genom haploid Dissotis
canescens berukuran 1.81 x 105 kb sehingga dalam keadaan diploid menjadi 3.62 x
105 kb. Untuk memuat seluruh genom ini dengan ukuran sisipan 10 kb, maka
pustaka genom memerlukan 3.62 x 104 klon rekombinan bila fragmen DNA
sisipan tidak saling tumpang tindih. Bila potongan DNA sisipan merupakan daerah
yang tumpang tindih letaknya di dalam genom, maka pustaka genom ini
memerlukan jumlah klon rekombinan lebih besar daripada 3.62 x 104.
Pada penelitian ini, volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan
titer fage rekombinannya adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah
6.8 x 103 pfu. Dengan menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Potongan besar DNA T. langsdorffiana dihasilkan dari pemotongan DNA
secara parsial dengan menggunakan 0.01 U Sau3AI tiap µg DNA pada suhu 37ºC
selama 30 menit. Potongan besar ini telah berhasil disisipkan ke dalam fage
BlueSTAR-1. Pengemasan hasil ligasi 0.5 µg DNA T. langsdorffiana dengan
BlueSTAR-1 dengan rasio molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer yang cukup tinggi
yaitu 1.7 x 105 pfu/ml dan 8% diantaranya adalah rekombinan. Karena volumenya
500 µl, maka pustaka genom genom T. langsdorffiana yang dikonstruksi
mempunyai 6.8 x 103 pfu rekombinan. Analisis DNA sisipan menunjukkan bahwa
DNA T. langsdorffiana yang tersisip di dalam BlueSTAR-1 berukuran 10 kb.
Berdasarkan ukuran DNA sisipan ini dan genom Dissotis canescens yang
berkerabat dekat dengan T. langsdorffiana maka peluang mendapatkan sembarang
potongan DNA atau gen di dalam pustaka genom adalah 17% sehingga pustaka
ini belum mengandung seluruh genom T. langsdorffiana.
Saran
Untuk mendapatkan pustaka genom T. langsdorffiana yang lengkap maka
DNA yang digunakan harus murni sehingga proses pemotongan, fill-in dan ligasi
dapat berjalan dengan baik.
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini dibiayai oleh Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005 atas
nama Dr. Ir. Suharsono, DEA.
26
fage rekombinan, f = rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom
(Sambrook et al. 1989), maka peluang (P) seluruh genom T. langsdorffiana
terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini berarti bahwa peluang untuk
mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam pustaka genom adalah 17%.
Peluang ini sangat kecil dibandingkan dengan pustaka genom kedelai kultivar
Lumut (Suharsono 2007).
Hal yang perlu diperhatikan dalam mengkonstruksi suatu pustaka genom
adalah bahwa pustaka genom tersebut harus mempresentasikan semua gen yang
ada di dalam sumber DNA asalnya. Dengan kata lain, suatu pustaka gen ini
dikatakan representatif apabila mengandung semua DNA dari suatu organisme.
DAFTAR PUSTAKA
Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple method for isolating RNA from
pine trees. Plant Mol Biol Rep 11:113-116.
Chauthaiwale VM, Therwath A, Deshpande VV. 1992. Bacteriophage lambda
as a cloning vector. Microbiol Mol Biol Rev 56(4):577-591.
Clontech. 1999. Chroma Spin Columns. [Produk protokol]. California:
Clontech.
Cross SH, Clark VH, Bird AP. 1999. Isolation of CpG islands from large
genomic clones. Nucl Acid Res 27(10):2099-2107.
Dale JW. 1994. Molecular Genetics of Bacteria. Ed ke-2. England: John Wiley
& Sons.
Elvawati. 1999. Konstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai (varietas Yellow
Biloxy) yang diinduksi cekaman aluminium menggunakan vektor
[tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Faravani M, Bakar BH. 2007. Descriptive analysis on the morphology, growth
and branching patterns of princess flower (Tibouchina urvilleana Cogn.)
in Peninsular Malaysia. J of food, Agriculture & Environment 5(1):234-
238.
Glick BR, Pasternak JJ. 1994. Molecular Biotechnology, Principles and
Applications of Recombinant DNA. Washington DC: American Society
for Microbiology Pr.
Hanson L, McMahon KA, Johnson MAT, Bennett MD. 2001. First nuclear
DNA C-values for 25 angiosperm families. Ann of bot 87:251-258.
http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm [13 Mei 2009].
http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm [13 Mei 2009].
Jansen S, Watanabe T, Smets E. 2002. Aluminium accumulation in leaves of 127
species in Melastomataceae, with comments on the order Myrtales. Ann of
Bot 90:53-64.
Judd WS, Campbell CS, Kellog EA, Stevens PF, Donoghue MJ. 2005. Plant
Systematics: A Phylogenetic Approach. Ed ke-2. USA: Sinauer
Associates, Inc.
Kurnia R. 2005. Isolasi gen penyandi glutathione s transferase dari pustaka
genom kedelai kultivar slamet [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
29
Kurniawan A. 2005. Isolasi fragmen DNA yang mengandung gen penyandi
glutathione s transferase dari pustaka genom kedelai kultivar lumut
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York: Madison
Avenue.
Miftahudin, Widyastuti U, Suwanto A, Jusuf M, Aswidinoor H. 1998.
Construction of cDNA library from drought-stressed soybean. Hayati
5:34-37.
Muhaemin. 2008. Analisis pertumbuhan melastoma (Melastoma malabathricum
auct. non. L. dan M. affine D. Don.) yang mendapat cekaman pH rendah
dan aluminium [tesis]. Bogor: Sekolah pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Murray K. 1977. Applications of Bacteriophage Lambda in Recombinant DNA
Research. Di dalam: Scott WA, Werner R, editor. Molecular Cloning of
Recombinant DNA. USA: Academic Pr. hlm. 133-154.
Mutiasari A. 2008. Akumulasi aluminium pada Melastoma affine dan
Melastoma malabathricum [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Novagen. 1997. BlueStar Vector System. Madison: Novagen.
Old RW, Primrose SB. 1989. Principles of Gene Manipulation. Oxford:
Blackwell.
Rachman F. 2005. Isolasi fragmen DNA yang mengandung gen penyandi
peroksidase dari pustaka genom kedelai kultivar slamet [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Rahmawati. 2005. Isolasi gen peroksidase melalui penapisan terhadap pustaka
genom kedelai kultivar lumut [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Renner SS. 1993. Phylogeny and classification of the Melastomataceae and
Memecylaceae. Nordic J of Bot 13:519-540.
Renner SS, Clausing G, Meyer K. 2001. Historical biogeography of
Melastomataceae the roles of tertiary migration and long distance
dispersal. Am J of Bot 88(7):1290-1300.
Sambrook J, Frisch EF, Kochian LV, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
30
Singer M, Berg P. 1991. Genes & Genomes. California: University Science
Books.
Stratagene. 2003. Gigapack III Gold Packaging Extract, Gigapack III Plus
Packaging Extract, and Gigapack III XL Packaging Extract. Instruction
Manual. California: Stratagene Cloning System.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati
9:67-70.
Suharsono, Julianto T, Jusuf M. 2003. Penapisan pustaka genom tanaman
kedelai kultivar Lumut menggunakan pelacak gen peroksidase dari
Arabidopsis thaliana. Simposium Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik,
Balitbiogen Pertanian, Bogor. hlm. 11-12.
Suharsono. 2007. Pembuatan perpustakaan genom kedelai (Glycine max (L.)
Merrill) kultivar Lumut di dalam fage lambda. Biosfera 24(2):83-89.
Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen: Bagaimana mengontruksinya? [ulasan].
Hayati 8:27-30.
Xu L et al. 2006. Average gene length is highly conserved in prokaryotes and
eukaryotes and diverges only between two kingdom. Submitted as a letter
to Mol Biol and Evol, MBE Advance Access published 12 April 2006.
Yuwono T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
top related