AKTIVITAS URIKASE YANG DIHASILKAN DARIBERBAGAI SEL Lactobacillus plantarum DAN

PARAMETER KINETIKANYA

EKA MARDIAH

DEPARTEMEN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

ABSTRAK

EKA MARDIAH. Aktivitas Urikase yang Dihasilkan dari Berbagai Sel Lactobacillusplantarum dan Parameter Kinetikanya. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINIPRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, TRIVADILA.

Penentuan kadar asam urat dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri padapanjang gelombang 293 nm dengan adanya urikase. Urikase yang digunakan diperolehdari sel bakteri Lactobacillus plantarum K. Mar. E yang diisolasi dari kulit markisa danL. plantarum Mgs. Psmb dan Mgs. Bst dari manggis. Penelitian ini dilakukan untukmenentukan aktivitas dan mempelajari kinetika urikase dari berbagai sel L. plantarumdengan metode spektrofotometri. Kemampuan L. plantarum dalam mendegradasi asamurat secara kualitatif terlihat dari zona bening yang terbentuk setelah lima hari dengandiameter 0,2 mm pada media pepton ragi glukosa yang mengandung 0,2% asam urat.Kondisi optimum urikase yang dihasilkan dari ketiga sel L. plantarum terjadi padakondisi fisiologis. Aktivitas urikase yang dihasilkan dari sel L. plantarum K. Mar. E,Mgs. Psmb, dan Mgs. Bst masing-masing sebesar 0,1073; 0,0867; dan 0,0842 U/mL.Parameter kinetika urikase ditentukan dengan menggunakan asam urat sebagai substrat.Vmaks yang dihasilkan L. plantarum K. Mar E, Mgs. Psmb, dan Mgs. Bst masing-masingsebesar 1,3635; 0,0316; dan 0,0418 U/mL kultur bakteri dan KM masing-masing sebesar0,1541; 0,0061; dan 0,0054 mM. Aktivitas urikase pada berbagai sel bakteri L. plantarumstabil sampai hari kedua.

ABSTRACT

EKA MARDIAH. Uricase Activity and Kinetics of Various Cells of Lactobacillusplantarum. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT,TRIVADILA.

Uric acid concentration could be determined by spectrophotometry method. Uricacid was oxidized into allatonin in the presence of uricase and calculated by measuringthe decrease of uric acid absorbance at 293 nm. These uricase were obtained from cells ofLactobacillus plantarum. L. plantarum K. Mar. E was isolated from passion fruit skin andL. plantarum Mgs. Psmb and Mgs. Bst from mangosteen. This research was conducted toobserve the activity and kinetics of uricase from various cells of L. plantarum byspectrophotometric method. The plate assay method indicated that L. plantarum produceduricase, based on the clear zone about 0,2 mm on glucose yeast peptone mediumcontained 0,2% uric acid. The optimum condition of uricase activity from the threedifferent sources occured in physiological condition. Uricase activity generated from cellsof L. plantarum K. Mar. E, Mgs. Psmb, and Mgs. Bst were 0,1073; 0,0867; and 0,0842U/mL, respectively. The kinetic parameters for uricase, determined with uric acid as thesubstrate. Vmax produced by L. plantarum K. Mar. E, Mgs. Psmb, and Mgs. Bst were1,3635; 0,0316; and 0,0418 U/mL of bacterial culture, respectively and KM 0,1541;0,0061; and 0,0054 mM, respectively. Uricase activity in various bacterial cells of L.plantarum was stable until the second day.

AKTIVITAS URIKASE YANG DIHASILKAN DARIBERBAGAI SEL Lactobacillus plantarum DAN

PARAMETER KINETIKANYA

EKA MARDIAH

Skripsisebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains padaDepartemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

Judul : Aktivitas Urikase yang Dihasilkan dari Berbagai SelLactobacillus plantarum dan Parameter Kinetikanya

Nama : Eka MardiahNIM : G44076018

Menyetujui,

Pembimbing I

Dr. Dyah Iswantini P., M. Agr.NIP 19670730 199103 2 001

Pembimbing II

Dr. Novik NurhidayatNIP 131932487

Pembimbing III

Trivadila, S.Si.

Mengetahui

Ketua Departemen KimiaFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor,

Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, M.S.NIP 19501227 197603 200 2

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nyasehingga penelitian dan karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini disusunberdasarkan penelitian dan studi pustaka yang dilaksanakan antara bulan Juli 2009 hinggaMei 2010 bertempat di Laboratorium Kimia Fisik dan Lingkungan, LaboratoriumBersama, Departemen Kimia, FMIPA-IPB dan Laboratorium Genetik Mikrobiologi,Puslit Biologi-LIPI, Bogor dengan judul Aktivitas Urikase yang Dihasilkan dari BerbagaiSel Lactobacillus plantarum dan Parameter Kinetikanya.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Dyah Iswantini P., M. Agr., BapakDr. Novik Nurhidayat, dan Ibu Trivadila, S.Si. selaku pembimbing atas saran, kritikan,dorongan dan bimbingannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Disamping itu, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staf laboran Kimia Fisik danLingkungan, Bapak Nano, Bapak Mail, dan Ibu Ai; staf laboran Laboratorium Bersama,Siti Rachmah Nurhayati dan Mas Eko; serta kepada teknisi Laboratorium GenetikMikrobiologi, Bapak Acun, Bapak Aswan dan Teh Ratih, juga kepada Ibu Erna dan IbuNeri atas fasilitas, bantuan, dan sarannya selama penelitian.

Ungkapan terima kasih yang tak terhingga juga disampaikan kepada Bapak, Umi,Aa dan Endah serta seluruh keluarga di Bantarjati dan Cimanggu atas kasih sayang, do’a,nasihat dan dukungan lain yang tidak pernah putus. Terima kasih juga penulis sampaikankepada Andayani Nurjayati, teman seperjuangan selama penelitian; Wina, Marlia, Rereatas informasi Mikrobiologi. Serta kepada Risna, Nurul, Kak Ivan, Kak Lutfi, Zehan, danteman-teman Ekstensi S-1 Kimia yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas do’a,semangat dan canda tawa selama perkuliahan dan penelitian.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juli 2010

Eka Mardiah

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 8 Oktober 1983 dari ayah EndangDeddi dan ibu Ati Maswati. Penulis merupakan putri kedua dari tiga bersaudara.

Tahun 2002 penulis lulus dari SMU Negeri 2 Bogor, pada tahun yang sama masukIPB Program Studi D-3 Analis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam. Kemudian pada tahun 2007 penulis melanjutkan kuliahPenyelenggaraan Khusus S-1 Kimia IPB, Departemen Kimia, Fakultas Matematika danIlmu Pengetahuan Alam.

Pada bulan April–Mei 2005 penulis berkesempatan melaksanakan kegiatan PraktikKerja Lapangan di Laboratorium Quality Control (QC) PT Bintang Toedjoe,Jakarta. Setelah lulus dari program D-3 Analisis Kimia, penulis sempat bekerja sebagaianalis di PT Centralpertiwi Bahari, Lampung pada tahun 2006-2007 dan PT KinglabIndonesia, Tangerang pada tahun 2007–2008.

DAFTAR ISI

HalamanDAFTAR TABEL ...................................................................................................... ii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................. ii

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................. ii

PENDAHULUAN ...................................................................................................... 1

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................. 1

Asam Urat ......................................................................................................... 1Urikase .............................................................................................................. 2Lactobacillus plantarum ................................................................................... 2Kinetika Enzim ................................................................................................ 2

BAHAN DAN METODE .......................................................................................... 3

Alat dan Bahan ................................................................................................. 3Metode Penelitian ............................................................................................ 3

HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................................. 4

Sel Bakteri Penghasil Urikase .......................................................................... 4Aktivitas Urikase Metode Spektrofotometri .................................................... 4pH Larutan Bufer Borat Optimum ................................................................... 5Suhu Optimum ................................................................................................. 5Konsentrasi Enzim ........................................................................................... 6Konsentrasi Optimum Substrat Asam Urat ...................................................... 7Stabilitas Aktivitas Urikase Sel Bakteri ........................................................... 8

SIMPULAN DAN SARAN ....................................................................................... 8

Simpulan .......................................................................................................... 8Saran ................................................................................................................ 9

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 9

LAMPIRAN ............................................................................................................... 11

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Hasil pengamatan zona bening ............................................................................ 4

2 Aktivitas urikase ................................................................................................. 5

3 Data nilai Vmaks dan KM ....................................................................................... 8

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Struktur asam urat ............................................................................................... 1

2 Mikroskopik L. plantarum .................................................................................. 2

3 Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan awal reaksi enzimatik ............... 3

4 Kurva Linewaever-Burk ...................................................................................... 3

5 Zona bening di sekitar sel (a) L. plantarum Mgs. Psmb (b) L. plantarum K.Mar. E (c) L. plantarum Mgs. Bst ...................................................................... 4

6 Aktivitas urikase enzim murni (a) dan sel L. plantarum (b) pada beragam pHbufer .................................................................................................................... 5

7 Aktivitas urikase enzim murni (a) dan sel L. plantarum (b) pada beragam suhu 6

8 Aktivitas urikase pada beragam konsentrasi enzim murni (a) dan suspensi selbakteri K. Mar. E (b) . ......................................................................................... 6

9 Aktivitas urikase enzim murni (a) dan sel L. plantarum K. Mar. E (b) padaberagam konsentrasi substrat asam urat ............................................................. 7

10 Kurva Lineweaver-Burk (a) untuk enzim murni dan (b) sel L. plantarum K.Mar. E ................................................................................................................. 8

11 Kestabilan aktivitas urikase sel bakteri sampai hari ke-7 ................................... 8

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Bagan alir kerja.................................................................................................... 12

2 Prosedur pembuatan larutan ................................................................................ 13

3 Hasil uji aktivitas urikase .................................................................................... 13

4 Grafik aktivitas urikase pada konsentrasi suspensi sel L. plantarum .................. 14

5 Grafik aktivitas urikase sel L. plantarum pada beragam konsentrasi substratasam urat ............................................................................................................. 15

6 Grafik Lineweaver-Burk ..................................................................................... 16

PENDAHULUAN

Asam urat merupakan produk akhir dariturunan purin pada metabolisme manusia yangberada dalam darah dan urin. Pengujian asamurat dalam darah dan urin menjadi sangatpenting karena dapat digunakan sebagaiindikator yang kuat pada tanda-tanda penyakitginjal. Ketidaknormalan konsentrasi asam uratdalam tubuh akan menyebabkan beberapapenyakit, di antaranya hiperurisemia, sindromLesch-Nyhan, gout, dan penyakit gagal ginjal(Luo et al. 2006).

Pengujian asam urat dalam cairan tubuhsecara klinis dilakukan dengan mengambildan memeriksa darah di laboratorium denganmetode spektrofotometriAsam urat, ditentu-kan dengan mengukur penurunan serapanpada panjang gelombang 290 nm pada hasiloksidasi asam urat menjadi alantoin denganadanya urikase (Worthington BiochemicalCorporation 2009).

Menurut Prætorius (1949), serapanmaksimum terjadi pada daerah ultraviolet,yakni pada panjang gelombang 293 nm.Metode spektrofotometri UV ini telahdimanfaatkan oleh Liao et al. (2006) untukmengevaluasi kinetika urikase dalampengujian asam urat dalam serum. Karakterenzim yang perlu dipelajari dalam kinetikaenzim di antaranya yaitu KM dan Vmaks melaluipersamaan Michaelis-Menten.

Penggunaan enzim murni dalam pengujiandinilai kurang efisien karena sangat mahal danstabilitasnya rendah. Oleh karena itu,digunakanlah mikrob penghasil urikasesebagai komponen pengenal hayati untukmengukur kadar asam urat. Keuntunganlainnya penggunaan mikrob ialah waktu hiduplebih lama, toleran pada pH, dan mudahdimurnikan.

Pemanfaatan mikrob sebagai penggantienzim murni juga pernah dilakukan olehIswantini et al. (1998) pada penentuanaktivitas enzim glukosa dehidrogenase (GDH)secara elektrokimia sebagai biosensorglukosa. Mikrob yang digunakan ialahEscherichia coli. GDH yang dihasilkan E. coliberada dalam bentuk apo-GDH (enzim yangbelum aktif) dan tidak memiliki kemampuanuntuk menghasilkan pirolokuinolin kuinon(PQQ). Pada tahun 2000, Iswantini et al.menguji tingkah laku katalitik dari sel E. colitersebut dengan holoenzim yang dicirikanoleh persamaan Michaelis-Menten.

Beberapa mikrob yang mampumenghasilkan urikase di antaranya Bacillusfastidosus (Mahler 1970), Microbacterium sp.

(Zhou et al. 2005), Pseudomonas aeruginosa(Abdel-Fattah 2005), dan B.thermocatenulatus (Lotfy 2007). Aktivitasurikase yang dihasilkan mikrob-mikrobtersebut pada umumnya diukur denganmenggunakan metode spektrofotometri.

Mikrob yang digunakan pada penelitian iniadalah Lactobacillus plantarum yang belumdiketahui aktivitasnya pada uricase. Namundiharapkan dapat menghasilkan aktivitas yanglebih besar dan tahan lama. Mikrob tersebutdipilih karena mudah diperoleh danbermanfaat sebagai probiotik yang dapatmencegah penyakit pada manusia dan hewan.

Penelitian ini bertujuan menentukanaktivitas dan mempelajari kinetika uricaseyang dihasilkan oleh berbagai sel bakteri L.plantarum dengan metode spektrofotometri,serta mempelajari kestabilannya. Selanjutnyapenelitian ini diharapkan dapat bermanfaatuntuk aplikasi biosensor asam urat denganmetode elektrokimia.

TINJAUAN PUSTAKA

Asam Urat

Asam urat (2,6,8-trihidroksipurin)berbentuk kristal putih dengan rumus molekulC5H4N4O3 memiliki bobot molekul sebesar168 g/mol (Gambar 1). Asam urat sedikit larutdalam air, jika berlebih akan terjadipenumpukan kristal sodium yangmengakibatkan rasa nyeri. Kadar asam uratnormal dalam serum berkisar 0,13–0,46 mM(2,18–7,7 mg/dL) sedangkan dalam ekskresiurin berkisar 1,49–4,46 mM (25–74 mg/dL)(Luo et al. 2006).

NH

ONH

NH

O

HN

O

Gambar 1 Struktur asam urat.

Asam urat dapat ditentukan di dalamlaboratorium klinik dengan menggunakanmetode kolorimetri atau metode enzimatik.Metode enzimatik terbaru melibatkan urikaseyang mampu meningkatkan spesifitas secarasignifikan. Dalam metode enzimatik hasildegradasi asam urat dapat menurunkanserapan pada panjang gelombang 293 nm(Trivedi et al. 1978).

Banyak penyakit dan gangguan patologiyang berkaitan dengan ragam konsentrasiasam urat dalam cairan tubuh, di antaranyagout, artritis, penyakit ginjal, penyakit

2

kardiovaskular, dan penyakit syaraf. Olehkarena itu, penentuan asam urat merupakanhal terpenting dalam penyakit yang berkaitandengan biosintesis purin dan katabolisme(Zhang et al. 2007).

Urikase

Urikase (urate: oksigen oksidoreduktase,EC 1.7.3.3) merupakan enzim yang memilikiperan penting dalam metabolisme nitrogendan katalis spesifik untuk oksidasi asam urat.Urikase digunakan dalam ilmu kedokteran danbiokimia klinis sebagai reagen diagnosa untukmengukur kadar asam urat (Adámek et al.1989). Enzim ini memiliki bobot molekulsebesar 125000 dengan nilai KM dan pHoptimum beragam sesuai sumber enzimnya.

Urikase mengkatalis oksidasi asam uratmembentuk alantoin, karbon dioksida, danhidrogen peroksida. Katalisis ini dilakukandengan cara membuka cincin purin pada asamurat dengan keberadaan oksigen sebagaioksidator untuk menghasilkan alantoin dankarbon dioksida. Sementara O2 tereduksimenjadi hidrogen peroksida. Jumlah O2 yangdiperlukan serta karbon dioksida dan hidrogenperoksida yang dihasilkan setara dengan kadarasam urat dalam darah (Arslan 2008; Abdel-Fattah 2005).

+ O2 + H2O

+ CO2 + H2O2

urikaseNH

ONH

NH

O

HN

O

asamuratO

HN

NH N

HNH2

O

O

alantoin

Urikase diketahui berasosiasi denganmikrobodi pada jaringan hewan, jaringantumbuhan, protozoa, alga, danmikroorganisme. Mikroorganisme yang dapatmenghasilkan urikase di antaranya bakteriMicrobacterium sp. (Zhou et al. 2005) denganaktivitas urikase sebesar 1,0 U/mL, P.aeruginosa (Abdel-Fattah 2005) 7,1 U/mL,dan B. thermocatenulatus (Lotfy 2008)sebesar 1,25 U/mL. Pada umumnya, aktivitastersebut diperoleh dengan menggunakanmetode spektrofotometri.

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum termasuk kedalam kingdom Bacteria, filum Firmicutes,kelas Bacilli, ordo Lactobacillales, familiLactobacillaceae, dan genus Lactobacillus. L.plantarum merupakan salah satu spesies

Lactobacillus yang penting pada industri. L.plantarum merupakan salah satu jenis bakteriasam laktat (BAL) homofermentatif dengansuhu optimum kurang dari 37 oC (Frazier &Westhoff 1988).

L. plantarum berbentuk batang (0,5–1,5s/d 1,0–10 mm) dan tidak bergerak(nonmotil). Bakteri ini memiliki sifat katalasenegatif, aerob atau fakultatif anaerob, mampumencairkan gelatin, cepat mencerna protein,tidak mereduksi nitrat, toleran pada asam, danmampu memproduksi asam laktat. Dalammedia agar, L. plantarum membentuk koloniberukuran 2–3 mm, konveks dan dikenalsebagai bakteri pembentuk asam laktat(Kuswanto dan Sudarmadji 1988 diacu dalamRostini 2007).

Gambar 2 Mikroskopik L. plantarum.

Lactobacillus dapat digunakan sebagaiorganisme probiotik dan berpotensi mencegahpenyakit pada manusia dan hewan, sertamampu menghambat patogen dalam bahanpangan (Ljungn & Wadström 2009). L.plantarum juga dapat menghasilkan enzim, diantaranya enzim malat (Park & Guttman1973) dan amilase (Giraud et al. 1993).Sampai saat ini, aktivitas urikase yangdihasilkan oleh L. plantarum belum diketahui.Namun demikian, menurut Ogawa (2006)Lactobacillus mempunyai kemampuan untukmendegradasi purin dalam asam urat.

Kinetika Enzim

Dalam reaksi enzim dikenal kecepatanreaksi hidrolisis, penguraian, atau reaksikatalisis lain yang disebut velocity (V). Padakonsentrasi enzim tetap (tertentu) harga Vhampir linear dengan konsentrasi substrat [S].Pada kondisi ketika V tidak dapat bertambahlagi dengan bertambahnya [S] disebutkecepatan maksimum (Vmaks). Vmaks

merupakan salah satu parameter kinetikaenzim. Parameter kinetika enzim yang lainadalah konstanta Michaelis-Menten, yanglebih dikenal dengan KM (Wiesman 1989diacu dalam Putra 2009).

3

Gambar 3 Pengaruh konsentrasi substrat padakecepatan awal reaksi enzimatik.

Bentuk kurva kejenuhan substrat (Gambar2) yang khas bagi suatu enzim dapatdinyatakan secara matematik oleh persamaanMichaelis-Menten:

vo =

Persamaan Michaelis-Menten merupakandasar bagi semua aspek kinetika kerja enzim.Akan tetapi, KM dan Vmaks sulit ditentukandengan tepat dari kurva Michaelis-Menten.Nilai KM dan Vmaks lebih tepat dapat diperolehdengan memanfaatkan transformasi aljabarpersamaan Linewaever-Burk (Lehninger1982):

Gambar 4 Kurva Linewaever-Burk.

Nilai KM urikase beragam sesuaisumbernya. KM urikase untuk B. fastidosussebesar 65 µmol/L (Zhao et al. 2005 diacudalam Liao et al. 2006) dan Candida utilissebesar 12,5 µmol/L (Liao et al. 2006).Menurut Lotfy (2008), Vmaks dan KM urikasedari B. thermocatenulatus dengan substrat

asam urat diperoleh sebesar 0,99 U/mL dan0,25 mM.

BAHAN DAN METODE

Bagan alir kerja secara umum ditunjukkanpada Lampiran 1.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah pengadukmagnet, neraca analitik, inkubator, oven,autoklaf, sentrifus, spektrofotometer UV-Visberkas ganda, dan alat kaca lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan adalahurikase murni (EC 1.7.3.3 dari Arthrobacterglobiformis diperoleh dari Sigma Aldrich), selL. plantarum Mgs. Psmb diisolasi darimanggis yang berasal dari Medan, L.plantarum K. Mar. E diisolasi dari kulitmarkisa yang berasal dari Medan dan L.plantarum Mgs. Bst diisolasi dari manggisyang berasal dari Brastagi (ketiga sel tersebutmerupakan koleksi Laboratorium Genetik,Mikrobiologi, Puslit Biologi, LIPI), asam urat,larutan bufer borat (Lampiran 2), glukosa,yeast extract, pepton, beef extract, natriumasetat, salt solution (Lampiran 2), Tween 80,dan agar.

Metode Penelitian

Media

Media agar pepton ragi glukosa (GYP).Satu liter media berisi 10 g glukosa, 10 gyeast extract, 5 g pepton, 2 g beef extract, 1,4g natrium asetat, 5 mL salt solution, 10 mLTween 80, 3,75 g CaCO3, dan 20 g agar.Media dipanaskan hingga homogen dandisterilisasi dengan autoklaf selama kuranglebih 15 menit pada 121 °C. Dalam keadaanmasih hangat, media dituang ke dalam cawanpetri. Setelah dingin dan membeku, mediasiap digunakan untuk meremajakan selbakteri.

Media GYP Cair. Kandungan media cairsama dengan media agar tetapi tanpa diberiagar dan CaCO3. Selanjutnya proses sterilisasitidak berbeda dengan sterilisasi media agar.

Uji Aktivitas Urikase Secara Kualitatif

Sebanyak satu ose bakteri yangditumbuhkan pada media GYP agardipindahkan ke media GYP yang mengandung0,2% asam urat. Apabila bakteri mempunyaiaktivitas urikase maka akan terlihat zonabening di sekitar koloni bakteri yang telahmendegradasi CaCO3. Zona bening tersebut

4

akan terlihat setelah lima hari inkubasi padasuhu 37 ˚C.

Penumbuhan dan Panen Mikrob

Inokulum digoreskan pada permukaanmedia GYP dalam cawan petri dengan jarumpindah (lup inokulasi). Kemudian diinkubasipada suhu 37 °C selama 2 hari. Bakteri yangtumbuh selanjutnya ditanam ke dalam 10 mLmedia GYP cair sebagai strarter dandiinkubasi hingga mencapai nilai OD600=1.Sebanyak 0,5 mL starter diinokulasi ke dalam50 mL media GYP dan diinkubasi. Sel bakteridipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan10000 rpm (8000× g) selama 15 menit. Peletdipisahkan dari supernatan, lalu dicuci duakali dengan air distilata dan diresuspensidengan NaCl 0,85%.

Pengukuran Spektrofotometri (Bergmeyeret al. 1974)

Sebanyak 0,02 mL suspensi bakteri (OD L.plantarum Mgs. Psmb = 1,099; L. plantarumK. Mar E = 0,999; L. plantarum Mgs. Bst =0,999) ditambahkan ke dalam 3,09 mL buferborat pH 8 dan 0,01 mL asam urat 3,57 mM,kemudian diinkubasi selama 5 menit. Untuklarutan blangko, 0,02 mL suspensi bakteridiganti dengan 0,02 mL bufer borat.Selanjutnya penurunan nilai serapan diukurpada panjang gelombang 293 nm.

Perhitungan Aktivitas Urikase

Aktivitas enzim (U/mL) =

Keterangan:

∆Α = Αblangko - Αcontoh

3,12 = volum total dalam pengukuran (mL)12,6 = koefisien ekstingsi asam urat pada

λ293 (cm2/µmol)0,02 = volume enzim yang digunakan

(mL)t = waktu (menit)

Pengaruh pH Bufer, Suhu, danKonsentrasiSubstrat

Pengukuran pH dilakukan pada ragamnilai pH bufer mulai dari pH 6–10 denganinterval 1 nilai pH. Pengukuran suhudilakukan pada rentang 15–65 ˚C denganinterval 10 ˚C. Pengukuran konsentrasisubstrat dilakukan dengan mengamatipenurunan serapan asam urat pada panjanggelombang 293 nm dari konsentrasi asam urat

dengan ragam 0,011–0,16 mM dalam buferasam borat pada nilai pH optimum dan suhuruang (25 ˚C).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sel Bakteri Penghasil Urikase

Ketiga sel L. plantarum yang ditumbuhkanpada media GYP memiliki ciri berbentukbatang dan berkoloni. Hasil pewarnaan Grammenunjukkan bahwa bakteri tersebutmerupakan bakteri gram positif, karenamengikat warna ungu kebiruan dari kristalviolet. Uji katalase negatif tidak menimbulkanbuih ketika ditetesi H2O2 karena L. plantarumtidak bereaksi dengan H2O2.

Secara kualitatif, bakteri L. plantarummemperlihatkan aktivitas urikase pada mediaGYP + 0,2% asam urat. Aktivitas urikaseditunjukkan dengan terbentuknya zona beningdi sekitar koloni dengan diameter masing-masing 0,2 cm setelah 5 hari inkubasi pada 37˚C (Gambar 5). Zona bening di sekitar kolonibakteri menunjukkan bahwa asam urat telahdidegradasi oleh urikase ekstraseluler yangdihasilkan oleh bakteri (Azab et al. 2005).

Tabel 1 Hasil pengamatan zona bening

Sel L. plantarumZona bening hari ke-

1 2 3 4 5K. Mar E - - + + ++Mgs. Psmb - - + + ++Mgs. Bst - - + + ++

Keterangan:- : tidak zona bening+ : zona bening kecil (± 0,1 cm)

++ : zona bening besar (± 0,2 cm)

(a) (b) (c)Gambar 5 Zona bening di sekitar sel (a) L.

plantarum Mgs. Psmb (b) L.plantarum K. Mar. E (c) L.plantarum Mgs. Bst.

Aktivitas Urikase Metode Spektrofotometri

Pengukuran aktivitas dengan metodespektrofotometri dilakukan berdasarkanpenurunan serapan asam urat pada panjanggelombang 293 nm yang merupakan hasil darioksidasi asam urat menjadi alantoin. Oksidasiasam urat membentuk alantoin melepaskanelektron yang diterima O2 dan tereduksimembentuk H2O2 melalui reaksi:

5

Asam urat + O2 + H2Ourikase alantoin +

CO2 + H2O2.Alantoin yang terbentuk tidak menyerap

pada panjang gelombang 293 nm. Penurunanserapan pada panjang gelombang 293 nmsebanding dengan keberadaan asam urat(Trivedi et al. 1978). Semakin tinggi aktivitasurikase maka semakin banyak alantoin yangterbentuk. Data pengukuran aktivitas urikasesecara keseluruhan ditunjukkan padaLampiran 3.

Aktivitas urikase yang dihasilkan olehenzim murni sebesar 1,2282 U/mL enzim danaktivitas berbagai sel bakteri L. plantarumditunjukkan pada Tabel 2. Aktivitas urikasedari sel L. plantarum K. Mar. E tertinggidibandingkan dengan kedua sel lainnya.Perbedaan aktivitas di antara ketiga seltersebut secara umum disebabkan adanyaperbedaan konsentrasi sel, kemurnian, danjuga jenis dari bakteri tersebut.

Tabel 2 Aktivitas urikase

Sel L. plantarumAktivitas urikase

(U/mL kultur)K. Mar. E 0,1070Mgs. Psmb 0,0867Mgs. Bst 0,0842

pH Larutan Bufer Borat Optimum

Setiap enzim memiliki pH optimum yangberbeda dengan lainnya. Menurut Lehninger(1982), pH optimum enzim merupakan pHyang menyebabkan aktivitas enzimmaksimum. Pada pH optimum, guguspenerima proton yang penting pada tapak aktifenzim berada dalam tingkat ionisasi yangdiinginkan.

Pengukuran pH larutan bufer borat padapenelitian ini digunakan untuk mendapatkanpH optimum bagi aktivitas urikase.Pengoptimuman pH ditentukan denganmenggunakan metode spektrofotometri.Kondisi pH awal diatur pada rentang 6–10pada suhu 25 ˚C dengan larutan asam urat3,57 mM.

Gambar 6a memperlihatkan bahwaaktivitas urikase murni maksimum terdapatpada pH 8 dengan aktivitas sebesar 1,2455U/mL enzim. Demikian pula aktivitas enzimyang dihasilkan dari sel L. plantarum K. Mar.E, L. plantarum Mgs. Psmb dan L. plantarumMgs. Bst terjadi pada pH 8 (Gambar 6b)dengan aktivitas masing-masing sebesar0,1007; 0,0817; dan 0,0792 U/mL kultur.

Trivedi et al. (1978) menyatakan bahwapH optimum untuk uriakse dengan metodespekrotofotometri terjadi pada pH 7.

Sementara menurut Duncan et al. (1982) pHoptimum urikase berada pada pH 8,5. Hasilpada penelitian ini sesuai dengan penelitianArslan et al. (2006) dan Zhang et al. (2007)dengan menggunakan metode amperometri,yakni optimum pada pH 8.

Akivitas enzim akan menurun setelah pHoptimum. Menurut Palmer (1981), penurunanaktivitas enzim akibat perubahan pH yangtidak terlalu besar (masih di sekitar pHoptimumnya) disebabkan oleh berubahnyakeadaan ion enzim maupun keadaan ionsubstrat (Palmer 1981 diacu dalam Syam 2005& Syam 2008).

(a)

(b)

Gambar 6 Aktivitas urikase enzim murni (a)dan sel L. plantarum (b) padaberagam pH bufer

Suhu Optimum

Suhu merupakan salah satu faktorlingkungan yang memengaruhi perkembangandari aktivitas enzim. Pengaruh suhu padaaktivitas urikase murni ditunjukkan padaGambar 7a. Aktivitas urikase mengalamipeningkatan dan mencapai optimum padasuhu 55 ˚C dengan aktivitas sebesar 1,4907

6

U/mL enzim. Hasil tersebut sesuai denganpenelitian Zhang et al. (2006) dan Arslan(2008).

Aktivitas uriksae dari mikrob berbedadengan urikase murni. Suhu optimumsel L.plantarum lebih rendah, yakni suhu 35 ˚Cuntuk urikase yang dihasilkan sel K. Mar. Edengan nilai aktivitas sebesar 0,1255 U/mLkultur. Sementara sel L. plantarum Mgs. Psmbdan Mgs. Bst mencapai optimum pada suhu45 ˚C, yakni sebesar masing-masing 0,1279U/mL kultur dan 0,1164 U/mL kultur(Gambar 7b). Rendahnya suhu optimumtersebut disebabkan kemampuan bakteri untukhidup. Akan tetapi, suhu optimum tersebuttelah sesuai dengan kondisi fisiologis.Aktivitas enzim di atas suhu optimum tersebutakan mengalami penurunan.

(a)

(b)

Gambar 7 Aktivitas urikase enzim murni (a)dan sel L. plantarum (b) padaberbagai suhu.

Pengaruh Konsentrasi Enzim

Faktor lain yang dapat memengaruhiaktivitas enzim adalah konsentrasi enzim.Dengan enzim-enzim yang derajatkemurniannya tinggi, di dalam batas-batastertentu, terdapat suatu hubungan linear antara

konsentrasi dan aktivitas enzim (Pelczar1988). Berdasarkan Gambar 8, konsentrasienzim berbanding lurus dengan aktivitasenzim. Semakin tinggi konsentrasi enzim,semakin tinggi aktivitas enzim dan semakincepat reaksi yang dikatalisis oleh enzim.

Apabila konsentrasi substrat tetap dankonsentrasi enzim turun maka kecepatanreaksi yang dikatalisis enzim akan menurunkarena enzim yang tersedia tidak cukupbanyak untuk bereaksi dengan substrat(Murray et al. 2003). Pada penelitian inidibuat larutan enzim dengan berbagai macamkonsentrasi untuk dapat membandingkan kerjaenzim pada berbagai konsentrasi enzim.Enzim murni dengan konsentrasi 0,5 U/mLmemiliki aktivitas teringgi (Gambar 8a). Halini disebabkan karena pada konsentrasitersebut terdapat banyak enzim yang dapatbereaksi dengan substrat.

(a)

(b)

Gambar 8 Aktivitas urikase pada beragamkonsentrasi enzim murni (a) dansuspensi sel bakteri K. Mar E (b).

Sel bakteri dengan suspensi sebanyak 1,0mL OD600/50 mL kultur memiliki aktivitasenzim tertinggi (Gambar 8b dan Lampiran 4).Hal ini dikarenakan pada suspensi tersebutterdapat urikase yang cukup banyak untukbereaksi dengan substrat. Akan tetapi,

7

aktivitas urikase dari sel bakteri ini lebihrendah dibandingkan aktivitas yang diperolehdari enzim murni. Hal ini dikarenakan jumlahurikase yang diproduksi sel bakteri L.plantarum sedikit.

Konsentrasi Optimum Substrat Asam Urat

Penentuan pengaruh konsentrasi substratasam urat dilakukan pada kondisi pHoptimum dengan berbagai konsentrasisubstrat, yakni 0,011–0,160 mM. Gambar 9menunjukkan hubungan antara konsentrasisubstrat asam urat dan aktivitas urikase. Hasiltersebut menunjukkan bahwa dengan metodeini, dapat digunakan untuk mengukurkonsentrasi asam urat sampai 0,1144 mM.

(a)

(b)

Gambar 9 Aktivitas urikase enzim murni (a)dan sel L. plantarum K. Mar. E(b) pada beragam konsentrasisubstrat asam urat.

Peningkatan konsentrasi substratcenderung meningkatkan aktivitas enzim,seperti yang ditunjukkan pada Gambar 9.Bentuk kurva tersebut menunjukkan aktivitasurikase menurut persamaan Michaelis-Menten. Persamaan Michaelis-Mentenmenunjukkan bahwa kecepatan awal reaksienzim pada substrat (vo) berbanding lurus

dengan kecepatan maksimum enzim (Vmaks)dikalikan konsentrasi substrat ([S]) danberbanding terbalik dengan konstantaMichaelis bagi substrat tersebut (KM),ditambahkan [S] (Lehninger 1982). KM

merupakan konstanta Michaelis yangmenyataan konsentrasi suatu substrat padasaat reaksi enzimatis mencapai setengahkecepatan maksimumnya (Vmaks).

Aktivitas urikase pada sel L. plantarumdiperoleh sekitar sepersepuluh dari enzimmurni. Jadi untuk mendapatkan kondisi yangsama dengan enzim murni kemungkinandiperlukan konsentrasi substrat yang lebihkecil. Pada penelitian ini konsentrasi asamurat diperkecil menjadi 0,357 mM. Gambar 9bmenunjukkan bahwa dengan urikase yangdihasilkan sel L. plantarum K. Mar. E dapatdigunakan untuk mengukur konsentrasi asamurat sampai 0,0046 mM. Demikian juga yangdihasilkan Mgs. Psmb dan Mgs. Bst(Lampiran 5).

Hampir semua reaksi enzimatis dapatdianalisis secara kuantitatif dengan teoriMichaelis-Menten. Akan tetapi, nilai KM danVmaks sulit ditentukan dengan tepat dari kurvaMichaelis-Menten. Oleh karena itu,diperlukan cara lain untuk memperoleh nilaiKM dan Vmaks yang lebih tepat, yaitu denganmemetakan data yang sama dengan cara yangberbeda dengan memanfaatkan transformasialjabar persamaan Lineweaver-Burk (Gambar10 dan Lampiran 6).

Nilai KM dan Vmaks yang diperolehberdasarkan persamaan Linewaever-Burk(Gambar 10a) pada enzim murni sebesar0,0283 mM dan 2,0838 U/mL. Hal tersebutmemberikan arti bahwa pada enzim murniakan mencapai setengah dari kecepatanmaksimumnya jika konsentrasi substrat0,0283 mM dan kecepatan reaksimaksimumnya sebesar 2,0838 U/mL.

Tabel 3 menunujukkan parameter kinetikauntuk sel L. plantarum. Nilai KM yang kecilmenunjukkan bahwa enzim dapat mengikatsubstrat dengan kuat dan rendahnyakonsentrasi substrat cukup untukmenjenuhkan enzim. Selain nilai KM dapatjuga ditentukan nilai kcat enzim yangmenggambarkan jumlah maksimum molekulsubstrat yang dikonversi menjadi produk (turnover number). Berdasarkan nilai kcat yangdiperoleh, L. plantarum K. Mar. E lebihefisien untuk mengkatalisis asam urat menjadialantoin.

8

(a)

(b)

Gambar 10 Kurva Lineweaver-Burk (a) untukenzim murni dan (b) sel L.plantarum K. Mar. E.

Tabel 3 Data nilai Vmaks dan KM

Sel L.plantarum

Vmaks KM kcat

(U/mL) (mM)(mM/menit mL

OD600)K. Mar E 1,3635 0,1541 17043,9051Mgs. Psmb 0,0316 0,0061 263,3056Mgs. Bst 0,0418 0,0054 523,0344

Stabilitas Aktivitas Urikase Sel Bakteri

Pengukuran kestabilan aktivitas urikasedilakukan dengan cara menyimpan sel bakteridalam larutan NaCl 0,85% bersuhu 4 ˚Cselama 1, 2, 3, dan 7 hari. Data pengukurankestabilan pada aktivitas urikase secarakeseluruhan ditunjukkan pada Lampiran 8.Gambar 11 menunjukkan perbandingankestabilan aktivitas urikase yang dihasilkanoleh sel bakteri sel K. Mar. E, Mgs. Psmb, danMgs. Bst.

Gambar 11 Kestabilan aktivitas urikase selbakteri sampai hari ke-7.

Aktivitas urikase masih stabil pada harikedua, yakni sebesar 98,39% untuk sel K.Mar. E, 94,29% untuk sel Mgs. Psmb, dan94,12% untuk sel Mgs. Bst. Hari ketiga,kestabilan urikase yang dihasilkan sel Mgs.Psmb menurun hingga 18,10%, sedangkanuntuk kedua sel lainnya aktivitas urikasemasih stabil sekitar 50–70%. Setelahseminggu, aktivitas urikase yang dihasilkansel Mgs. Bst memiliki kestabilan yangtertinggi di antara ketiga sel bakteri yaknisebesar 18,10%, sedangkan yang terendahadalah sel Mgs. Psmb.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Aktivitas urikase tertinggi dihasilkan olehL. plantarum dari sel K. Mar. E sebesar0,1073 U/mL kultur. pH optimum untukurikase terjadi pada pH 8. Kondisi suhuoptimum untuk urikase yang dihasilkan sel K.Mar. E ialah 35 ˚C dan sel Mgs. Psmb danMgs. Bst terjadi pada suhu 45˚C. Kondisitersebut telah sesuai dengan fisiologis tubuh.Dengan menggunakan metodespektrofotometri, dapat digunakan untukmengukur asam urat secara in vivo sampaikonsentrasi 0,1144 mM untuk enzim murnidan 0,0046 mM untuk sel L. plantarum. NilaiVmaks dan KM untuk enzim murni sebesar2,0838 U/mL enzim dan 0,0283 mM.Sementara L. plantarum K. Mar. E memilikiafinitas terbesar di antara ketiga sel dengannilai Vmaks, KM, dan kcat sebesar 1,3635 U/mLkultur; 0,1541 mM, dan 17043,9051mM/menit mL OD600. Aktivitas urikase padaberbagai sel bakteri L. plantarum umumnyastabil sampai hari kedua.

9

Saran

Perlu dilakukan imobilisasi bakteri agardapat dimanfaatkan pada aplikasi biosensordengan metode elektrokimia.

DAFTAR PUSTAKA

[WBC] Worthington BiochemicalCorporation. 2009. Uricase Assay.Lakewood: WBC.

Abdel-Fattah YR, Saeed HM, Gohar YM, El-Baz MA. 2005. Improved productionof Pseudomonas aeruginosa urikase byoptimization of process parametersthrough statistical experimental design.Process Biochemistry 40:1707-1714.

Adámek V, Králová B, Šűchová M, ValentováO, Demnerová K. 1989. Purification ofmicrobial urikase. Journal ofChromatography 497:268-275.

Arslan F. 2008. An amperometric biosensorfor uric acid determination preparedfrom urikase immobilized inpolyaniline-polypyrole film. Sensor8:5492-5500,

Azab EA, Ali MM, Farred MF. 2005. Studieson uricase induction in certain bacteria.Egyptian Journal of Biology 7:44-54.

Bergmeyer HU, Gawehn K, Grassl M. 1974.In Methods on Enzymatic Analysis(Bergmeyer HU). Ed ke-2. Volume ke-1 (518). New York: Academic Pr.

Duncan PH. Gochman N, Cooper T, Smith E,Bayse D. 1982. A candidate referencemethod for uric acid in serum. I.Optimization and evalustion. ClinChem 28(2):284-290.

Frazier WB, Westhoff DC. 1998. FoodMicrobiology. Ed ke-3. New York:McGraw-Hill.

Giraud E, Gosselin L, Marin B, Parada JL,Raimbault M. 1993. Purification andcharacterization of an extracellularamylase from Lactobacillus plantarumstrain A6. Journal of AppliedBacteriology 75:276-282.

Iswantini D, Kato K, Kano K, Ikeda T. 1998.Electrochemical measurements ofglucose dehydrogenase activityexhibited by Escherichia coli cells;effects of the additions ofpyrroloquinoline quinine, magnesium

or calcium ions andethylenediaminetetraacetic acid.Bioelectrochemistry and Bioenergetics46:249-254.

Iswantini D, Kano K, Ikeda T. 2000. Kineticsand thermodynamics of activation ofquinoprotein glucose dehydrogenaseapoenzyme in vivo and catalyticactivity of the activated enzyme inEscherichia coli cells. BiochemistryJournal 350:917-923.

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia.Jilid 1, Thenawidjaja M, penerjemah;Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:Principles of Biochemistry.

Liao F et al.. 2006. Evaluation of a kineticuricase method for serum uric acidassay by predicting backgroundserapance of uricase reaction solutionwith an integrated method. Journal ofZhejiang University SCIENCE B7(6):497-502.

Ljungn Å, Wadström T. 2009. LactobacillusMolecular Biology: From Genomics toProbiotics. Lund: Caister Academic Pr.

Lotfy WA. 2008. Production of athermostable uircase by a novelBacillus thermotemalatus strain.Bioresource Technology 99:699-702.

Luo YC, Do JS, Liu CC. 2006. Anamperometric uric acid biosensor basedon modified Ir-C electrode. Biosensorand Bioelectronics 22:482-488.

Mahler JL. 1970, A new bacterial urikase foruric acid determination. AnalyticalBiochemistry 38:68-84.

Murray RK et al. 2003. Biokimia Harper. Edke-25. Jakarta: Kedokteran EGC.

Ogawa J. 2006. Analysis of microbial purinemetabolism and its application forhyperuricemia prevention. [NodaInstitute for Scientific ResearchGRANT]. Outline of Research Result.

Park SL, Guttman HN. 1973. Purification andproperties of Lactobacillus plantaruminducible malic enzyme. Journal ofBacteriology 116(1):263-270.

Pelczer MJJr, Chan ECS. 1988. Dasar-DasarMikrobologi. Volume ke-1 dan, -2.Hadieotomo RS, Imas T, TjitrosomoSS, Angka SL, penerjemah. Jakarta:

10

UI-Pr. Terjemahan dari: Elements ofMicrobiology.

Prætorius E. 1949. An enzymatic method forthe determination of uric acid byultraviolet spectrofhotometry.Scandinavian Journal of Clinical andLaboratory Investigation 1(3):222-230.

Putra GGP. 2009. Penentuan kinetika enzimpoligalakturonase (PG) endogenousdari pulp biji kakao. Jurnal BiologiXIII(1):21-24.

Rostini I. 2007. Peranan bakteri asam laktat(Lactobacillus plantarum) terhadapmasa simpan filet nila merah pada suhurendah. [tesis]. Jatinangor: FakultasPerikanan dan Ilmu Kelautan,Universitas Padjadjaran.

Syam KA. 2008. Pengoptimuman produksidan aktivitas enzim selulase dar mikrobsellotik asal rayap. [skripsi]. Bogor:Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam, Institut PertanianBogor.

Syam V. 2005. Isolasi bakteri, uji aktivitasdan karakterisisasi amiase Bacillusnatoo dari empat jenis natto komersial.[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematikadan Ilmu Pengetahuan Alam, InstitutPertanian Bogor.

Trivedi RC, Rebar L, Berta E, Stong L.1978a. New ultraviolet (340 nm)methode for assay of uric acid in serumor plasma. Clin Chem 24(4):562-566.

Zhang Y et al.. 2007. Development andanalytical application of an uric acidbiosensor using an urikase-immobilized eggshell membrane.Biosensor and Bioelectronics 22:1791-1797.

Zhou XL, Ma XH, Sun QQ, Li X, Guo KP.2005. Isolation of a thermostableurikase-producing bacterium and studyon its enzyme production conditions.Process Biochemistry 40:3749-3753.

LAMPIRAN

12

Lampiran 1 Bagan alir kerja

Tanam pada media GYP+ 0,2% asam urat

Mikroba

Inkubasi 2 hari pada 37 ˚C

Zona beningTanam pada media agar

Inkubasi 2 hari pada 37 ˚C

Tanam pada 10 mL media (starter)

Inkubasi s.d OD (600 nm) = 1

Inokulasi pada 50 mL media cair

Inkubasi

Sentrifuse (panen);Kecepatan 10000 rpm (8000× g)

Pelet (sel) supernatan

Resuspensi: NaCl fisiologis

Enzim murniSuspensi sel

Metode spektrofotometri λ293 nm

Pengoptimuman pH, suhu,konsentrasi substrat

Uji aktivitas urikase Kestabilan aktivitas urikase

13

Lampiran 2 Prosedur pembuatan larutan

Pembuatan larutan bufer borat pH 8Bufer borat dibuat dengan mencampur 50 mL larutan asam borat 0,2 M dan 7 mL larutan

boraks 0,05 M, diencerkan dengan akuades hingga 200 mL lalu ditepatkan menjadi pH 8. Larutanborat 0,2 M dibuat dengan cara melarutkan 6,183 g asam borat (H3BO4, BM = 61,83 g/mol)dengan akuades lalu ditera sampai 500 ml. Sementara larutan borak 0,05 M dibuat dengan caramelarutkan 9,5345 g boraks (Na2B4O7 .10H2O, BM = 381,382 g/mol) dengan akuades lalu diterasampai 500 mL.

Pembuatan larutan asam urat 3,57 mMSebanyak 0,015 g asam urat (C5H4N4O3, BM =168,11 g/mol) dilarutkan dengan

NaOH. Setelah larut diencerkan dengan bufer borat lalu ditera sampai 25 mL.

Komposisi salt solution dalam 50 mLBahan Bobot(g)

MgSO4 . 7H2O 0,1MnSO4 . 4H2O 0,1FeSO4 . 7H2O 0,1NaCl 0,1

Lampiran 3 Hasil uji aktivitas urikase

(a) Data lengkap hasil pengukuran aktivitas urikase pada enzim murni

Ulangan Ablangko Acontoh Aterkoreksi*) Aktivitas urikase Aktivitas urikase rerata

(U/mL) (U/mL)1

0,5540,058 0,496 1,2282

1,22822 0,057 0,497 1,23073 0,059 0,495 1,2257

Keterangan: *) Aterkoreksi = Ablangko – Acontoh

(b) Data lengkap hasil uji aktivitas urikase pada berbagai sel bakteri L. plantarum

SelL. plantarum

Ulangan Ablangko Abakteri Acontoh Aterkoreksi**)

Aktivitasurikase

Aktivitasurikase rerata

(U/mL) (U/mL)K. Mar. E 1

0,554 0,058

0,570 0,042 0,1040

0,10732 0,569 0,043 0,10653 0,567 0,045 0,1114

Mgs. Psmb 1

0,554 0,066

0,584 0,036 0,0891

0,08672 0,586 0,034 0,08423 0,585 0,035 0,0867

Mgs. Bst 10,554 0,040

0,559 0,035 0,08670,08422 0,560 0,034 0,0842

3 0,561 0,033 0,0817Keterangan: **) Aterkoreski = Ablangko – (Acontoh – Abakteri)

Perhitungan:

Aktivitas enzim (U/mL) =

Contoh Perhitungan:

Aktivitas enzim (U/mL) = 1,2282 U/mL

14

Lampiran 4 Grafik aktivitas urikase pada konsentrasi suspensi sel L. plantarum

15

Lampiran 5 Grafik aktivitas urikase sel L. plantarum pada beragam konsentrasi substrat asamurat

Grafik aktivitas urikase sel L. plantarum Mgs. Psmb pada beragam konsentrasi substrat asam urat

Grafik aktivitas urikase sel L. plantarum Mgs. Bst pada beragam konsentrasi substrat asam urat

16

Lampiran 6 Grafik Lineweaver-Burk

Kurva Lineweaver-Burk untuk sel L. plantarum Mgs. Psmb

Kurva Lineweaver-Burk untuk sel L. plantarum Mgs. Bst

Catatan:

Perhitungan nilai Vmaks dan KM menggunakan persamaan Lineweaver-BurkPersamaan Linewear-Burk:

Contoh perhitungan:

Dengan persamaan linear yang diperoleh: y = 0,1930x + 31,6489

mM ⁄ menit

17

Lanjutan lampiran 6

[bakteri0] = 0,3 ml/50 mL OD600 x 0,02 mL = 0,00012 mL OD600

Sehingga: